Ringraziamo il Prof. Christoph Englert e il Prof. Didier Stainier per regalare il Tg (wt1b: GFP) LI1 e Tg (kdrl: EGFP) s843 ceppi, rispettivamente, e il meccanismo di Taiwan Zebrafish Nucleo per la fornitura di Tg (kdrl: mCherry) CI5. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni dal Ministero della Scienza e della Tecnologia (96-2628-B-029-002-MY3, 101-2313-B-029-001, 102-2628-B-029-002-MY3 di Taiwan, 102- 2321-B-400-018).

Etica Dichiarazione: Tutte le procedure sperimentali su zebrafish sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali di Tunghai University (IRB Soddisfazione NO 101-12.) E realizzato in conformità con le linee guida approvate. 1. Soluzioni azioni 3β-Hsd enzimatico attività di colorazione <ol><li> Preparare trans-dehydroandrosterone [10 mg / ml in dimetilsolfossido (DMSO)]. </li><li> Preparare β-nicotinammide adenina dinucleotide idrato (1,2 mg / ml in tampone fosfato 0,1 M, pH 7,2). </li><li> Preparare nicotinamide (vitamina B3, 50 mg / ml in H 2 O). </li><li> Preparare 4-nitro tetrazolio blu (50 mg / ml nel 70% dimetilformammide). </li><li> Aliquota tutti questi componenti in tubi microcentrifuga e conservare a -20 ° C. NOTA: Nella nostra esperienza, ripetuti di congelamento e scongelamento delle aliquote di tutte le soluzioni di cui sopra non influenzano l&#39;intensità della 3β-Hsd attività di colorazione. </li></ol> 2. Whole-mount 3β-Hsd attività di colorazione NOTA: L&#39;attività enzimatica 3β-HSD è rilevabile in embrioni di zebrafish come già 28 ore dopo la fecondazione (HPF) quando coltivate a 28,5 ° C, che è coerente con l&#39;inizio di espressione dell&#39;mRNA di hsd3b1 2,7. Il tutto il montaggio 3β-Hsd protocollo attività colorazione in questo studio si basa su un metodo precedentemente descritto 8 ed era determinato ad avere successo nel zebrafish in via di sviluppo fino a 7 giorni dopo la fecondazione 9. Per analizzare il microambiente vascolare del tessuto steroidea interrenale, tutto il montaggio 3β-Hsd attività colorazione deve essere applicato a linee transgeniche che esprimono fluorescenza specifica-endotelio, come ad esempio Tg (kdrl: EGFP) s843 14 e Tg (kdrl: mCherry) CI5 15 . Per analizzare il tessuto steroidogenica interrenale considerando lo sviluppo del rene zebrafish, 3β-Hsd attività colorazione può essere applied al Tg (wt1b: GFP) pesci LI1 16, dove si delinea la formazione del glomerulo e pronephric tubuli. <ol><li> Trattare il zebrafish sviluppo incubandoli in 0,03% phenylthiourea in acqua uovo (0,06 mg / L barriera sale in acqua deionizzata), partendo da una fase compresa tra 12 e 24 HPF, per inibire la formazione di pigmento. </li><li> Fix embrioni dechorionated o larve in (A) 4% paraformaldeide (PFA) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) supplementato con 0,1% Tween 20 (PFAT) per 1 ora a temperatura ambiente (RT) o (B) 2% PFAT notte a 4 ° C o per 2 ore a 4 ° C, seguita da 4 ore a RT. Attenzione: PFA è tossico per inalazione e per contatto con la pelle. E &#39;distruttivo per la pelle, le mucose, gli occhi e le vie respiratorie superiori. </li><li> Lavare il embrioni 4x per 10 minuti con PBS integrato con 0,1% di Tween 20 (PBST) a temperatura ambiente. NOTA: E &#39;fondamentale per non secca i campioni, mentre la modifica delle soluzioni di lavaggio. </li><li> Appena preparare la