This work was supported by the Canadian Institute of Health Research to CP (OR 142730 and OR 89931). We would like to thank Jelena Brkic for her initial idea of binary particle analysis in ImageJ.

<ol>
	<li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+and+Determining+the+Viability+of+Cultured+Cells.">Counting and Determining the Viability of Cultured Cells.</a> J. Vis. Exp. (16), e752 (2008).</li><li>Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology Available from: <a target="_blank" href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells</a> (2016)</li><li>Graham, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coulter+principle:+foundation+of+an+industry.">The coulter principle: foundation of an industry.</a> J. Lab. Autom. 8 (6), 72-81 (2003).</li><li>Ormerod, M. G., Imrie, P. R., Walker, J. M., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry.">Flow cytometry.</a> Animal Cell Culture. , 543-558 (1990).</li><li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Imaging+Software+Tools.">Biological Imaging Software Tools.</a> Nat. Methods. 9 (7), 697-710 (2013).</li><li>Louis, K. S., Siegel, A. C., Stoddart, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+viability+analysis+using+Trypan+blue:+manual+and+automated+methods.">Cell viability analysis using Trypan blue: manual and automated methods.</a> Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. , 7-12 (2011).</li><li>Scott, W. N., Langdon, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+and+motility+assays.">Invasion and motility assays.</a> Cancer Cell Culture: Methods and Protocols. , 225-229 (2004).</li><li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Cell+Migration+and+Invasion+Assays.">In vitro Cell Migration and Invasion Assays.</a> J. Vis. Exp. (88), e51046 (2014).</li><li>Luo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-378a-5p+promotes+trophoblast+cell+survival,+migration+and+invasion+by+targeting+Nodal.">MicroRNA-378a-5p promotes trophoblast cell survival, migration and invasion by targeting Nodal.</a> J. Cell Sci. 125, 3124-3132 (2012).</li><li>Adorno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mutant-p53/Smad+Complex+Opposes+p63+to+Empower+TGFbeta-Induced+Metastasis.">A Mutant-p53/Smad Complex Opposes p63 to Empower TGFbeta-Induced Metastasis.</a> Cell. 137, 87-98 (2009).</li><li>Chung, T. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+microRNA-204+mediates+migration+and+invasion+of+endometrial+cancer+by+regulating+FOXC1.">Dysregulation of microRNA-204 mediates migration and invasion of endometrial cancer by regulating FOXC1.</a> Int. J. Cancer. 130, 1036-1045 (2012).</li><li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays.">et al. In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutat. Res./Rev. Mutat. 752, 10-24 (2013).</li><li>Al-Khazraji, B. K., Medeiros, P. J., Novielli, N. M., Jackson, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+cell-counting+algorithm+for+fluorescently-stained+cells+in+migration+assays.">An automated cell-counting algorithm for fluorescently-stained cells in migration assays.</a> Biol. Proced. Online. 13, 1-6 (2011).</li><li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+with+ImageJ.">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics Intern. 11, 36-42 (2004).</li><li>Grishagin, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+cell+counting+with+ImageJ.">Automatic cell counting with ImageJ.</a> Anal. Biochem. 473, 63-65 (2015).</li><li>Thomas, C. R., Paul, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+image+analysis+in+cell+technology.">Applications of image analysis in cell technology.</a> Curr. Opin. Biotech. 7 (1), 35-45 (1996).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appreciating+data:+warts,+wrinkles+and+all.">Appreciating data: warts, wrinkles and all.</a> Nat. Cell Biol. 8, 203 (2006).</li><li>Rossner, M., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What's+in+a+picture?+The+temptation+of+image+manipulation.">What's in a picture? The temptation of image manipulation.</a> J. Cell Biol. 166, 11-15 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Count+objects+in+an+image+in+Adobe+Photoshop.">Count objects in an image in Adobe Photoshop.</a> Helpx.adobe.com. , (2016).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

