저자 인정 NIH/NIGMS에서 지원 (HJN에 R01GM084135) 및 Glycoscience (부여 #110071 HJN), 그리고 톰 V. 리 토론 및 분석 실험에 대 한 제안에 대 한 감사에 대 한 미즈타 니 재단과 Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, 로버트 플레밍, 켄 어바인과 플라스 미드를 세포 초파리 게놈 자원 센터 (DGRC)

1. 가짜 최저 두 배 좌초 RNA (dsRNA)의 준비
<ol>
	<li>제품의 PCR 증폭
	<ol>
		<li>야생-타입 옐로우 화이트 (y w) 게놈 DNA와 pAc5.1 EGFP 템플릿과 다음 뇌관 쌍으로 dsRNA 합성에 사용 된 DNA 파편을 증폭을 사용 합니다. 다음 PCR 온도 프로 파일을 사용 하 여: 변성 (95 ° C, 30 s), 어 닐 링 (58 ° C, 30 s) 및 확장 (72 ° C, 1 분). 
		녹색 형광 단백질 강화 (EGFP) dsRNA 뇌관 (5'-3')- 앞으로 뇌관-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG 반전 뇌관-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG 
		Shams dsRNA 뇌관 (5'-3')- 앞으로 뇌관-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT 반전 뇌관-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA 참고: EGFP dsRNA 부정적인 컨트롤로 사용 됩니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>젤-제조 업체의 프로토콜에 따라 상업 젤 정화 키트를 사용 하 여 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 제품을 정화.</li>
	<li>전사 체 외에 상업 제품 제조 업체의 프로토콜에 따라 T7 발기인에서 속기의 능력을 사용 하 여 수행 합니다.</li>
	<li>제조 업체의 프로토콜에 따라 RNA 정화 키트를 사용 하 여 dsRNA를 정화 하 고-80 ° c.에 저장</li>
	<li>다음 단계 (1.5.1-1.5.5)를 사용 하 여 가짜 최저의 효율성을 평가 합니다.
	<ol>
		<li>태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 100 U/mL 페니실린-스 셀 사용 하 여 수동으로 hemocytometer 및 플레이트 5 x 105 s 2 셀에는 6의 각 잘 잘 플레이트 1 mL/슈나이더의 매체의 10% 보충 수.</li>
		<li>각 잘 하 EGFP-또는 shams dsRNA의 7.5 µ g을 추가 하 고 24 시간에 대 한 25 ° C에서 품 어.</li>
		<li>수확 컨트롤 (EGFP dsRNA 치료) 및 25 ° C에서 5 분 동안 1000 x g와 RNA 분리에 따라 RNA 추출 키트를 사용 하 여 프로세스에서 원심 분리에 의해 아래로 산 뒤 부드러운 pipetting으로 shams dsRNA 취급 S2 셀 제조 업체의 프로토콜입니다.</li>
		<li>분 광 광도 계 및 프로세스 100 사용 하 여 RNA를 정량 1 단계 qRT-PCR 상업 정량 시 약 및 뇌관/프로브와 다음 PCR 온도 프로 파일을 사용 하 여에 대 한 RNA의 ng: 변성 (95 ° C, 15 s) 및 소 둔/확장 (60 ° C, 1 분). 참고: 뇌관/프로브 세트와 이러한 연구에서 shams 및 제어 qRT-PCR 실험을 위해 사용 하는 악기에 정보에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.</li>
		<li>2-ΔΔCT 방법16를 사용 하 여 상대 shams mRNA 레벨을 계산 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 평가의 노치 수용 체와 트랜스사이의 바인딩-ligands
<ol>
	<li>신호 수신 셀 (S2 노치 수용 체를 표현)을 준비 합니다.
	<ol>
		<li>hemocytometer를 사용 하 여 수동으로 셀 및 플레이트 5 x 105 S2 및 안정적인 S2-노치 셀에 1 ml에서 6 잘 플레이트/슈나이더의 매체의 잘 각 잘 보충 10 %FBS 및 100 U/mL 페니실린-스. 참고: S2 노치 셀, 초파리 게놈 자원 센터 (DGRC)에서 사용할 수 있는 미디어에 200 nM 토트를 추가 합니다. 0.5 m m 토트 재고 솔루션을 준비 하려면 먼저 1 M NaOH의 250 µ L에 20 mM 토트 솔루션 준비. 다음, 0.5 m m 1 M 인산 염 버퍼 식 염 수에-20 ° c.에가을이 솔루션을 희석 S2-노치 셀에 노치 단백질의 표정은 pMT 벡터에 초파리 metallothionein 발기인의 제어.</li>
		<li>각 잘 하 dsRNA의 7.5 µ g을 추가 하 고 24 시간에 대 한 25 ° C에서 품 어.</li>
		<li>0.7 m m 노치의 표현을 유도 하 여 25 ° C에서 3 일 동안 품 어 CuSO4 를 추가 합니다. 참고: CuSO4 metallothionein 발기인에 의해 제어 하는 단백질의 표정을 유도 하는 데 사용 됩니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>신호를 보내는 셀 (S2 셀 델타 또는 Serrate ligands 표현)을 준비 합니다.
	<ol>
		<li>사용 하 여 수동으로 hemocytometer를 접시 ~ 5 x 106 안정 S2 델타 또는 S2 Serrate톰 셀 1 ml에서 6 잘 플레이트의 각 음에 셀/슈나이더의 매체의 보충 10 %FBS 및 100 U/mL 페니실린-스. 참고: 미디어에 S2-델타 셀 200 nM 토트와 100 µ g/mL hygromycin S2 Serrate톰 셀을 추가 합니다. 델타와 Serrate톰의 표정-Serrate12의 토마토 태그, 기능 버전- pMT 벡터에 초파리 metallothionein 발기인을 받고 있다.</li>
		<li>0.7 m m ligands의 표현을 유도 하는 3 h 25 ° C에서 품 어 CuSO4 를 추가 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>신호 보내기 및 신호 받기 셀 사이의 집계를 수행 합니다.
	<ol>
		<li>DsRNA 취급 S2 수확 (제어)과 부드러운 pipetting 접시 2.5 x 105 셀/잘 hemocytometer에 의해 수동 계산 후 24-잘 접시에에서 의해 S2-노치 셀.</li>
		<li>5 x 105 안정 S2 델타 또는 S2 Serrate톰 셀 슈나이더의 매체의 200 µ L의 전체 볼륨에 추가 (보충 10 %FBS 및 100 U/mL 페니실린-스). 참고: 모든 S2 셀 (를 포함 하 여 도금, 유도 및 dsRNA 처리) 처리는 biosafety 캐비닛 아래 이루어졌다.</li>
		<li>150 rpm (942.48 rad/min)에서 궤도 통에 접시를 놓습니다.</li>
		<li>1 분 후 각의 내용을 혼합 하 고 꺼내 20 µ L의 수를 계산 합니다.<ol>
			<li>10 배 확대 (PLL 10/0.25 목표)를 사용 하 여 거꾸로 화합물 현미경 대표 이미지 걸릴 동시에.</li>
			<li>수동으로 집계를 계산 (&#62; 6 셀)는 hemocytometer를 사용 하 여.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>통에 접시를 놓습니다.</li>
		<li>이미지 수집 및 5 분 후, 15 분 집계의 계산을 반복 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>트랜스의 정량화를 수행-바인딩.
	<ol>
		<li>배경 컨트롤 S2 셀과 S2 델타 또는 S2 Serrate톰 셀 간의 mL 당 집계 수를 계산 합니다.</li>