STAsoluzione ining prima delle reazioni (Tabella 1). Preparare, vortice, e componenti per centrifughe di A e B in tubi separati. NOTA: L&#39;aggiunta di tutti i componenti direttamente in un unico tubo potrebbe causare gravi precipitazioni. </li><li> Aggiungere l&#39;intera soluzione della parte A per l&#39;intera soluzione di parte B, mescolare bene per preparare la soluzione colorante, e subito distribuire 1 ml in ogni provetta da microcentrifuga contenente embrioni fissi e lavati. </li><li> Avvolgere i tubi microcentrifuga con un foglio di alluminio per proteggerli dalla luce e luogo sia su un rotatore o di una piattaforma oscillante per gentile agitazione a temperatura ambiente. </li><li> Empiricamente determinare il tempo di reazione per il monitoraggio dei segnali cromogenici mediante microscopia. precipitazioni lievi si svilupperà nel corso del tempo; tuttavia, essi non interferiscano con il processo di reazione. NOTA: per gli embrioni fissati a 28 HPF, colorazione a 25 ° C per 4 ore genera un segnale chiaro al tessuto interrenale. </li><li> Arrestare la reazione lavando 4x per 10 min in PBST. iof è richiesta alcuna ulteriore immunoistochimica (IHC) analisi, post-correggere gli embrioni colorate con 4% PFAT per 60 minuti a temperatura ambiente. Altrimenti, memorizzare gli embrioni lavati a 4 ° C fino all&#39;utilizzo. </li><li> Per tutto il montaggio microscopia, cancellare gli embrioni macchiati, post-fisso, e lavato con il 50% glicerolo in PBS, orientarli con il lato dorsale rivolto verso l&#39;alto su una diapositiva, e osservare con un microscopio verticale sotto illuminazione in campo chiaro. NOTA: per creare un&#39;immagine ad alta risoluzione della morfologia del tessuto interrenale, analisi dell&#39;embrione 3β-Hsd attività macchiato e deyolked TV a montaggio è raccomandato. Come il tessuto steroidogenica interrenale è posizionato proprio sopra il sacco vitellino, una ventrale analisi TV a monte del tessuto interrenale permette una osservazione diretta e chiara della morfologia interrenale 17. </li></ol> 3. Analisi IHC di 3β-HSD embrioni attività macchiati NOTA: Per analizzare il microambiente vascolare del steroitessuto dogenic, gli embrioni di attività macchiati 3β-HSD con un reporter fluorescenti transgenici specifici endotelio sono sottoposti ad trasversali vibratome sezionamento e la successiva analisi IHC 12,18. <ol><li> Post-fissaggio <ol><li> Post-rimuovere gli embrioni 3β-Hsd activity-tinto e lavato con 2% PFA integrato con 1% Triton X-100 per 1 ora a 4 ° C e lavare 4x per 10 min in PBS contenente 1% Triton X-100 (PBSTx) a RT. </li></ol></li><li> Incorporare <ol><li> Preparare 4% a basso punto di fusione agarosio sciogliendo l&#39;agarosio in PBS a 95 ° C, aliquota in tubi microcentrifuga, e conservare a 4-8 ° C. </li><li> Sciogliere un&#39;aliquota del 4% bassofondente agarosio a 70 ° C per 10 minuti, e quindi mantenere il un&#39;aliquota a 47 ° C. Incorpora ogni embrione nel fuso 4% a basso punto di fusione agarosio in un berretto distaccata di una provetta da 1,5 ml microcentrifuga che funge da stampo e lasciare raffreddare fino solido. </li></ol></li><li> vibratome sezionamento <ol><li> Attaccare un pezzo di nastro di carta per la p seccalatform del vibratome. </li><li> Rimuovere il blocco di agarosio indurito dallo stampo da una lama di