중요한 단계, 문제 해결 및 제한 사항 자동화 된 계산 방법의 특성상 입자 분석의 상세들은, 이들 입자를 정의하는 수학적인 기능을 필요로한다. 따라서, 세포 농도 계산기 마이그레이션 분석 계수기 모두의 정확도는 상기 캡쳐 된 이미지는 세포 샘플 또는 마이그레이션 분석 막과 유사한 방법에 가깝게, 즉 이미지 충실도 majorly에 의존한다. 따라서 가능한 한 가장으로 현미경 및 관련 소프트웨어 보정 프로토콜을 수행 할 수있는 최상의 중요하다. 이는 배경 잡음을 제한 불필요한 입자를 감소 밝고 균일 합초 이미지 캡처 및 TIFF와 같은 비 손실 파일 형식으로 저장 포함한다. 따라서, 두 플러그인은 이러한 요건이 충족되지 않은 경우에 잘못된 결과를 생성 할 가능성이있다. 퍼펙트 세포 수에 따라서 항상 좋은 연습 때 두 í에 그들은 시각적 인 기대와 일치하는지 확인하는 것입니다티. 만약 참 결과가 문제 (10.4 주)를 명료하게 도움이 될 바이너리 이미지와 원본 이미지를 비교하여 일치하지 않는다. 어떤 경우에는, 더 어두운 마이그레이션 분석 사진 컬러 임계치 한계 내에 화소 값에 의한 계산 된 큰 영역을 포함 할 수있다. 일반적으로, Flatfield () 현재의 이미지를 사용하는 것은 어둠과 반점을 제거하고 색의 요철로 인해 가장 원치 않는 수를 방지 할 수 있습니다. 이 가능하고 상대적으로 일반적인 문제를 감안할 때, 그것은 자연 출판 그룹 및 기타 (13)에 의해 제안 된 것과 같은 표준 이미지 무결성 지침을 따르는 것이 중요합니다. 일관된 수를 유지하기 위해, 하나의 이미지에 대한 조정은 모든 다른 사람에게 동등하게 적용되어야한다. 이 포함되지만, 채도, 밝기, 콘트라스트 이득에 한정되지 않고, 예컨대 평균화 선명도, 색 필터 등의 필터를 포함한다. 감마 조정은 픽셀 컬러의 비선형 변경 적용 피해야과 다르기 때문에, 각 화상에 영향을 미칠 수있다LY 14. 몇 가지 세포와 이미지에 공통의 노출 시간을 적용 할 때 (&lt;1000)이 과다 노출 및 이미지 충실도의 손실을 초래할 수 있습니다. 반대로, 수천 개의 세포를 가진 멤브레인 노출 부족을 방지하기 위해 높은 노출 시간을 필요로 할 수 있습니다. 따라서, 달성 가장 높은 이미지 충실도를 유지하기 위해 가능한 한 작은 한 경우에만 필요에 따라 이미지를 조정하는 것이 좋습니다. 심지어 높은 충실도 이미지로, 진정한 입자 수는 원치 않는 입자에 의해 심각하게 왜곡 될 수 있습니다. 샘플은 세포 파편 상당량 포함되어 있으면 특별히 현탁 세포와 동일한 부분의, 세포 농도 계산기를 사용하는 경우,이 결과를 왜곡 할 수있다. 파편을 최소화 할 수없는 경우는 어떤 경우에는,이 자동 분석을 방지 할 수있다. 마찬가지로, 유사한 색상의 배경 염색 높은 수준을 함유 마이그레이션 분석 멤브레인은 멤브레인의이면으로부터 제거되지 않은 세포 또는 세포를 염색하는 것 I를 만들어n 정확도 결과. 이 원하지 않는 입자는 일반적으로 몇 가지 방법으로 제거 할 수 있습니다 : 광원의 밝기 나 노출 시간을 증가, 더 엄격한, 또는 수동으로 &#39;카운트 열기 이미지&#39;(10.4)를 통해 제거 할 색상 임계 값을 수정. 이 프로토콜은 정밀도를 유지하고 CCC TC에 필요한 이미지의 최적 품질을 제공하는 것이 중요하다. 그러나, TC는 일반적으로 단지 수동 조정 (10.4)에 소요되는 시간을 더 필요로 훨씬 적은 품질, 가변 배율 또는 다른 색 얼룩의 이미지를 카운팅 할 수있다. 모든 이주 검정 멤브레인 화상의 교정시는 고려 화상의 해상도와 세포의 상대적인 크기를 취하는 것이 중요하다. 전술 한 바와 같이, 이미지 품질 (Q) 및 교정 추천 (CR)는 입자 영역의 주파수 플롯 통계에 따라 달라집니다. 분석 된 이미지의 각 셀의 평균 1 / 100,000에 소요전체 이미지 영역입니다. 작은 셀 크기의 비율로 화소 단지 수백만의 이미지를 사용하는 경우, 셀 사이즈의 변화는 작다. 즉, 분산이 단지 10 내지 60 픽셀의 범위 일 수있다. 화상 영역 비율이 셀 면적이 커질수록하지만 세포의 분포는 특정 영역의 주파수를 감소시킴으로써 셀 크기 정규 분포의 첨도를 줄여 증가 크기. 명확한 극소 영역을 판별 할 수 없기 때문에 차례로이 셀 영역의 자동 계산이 더 어렵거나 불가능하게 만들 수있다. 마찬가지로,이 또한 (&lt;50) 다른 세포 크기의 주파수가 매우 낮은 될 수있는 위치 세포의 몇 가지 숫자 이미지에 적용됩니다. 본 연구 또는 셀 크기의 다른 배포판으로 사용되는 것보다 상이한 해상도 이미지를 분석 할 때, 그 결과, 세포의 크기 범위의 수동 식별은 (10.3.3)이 필요할 수있다. 의의 및 향후 방향 ImageJ에 플러그인 셀 카운터는 처음 rele했다박사 커트 드 보스에 의해 2001 년에 ased이 일을 수동으로 세포 계수에 대한 주식을 역임했다. 생물 공동체를위한 자유롭게 사용할 수있는 도구의 추세를 계속하려면, 셀 농도 계산기 및 마이그레이션 분석 카운터는 처리량 및 마이그레이션 분석의 간 실험 재현성을 높일 수 있도록하는 무료 도구의 다음 단계를 제공합니다. 마이그레이션 분석의 최종 결과는 파종 세포 수에 크게 의존한다. 고로 안정적인 세포 수 재현성에 대한 필요성이다. 이러한 방식으로, 두 CCC 인해 세포 농도 및 셀 상태를 유지 짧은 카운트 배 높은 통계적 확실성 정확도를 증가 제공한다. 또한, 양 플러그의 최종 결과는 세포 수의 카운트가 아닌 형광 물질로서 상대 인덱스이다. 다양한 다른 프로토콜은 염색 후 그 측정 형광 존재하지만, 이러한 방법은 감도 (13)의 부족으로 고통 받고 있습니다. 어도비의 포토샵 자체 입자 분석 t을 제공합니다OOL하지만 프로그램이 사용하기 위해 구입해야합니다 및 마이그레이션 분석 카운터 (20)에서 사용할 수있는 포스트 계수 분석을 제공하지 않습니다. 두 플러그인 ImageJ에의 입자 계수 기능에 의존하고 따라서 ImageJ에 의해 사용되는 매크로를 편집하여 최종 사용자에 의해 수정 될 수있다. 이것은 사용자가 새로운 매크로를 작성하여 다른 입자에 플러그인의 범위를 확장하기위한 유연성을 제공합니다. 최종 사용자의 기여를 가산 입자의 폭을 증가시키고 통합하는 발전 다음 논리적 단계이다. 자동화 된 계산 알고리즘 및 사후 계수 분석 세포 카운터의 핵심 원리를 조합하여, 이것은 크게 마이그레이션 분석 정확도의 손실없이 처리 될 수있는 용이성을 증가시킨다. http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins : 플러그인은에서 설치 지침을 다운로드 자유롭게 사용할 수 있습니다.