		<li>S2-노치와 S2-델타 또는 S2 Serrate톰 셀 사이의 mL 당 집계 수를 계산 ( 트랜스의 크기-바인딩).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3입니다.노치와 트랜스간의 바인딩의 저해의 평가- Cis에 의해 ligands-ligands
<ol>
	<li>신호 수신 셀을 준비 합니다.
	<ol>
		<li>플레이트 5 x 105 s 2 셀의 1 mL에는 6-잘 접시/슈나이더의 매체의 잘 각 잘 보충 10 %FBS 및 100 U/mL 페니실린-스.</li>
		<li>각 잘 하 dsRNA의 7.5 µ g을 추가 하 고 24 시간에 대 한 25 ° C에서 품 어.</li>
		<li>공동 transfect dsRNA 치료 셀 pBluescript 및 pMT 노치11 (DGRC) 혼자 또는 pMT 노치 및 pMT 델타11 (DGRC) 또는 pMT Serrate총17 DNA는 2 µ g/잘 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜에 따라 상업 transfection 시 약의 농도. 참고: pBluescript 컨트롤로 사용 됩니다. 공동 transfected 세포 S2-노치 이라고 불릴 것 이다 &#38; 델타과도 또는 S2-노치 &#38; Serrate과도 셀이.</li>
		<li>뚜렷이 페 S2 셀 24 h에 대 한 25 ° c를 품 어.</li>
		<li>0.7 m m 노치와는 ligands의 표현을 유도 하 여 25 ° C에서 3 일 동안 품 어 CuSO4 를 추가 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>2.2에 설명 된 대로 신호를 보내는 셀을 준비 합니다.</li>
	<li>2.3 섹션에 설명 된 대로 신호 보내기 및 신호 받기 셀 사이의 집계를 수행 합니다.</li>
	<li>트랜스의 저해를 계량- cis에 의해 바인딩-ligands.
	<ol>
		<li>배경 컨트롤 S2 셀과 S2 델타 또는 S2 Serrate 셀 간의 mL 당 집계 수를 계산 합니다.</li>
		<li>Cis에 의해 억제의 크기를 정량화-다음과 같이 ligands.<ol>
			<li>S2-노치과도 S2-델타 세포 사이의 집계의 수로 A 를 정의 합니다.</li>
			<li>S2 셀 사이의 집계 수 노치와 델타 정도 공동 페 B 정의 (S2-노치 &#38; 델타과도)와 S2-델타 세포.</li>
			<li>상대 집계 C 계산 = (B x 100) /A</li>
			<li>Cis-ligand (델타 또는 Serrate) 100-의해 억제의 크기를 계산 C. 참고: 한 예로, 상대 집계가 45%, cis-ligands 횡단을 억제 하는 것으로 간주 됩니다-55% 바인딩.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling+regulates+veinlet+expression+and+establishes+boundaries+between+veins+and+interveins+in+the+Drosophila+wing.">Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing.</a> Development. 124 (10), 1919-1928 (1997).</li><li>Fortini, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling:+the+core+pathway+and+its+posttranslational+regulation.">Notch signaling: the core pathway and its posttranslational regulation.</a> Dev Cell. 16 (5), 633-647 (2009).</li><li>del Alamo, D., Rouault, H., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+significance+of+cis-inhibition+in+Notch+signalling.">Mechanism and significance of cis-inhibition in Notch signalling.</a> Curr Biol. 21 (1), R40-R47 (2011).</li><li>Sprinzak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis-interactions+between+Notch+and+Delta+generate+mutually+exclusive+signalling+states.">Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalling states.</a> Nature. 465 (7294), 86-90 (2010).</li><li>Kopan, R., Ilagan, M. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interactions+between+the+protein+products+of+the+neurogenic+loci+Notch+and+Delta,+two+EGF-homologous+genes+in+Drosophila.">Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila.</a> Cell. 61 (3), 523-534 (1990).</li><li>Fleming, R. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Okajima, T., Xu, A., Irvine, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+notch-ligand+binding+by+protein+O-fucosyltransferase+1+and+fringe.">Modulation of notch-ligand binding by protein O-fucosyltransferase 1 and fringe.</a> J Biol Chem. 278 (43), 42340-42345 (2003).</li><li>Acar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rumi+is+a+CAP10+domain+glycosyltransferase+that+modifies+Notch+and+is+required+for+Notch+signaling.">Rumi is a CAP10 domain glycosyltransferase that modifies Notch and is required for Notch signaling.</a> Cell. 132 (2), 247-258 (2008).</li><li>Bruckner, K., Perez, L., Clausen, H., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosyltransferase+activity+of+Fringe+modulates+Notch-Delta+interactions.">Glycosyltransferase activity of Fringe modulates Notch-Delta interactions.</a> Nature. 406 (6794), 411-415 (2000).</li><li>Yamamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutation+in+EGF+repeat-8+of+Notch+discriminates+between+Serrate/Jagged+and+Delta+family+ligands.">A mutation in EGF repeat-8 of Notch discriminates between Serrate/Jagged and Delta family ligands.</a> Science. 338 (6111), 1229-1232 (2012).</li></ol>