rasoio. Applicare colla al nastro di carta sulla piattaforma, e fissare il blocco di agarosio sul nastro di carta, con il lato anteriore del campione verso l&#39;alto. Tagliare il blocco di agarosio a una forma trapezoidale prismatica, con circa 4 mm e 8 mm per lato delle faccette superiore ed inferiore, rispettivamente. </li><li> Risciacquare blocco agarosio campioni contenenti con PBS freddo integrato con 0,5% Triton X-100 (0,5% PBSTx) utilizzando un contagocce. </li><li> Tagliare il blocco di agarosio in 100 sezioni micron secondo il manuale di istruzioni del vibratome. Costantemente lavare il blocco di agarosio per evitare l&#39;essiccazione. Come ogni fetta viene tagliata, toglierlo dal vibratome utilizzando un ago G 26 della siringa, e trasferire in un posto piatto contenente freddo 0,5% PBSTx (500 microlitri / pozzetto). </li><li> Raccogliere le sezioni di tessuto di attività-positivo 3beta-Hsd controllando al microscopio dissezione, e trasferire le sezioni da un PIpunta Pette con la sua estremità cut-off (circa 1 mm di diametro interno, in apertura) in una piastra a 96 pozzetti contenente freddo 0,5% PBSTx (150 ml / pozzetto). I campioni di tessuto di solito dissociano dal blocco agarosio dopo questo passaggio. </li></ol></li><li> Permeabilizzazione e lavaggio <ol><li> Lavare le fette 6x per 15 minuti a 0,5% PBSTx a RT, 10 min in PBS, e 4x per 10 min in PBS integrato con 1% di siero albumina bovina / 1% DMSO / 0,1% Triton X-100 (PBDTx). </li></ol></li><li> Blocco <ol><li> Incubare le fette per 1 hr a 2% di siero fetale bovino (FCS) in PBDTx a RT. </li></ol></li><li> Reazione anticorpo primario <ol><li> Incubare le fette per 1,5 giorni in PBDTx contenente un anticorpo primario (ad esempio, policlonale di coniglio anti-fibronectina umana e topo anti-umano adesione focale chinasi) a 4 ° C. </li></ol></li><li> Lavaggio <ol><li> Lavare le fette 6x per 10 min in PBDTx a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Blocco <ol><li> Incubare le fette per 1 ora a 2% FCS in PBDTx a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Reazione anticorpo secondario <ol><li> Incubare le fette per 1,5 giorni in PBDTx contenenti un anticorpo secondario (fluoroforo coniugato capra anti-coniglio o anti-topo IgG) a 4 ° C. </li></ol></li><li> Lavaggio <ol><li> Lavare le fette 6x per 10 min in PBDTx a temperatura ambiente e 4x per 10 min in PBST a temperatura ambiente. NOTA: Per l&#39;analisi al microscopio confocale, cancellare i campioni con il 50% glicerolo in PBS. </li></ol></li></ol> 4. Analisi confocale <ol><li> Osservare l&#39;intero embrione monte e la sezione con un microscopio confocale dotato di 10X / 20X e 0,5 / 0,75 lente dell&#39;obiettivo. </li><li> Per la rilevazione simultanea di fluorescenza e la colorazione 3β-Hsd, impostare la modalità multitraccia come segue: 488 nm laser argon e 505-530 nm filtro passa-banda per il rilevamento di GFP; 543 nm laser a elio-neon e 560-615 nm filtro passa-banda per il rilevamento di mCherry; e trasmessa canale di luce per la rivelazione di 3β-Hsd colorazione.La dimensione del foro stenopeico è 1 unità Airey, e la risoluzione è 1.024 x 1.024 pixel. </li><li> Montare le pile z (con 6 intervalli micron) come proiezione 3D, e unire la proiezione e il campo luminoso, utilizzando il software incorporato confocale. </li></ol>