시험 관내 세포 카운트에서 조직 배양 실험의 넓은 범위의 중요한 기본 기술이다. 정확하게 배양 세포의 수를 결정하는 실험 재현성 표준화 1,2- 필수적이다. 세포는 혈구 계산을 사용뿐만 아니라 자동화 된 방법의 다양한 고유의 장점과 단점 3,4,5- 각을 사용하여 수동으로 수행 될 수있다. 세포 계수에 대한 자동화 된 방법의 대부분은 두 개의 클래스, 콜터 원리를 사용하거나 유동 세포 계측법이 그 중 하나에 속한다. 콜터 카운터는 세포 수와 크기를 결정하기 위해 셀의 전기 저항을 이용한다. 이들은 유동 세포 계측기보다 빠르고 정확하고 저렴하다. 그러나, 이들은 거의 수동 계산 3 비교 인해 상당한 비용 만 세포 카운팅에 사용되지 않는다. 한편, 세포 계측기 흐름 비싸다 있지만 휴대 계산, 셀 형상, 명세서의 분석과 같은 많은 응용 분야를 가지고ructure 측정 내부 셀은 4,5 마커. 이 두 원칙 중 하나를 사용 기계는 많은 제조 업체에서 사용할 수 있습니다. 자동화 된 방법은 수동 계산에 필요한 시간의 일부와 함께하지만 비싼 기계 (6)을 사용하는 동안 수동 계산은 저렴하지만 시간과 바이어스의 적용을받습니다. 다른 일반적인 세포 배양 과정은 시험 관내 세포 운동성 분석, 즉, 세포 이동 및 침입 7이다. 마이그레이션 및 침략 분석은 일반적으로 화학 주성 응답에 대한 응답으로 세포 운동성 및 침입을 조사하는 데 사용됩니다. 또한, 이들은 널리 여러 세포 유형 7-11 배아의 발달, 분화, 염증성 반응 및 전이를 연구하기 위해 사용된다. 마이그레이션 분석의 다공질 막을 통해 이전 또는 침입 한 세포는 두 가지 방법으로 정량화 될 수있다. 첫째, 형광 염료로 염색 세포를 해리하여 이리저리형광 판독기 (12)를 사용하여 막 및 정량화 해요. 정량이 방법의 제한은 기록 막의 유지 될 수 없으며 추가 분석 13 가능성이 없다는 것이다. 마이그레이션에 대한 두 번째 정량 방법은 / 고정 및 크리스탈 바이올렛, 톨루이딘 블루 염색 또는 헤 마톡 실린과 같은 세포 학적 염료와 더 일반적으로 형광 염료, 염색되는 세포를 침공된다 그 다음 세포는 수동으로 매우 시간이 걸리는 작업 12,13 이들 막의 반전 현미경 이미지를 사용하여 정량화된다. 수동 세포 계수의 단점을 극복하기 위해, 세포 농도 및 마이그레이션 분석을위한 두 신뢰성 있고 정확한 자동 세포 계수기가 개발되었다. 이러한 자동 세포 계수기 알고리즘 오라클 자바 컴퓨터 언어를 사용하여 플러그인으로 ImageJ에 대해 개발되었다. ImageJ에는 난방 국립 연구소에서 개발 한 공공 및 널리 사용되는 이미지 처리 도구입니다l 번째 (NIH) 14, 15; 따라서, ImageJ에 이러한 플러그인을 작성하는 것은 생물학적 지역 사회에 쉽게 통합을 용이하게합니다. 세포 계수의 자동화는 수동 계산에 비해 높은 처리량과 재현성을 보장합니다. 다른 가능한 소프트웨어 및 플러그인은 이미지 분석 5,16,17, 세포 농도 계산기 플러그인을 통해 세포 농도를 계산하기 위해 사용될 수 있지만 고속이며 또한 세포 치료의 희석 처리 할 수있다. 또한,이 두 카운터에서 모든 결과 및 계산을 저장하고 내보낼 수 있습니다. 이 논문에서 설명 된 두 개의 플러그인 해부 범위의 사용을 통해 생균 이미징 마이그레이션 분석 멤브레인 큰 시야 (전체 막 캡처) 이미징 위상차 현미경의 사용을 위해 최적화된다. http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins : 플러그인은에서 설치 지침을 다운로드 자유롭게 사용할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1175">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">HyClone Classical Liquid Media: 
			RPMI 1640 - With L-Glutamine</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SH3002702</td>
			<td style="width:692px;">Cell culturing media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">Fetal bovian serum (FBS)</td>
			<td style="width:124px;">GIBCO BRL</td>
			<td style="width:119px;">P00015</td>
			<td>Media suppliment</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:107px;width:240px;">HTR8/SVneo trophoblast cell line</td>
			<td style="width:124px;">Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen&#8217;s University, Kingston, Canada)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software is designed to work with any cell line.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">Trypsin</td>
			<td style="width:124px;">GIBCO BRL</td>
			<td style="width:119px;">27250-018</td>
			<td>Prepared as 0.20% (w/v) in 10uM EDTA&#160; 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:240px;">Accutase</td>
			<td style="width:124px;">Innovative Cell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">10 cm cell culture plates</td>
			<td style="width:124px;">SARSTEDT</td>
			<td style="width:119px;">833902</td>
			<td>Any tissue culture treated plates will be suitable</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">Transwell Polyester Membrane Inserts - 8.0&#181;m Pore size</td>
			<td style="width:124px;">Costar 3422 ordered from Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">7200150</td>
			<td>For 24-well plates; Pore size: 8.0&#181;m; 6.5mm diameter; 0.33cm2 growth area</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 &#38; 3</td>
			<td style="width:124px;">EMD Millipore and ordered from VWR</td>
			<td style="width:119px;">65044A, B, &#38; C</td>
			<td>Hemacolor stain set consists of three 500mL (16.9oz.) poly bottles &#38; includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">Cotton Tipped Applicator</td>
			<td style="width:124px;">Puritan Medical</td>
			<td style="width:119px;">806-WC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Single-edge industrial razor blades</td>
			<td style="width:124px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">55411 - 055</td>
			<td>Thickness: 0.30 mm (0.012&#34;)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">Microscope Slides - Precleaned/Plain</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12550A3</td>
			<td>Dimentions: 25 X 75 X 1.0 mm</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">Fisherbrand Cover Glasses - Rectangles no. 1</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-545E</td>
			<td>Thickness: 0.13 to 0.17mm; Size: 50 x 22mm</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">Fisher Chemical Permount Mounting Medium</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="124">
			<td height="124" style="height:124px;width:240px;">Leica Stereo dissecting microscope</td>
			<td style="width:124px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:692px;">The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD &#38; camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts:&#160; LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90mm Model: MOB306 &#38; Objective achromat 0.32X, WD=303mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293,&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:124px;">Assistant Germany&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>0.100 mm Depth - 0.0025 mm2</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">Olympus inverted light microscope</td>
			<td style="width:124px;">Olympus Corporation</td>
			<td style="width:119px;">CKX41SF</td>
			<td>The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2&#160;&#160; 2.0 Megapixel CMOS Color Camera &#38; camera software is Infinity analyze Version 6.5.2</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">Laminar flow cabinet 1300 Series A2</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Model: 1375</td>
			<td>Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">Cell culture incubator</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Model: 370</td>
			<td>Any cell culture incubator will be suitable - Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:67px;width:240px;">ImageJ</td>
			<td style="width:124px;">NIH</td>
			<td>Version 1.50e</td>
			<td>Minimum version required</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:240px;">Java Runtime Environment</td>
			<td style="width:124px;">Oracle</td>
			<td style="width:119px;">Version 1.8.0_66</td>
			<td>Minimum version required</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated quantification and analysis of cell counting procedures using imagej plugins