저자는 전혀 충돌의 관심이 없다.

정식 노치 신호 노치 수용 체와 ligands5간의 상호 작용에 따라 달라 집니다. 노치 통로에 대부분의 연구는 주로 노치와 인접 셀 (트랜스)에 ligands의 바인딩은 고려, 하지만 노치와 같은 셀 ligands 할 상호 작용, 그리고 이러한 소위 cis-상호 작용 단계에서 억제 역할을 재생할 수 있습니다 신호3,4. 따라서, 정식 노치 신호에 한정자의 영향을 기본 메커니즘을 해독, 그것은 종종 두 종류 (트랜스 와 cis) 노치 ligand 상호 작용의 검사 관련. 그러나, 동물 개발 하는 동안 많은 컨텍스트에서 이러한 상호 작용 및 그들의 피드-다시 규제의 둘 다의 참여는 vivo에서 연구1,6복잡. 현재 프로토콜에서 우리는 생체 외에서 셀 집계 분석 초파리 S2 세포를 사용 하 여 트랜스ligands 및 cis에 의해 그것의 억제와 노치 수용 체의 바인딩을 평가 대 한 상세한 방법론을 제공 ligands입니다. 우리는 (xylosyltransferase Shams7,8)에 수용 체 ligand 바인딩 신호 노치의 유전 한정자의 효과 평가 하기 위해이 방법론의 활용을 제시 했습니다.
첫째, 집계 분석 트랜스에 shams KD의 효과 검사 안정적인 S2-델타 EGFP 또는 shams dsRNA 치료 안정 S2-노치 셀 사이 수행한-바인딩. S2-델타 shams dsRNA 취급 일반 S2 셀과 셀의 배경 제어로 찍은. Shams KD S2-노치와 제어에 비해 S2-델타 세포 사이의 집계를 향상. 트랜스에 병렬로 일반 S2 셀과 리간드 들고 S2 셀 간의 배경 실험 제어 집계를 수행 하는 것이 중요 하다-실험 바인딩. 내 생 노치 수용 체 및 델타 리간드11 초파리 S2 세포 표현 하지 않습니다, 비록 Serrate의 낮은 레벨의 표현 S2 셀13에 보고 됩니다. 고려, 일반 S2 셀 배경 제어; 셀 집계 분석 실험에서 사용 되었다 이 세포는 어떤 집계 (그림 5B)를 보여주지 않았다. 집계는 hemocytometer를 사용 하 여 수동으로 계산 됩니다. 집계 정량화에 일관성을 보장 하기 위해, 혼합된 세포 인구의 10-20 µ L 잘 계산 당 적어도 3 개의 다른 지역에서 밖으로 pipetted 수 있습니다. 이 분석 실험 건강 한 성장 S2 셀 필요합니다. S2의 반 부착 성격을 고려 셀, 셀을 수집 하는 동안 pipetting 부드러운 고 집계 분석 결과 동안 떨고 상수는 중요 한.
이전에 우리와 다른 사용 잘 설립, 수용 성 리간드-수용 체 바인딩 분석 트랜스17,,1819, 수용 체 ligand 바인딩의 양적 평가 대 한 20. 성 ligand 바인딩 분석 노치 ligand 트랜스에 shams KD의 효과 검사 하도 수행한 집계 분석 실험 반 정량적 이기 때문에,-바인딩. 관찰된 결과 집계 분석 실험8에서 얻은 그 추세에서 유사 했다. 이 트랜스와 노치의 바인딩의 충실 한 평가 인증-ligands 셀 집계 분석 실험을 사용 하 여. 집계 형성은 수용 체 ligand 바인딩의 판독, 노치 수용 체 또는 그것의 ligands의 표면 식 주어진된 한정자에 의해 영향을 받는 경우 복잡 한 수 있습니다. 이것으로 집계 형성에 변경 변경된 수용 체 ligand 바인딩 때문에 또는 표면 식 변경 경우 고유 수 없습니다 셀 집계 분석의 한계를 강조 한다. 따라서, 집계 분석을 병렬, 노치와 ligands의 표면 식 각 한정자의 효과 필요 S2 세포에서 테스트 합니다. 우리의 연구의 맥락에서 노치와 델타의 표면 레벨 shams dsRNA 취급 S2 셀8에 영향을 받지 했다.
트랜스의 억제 검사- cis의 추가 의해 바인딩-ligands, 집계 분석 실험 S2-델타 세포와 EGFP 또는 가짜 사이 수행 된 dsRNA 취급 S2-노치 &#38; 델타과도 셀 . 이 세포 사이 형성 하는 집계 수는 S2-델타 세포와 S2-노치과도 세포 사이 형성 하는 집계 수와 비교 되었다. 수 집계의 상대적 감소 계산 되었고 cis에 의해 억제의 크기에 대 한 지표로 서 사용-델타. 제어 실험 보여주었다는 cis-ligands 노치의 강력 하 고 복용량 의존 금지 표시 /트랜스- cis에 노치의 다소 넓은 범위 동안 델타 바인딩-ligand 비율 (1:1 1:0. 1) (그림 5A)8 . Cis의 강한 정도 귀착되 었 다 1:1 비율-억제, 및 cis의 상대적 수준 감소-델타 cis약화-억제. 따라서, 비율의이 범위 KD 실험 수행 되었다. 메모의 노치 수용 체의 양과 transfected DNA의 총 금액은 모든 실험에서 일정 유지 되었다. 이렇게 하면 집계 형성 주로 cis의 활동에 의해 영향을-ligands 노치 식 세포의 수준에 의해 변경 되지.
그것은 이전 노치와 cis의 공동 식 표시 했다-S2 셀에 ligands homotypic 집계14의 형성에 발생할 수 있습니다. 유사 여부를 검사 하 S2-노치 사이 homotypic 집계 &#38; 델타과도 또는 S2-노치 &#38; Serrate과도 셀 cis에서집계 quantifications의 우리의 해석을 손상 시킬 수 있습니다-리간드 연구, S2-노치 사이 제어 집계 분석 결과 수행한 &#38; 델타과도 및 일반 S2 셀. S2 셀이이 실험에 사용 된 수는 cis에서사용 S2-델타 세포와 동일-델타 실험. 일부 homotypic 집계 관찰 되었다, 하지만 정량화 결과 집계 S2-노치 사이 heterotypic 집계에 비해 총 집계의 낮은 분수 기여 &#38; 델타과도 S2-델타 세포 ( 그림 5B)입니다.우리가 변화 cis에서의 수에서 관찰 된 결론- cis의 억제 효과 주로 ligand 분석 실험-노치와 트랜스간의 바인딩에 ligands-델타.
요약, 집계 분석 실험이이 프로토콜에 트랜스-와 cis의 반 정량적 평가 위한 쉽고 간단한 방법론을 제공-노치 수용 체 및 그것의 ligands의 상호 작용. 이 분석 실험에 노치 ligand 바인딩에서 생체 외에서 유전자 또는 약리학 노치 통로 한정자의 효과 검사 하는 데 사용할 수 있습니다 및 따라서 vivo에 효과 이러한 한정자의 계급에 기본 메커니즘을 명료 하 게 도움이 될 수 있습니다. 신호.