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W., Chiu, C. H., Liu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+mediates+correct+positioning+of+the+interrenal+organ+in+zebrafish.">Fibronectin mediates correct positioning of the interrenal organ in zebrafish.</a> Dev Dyn. 242, 432-443 (2013).</li><li>Chiu, C. H., Chou, C. W., Takada, S., Liu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+fibronectin+signaling+requirements+of+the+zebrafish+interrenal+vessel.">Development and fibronectin signaling requirements of the zebrafish interrenal vessel.</a> PLoS One. 7, e43040 (2012).</li></ol>

The authors have no competing financial interests to declare.

La forza dell&#39;attività 3β-Hsd segnale aumentato nel corso della reazione. chiari segnali di attività 3β-HSD sono stati rilevati dopo 4 ore di reazione per fasi, dalla 28 in poi HPF. Tuttavia, la durata della reazione richiede determinazione empirica, a seconda dello scopo del test. Nei casi in cui la colorazione richiede elaborazione notturna, uno sfondo leggermente bluastra tende a svilupparsi sui campioni. Questo problema può essere superato aumentando la durata di fissaggio (ad esempio, 4 ore a 4% PFAT a RT) prima dell&#39;attività colorazione 3β-Hsd. Per contro, overfixation, come ancoraggio per una notte con 4% PFAT a RT, porta ad un fondo estremamente chiara. Tuttavia, più tempo sarebbe necessario per ottenere un&#39;intensità desiderabile del segnale. Abbiamo notato che fissa i campioni durante la notte con il 2% invece che al 4% PFAT prima 3β-Hsd attività colorazione produce in genere risultati più desiderabili in una successiva osservazione reporter fluorescente o ioanalisi HC. Tuttavia, fissando gli embrioni con il 4% PFAT permette una rapida analisi delle attività 3β-Hsd (completata entro 1 giorno) e sarebbe quindi beneficiare schermi genetici o chimici di targeting dei tessuti steroidogenici interrenale. Post-fissa i embrioni dopo 3β-Hsd attività colorazione è essenziale perché tracce di componenti chimici tendono a persistere nei campioni macchiati anche dopo ampia lavaggio e si tradurrebbe in fondo elevato dopo una durata di stoccaggio a lungo. Tuttavia, se le 3β-HSD embrioni attività macchiate devono essere sottoposti ad ulteriore analisi IHC, memorizzare l&#39;attività macchiate 3β-Hsd ed embrioni lavato a 4 ° C overnight non comporta un miglioramento notevole dello sfondo. In situ ibridazione analisi (ISH) di 3β-HSD embrioni attività macchiato è possibile. Ad esempio, l&#39;espressione dei trascritti Prox1 è colocalizzava con l&#39;attività 3β-Hsd al steroidogenic tessuto 10. Per eseguire 3β-Hsd attività colorazione oltre ISH, gli embrioni devono essere fissati in 4% PFAT per 4 ore prima e dopo il dosaggio dell&#39;attività 3β-Hsd modo che trascritti di RNA cellulare possono essere conservati con qualità desiderabile per l&#39;analisi ISH. Analisi ISH utilizzando riboprobes di ff1b, cyp11a1, hsdb1, e la stella sono stati applicati negli studi di sviluppo del interrenale 1,2,11 tessuto steroidea. Il riboprobe di ff1b rileva le cellule primordiali interrenale da 22 HPF, mentre quelli di cyp11a1 e stella rilevare differenziazione delle cellule interrenale da 24 HPF. Rispetto al 3β-Hsd colorazione istochimica che rileva solo i tessuti interrenale differenziati da 28 HPF in poi, l&#39;analisi ISH può essere utilizzato per analizzare una gamma di geni specifici interrenale in entrambe le cellule primordiali interrenale e differenziati. Tuttavia, 3β-Hsd istochimiche colorazione ettaris il vantaggio di essere semplice, rapido e affidabile per analizzare il fenotipo del tessuto interrenale steroidogenico differenziata, e quindi è un potente strumento per studi sullo sviluppo dettagliati nonché schermi genetici o chimici su larga scala. Come per la nostra revisione della letteratura rilevante, non esiste un anticorpo specifico in grado di rilevare in modo affidabile l&#39;espressione della proteina al tessuto interrenale steroidogenica attraverso immunoistochimica. Pertanto, il metodo di colorazione istochimica 3β-HSD è particolarmente utile nel delineare il tessuto e la morfologia cellulare del tessuto interrenale steroidogenica. Anche se 3β-Hsd colorazione istochimica è utile per la visualizzazione del tessuto interrenale steroidogenico differenziata, che non riporta direttamente capacità di sintesi degli steroidi o la funzionalità delle cellule interrenale. Le mutazioni o sostanze chimiche che interessano enzimi a monte oa valle di 3β-HSD nella cascata di sintesi steroidea non possononecessariamente essere rilevato con questo metodo descritto, dato che possono o non possono perturbare sia dimensione o la morfologia del tessuto interrenale. Pertanto, gli utenti di questo protocollo dovrebbe tenere a mente che alcune alterazioni enzimatiche che colpisce la funzione ma non la morfologia del tessuto interrenale non possono essere facilmente rilevati da questo metodo.