건강의 ImageJ에 국립 연구소는 강력하고 자유롭게 사용할 이미지 처리 소프트웨어 제품군입니다. ImageJ에 다양한 생물학적 입자를 계산하기 위해 효과적으로 사용할 수있는 포괄적 인 입자 분석 알고리즘을 보유하고 있습니다. 세포 샘플들의 다수를 카운트하면 혈구 시간 관련하여 병목 현상을 나타낸다. 마찬가지로, 상기 ImageJ에 플러그인 셀 카운터와 마이그레이션 / 침공 분석에서 막을 계산 정확하지만, 손목 통증을 일으키는 매우 노동 집약적 주관적인, 그리고 악명입니다. 이러한 요구를 해결하기 위해, 우리는 자동 혈구 (또는 알려진 볼륨) 및 마이그레이션 / 침략 세포 계수의 유일한 작업 ImageJ에 내 두 개의 플러그인을 개발했다. 두 플러그인 최소 배경 고품질 현미경 사진을 획득 할 수있는 능력에 의존한다. 그들은 사용하기 쉽고 카운트 교정에 도움 내장 된 분석 도구와 큰 샘플 크기의 빠른 계산과 분석에 최적화되어 있습니다. 핵심 원리를 결합하여자동화 된 계산 알고리즘 및 사후 분석 계산 셀 카운터 (S)이 크게 이동 분석 정확도의 손실없이 처리 될 수있는 용이성을 증가시킨다.