정식 노치 신호 노치 수용 체와 그들의 ligands1간의 상호 작용을 촉진 하기 위하여 세포를 이웃의 육체적 인 접촉을 필요로 하는 단거리에 셀 통신 메커니즘입니다. Ligands와 노치 수용 체 (신호 수신 세포의 표면에 존재 하는)의 상호 작용 (신호 전송의 표면에 세포) 노치 신호를 시작 하 고 트랜스로 알려져 있다-활성화2. 다른 한편으로, 노치와 동일한 셀에 있는 그것의 ligands 사이 상호 작용 노치 통로의 억제를 지도 하 고 cis로 알려져 있다-금지3. 트랜스-와 cis사이의 균형-상호 작용 최적의 ligand 의존 노치4신호를 확인 하는 데 필요한. 초파리 는 포유류, 4 개의 노치 수용 체 있고 5 개의 ligands에 반대 한 노치 수용 체 및 두 ligands (델타와 Serrate) [가변 1 (JAG1), JAG2, 델타 같은 1 (DLL1), DLL3 및 DLL4]5. 이 단순 데, 초파리 모델 부드럽게 해 부 연구 노치 ligand 상호 작용 및 이후에 노치 신호 통로 한정자의 효과를 제공 합니다. ( 초파리날개 개발 포함), 동물 개발 하는 동안 특정 상황에서 cis-및 트랜스-상호 적절 한 노치 신호를 달성 하기 위해 운명1,6 셀 관련 . 시스- 트랜스대에 이러한 상황에서 노치 통로 한정자의 효과 구별 하는 것이 중요 하다-그것의 ligands와 노치의 상호 작용.
우리의 그룹은 이전 부정적인 초파리 노치를 xylose 라는 탄수화물 잔류물의 날개 개발7을 포함 한 특정 컨텍스트에서 노치 신호 조절 보고. Shams 의 손실 (효소는 xylosylates 노치) "날개 정 맥의 손실" 형7리드. 최근에, 유전자 복용량 실험 및 클론 분석 shams 의 손실 델타 중재 노치 내 서 향상을 보여 사용 되었다. Shams 돌연변이에 향상 된 노치 신호는 감소 cis의 결과 여부를 구별 하는 것-금지 또는 증가 트랜스-활성화, 애벌레 윙 imaginal 디스크에 노치 ligands의 소성 overexpression 학문 민 진 당-GAL4 드라이버를 사용 하 여 수행 했다. Shams 트랜스규제를 제안 하는 증거를 제공 하는이 실험-노치 cis를 영향을 주지 않고 델타에 의해 노치의 활성화-ligands8에 의해 저해. 그러나, 피드-다시 규정 그리고 내 인 성 ligands의 효과 소성 overexpression 학문1,,69의 해석 복잡 하 게 만들 수 있습니다.
10 사용 되었다 초파리 S2 세포가이 문제를 해결 하려면는 노치 ligand 상호 작용 연구11,12간단한 체 외에 시스템을 제공 합니다. S2 셀 하지 생 노치 수용 체 델타 리간드11 을 표현 하 고 표현 Serrate13, 노치 ligand 집계 실험8에 영향을 주지 않는 낮은 수준. 따라서, S2 셀 수 수 안정적으로 또는 정도 페 노치 또는 개별 ligands 델타 (Serrate) 독점적으로 노치 수용 체 또는 그것의 ligands의 하나를 표현 하는 세포를 생성 하 또는 그들의 조합에 의해. Heterotypic 수용 체 ligand 바인딩11,,1214중재의 형성에 S2 셀 결과 ligand 표현 S2 노치 표현 세포의 혼합. 트랜스의 측정을 제공 하는 집계 형성의 정량화-노치와 그것의 ligands15 (그림 1) 사이의 바인딩. 마찬가지로, S2 셀 노치와 델타 또는 Serrate ligands와 공동 transfected 수 (즉, cis-ligands). Cis-S2 노치 표현 세포에 ligands 파기 트랜스와 노치의 바인딩-ligands 및 결과에 집계 형성8,,1214감소. Cis에 의해 발생 하는 집계 형성의 상대적 감소- cis의 억제 효과의 측정을 제공 하는 ligands-노치와 트랜스간의 바인딩에 ligands-ligands (그림 2). 따라서, 셀 집계 분석 트랜스-와 cis에 xylosylation의 손실의 영향을 검토 하 활용 했다-노치와 그것의 ligands 사이 상호 작용.
여기, 선물이 상세한 프로토콜 트랜스와 노치의 바인딩을 평가를 겨냥 한 셀 집계 분석 실험-ligands 및 cis에 의해 그것의 억제-ligands 초파리 S2 세포를 사용 하 여. 예를 들어, 제공 하는 데이터 바인딩 노치와 트랜스사이 노치 xylosylation의 효과 결정 하는-델타8. 이러한 간단 분석 노치 ligand 상호 작용에서 생체 외에서 의 반 정량적 평가 제공 하 고 기본 노치 통로 한정자의 비보에 효과 분자 메커니즘을 결정 하는 데 도움이.

<table><tbody><tr><td>BioWhittaker Schneider&amp;rsquo;s Drosophila medium, Modified</td><td>Lonza</td><td>04-351Q</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution</td><td>GE Healthcare lifescience&amp;nbsp;</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 6 well plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657 160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 24 well plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>VWR mini shaker</td><td>Marshell Sceintific</td><td>12520-956</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Fisher Sceintific&amp;nbsp;</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE HD Transfection Reagent</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscrip T7 Transcription Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit)</td><td>Zymo Research</td><td>R1054</td><td></td></tr><tr><td>VistaVision Inverted microscope</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software</td><td>AmScope</td><td>MU-900</td><td>Image acquisition using ToupView software</td></tr><tr><td>PureLink Quick Gel Extraction Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K210012</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>GenDepot</td><td>F0600-050</td><td></td></tr><tr><td>Methotrexate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6770-10</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Invitrogen</td><td>HY068-L6</td><td></td></tr><tr><td>Copper sulphate</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>4448-02</td><td></td></tr><tr><td>S2 cells</td><td>Invitrogen</td><td>R69007</td><td></td></tr><tr><td>S2-Serrate&lt;sup&gt;Tom &lt;/sup&gt;cells</td><td></td><td></td><td>Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013)</td></tr><tr><td>S2-Delta cells</td><td>DGRC</td><td>152</td><td></td></tr><tr><td>S2-Notch cells</td><td>DGRC</td><td>154</td><td></td></tr><tr><td>pMT-Delta vector</td><td>DGRC</td><td>1021</td><td>Gift from S. Artavanis-Tsakonas</td></tr><tr><td>pMT-Serrate vector</td><td></td><td></td><td>Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003)</td></tr><tr><td>pMT-Notch vector</td><td>DGRC</td><td>1022</td><td>Gift from S. Artavanis-Tsakonas</td></tr><tr><td>pAc5.1-EGFP</td><td></td><td></td><td>Gift from Hugo Bellen</td></tr><tr><td>TaqMan RNA-to-Ct 1-&lt;em&gt;Step&lt;/em&gt; Kit</td><td>Applied Biosystem</td><td>1611091</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams)</td><td>Applied Biosystem</td><td>Dm02144576_g1&amp;nbsp;</td><td>with FAM-MGB dye</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32)</td><td>Applied Biosystem</td><td>Dm02151827_g1</td><td>with FAM-MGB dye</td></tr><tr><td>Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system</td><td>Applied Biosystem</td><td>4351405</td><td>96-well Block module</td></tr></tbody></table>

cell aggregation assays to evaluate the binding of the drosophila notch with trans-ligands and its inhibition by cis-ligands