La ghiandola surrenale, una componente fondamentale dell&#39;asse ipotalamo-ipofisi-surrene, secerne gli steroidi e coordina l&#39;omeostasi di steroidi e la risposta del corpo allo stress. La ghiandola surrenale comprende la corteccia esterna, che secerne steroidi in maniera specifica per la zona, e midollo interni, che sintetizza catecolamine. La ghiandola interrenale in teleostei è la controparte della ghiandola surrenale nei mammiferi ed è composto da cellule interrenale e cromaffini steroidogenici, che sono equivalenti funzionali della corteccia surrenale e midollare, rispettivamente, 1-3. Studi condotti utilizzando il modello zebrafish hanno riferito che entrambe le linee cellulari steroidogenici e cromaffini sono formate da meccanismi molecolari e cellulari altamente simili a quelle dei mammiferi 1,2. Pertanto, il pesce zebra è un modello potenzialmente potente per lo studio di malattie genetiche, controllo neuroendocrino, e la biologia dei sistemi dell&#39;asse ipotalamo-ipofisi-surrene (interrenale). <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Nella ghiandola surrenale, 3β-Hsd catalizza la conversione del progesterone dal pregnenolone, 17α-idrossiprogesterone da 17α-hydroxypregnelolone, e androstenedione da deidroepiandrosterone 4,5. 3β-HSD è essenziale per biosynthesizing tutte le classi di steroidi ormonali, vale a dire il progesterone, glucocorticoidi, mineralcorticoidi, androgeni ed estrogeni,. I due umana 3β-Hsd isoenzimi HSD3B1 e HSD3B2 sono espressi in modo differenziale 6. HSD3B1 è espressa nella placenta e nei tessuti periferici, mentre HSD3B2 si esprime nella corteccia surrenale e gonadi. HSD3B1 umana e HSD3B2 sono co-ortologhi di hsd3b1 zebrafish, che si esprime al tessuto interrenale e gonadi adulti; hsd3b2 zebrafish è un gene maternamente espresso le cui trascrizioni scomparire prima organogenesi 7. Il protocollo di tutto il montaggio 3β-Hsd saggio di attività enzimatica per zebrafish è stato sviluppato modificando il metodo di Levy, uns descritto da Milano et al. , Su sezioni congelate di otto specie di teleostei 8. A causa della permeabilità dei tessuti e la trasparenza ottica del pesce zebra in via di sviluppo, tutto il montaggio 3β-Hsd istochimica può essere utilizzato con successo per l&#39;embrione zebrafish fisso e larve e specificamente delineare i tessuti interrenale differenziati. Questo test sensibile e rapida è stata applicata a vari mutanti e morphants dimostrano diversi tipi di dysmorphogenesis interrenale. L&#39;attività interrenale 3β-HSD è assente nell&#39;embrione se le specifiche del tessuto interrenale è interrotta attraverso una specifica atterramento del fattore di trascrizione Ff1b ed è diminuito come la differenziazione interrenale è influenzata da un atterramento del coregulator Ff1b Prox1 9,10. In particolare, l&#39;attività 3β-Hsd può essere rilevato in mutanti con gravi difetti nelle fasi iniziali, come ad esempio un occhio capocchia di spillo e strabismo, dove il 3β-Hsd istochimica delinea come la migrazione delle cellule interrenale è influenzata 11. La differenziazione del tessuto interrenale non è compromessa anche in completa assenza di sangue e vascolare. Pertanto, come forma di segnali endotelio-derivati in via di sviluppo dell&#39;organo interrenale può essere determinato 12,13. Nel complesso, questo saggio istochimico è stato utilizzato con successo per lo studio specificazione, differenziazione e migrazione delle cellule steroidogeniche nel modello zebrafish. Pertanto, dovrebbe essere un efficiente e uno strumento affidabile per eventuali schermi genetici o chimici di targeting disturbi degli organi surrenali e interrenale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="565">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:187px;">Carl Zeiss&#160;</td>
			<td style="width:72px;">LSM510&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>USB</td>
			<td>US16374</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyclone Fetal Calf Serum&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30073</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N1636</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-Nitro blue tetrazolium</td>
			<td>Promega</td>
			<td>S380C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nusieve GTG</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50081</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylthiourea</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P7629</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417-100Tab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PYREX Spot Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7220-85</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reef Salt</td>
			<td>AZOO</td>
			<td>AZ28001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">trans-Dehydroandrosterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the interrenal steroidogenic tissue and its vascular microenvironment in zebrafish

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-&#946;-Hydroxysteroid dehydrogenase /&#916;5-4 isomerase (3&#946;-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3&#946;-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3&#946;-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.