세포 농도 계산기 그림 1은 CCC의 교정 및 가산 이미지 수집의 전체 프로세스를 제공합니다. 도 1a와 1b는 픽셀 P-평방 길이의 P-광장 교정 이미지와 계산을 묘사한다. CCC는 식을 이용하여 소정의 부피로 세포 농도를 결정 <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/54719/54719eq1.jpg" /> 혈구의 P-광장은 100 거리 nL의 볼륨 (1 mm × 1 mm X 0.1 mm) 및, 전체 이미지 볼륨이 mm로 픽셀을 변환 한 후이 상수 계산 될 수있다 주어진 있습니다. 도 1C에 초점 세포 특성 상 조명없이 배경 혈구 눈금 표시와 이상적인 가산 이미지입니다. 마지막으로, Figur의 산포도전자 1D는 HTR8, ES-2, Swan71 등 다양한 실험과 세포 유형 점령 57 이미지에서 세포의 자동화 된 수에 비해 높은 상관 관계, 설명서를 보여줍니다. 참고로, 농도의 상한 범위는 ~ 5.6 × 10 6 세포 / ㎖의 ~ 2.3 × 103 세포 / ㎖ (이미지 당 ≈ 5 세포)의 낮은 끝이었다. 이 계수는 이미지 당 10-15 세포 미만인 경우, 샘플이 통계적으로 전력을 증가시키기 위해 작은 부피에 현탁되어야한다고 제안한다. 마이그레이션 분석 카운터에 대한 수집 및 이미지의 처리 마이그레이션 분석 막의 수백 인간 영양막 세포주 HTR8, Swan71 또는 난소 암 세포주 ES-2 시딩 모두 많은 실험을 통해 영상화 하였다. 이러한 이미지의 여러 밝기, 선명도와 staine의 색상에 따라 우수한 품질에 매우 가난에서 범주의 범위를 표현하기 위해 선택되었다D 세포 및 배경 염색과 원치 않는 입자 (노이즈)의 정도. 이 이미지를 사용하여 기본 RGB 임계 값 색상 설정 (≈ 150, 120, 0) (그림 2C) 결정하고, 알고리즘의 모든 후속 개발의 기준으로 사용된다. 목표 즉 총 색 비율로 핵 색을 극대화 하였다 컬러 픽셀의 대부분은 세포 핵 내에 있어야한다. 도 2a에 상판 이상적인 이미지 밝기 세포 핵 선명도, 색상 무시할 배경 잡음을 나타낸다. 화상의 밝기가 흑백 이진 화상을 생성하는 셀과 배경 간의 훌륭한 충분한 콘트라스트가 확인하는 것이 중요하다. 이 차이가 충족되지 않으면, 크거나 예기치 않은 영역은 입자 기능 분석 ImageJ에 의해 계산 될 수있다; 최선의 상황은 완전히 흰색 배경이다. 반대, 인터넷의 하부 패널gure 2a는 극단적 인 배경 염색과 거의 구별 할 수있는 세포를 가지고있다. 염색이 정도 막을 가능성이 높습니다 마이그레이션 분석 카운터에서 신뢰할 수없는 결과를 생성합니다. 일부 예에서, 최적의 수준으로 휘도를 증가 시키면 이미지의 과도한 노출에 의해 화상 정확도에 영향을 미칠 수있다. 마찬가지로, 높은 노출이나 밝기가 점진적 또는 불규칙한 빛과 어두운 영역으로 전신 색채 효과를 생성 할 수있다. Flatfield () 현재 보정,이 효과는 최소화되거나도 2B (상부 대 하부 패널)에 나타낸 바와 같이 완전히 제거 할 수있다. 또한, Flatfield () 현재 보정 여러 막 이미지의 밝기를 균일하게 할 수있는 좋은 방법입니다. 교정 및 마이그레이션 분석 카운터의 검증 미국을 돕기 위해ER 마이그레이션 분석 막의 이미지를 정확히 계산에 필요한 기준을 충족하는 경우에 더 나은 결정 두 한정자 설계되었다라는 이미지 품질 (Q)을 보정 권고 (CR). 중요한 것은, 두 규정은, 이름 CR에서 알 수 있듯이, 오히려 각 이미지의 countability의 절대 심사 위원보다 가이드로만 추천 행위입니다. 두 Q와 CR은 입자 영역 (10.3.2)의 주파수 산포도의 측정을 기반으로합니다. 단순화를 위해, 메트릭은 주파수 플롯을 구성하는 곡선의 다양한 형태로 간주 될 수있다. 적절한 Q (≥0.5)의 원하는 메트릭은 셀 크기의 관찰 대략 정규 분포에 의해 결정 하였다. 일반적으로, 서로 해석 할 수없는있는 세포, 아니면 그냥 특히 대형 스테인드 오버, 오른쪽 꼬리 정규 분포 (그림 3B)에 skewedness을 이동. 이와 같이, 전형적인 이미지 보정 이상적인 메트릭이다. 와배경 잡음의 추가는,이 통상 1-5 화소 영역 범위 (도 3a)의 입자가 다수로 이끈다. 플롯 통계를 계산하기 위해, 데이터는 박사 마이클 토마스 플래너의 Java 과학 도서관 (http://www.ee.ucl.ac.uk/~mflanaga에 의해 생성 다항식도 다른의 열 Savitzky - 골 레이 평활화 곡선 장착되어 있습니다 /자바/). 기본적으로,이 각 극한치의 대략적인 지역의 여러 지점을 만듭니다. 로컬 최소치와 최대치의 농도 클러스터 맵 일련 플롯 메트릭들의 일반적인 포토 순서리스트, 즉, 최소, 최대, 최소 / 최대 오버랩, ..., N 번째 극한치 같이 계산 될 수있다. 요컨대, 어느 정도 평활화 된 곡선은 주파수 데이터 포인트는 극값 인 포장 방법에 밀접 결정 맞게. 겹치지 극값의 큰 클러스터링은보다 Q가된다. 이론적으로, Q는 t에 기초하여 전체 이미지 선명도를 나타냅니다별개의 입자 크기 분포의 고. 부울 CR 사실인지 여부는 극값의 순서에 따라 달라집니다. 도 3a에서, 정렬 된리스트는 최소, 최대 및 Savitzky-골 레이 곡선의 특성에 기초 극값 겹치는 순서가 될 것이다. 그림 3a는 이미지 보정을해야 할 수 있습니다 사용자에게 제안, 보정되지 않은 이미지, 참으로 극값 플래그 CR이 일반적인 순서를 나타 내기 때문에. 나아가, 이는도 3b에서,이 목록은 동일하지만, 제 1 최소의 배제와 것이라고 볼 수있다. 따라서 이상적인 보정되지 않은 및 보정 이미지의 측정은 측정 하였다. 이러한 측정에서의 편차를 보정하는 화상을 신고 및도 3c에서의 높은 배경 잡음 멤브레인의 경우와 같이, Q ≤ 0의 감소 일반적으로한다. 선택에이 규정을 적용밝기와 배경 잡음에 관해서 우수한 이미지에 겸손, 보정 이미지 카운트 (도 3D, E는 각각 2.9 ± 0.3 21.7 % 대 ± 1.9 %) 보정되지 않은 이상 수동 계산에 상당히 가까운 것이 분명하다. 보정되지 않은 분석을 위해 선택된 이미지의 전반적인 품질 (감안할 <img alt="식 (2)" src="/files/ftp_upload/54719/54719eq2.jpg" /> = 0.71 ± 0.04; ) ± SE를 의미, 거기 교정 다음 만 Q의 예상 완만 한 증가 ( <img alt="식 (2)" src="/files/ftp_upload/54719/54719eq2.jpg" /> = 0.90 ± 0.04). 종합적으로, Q는 CR 반면, 이미지의 전체적인 countability 전위 보정이 성공적인지 여부의 강한 지표가 나왔다. 두 세포 농도 카운터 및 마이그레이션 분석 카운터의 비교 타이밍 <p class="jove_content" fo:keep-together.wit힌 페이지는 = &quot;1&quot;&gt; 두 연구원 (사용자 1, 사용자 2)를 수동 및 자동 방법 사이의 속도 비교 테스트에 사용 하였다. 두 연구팀은 세포 계수 및 마이그레이션 분석과 실질적인 경험을했지만, 사용자 2 작성 지침을 따르했다 동안 사용자 1 모두 CCC와 TC의 사용 경험했다. 