노치 신호 동물 개발 및 성인 유지 관리에 광범위 하 게 사용 되는 진화론 보존된 셀 통신 시스템입니다. 신호 통로의 활성화를 유도 하는 이웃 세포에서 ligands와 노치 수용 체의 상호 작용 (트랜스-활성화) 신호를 억제 하는 ligands는 동일한 세포에서와 상호 작용 하는 동안, (cis-억제). 트랜스사이의 적절 한 균형-활성화 및 cis-억제 노치 동물 개발 하는 동안 일부 컨텍스트에서 신호의 최적 수준을 확립 도움이 됩니다. 노치와 많은 세포 유형에의 ligands의 겹치는 식 도메인 및 피드백 메커니즘의 존재, 트랜스- cis대에 주어진된 포스트 번역 상 수정의 효과 공부-노치의 상호 작용 및 그것의 ligands에서 비보에 어렵습니다. 여기, 우리 노치의 트랜스 와 cis각 ligand 바인딩에 노치 통로 한정자 노크의 효과 평가 하기 위해 셀 집계 분석 실험에서 초파리 S2 세포를 사용 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. S2 셀 안정적으로 또는 정도 페 노치 표현 벡터와 각 노치 ligand (S2-델타 또는 S2 Serrate)를 표현 하는 세포와 혼합 됩니다. 트랜스-수용 체와 ligands 간의 바인딩을 heterotypic 셀의 형성 귀착되 고 mL의 구성 당 집계 수 측정 된다 &#62; 6 셀. Cis의 억제 효과 검토-ligands, S2 셀 공동 노치와 각 ligand를 표현 S2 델타 또는 S2 Serrate 세포 혼합 및 위에서 설명한 대로 집계의 수 정량은. Cis의 존재로 인해 집계 수의 상대적 감소- cis의 측정을 제공 하는 ligands-ligand- 트랜스의 저해를 중재-바인딩. 이러한 간단 분석 실험 유전 또는 약리학 바인딩에 노치의에 조작의 ligands의 효과에 반 양적 데이터를 제공할 수 있습니다 그리고 vivo에서 효과의 기본 분자 메커니즘을 파악 하는 것을 도울 수 있다 노치 신호에 같은 조작.