Per determinare come i codevelops steroidogenici tessuto interrenale con il glomerulo renale pronephric e la sua vascolarizzazione nascente, il saggio di attività enzimatica 3β-HSD è stato eseguito sul doppio transgenici Tg (wt1b: GFP) LI1; Tg (kdrl: mCherry) CI5 embrione a 34 HPF (Figura 1). In questa fase, il tessuto steroidogenico activity-positive 3β-Hsd si trova alla linea mediana e caudale immediatamente glomeruli renali pronephric, mentre alcune cellule steroidogeniche iniziano migrazione attraverso la linea mediana e formano un bordo sporgente dalla vista dorsale. Il tessuto steroidea è strettamente associata con l&#39;aorta dorsale (DA) e la vena cardinale posteriore (PCV). Il saggio di attività enzimatica 3β-Hsd sul Tg (kdrl: GFP) s843 embrioni permesso una chiara definizione dei vasi peri-interrenale, tra cui la DA, PCVE di un recipiente interrenale (IRV; Figura 2). Vibratomo sezioni dei 3β-HSD embrioni attività macchiate stati sottoposti ad analisi IHC per rilevare la extracellular matrix protein fibronectina e il suo effettori a valle fosforilata Focal Adhesion Kinase. La deposizione peri-DA di fibronectina è essenziale per sostenere la crescita IRV 18. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54820/54820fig1.jpg" /> Figura 1: tutto il montaggio 3β-Hsd attività colorazione eseguita su zebrafish esprimere reporter fluorescenti. Dorsale (sinistra pannelli) e dorsolaterale (pannelli di destra) vista su un 3β-Hsd attività macchiato di Tg (wt1b: GFP) LI1; Tg (kdrl: mCherry) CI5 embrione a 34 HPF, che permette di visualizzare la distribuzione spaziale relativa del interrenale tessuti (IR), glomerulo pronephric (PG), tubuli pronephric (PT), dorsale dell&#39;aorta (DA), dorsale lateraledell&#39;aorta (LDA), e posteriore cardinale vena (PCV). Grazie alla posizione del tessuto interrenale in questa fase, le viste dorsolaterali sono dal lato destro dell&#39;embrione. D, dorsale; V, ventrale; A, anteriore; P, posteriore; R, a destra; L, a sinistra. Barra di scala = 50 micron. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54820/54820fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54820/54820fig2.jpg" /> Figura 2: Vibratome sezionamento ed analisi IHC di 3β-Hsd attività macchiato di Tg (kdrl: GFP) s843 embrioni. L&#39;embrione 34-HPF stato sottoposto ad un saggio di attività enzimatica 3β-Hsd quindi vibratome sezionamento. La sezione 3β-Hsd attività-positivo è stato macchiato con un doppio IHC con coniglio fibronectina anti-umano (Fn; 1/200) e topo anti-umano fosforilata adesione focale chinasi (pFak; pY397, 1/100). La sezione trasversale mostra la relativa distribuzione del tessuto interrenale (IR) e le sue navi vicine, tra cui l&#39;aorta dorsale (DA), posteriore cardinale vena (IRV), e posteriore cardinale vena (PCV). NT, tubo neurale; NC, notochord; S, somite. Barra di scala = 50 micron. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54820/54820fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> la concentrazione della </td><td> In 1.000 ml </td><td> concentrazione finale </td></tr><tr><td> Parte A. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td></td><td> 40 ml </td><td></td></tr><tr><td> DHEA </td><td> 10 mg / ml </td><td> 10 microlitri </td><td> 0,1 mg / ml </td></tr><tr><td> NAD </td><td> 1,2 mg / ml </td><td> 10 microlitri </td><td> 12 mg / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Parte B. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBST </td><td></td><td> 936 ml </td><td></td></tr><tr><td> La vitamina B3 </td><td> 50 mg / ml </td><td> 2 ml </td><td> 0,1 mg / ml </td></tr><tr><td> NBT </td><td> 50 mg / ml </td><td> 2 ml </td><td> 0,1 mg / ml </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Componenti della reazione di colorazione 3β-HSD.