예상대로도 4a는 사용자 1 CCC 교정 평균 약 5 분에 복용, 함께, 실질적으로 빠른 사용자 2 이상이고, 사용자 1과 2 사이 CCC 교정 시간을 비교합니다. 수동 혈구 계산 및 자동 요금을 비교하기 위해, 집계 카운터를 사용하여 계산의 수동 속도는 혈구 실의 9 개의 이미지를 가지고하는 데 걸린 시간을 비교하고, CCC (그림 4B)에서 계산. 1.15 × 106 세포의 통상적 인 세포 농도 / ㎖의 1X 처리량 증가 평균 선도 타이밍을 비교하기 위해 사용 하였다. 이 비율은로로드 셀의 개수에 따라 달라질이미지를 캡처하고 처리하는데 걸리는 총 시간 같은 혈구 세포 수와 무관하다. 마지막으로, 막, TC 내의 정량화하고 이러한 이미지를 수동으로 조정 화상 취득 타이밍을 둘러싸는도 4c에서 측정 하였다. 특히, 저 세포 수 (= 총 10,571 세포) 상당한 배경 염색 및 세포 파편 12 마이그레이션 분석 막은 셀 번호를 수동으로 조정할 필요 최악의 시나리오를 용이하게하기 위해 선택되었다. 이는 원치 않는 계수를 제거하고 부재중 세포를 추가 13 분의 평균 걸렸다도 4C 조정 (ADJ) 열에 반영된다. 수동 계산 비교를 들어, 최적의 셀 계산 속도는 셀 카운터로 측정 하였다; 높은 세포 밀도로 고품질 막을 이미지 (결과 미도시)를 사용 하였다. 이는 9.1 × 103 세포 / H의 사용자 1과 2 사이의 평균 최대 레이트를 수득(~ 2.5 세포 / s) 등이 있습니다. 이 번호를 사용하여,도 4c에서 막은 빠르게 TC와 최대 매뉴얼 속도 예상되는 것보다 4.4 배를 계산 하였다. 시간 절감이 거의 없거나 전혀 조정 및 높은 세포 밀도 (~ 7,000 세포 / 막)이 필요 이주 막을 카운팅함으로써, 세포 수 및 이미지 품질에 직접적으로 의존하는, TC는 세포 수 빨리 최대 매뉴얼 속도보다 1,395x 생성. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54719/54719fig1.jpg" /> 그림 1 : 세포 농도 계산기. 40X 총 배율로 촬영 한 혈구의 중심 주 광장 (A) 위상차 현미경 사진. 스케일 바는 200 μm의를 나타냅니다. (B) A는 혈구를 측정하기 위해 어떤 길이 묘사 (A)에서 이미지의 버전을 잘립니다. 결과 창 길이 열이 쉽게 식별 강조했다. 노란색 막대= 1 mm이다. (C) 1600 X 1200 픽셀의 해상도로 40 배의 총 배율로 현미경 및 소프트웨어 교정 후 HTR8 세포를 포함하는 혈구 이상적인 현미경. 스케일 바 = 200 μm의. (D) 세포 농도 계산기를 사용하여 동일한 이미지의 자동 카운트에 비해 ImageJ에 플러그인 셀 카운터를 사용하여 수동 수를 비교 산점도. 여기서 n은 = 57 이미지. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54719/54719fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54719/54719fig2.jpg" /> 그림 2 : 마이그레이션 분석은 대표 이미지에 대응. (A) 상단 패널은 최소한의 배경으로 이상적인 이미지를 묘사하는 총 막의 팔분의 일 부분이다; 스케일 바 = 200 μm의. 그만큼하부 패널은 심각 자동 계산의 정확성에 영향을 미치는 중요한 배경 염색 이미지를 포함, 스케일 바 = 585 μm의. (B) 상단 패널은 부정확 한 수를 생산 좋은 품질의 어두운 이미지를 나타냅니다. 바닥 판은 Flatfield () 현재 보정 후의 동일한 화상의 가산 버전이다. 스케일 바는 593 μm의 =. (C)의 상단 패널 나타내는 확대 된 일반적인 멤브레인의보기. 하판은 ImageJ에 원하는 색 임계이어서 동일한 이미지 (RGB 임계 값 = 150, 120, 0) 간 배경과 시각적으로 염색 세포질의 대부분을 제거한다. 모든 이미지는 헤 마톡 실린 염색 HTR8의 여러 마이그레이션 분석 침략에서 2592 X 1944 픽셀의 해상도로 보정 해부 범위와 1.35X 총 배율로 촬영되었다. 스케일 바는 100 μm의 =. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54719/54719fig2large.jpg" target="_blank">경쟁하려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 WA 더 큰 버전. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54719/54719fig3.jpg" /> 그림 3 : 교정 및 마이그레이션 분석 ㄴ ounter의 검증. (A) 높은 품질의 보정되지 않은 이미지의 전형적인 예입니다. 마이그레이션 분석 카운터의 재계&gt; &#39;추천 크기&#39;를 사용하여 (B) (A)의 보정 된 버전. (C) 상당한 배경 얼룩 또는 전체 어둠 낮은 화질 막의 전형적인 주파수 플롯. (D)를 ImageJ에 플러그인 셀 카운터 및 마이그레이션 분석 카운터 자동 카운트를 사용하여 수동 수를 비교 산점도. (E) 보정되지 않은 자동 카운트 대 교정의 평균 %의 차이를 보여주는 막대 그래프. 데이터는 ± SE 평균입니다. P &lt;0.0001, N = 30, 웰치의 corre와 짝 t-test를ction. 같은 이미지가 D에 사용하고, 모두의 E. 교정이 재계&gt; &#39;추천 크기&#39;와 재계&gt;로 이루어졌다 &#39;수동 설정&#39;은 또한 최소 크기 계산 및 컬러 임계 값을 수정합니다. 없음 수동 카운트 조정 함수 &#39;카운트 열기 이미지&#39;를 사용하지 하였다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54719/54719fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54719/54719fig4.jpg" /> 그림 4 : 세포 농도 카운터 및 마이그레이션 분석 카운터 사용의 타이밍. CCC 교정 시간 (A) 비교 (1 단계, 2) 사용자 1 (CCC / TC 전문가) 및 사용자 2 (CCC / TC 초보자) 사이. (B) 수동 셀 카운팅 시간은 다섯 가지 실험에 대해 평균 및 분당 카운트 세포에서 발현되었다. 사설C 카운트 혈구 챔버의 9 개의 이미지를 캡처하는 평균 시간으로 계산 CCC로 계수 하였다. 사용되는 세포 농도는 ~ 1.15 × 10 6 세포 / ㎖이었다. 데이터는 ± SE 평균입니다. 10.4 단계들 (QNT, 기본 구성 설정 사용 10.1-10.3.3 단계), 정량, 수집 (7 단계와 8 ACQ), 및 수동 조정 (ADJ를 : N = 5 (C) 트랜스 웰 카운터 타이밍 세 이상 카테고리를 비교 하였다 -1.4.2). 정량 세포막 정확한 카운트 상당한 수동 조정을 필요로하기 위해 배경 염색과 파편 높은 수준이었다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54719/54719fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins at JoVE.com

Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

This paper describes the quantification of hemocytometer and migration/invasion micrographs through two new open-source ImageJ plugins Cell Concentration Calculator and migration assay Counter. Furthermore, it describes image acquisition and calibration protocols as well as discusses in detail the input requirements of the plugins.

ImageJ에 플러그인을 사용하여 셀 카운팅 절차의 자동화 된 정량 및 분석

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis ...

automated-quantification-analysis-cell-counting-procedures-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

46.7K 조회수.  York University. This paper describes the quantification of hemocytometer and migration/invasion micrographs through two new open-source ImageJ plugins Cell Concentration Calculator and migration assay Counter. Furthermore, it describes image acquisition and calibration protocols as well as discusses in detail the input requirements of the plugins.

비디오: Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

카운팅 및 교양 세포의 생존을 결정

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

연구

생물학

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

작은 하트의 세미 - 자동 광학 도면 분석

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. 

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK pathway in zebrafish embryos. The zebrafish embryo is an ideal system for in vivo high-content chemical screens. The 1-day old embryo is approximately 1mm in diameter and can be easily arrayed into 96-well plates, a standard format for high throughput screening. During the first day of development, embryos are transparent with most of the major organs present, thus enabling visualization of tissue formation during embryogenesis. The complete automation of zebrafish chemical screens is still a challenge, however, particularly in the development of automated image acquisition and analysis. We previously generated a transgenic reporter line that expresses green fluorescent protein (GFP) under the control of FGF activity and demonstrated their utility in chemical screens 1. To establish methodology for high throughput whole organism screens, we developed a system for automated imaging and analysis of zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in 96-well plates 2. In this video we highlight the procedures for arraying transgenic embryos into multiwell plates at 24hpf and the addition of a small molecule (BCI) that hyperactivates FGF signaling 3. The plates are incubated for 6 hours followed by the addition of tricaine to anesthetize larvae prior to automated imaging on a Molecular Devices ImageXpress Ultra laser scanning confocal HCS reader. Images are processed by Definiens Developer software using a Cognition Network Technology algorithm that we developed to detect and quantify expression of GFP in the heads of transgenic embryos. In this example we highlight the ability of the algorithm to measure dose-dependent effects of BCI on GFP reporter gene expression in treated embryos.

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

We report the development of a system for automated imaging and analysis of zebrafish transgenic embryos in multiwell plates. This demonstrates the ability to measure dose dependent effects of a small molecule, BCI, on Fibroblast Growth Factor reporter gene expression and provide technology for establishing high-throughput zebrafish chemical screens.

zebrafish 화학 화면을위한 자동화 이미징 및 분석의 개발.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Determination of Mammalian Cell Counts, Cell Size and Cell Health Using the Moxi Z Mini Automated Cell Counter

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A critical breakthrough in cell/particle counting technologies was the development of the Coulter technique by Wallace Coulter over 50 years ago. The technique involves the application of an electric field across a micron-sized aperture and hydrodynamically focusing single particles through the aperture. The resulting occlusion of the aperture by the particles yields a measurable change in electric impedance that can be directly and precisely correlated to cell size/volume. The recognition of the approach as the benchmark in cell/particle counting stems from the extraordinary precision and accuracy of its particle sizing and counts, particularly as compared to manual and imaging based technologies (accuracies on the order of 98% for Coulter counters versus 75-80% for manual and vision-based systems). This can be attributed to the fact that, unlike imaging-based approaches to cell counting, the Coulter Technique makes a true three-dimensional (3-D) measurement of cells/particles which dramatically reduces count interference from debris and clustering by calculating precise volumetric information about the cells/particles. Overall this provides a means for enumerating and sizing cells in a more accurate, less tedious, less time-consuming, and less subjective means than other counting techniques6.
Despite the prominence of the Coulter technique in cell counting, its widespread use in routine biological studies has been prohibitive due to the cost and size of traditional instruments. Although a less expensive Coulter-based instrument has been produced, it has limitations as compared to its more expensive counterparts in the correction for "coincidence events" in which two or more cells pass through the aperture and are measured simultaneously. Another limitation with existing Coulter technologies is the lack of metrics on the overall health of cell samples. Consequently, additional techniques must often be used in conjunction with Coulter counting to assess cell viability. This extends experimental setup time and cost since the traditional methods of viability assessment require cell staining and/or use of expensive and cumbersome equipment such as a flow cytometer.
The Moxi Z mini automated cell counter, described here, is an ultra-small benchtop instrument that combines the accuracy of the Coulter Principle with a thin-film sensor technology to enable precise sizing and counting of particles ranging from 3-25 microns, depending on the cell counting cassette used. The M type cassette can be used to count particles from with average diameters of 4 - 25 microns (dynamic range 2 - 34 microns), and the Type S cassette can be used to count particles with and average diameter of 3 - 20 microns (dynamic range 2 - 26 microns). Since the system uses a volumetric measurement method, the 4-25 microns corresponds to a cell volume range of 34 - 8,180 fL and the 3 - 20 microns corresponds to a cell volume range of 14 - 4200 fL, which is relevant when non-spherical particles are being measured. To perform mammalian cell counts using the Moxi Z, the cells to be counted are first diluted with ORFLO or similar diluent. A cell counting cassette is inserted into the instrument, and the sample is loaded into the port of the cassette. Thousands of cells are pulled, single-file through a "Cell Sensing Zone" (CSZ) in the thin-film membrane over 8-15 seconds. Following the run, the instrument uses proprietary curve-fitting in conjunction with a proprietary software algorithm to provide coincidence event correction along with an assessment of overall culture health by determining the ratio of the number of cells in the population of interest to the total number of particles. The total particle counts include shrunken and broken down dead cells, as well as other debris and contaminants. The results are presented in histogram format with an automatic curve fit, with gates that can be adjusted manually as needed.
Ultimately, the Moxi Z enables counting with a precision and accuracy comparable to a Coulter Z2, the current gold standard, while providing additional culture health information. Furthermore it achieves these results in less time, with a smaller footprint, with significantly easier operation and maintenance, and at a fraction of the cost of comparable technologies.