우리의 vivo에서 관측 제안는 노치 신호 때문에 이득에 xylosyltransferase 유전자 shams 결과의 손실 증가 델타 중재 트랜스- cis를 영향을 주지 않고 노치의 활성화-의 저해 노치 ligands8. 이 테스트 하려면 셀 집계 분석 생체 외에서 수행 했다. 첫째, shams 식 S2 셀에는 뜨 shams dsRNA를 사용 하 여. EGFP dsRNA 제어로 사용 되었다. 최저 (KD)의 실시간 PCR에 의해 시험 되었다 그리고 808보다 큰 수를 표시 했다. 그런 다음 트랜스와 노치 수용 체의 바인딩을-shams KD 집계 분석 실험을 사용 하 여 조사 되었다 시 델타. S2-노치와 S2-델타 세포 사이 집계는 그들을 혼합 후 여러 시간 지점에서 시험 되었다. 일반 S2 셀과 S2-델타 세포 간의 집계 배경 제어로 찍은. 그림 3 쇼의 수를 나타내는 그래프에서 다른 형성 혼합 후 포인트 (1, 5, 15, 30 분) 시간. 날카로운 증가 계속 느린 속도로 30 분까지 증가 하는 집계 수 사이 1 그리고 5 분 후, 집계 수가 관찰 되었다. 따라서, 집계 형성은 1, 5, 15 분에 몇 군데와 혼합의 5 분 후의 수 정량 했다.
그림 4A 에 노치 수용 체와 트랜스간의 바인딩을 shams KD의 효과 평가 하기 위해 안정적인 S2-노치와 S2-델타 셀 사이의 집계 분석 셀의 대표 이미지를 보여줍니다-델타. 이미지는 3 시간 포인트 (1, 5, 15 분)에서 집계를 표시합니다. 배경 컨트롤에 대 한 일반 S2 셀 ( shams dsRNA와 대우) S2-델타 세포와 혼합 했다. EGFP dsRNA 취급 S2-노치 셀 집계 시간 수가 증가 S2-델타 세포 형성. 반면, shams dsRNA 취급 S2-노치 셀, 집계 형성 하 고 크고 수 컨트롤 것 들 보다 (그림 4B)에서 더 큰 집계 했다. 이 트랜스향상 Shams 수준 감소 표시-델타8노치의 바인딩.
검사 여부 Shams 조절 cis의 억제 효과-노치와 트랜스간의 바인딩에 ligands-델타, 우리가 먼저 설립 노치와 델타의 공동 식 신호 수신에 셀 셀 집계를 줄일 수 있다 노치와 트랜스에 의해 중재-델타. 그림 5A S2-델타와 S2-노치 사이 형성 하는 집계 수를 나타내는 그래프를 보여준다 &#38; 다른 양의 cis델타과도 셀-델타. S2 셀에 같은 양의 노치 및 델타 식 구조를 극적으로 transfecting 사이 이러한 셀 및 S2-델타 세포 형성의 수 감소. 또한, cis의 양을 감소-델타 홈의 범위를 나타내는 집계의 증가에서 결과 /cis-델타 비율 이러한 분석 실험, cis에 사용-델타 노치 사이 바인딩을 억제할 수 있는 고 트랜스-델타는 복용량-의존 방식에서. S2-노치 이후 &#38; 델타과도 셀 노치와 델타 익스프레스, S2-델타 세포 별도로 homotypic 집계 형성 수 있습니다. Homotypic 형성 S2-노치 사이에서 집계 하는 경우 검사 &#38; 델타과도 셀 cis혼동 요인일 수 있다-금지 분석 실험 에서처럼 그림 5A, 우리 s 2 세포와이 세포를 혼합 하 고 정량은 집계합니다. S2-노치 S2 셀 혼합 후 형성 하는 집계 수를 표시 하는 그림 5B &#38; 델타과도 셀 다양 한 노치 표현 /cis-델타 비율. 그림 5A 와 같이 heterotypic 집계에 비해 homotypic 집계의 오히려 작은 수 관찰 되었다. 우리는 이러한 집계 분석 충실 하 게 cis의 효과 측정 하는 결론-바인딩 노치와 트랜스사이 델타-델타.
우리는 다음 shams KD cis의 억제 능력의 효과 검사-델타. 이 끝, S2-델타와 S2-노치 사이 집계 &#38; 델타과도 셀 시험 되었다. 그림 6A S2-델타 세포와 S2-노치과도 (제어) 또는 S2-노치 사이 집단의 대표 이미지를 보여주는 &#38; 델타과도 셀. S2-델타와 EGFP dsRNA 취급 S2-노치과도 셀 집계, 시간, S2-델타와 안정적인 S2-노치 셀 (그림 4) 사이의 집계를 비슷한 숫자의 증가 형성. 특히, S2-델타와 S2-노치 혼합 &#38; 델타과도 셀 노치 및 델타 식 플라스 미드의 동등한 양의 페 공동 형성 EGFP KD와 shams KD, 감소 하는 그 제안에 따라 덜 집계 Shams의 수준 cis의 기능에 영향을 주지 않습니다-노치를 차단 하는 델타 /트랜스-델타 바인딩. 더 나은 shams KD 활동에 cis의 효과 평가 하기 위해-델타, cis에 의해 억제의 크기-델타 노치의 범위를 통해 상대 집계 비율을 계산 하 여 측정 되었다 /cis-델타 3.4.2 섹션에 설명 된 대로 비율입니다. 상대 집단의 정량화 EGFP 그리고 shams dsRNA 치료 (그림 6B) 시 집계의 유사한 금지를 보여주었다. 함께, 이러한 관찰이 좋습니다 xylosylation의 손실 트랜스촉진- cis를 영향을 주지 않고 바인딩-억제8, shams 관찰 날개 정 맥 손실 형에 대 한 분자 메커니즘을 제공 하 고 돌연변이.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56919/56919fig1.jpg"> 
그림 1: 트랜스에 대 한 셀 집계 분석 결과의 도식 표현-바인딩. 0.7 m m CuSO4(S2-델타 또는 S2 Serrate) 표현 S2 세포 수용 체 (S2-노치)와 리간드의 유도 보여주는 다이어그램. 두 s 2 세포의 유도 집계 하는 경향이,에 선행 된다. 이러한 집계 (&#62; 6 셀) 몇 군데 고 정량.<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56919/56919fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56919/56919fig2.jpg"> 
그림 2: Cis를 평가 하기 위해 셀 집계 분석 결과의 도식 표현-억제. S2 셀 pMT 노치 (S2-N과도), pMT 노치 와 pMT 델타 페 정도 되었다 (S2-노치 &#38; 델타과도), 또는 pMT 노치 및 pMT Serrate (S2-노치 &#38; Serrate과도)입니다. 0.7 m m CuSO4 와 S2-델타 세포와 혼합 하 여 유도, 후 집계 (&#62; 6 셀)는 계량. Cis에 의해 억제-ligands 존재 및 각 cis의 부재에 상대 집계 백분율의 점에서 측정 된다-ligand. Cis의 효과-노치와 트랜스간의 바인딩에 ligands-Serrate S2 Serrate톰 셀 (표시 되지 않음)으로 뚜렷이 transfected 세포를 혼합 하 여 확인할 수 있습니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56919/56919fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56919/56919fig3.jpg"> 
그림 3: S2-노치와 S2 또는 다른 시간 지점에서 S2-델타 세포 사이 집계. 그래프는 다른 시간 포인트 (1, 5, 15, 30 분) 셀의 표시 형식 사이 mL 당 집계 수를 보여 줍니다. 오차 막대는 3 개의 복제의 의미 (SEM)의 표준 오차를 나타냅니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56919/56919fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56919/56919fig4.jpg"> 
그림 4: 셀 집계 노치와 트랜스에 의해 중재-델타. (A) 이미지 다른 시간 포인트 (1, 5, 15 분)에서 집계를 표시. Shams dsRNA 취급 일반 S2 셀과 S2-델타 세포 간의 집계 배경 제어로 찍은. Shams-dsRNA 취급 S2-노치 세포 수에서 증가 보여와 S2-델타 세포와 혼합 후 S2-노치 셀 EGFP dsRNA 처리 (제어)에 비해 집계의 크기. 눈금 막대 = 100 µ m. 세포의 수의 (B) 부 량 집계 6 셀 보다 큰 집단의 5 분 후. 오차 막대 표시 SEM. * P &#60; 0.01 (단방향 분산 분석 (ANOVA)). 3 개의 독립적인 반복 된 3 개의 복제를 수행 했다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56919/56919fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56919/56919fig5.jpg"> 
그림 5: Cis-델타는 셀 집계 형성에 의해 중재 노치와 트랜스억제-델타는 복용량-의존 방식에서. (A) 그래프로 S2-델타 세포와 s 2 셀 정도 페 식 벡터의 다른 비율으로 노치와 cis에 대 한 조건 (집계/mL의 수) 집계-델타 (1:0, 1:1, 1:0. 5, 1:0.2 및 1:0. 1). 오차 막대 표시 SEM. * P &#60; 0.01 (단방향 ANOVA). 3 개의 독립적인 반복 된 3 개의 복제를 수행 했다. 참고는 cis의 수준을 감소-델타 결과 집계, 감소 cis인해 가능성이 증가-억제. (B) 그래프 정도 S2 셀에 조건 (mL 당 집계 수) homotypic 집계를 보여주는 노치와 델타 (1:0, 1:1, 1:0. 5, 1:0.2 및 1:0. 1)의 다른 비율으로 페와 일반 S2 세포와 혼합. 오차 막대 표시 SEM. 수 집계의 S2-델타와 S2-노치 사이 형성 heterotypic의 수보다 훨씬 작습니다 &#38; 델타과도 셀. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56919/56919fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56919/56919fig6.jpg"> 
그림 6: 최저 shams 의 영향을 주지 않습니다 cis의 금지 활동-델타. (A) 표시는 cis에 shams KD의 효과의 대표적인 이미지-델타-중재 하는 노치에 의해 중재 하는 세포 집단의 금지 /트랜스-델타 바인딩. 이미지는 다른 시간 포인트 (1, 5, 15 분)에서 집계를 표시합니다. Shams dsRNA 취급 일반 S2 셀과 S2-델타 세포 간의 집계 배경 제어로 찍은. 안정적으로 페 비슷합니다 S2-노치 셀, shams KD S2-델타와 제어 (EGFP dsRNA 취급)에 비해 S2-노치과도 셀의 수를 증가. Cis의 공동 식-1:1 비율로 노치 델타 결과 집계 컨트롤 (EGFP dsRNA 처리)에서 수에 비해 감소 뿐만 shams 취급 dsRNA 세포에서. 눈금 막대 = 100 µ m. (B) 그래프로 S2-델타 셀과 뚜렷이 표시 비율 (1:0, 1:1, 1:0. 5, 1:0.2 및 1:0. 1) 노치와 cis의 페 공동 S2 셀 간의 상대 집계-델타. EGFP 그리고 shams dsRNA 치료 각 노치에 집계에 비해 감소 표시 /cis-델타 비율. 여기에 제시 된 데이터는 3 개의 독립적인 실험의 대표. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56919/56919fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Vivo에서 시스템의 복잡성 트랜스-와 cis에 의해 활성화 노치 수용 체의 억제 사이 구별 하 게 어려운 게-ligands, 각각. 여기, 우리가 시험관에서 셀 집계 분석 실험의 트랜스를 초파리 노치의 바인딩 질적 및 반 정량적 평가 위한 기반 프로토콜 제시-ligands 대 cis-ligands.