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Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

La ghiandola interrenale in zebrafish è la controparte teleostei della ghiandola surrenale mammiferi. Questo protocollo introduce come eseguire la deidrogenasi 3-β-idrossisteroide (Δ 5-4 isomerasi; 3β-HSD) saggio di attività enzimatica, che rileva le cellule differenziate steroidogeniche nel zebrafish in via di sviluppo.

Visualizzare il Tissue interrenale Steroidogenic e la sua Vascolare Microenvironment in Zebrafish

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying ...

visualizing-interrenal-steroidogenic-tissue-its-vascular

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.9K Views.  Tunghai University.  La ghiandola interrenale in zebrafish è la controparte teleostei della ghiandola surrenale mammiferi. Questo protocollo introduce come eseguire la deidrogenasi 3-β-idrossisteroide (Δ 5-4 isomerasi; 3β-HSD) saggio di attività enzimatica, che rileva le cellule differenziate steroidogeniche nel zebrafish in via di sviluppo. 

Video: Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Catturare Tissue Repair in Zebrafish Larve con Time-lapse Brightfield stereomicroscopia

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analisi delle larve Zebrafish muscolo scheletrico Integrità con Blu di Evans Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex determination system, where several genes distributed throughout the genome collectively determine the sex identities of individual fish. Currently, the genes involved in regulating gonad development and how they work remain elusive. Normally, isolating gonadal tissue is the first step to examine the sex developmental processes. Here, we present a procedure to isolate gonadal tissue from 17 dpf (days post fertilization) and 25 dpf zebrafish larvae. The isolated gonadal tissue may be subsequently examined by morphology and gene expression profiling.

Here, we present a protocol for isolating gonadal tissue of larval zebrafish, which will facilitate investigations of zebrafish sex differentiation and maintenance.

La dissezione del larvale Zebrafish gonadica Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response to&#160;growth and reproduction. In insects, the larval prothoracic gland (PG) and the adult female ovary play essential roles in biosynthesizing the principal steroid hormones called ecdysteroids. These ecdysteroidogenic organs are innervated from the nervous system, through&#160;which the timing of biosynthesis is affected by environmental cues. Here we describe a protocol for visualizing ecdysteroidogenic organs and their interactive organs in larvae and adults of the fruit fly Drosophila melanogaster, which provides a suitable model system for studying steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. Skillful dissection allows us to maintain the positions of ecdysteroidogenic organs and their interactive organs including the brain, the ventral nerve cord, and other tissues. Immunostaining with antibodies against ecdysteroidogenic enzymes, along with transgenic fluorescence proteins driven by tissue-specific promoters, are available to label ecdysteroidogenic cells. Moreover, the innervations of the ecdysteroidogenic organs can also be labeled by specific antibodies or a collection of GAL4 drivers in various types of neurons. Therefore, the ecdysteroidogenic organs and their neuronal connections can be&#160;visualized simultaneously&#160;by immunostaining and transgenic techniques. Finally, we describe how to visualize germline stem cells, whose proliferation and maintenance are controlled by ecdysteroids. This method contributes to comprehensive understanding of steroid hormone biosynthesis and its neuronal regulatory mechanism.

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

We describe a protocol for dissection, fixation, and immunostaining of steroidogenic organs in Drosophila larvae and adult females to study steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. In addition to steroidogenic organs, we visualize the innervation of steroidogenic organs as well as steroidogenic target cells such as germline stem cells.

Protocolli per la visualizzazione steroidogenica organi e dei loro organi interattivi con Immunocolorazione nella mosca della frutta<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

Una tecnica novel di trapianto di grassi del grasso mammario per visualizzare la generazione di vascelli delle cellule staminali endoteliali vascolari

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imaging Live di Mouse Seconda Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and optical transparency. In particular, the zebrafish embryo has become an important organism to study vertebrate kidney organogenesis as well as multiciliated cell (MCC) development. To visualize MCCs in the embryonic zebrafish kidney, we have developed a combined protocol of whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) and whole mount immunofluorescence (IF) that enables high resolution imaging. This manuscript describes our technique for co-localizing RNA transcripts and protein as a tool to better understand the regulation of developmental programs through the expression of various lineage factors.