The Moxi Z miniature automated cell counter is a novel instrument that combines the Coulter Principle with patented thin-film sensor technology and a proprietary software algorithm to perform sizing and counting of a broad size range of particles as well as to determine the overall health of monodisperse mammalian cell cultures. This protocol describes the use of this instrument for counting and assessing the health of cell cultures.

Moxi Z 미니 자동 셀 카운터를 사용하여 포유류 세포 계산, 세포 크기와 세포 건강의 결정

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

의 세포 구체적인 분석<em&gt; Arabidopsis</em&gt; 형광 활성화 셀 정렬을 사용하여 잎

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the primary photosynthetic organ, and their size and shape vary developmentally and environmentally within a plant. For these reasons studies on leaf morphology require measurement of multiple parameters from numerous leaves, which is best done by semi-automated phenomics tools5,6. Canopy shade is an important environmental cue that affects plant architecture and life history; the suite of responses is collectively called the shade avoidance syndrome (SAS)7. Among SAS responses, shade induced leaf petiole elongation and changes in blade area are particularly useful as indices8. To date, leaf shape programs (e.g. SHAPE9, LAMINA10, LeafAnalyzer11, LEAFPROCESSOR12) can measure leaf outlines and categorize leaf shapes, but can not output petiole length. Lack of large-scale measurement systems of leaf petioles has inhibited phenomics approaches to SAS research. In this paper, we describe a newly developed ImageJ plugin, called LeafJ, which can rapidly measure petiole length and leaf blade parameters of the model plant Arabidopsis thaliana. For the occasional leaf that required manual correction of the petiole/leaf blade boundary we used a touch-screen tablet. Further, leaf cell shape and leaf cell numbers are important determinants of leaf size13. Separate from LeafJ we also present a protocol for using a touch-screen tablet for measuring cell shape, area, and size. Our leaf trait measurement system is not limited to shade-avoidance research and will accelerate leaf phenotyping of many mutants and screening plants by leaf phenotyping.

Demonstration of key methods for high throughput leaf measurements. These methods can be used to accelerate leaf phenotyping when studying many plant mutants or otherwise screening plants by leaf phenotype.

LeafJ : 세미 자동 리프 형상 측정을위한 ImageJ 플러그인

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

Clock Scan Protocol for Image Analysis: ImageJ Plugins

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a closed or segmented convex-shaped region of interest, leading to the generation of an averaged integral radial pixel-intensity profile. This protocol was originally developed in 2006, as a visual basic 6 script, but as such, it had limited distribution. To address this problem and to join similar recent efforts by others, we converted the original clock scan protocol code into two Java-based plugins compatible with NIH-sponsored and freely available image analysis programs like ImageJ or Fiji ImageJ. Furthermore, these plugins have several new functions, further expanding the range of capabilities of the original protocol, such as analysis of multiple regions of interest and image stacks. The latter feature of the program is especially useful in applications in which it is important to determine changes related to time and location. Thus, the clock scan analysis of stacks of biological images may potentially be applied to spreading of Na+ or Ca++ within a single cell, as well as to the analysis of spreading activity (e.g., Ca++ waves) in populations of synaptically-connected or gap junction-coupled cells. Here, we describe these new clock scan plugins and show some examples of their applications in image analysis.

This paper describes two novel ImageJ plugins for &#39;Clock Scan&#39; image analysis. These plugins expand the functionality of the original visual basic 6 program and, most importantly, make the program available to a large research community by bundling it with the ImageJ free image analysis software package.

이미지 분석을위한 클록 스캔 프로토콜 : ImageJ Plugins

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a ...

Measuring the Confluence of iPSCs Using an Automated Imaging System

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence in real time has been established without the need to count cells in single cell suspension to avoid any growth perturbation. A high-content image analysis system was used to assess iPCS confluence on 4 different ECMs over time in an automated manner. Different analysis settings were used to assess cell confluence of adherent iPSCs and only a slight difference (at 24 and 48 hours with laminin) has been observed whether a 60, 80 or 100% mask was applied. We also show that laminin lead to the best confluence compared to Matrigel, vitronectin and fibronectin.

The goal of the protocol is to compare different extracellular matrix (ECM) coating conditions to assess how differential coating affects the growth rate of induced pluripotent stem cells (iPSCs). In particular, we aim to set up conditions to obtain optimal growth of iPSC cultures.

자동 이미징 시스템을 사용한 iPSC의 합류점 측정.

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

새로운 로봇 시스템, 스포티폰을 사용하여 시간 해결 연구를 위한 극저온 전자 현미경 그리드 준비

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Automated Detection and Analysis of Exocytosis

Timelapse TIRF microscopy of pH-sensitive GFP (pHluorin) attached to vesicle SNARE proteins is an effective method to visualize single vesicle exocytic events in cell culture. To perform an unbiased, efficient identification and analysis of such events, a computer-vision based approach was developed and implemented in MATLAB. The analysis pipeline consists of a cell segmentation and exocytic-event identification algorithm. The computer-vision approach includes tools for investigating multiple parameters of single events, including the half-life of fluorescence decay and peak &#916;F/F, as well as whole-cell analysis of the frequency of exocytosis. These and other parameters of fusion are used in a classification approach to distinguish distinct fusion modes. Here a newly built GUI performs the analysis pipeline from start to finish. Further adaptation of Ripley&#39;s K function in R Studio is used to distinguish between clustered, dispersed, or random occurrence of fusion events in both space and time.

We developed automated computer vision software to detect exocytic events marked by pH-sensitive fluorescent probes. Here, we demonstrate the use of a graphical user interface and RStudio to detect fusion events, analyze and display spatiotemporal parameters of fusion, and classify events into distinct fusion modes.

엑소시토시스의 자동 검출 및 분석

Timelapse TIRF microscopy of pH-sensitive GFP (pHluorin) attached to vesicle SNARE proteins is an effective method to visualize single vesicle exocytic ...