트랜스와 초파리 노치의 바인딩을 평가를 집계 분석 셀-Ligands 및 Cis에 의해 그것의 억제-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

cell-aggregation-assays-to-evaluate-binding-drosophila-notch-with

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

7.5K 조회수.  Baylor College of Medicine. Vivo에서 시스템의 복잡성 트랜스-와 cis에 의해 활성화 노치 수용 체의 억제 사이 구별 하 게 어려운 게-ligands, 각각. 여기, 우리가 시험관에서 셀 집계 분석 실험의 트랜스를 초파리 노치의 바인딩 질적 및 반 정량적 평가 위한 기반 프로토콜 제시-ligands 대 cis-ligands.

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Integration of Bioinformatics Approaches and Experimental Validations to Understand the Role of Notch Signaling in Ovarian Cancer

Notch signaling is a highly conserved regulatory pathway involved in many cellular processes. Dysregulation of this signaling pathway often leads to interference with proper development and may even result in initiation or progression of cancers in certain cases. Because this pathway serves complex and versatile functions, it can be studied extensively through many different approaches. Of these, bioinformatics provides an undeniably cost-efficient, approachable, and user-friendly method of study. Bioinformatics is a useful way to extract smaller pieces of information from large-scale datasets. Through the implementation of various bioinformatics approaches, researchers can quickly, reliably, and efficiently interpret these large datasets, yielding insightful applications and scientific discoveries. Here, a protocol is presented for integration of bioinformatics approaches to investigate the role of Notch signaling in ovarian cancer. Furthermore, bioinformatics findings are validated through experimentation.

Bioinformatics is a useful way to process large-scale datasets. Through the implementation of bioinformatics approaches, researchers can quickly, reliably, and efficiently obtain insightful applications and scientific discoveries. This article demonstrates the utilization of bioinformatics in ovarian cancer research. It also successfully validates bioinformatics findings through experimentation.

난소암에서 노치 신호의 역할을 이해하기 위한 생물정보학 접근법 및 실험 검증의 통합

Notch signaling is a highly conserved regulatory pathway involved in many cellular processes. Dysregulation of this signaling pathway often leads to ...

연구

암 연구학

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted epithelial morphogen. In this assay, Fog is used as an agonist to activate Rho through a signaling cascade that includes a G-protein-coupled receptor (Mist), a G&#945;12/13 protein (Concertina/Cta), and a PDZ-domain-containing guanine nucleotide exchange factor (RhoGEF2). Fog signaling results in the rapid and dramatic reorganization of the actin cytoskeleton to form a contractile purse string. Soluble Fog is collected from a stable cell line and applied ectopically to S2R+ cells, leading to morphological changes like apical constriction, a process observed during developmental processes such as gastrulation. This assay is amenable to high-throughput screening and, using RNAi, can facilitate the identification of additional genes involved in this pathway.

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

Here we describe a contractility assay using Drosophila S2R+ cells. The application of an exogenous ligand, folded gastrulation (Fog), leads to the activation of the Fog signaling pathway and cellular contractility. This assay can be used to investigate the regulation of cellular contractility proteins in the Fog signaling pathway.

조사 비 근육 Myosin II 수축 통해 접혀 gastrulation 신호 전달 경로 초파리 S2R + 셀에 셀 기반 분석 결과

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted ...

발생학

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

라이브 해부 Drosophila 태아 : 항체 스테 이닝에 의해 돌연변이 컬렉션을 검사 늘씬한 방법

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

생물학

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates how Proximity Ligation Assay can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval neuromuscular junction. With this technique, Discs large and Hu-li tai shao are shown to form a complex at the postsynaptic region, an association previously identified through co-immunoprecipitation.

검출<em&gt; 현장에서</em상기&gt; 단백질 - 단백질 복합체<em&gt; 초파리</em근접 내고 분석을 사용하기&gt; 애벌레 신경 근육 접합부

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

신경과학

Antibody-Mediated Live Imaging을 통한 단백질 시각화 향상

Visualizing Low-Abundance Proteins and Post-Translational Modifications in Living Drosophila Embryos via Fluorescent Antibody Injection

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein localization, dynamics, and function. Compared to immunofluorescence, live imaging more accurately reflects protein localization without potential artifacts arising from tissue fixation. Importantly, live imaging enables quantitative and temporal characterization of protein levels and localization, crucial for understanding dynamic biological processes such as cell movement or division. However, a major limitation of fluorescent tagging approaches is the need for sufficiently high protein expression levels to achieve successful visualization. Consequently, many endogenously tagged fluorescent proteins with relatively low expression levels cannot be detected. On the other hand, ectopic expression using viral promoters can sometimes lead to protein mislocalization or functional alterations in physiological contexts. To address these limitations, an approach is presented that utilizes highly sensitive antibody-mediated protein detection in living embryos, essentially performing immunofluorescence without the need for tissue fixation. As proof of principle, endogenously GFP-tagged Notch receptor that is barely detectable&#160;in living embryos can be successfully visualized after antibody injection. Furthermore, this approach was adapted to visualize post-translational modifications (PTMs) in living embryos, allowing the detection of temporal changes in tyrosine phosphorylation patterns during early embryogenesis and revealing a novel subpopulation of phosphotyrosine (p-Tyr) underneath apical membranes. This approach can be modified to accommodate other protein-specific, tag-specific, or PTM-specific antibodies and should be compatible with other injection-amenable model organisms or cell lines. This protocol opens new possibilities for live imaging of low-abundance proteins or PTMs that were previously challenging to detect using traditional fluorescent tagging methods.