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Cilia development is vital to proper organogenesis. This protocol describes an optimized method to label and visualize ciliated cells of the zebrafish.

Visualizzazione di cellule Multiciliated in Zebrafish attraverso un protocollo combinato di tutta Monte fluorescente ibridazione In Situ e immunofluorescenza

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the Notch receptor with ligands from neighboring cells induces activation of the signaling pathway (trans-activation), while interaction with ligands from the same cell inhibits signaling (cis-inhibition). Proper balance between trans-activation and cis-inhibition helps establish optimal levels of Notch signaling in some contexts during animal development. Because of the overlapping expression domains of Notch and its ligands in many cell types and the existence of feedback mechanisms, studying the effects of a given post-translational modification on trans- versus cis-interactions of Notch and its ligands in vivo is difficult. Here, we describe a protocol for using Drosophila S2 cells in cell-aggregation assays to assess the effects of knocking down a Notch pathway modifier on the binding of Notch to each ligand in trans and in cis. S2 cells stably or transiently transfected with a Notch-expressing vector are mixed with cells expressing each Notch ligand (S2-Delta or S2-Serrate). Trans-binding between the receptor and ligands results in the formation of heterotypic cell aggregates and is measured in terms of the number of aggregates per mL composed of &#62;6 cells. To examine the inhibitory effect of cis-ligands, S2 cells co-expressing Notch and each ligand are mixed with S2-Delta or S2-Serrate cells and the number of aggregates is quantified as described above. The relative decrease in the number of aggregates due to the presence of cis-ligands provides a measure of cis-ligand-mediated inhibition of trans-binding. These straightforward assays can provide semi-quantitative data on the effects of genetic or pharmacological manipulations on the binding of Notch to its ligands, and can help deciphering the molecular mechanisms underlying the in vivo effects of such manipulations on Notch signaling.

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Complexity of in vivo systems makes it difficult to distinguish between the activation and inhibition of Notch receptor by trans- and cis-ligands, respectively. Here, we present a protocol based on in vitro cell-aggregation assays for qualitative and semi-quantitative evaluation of the binding of Drosophila Notch to trans-ligands vs cis-ligands.

Cella di aggregazione saggi per valutare l'associazione della tacca della drosofila con Trans-ligandi e la sua inibizione di Cis-ligandi

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the field of developmental biology. The discovery and development of photoconvertible proteins have greatly aided our understanding of these dynamic changes by providing a method to optically highlight cells and tissues. However, while photoconversion, time-lapse microscopy, and subsequent image analysis have proven to be very successful in uncovering cellular dynamics in organs such as the brain or the eye, this approach is generally not used in the developing heart due to challenges posed by the rapid movement of the heart during the cardiac cycle. This protocol consists of two parts. The first part describes a method for photoconverting and subsequently tracking endocardial cells (EdCs) during zebrafish atrioventricular canal (AVC) and atrioventricular heart valve development. The method involves temporally stopping the heart with a drug in order for accurate photoconversion to take place. Hearts are allowed to resume beating upon removal of the drug and embryonic development continues normally until the heart is stopped again for high-resolution imaging of photoconverted EdCs at a later developmental time point. The second part of the protocol describes an image analysis method to quantify the length of a photoconverted or non-photoconverted region in the AVC in young embryos by mapping the fluorescent signal from the three-dimensional structure onto a two-dimensional map. Together, the two parts of the protocol allows one to examine the origin and behavior of cells that make up the zebrafish AVC and atrioventricular heart valve, and can potentially be applied for studying mutants, morphants, or embryos that have been treated with reagents that disrupt AVC and/or valve development.

This protocol describes a method for the photoconversion of Kaede fluorescent protein in endocardial cells of the living zebrafish embryo that enables the tracking of endocardial cells during atrioventricular canal and atrioventricular heart valve development.

Seguendo i movimenti del tessuto Endocardial tramite cella fotoconversione nell'embrione di pesce zebra

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

Visualizzare il nodo e la piastra Notochordal In embrioni di topo Gastrulating mediante microscopia elettronica a scansione e intero Monte immunofluorescenza

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...