저자 스포트라이트: Unveiling the Dynamics of Mechanical and Biochemical Signals in Animal Morphogenesis Research (동물 형태 형성 연구에서 기계적 및 생화학적 신호의 역학 공개) 

This protocol describes the customized antibody-based fluorescence labeling and injection into early Drosophila embryos to enable live imaging of low-abundance proteins or post-translational modifications that are challenging to detect using traditional GFP/mCherry-tag approaches.

형광 항체 주입을 통한 살아있는 초파리 배아의 저농도 단백질 및 번역 후 변형 시각화

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein ...

Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System

Protein interactions at cellular interfaces dictate a multitude of biological outcomes ranging from tissue development and cancer progression to synapse formation and maintenance. Many of these fundamental interactions occur in trans and are typically induced by heterophilic or homophilic interactions between cells expressing membrane anchored binding pairs. Elucidating how disease relevant mutations disrupt these fundamental protein interactions can provide insight into a myriad of cell biology fields. Many protein-protein interaction assays do not typically disambiguate between cis and trans interactions, which potentially leads to an overestimation of the extent of binding that is occurring in vivo and involve labor intensive purification of protein and/or specialized monitoring equipment. Here, we present an optimized simple protocol that allows for the observation and quantification of only trans interactions without the need for lengthy protein purifications or specialized equipment. The HEK cell aggregation assay involves the mixing of two independent populations of HEK cells, each expressing membrane-bound cognate ligands. After a short incubation period, samples are imaged and the resulting aggregates are quantified.

Here, we present an optimized protocol to rapidly and semiquantitatively measure ligand-receptor interactions in trans in a heterologous cell system using fluorescence microscopy.

이종 세포 시스템에서 단백질 응집을 통한 세포 간 상호 작용 측정

Protein interactions at cellular interfaces dictate a multitude of biological outcomes ranging from tissue development and cancer progression to synapse ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs). The onset of a reverse pharmacology assay is the cloning and subsequent transfection of a GPCR of interest in a cellular expression system. The heterologous expressed receptor is then challenged with a compound library of candidate ligands to identify the receptor-activating ligand(s). Receptor activation can be assessed by measuring changes in concentration of second messenger reporter molecules, like calcium or cAMP. The fluorescence-based calcium mobilization assay described here is a frequently used medium-throughput reverse pharmacology assay. The orphan GPCR is transiently expressed in human embryonic kidney 293T (HEK293T) cells and a promiscuous G&#945;16 construct is co-transfected. Following ligand binding, activation of the G&#945;16 subunit induces the release of calcium from the endoplasmic reticulum. Prior to ligand screening, the receptor-expressing cells are loaded with a fluorescent calcium indicator, Fluo-4 acetoxymethyl. The fluorescent signal of Fluo-4 is negligible in cells under resting conditions, but can be amplified more than a 100-fold upon the interaction with calcium ions that are released after receptor activation. The described technique does not require the time-consuming establishment of stably transfected cell lines in which the transfected genetic material is integrated into the host cell genome. Instead, a transient transfection, generating temporary expression of the target gene, is sufficient to perform the screening assay. The setup allows medium-throughput screening of hundreds of compounds. Co-transfection of the promiscuous G&#945;16, which couples to most GPCRs, allows the intracellular signaling pathway to be redirected towards the release of calcium, regardless of the native signaling pathway in endogenous settings. The HEK293T cells are easy to handle and have proven their efficacy throughout the years in receptor deorphanization assays. However, optimization of the assay for specific receptors may remain necessary.

The here described fluorescence-based calcium mobilization assay is a medium-throughput reverse pharmacology screening system for the identification of functionally activating ligand(s) of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs).

형광 기반의 칼슘 동원 분석에 의해 G 단백질 결합 수용체의 특성

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4

Pharmacological targeting of G protein-coupled receptors (GPCRs) is of great importance to human health, as dysfunctional GPCR-mediated signaling contributes to the progression of many diseases. The ligand/receptor pair CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)/CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) has raised significant clinical interest, for instance as a potential target for the treatment of cancer and inflammatory diseases. Small molecules as well as therapeutic antibodies that specifically target CXCR4 and inhibit the receptor&#39;s function are therefore considered to be valuable pharmacological tools. Here, a flow cytometry-based cellular assay that allows identification of compounds (e.g., small molecules) that abrogate CXCL12 binding to CXCR4, is described. Essentially, the assay relies on the competition for receptor binding between a fixed amount of fluorescently labeled CXCL12, the natural chemokine agonist for CXCR4, and unlabeled compounds. Hence, the undesirable use of radioactively labeled probes is avoided in this assay. In addition, living cells are used as the source of receptor (CXCR4) instead of cell membrane preparations. This allows easy adaptation of the assay to a plate format, which increases the throughput. This assay has been shown to be a valuable generic drug discovery assay to identify CXCR4-targeting compounds. The protocol can likely be adapted to other GPCRs, at least if fluorescently labeled ligands are available or can be generated. Prior knowledge concerning the intracellular signaling pathways that are induced upon activation of these GPCRs, is not required.

A flow cytometry-based cellular binding assay is described that is primarily used as a screening tool to identify compounds that inhibit the binding of a fluorescently labeled CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) to the CXC chemokine receptor 4 (CXCR4).

트랜스와 초파리 노치의 바인딩을 평가를 집계 분석 셀-Ligands 및 Cis에 의해 그것의 억제-Ligands

요약

더 많은 비디오 탐색

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조사 비 근육 Myosin II 수축 통해 접혀 gastrulation 신호 전달 경로 초파리 S2R + 셀에 셀 기반 분석 결과

라이브 해부 Drosophila 태아 : 항체 스테 이닝에 의해 돌연변이 컬렉션을 검사 늘씬한 방법

검출

형광 항체 주입을 통한 살아있는 초파리 배아의 저농도 단백질 및 번역 후 변형 시각화

형광 항체 주입을 통한 살아있는 초파리 배아의 저농도 단백질 및 번역 후 변형 시각화

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이종 세포 시스템에서 단백질 응집을 통한 세포 간 상호 작용 측정

형광 기반의 칼슘 동원 분석에 의해 G 단백질 결합 수용체의 특성

CXC Chemokine 수용 체 4에 붙일 레이블 CXC Chemokine Ligand 12의 바인딩 중단 하는 화합물을 식별 하는 흐름 Cytometry 기반 시험