This work was supported by the Canadian Institute of Health Research to CP (OR 142730 and OR 89931). We would like to thank Jelena Brkic for her initial idea of binary particle analysis in ImageJ.

<ol>
	<li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+and+Determining+the+Viability+of+Cultured+Cells.">Counting and Determining the Viability of Cultured Cells.</a> J. Vis. Exp. (16), e752 (2008).</li><li>Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology Available from: <a target="_blank" href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells</a> (2016)</li><li>Graham, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coulter+principle:+foundation+of+an+industry.">The coulter principle: foundation of an industry.</a> J. Lab. Autom. 8 (6), 72-81 (2003).</li><li>Ormerod, M. 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Biotech. 7 (1), 35-45 (1996).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appreciating+data:+warts,+wrinkles+and+all.">Appreciating data: warts, wrinkles and all.</a> Nat. Cell Biol. 8, 203 (2006).</li><li>Rossner, M., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What's+in+a+picture?+The+temptation+of+image+manipulation.">What's in a picture? The temptation of image manipulation.</a> J. Cell Biol. 166, 11-15 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Count+objects+in+an+image+in+Adobe+Photoshop.">Count objects in an image in Adobe Photoshop.</a> Helpx.adobe.com. , (2016).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Los pasos críticos, solución de problemas y limitaciones La propia naturaleza de los métodos de cálculo automatizados, específicamente los de análisis de partículas, requiere la capacidad matemática para definir estas partículas. En consecuencia, tanto la exactitud de la calculadora de la concentración de células y el contador de ensayo de migración depende mayormente en la fidelidad de la imagen, es decir, cómo de cerca la imagen capturada se asemeja a la membrana de célula o muestra de ensayo de migración. Por tanto, es de suma importancia para seguir microscopio y protocolos de calibración de software asociados de la mejor manera posible. Esto incluye la limitación del ruido de fondo, lo que reduce las partículas no deseadas, la captura de imágenes brillantes y de manera uniforme en-foco, y guardar en formatos de archivo sin pérdidas como tiff. Por lo tanto, ambos plugins son susceptibles de producir resultados erróneos si no se cumplen estos requisitos. Está por lo tanto, siempre es buena idea recuentos de células dobles comprobación para determinar si coinciden con las expectativas visuales cuando en doubt. Si, efectivamente, los resultados no coinciden, se compara la imagen original con la imagen binaria puede ayudar a dilucidar la cuestión (10,4 nota). En algunos casos, las imágenes ensayo de migración más oscuros pueden contener grandes áreas que han sido contados debido a los valores de píxeles que caen dentro de los límites de umbral de color. En general, el uso de una imagen de flatfield eliminará la oscuridad y la aparición de manchas y prevenir los recuentos más deseados debido a irregularidades cromáticas. Teniendo en cuenta estos posibles problemas y relativamente comunes, es importante seguir las directrices de integridad de la imagen estándar, como los propuestos por el Nature Publishing Group y otros 13. Para mantener los recuentos consistentes, cualquier ajuste de una imagen debe aplicarse por igual a todos los demás. Esto incluye pero no se limita a contraste, saturación, brillo, ganancia, filtros, como promedio y la nitidez, y filtros de color. El ajuste de gamma debe evitarse ya que se aplica un cambio no lineal de color del píxel y por lo tanto puede afectar a cada imagen diferentely 14. Cuando se aplica un tiempo de exposición común a las imágenes con pocas células (&lt;1,000), esto puede conducir a la sobreexposición y la pérdida de fidelidad de imagen. A la inversa, una membrana con miles de células puede requerir mayores tiempos de exposición para evitar la subexposición. En consecuencia, es la mejor práctica para ajustar las imágenes lo menos posible y sólo cuando sea necesario, para mantener la más alta fidelidad de la imagen alcanzable. una imagen de alta fidelidad, incluso con, verdaderos recuentos de partículas pueden ser muy sesgada por las partículas no deseadas. Cuando se utiliza la calculadora de concentración de células, si una muestra contiene cantidades significativas de residuos de células, específicamente de áreas similares a las de las células en suspensión, esto puede sesgar el resultado. En algunos casos, esto podría impedir el análisis automatizado si los escombros no puede ser minimizado. Del mismo modo, las membranas de ensayo de migración que contienen altos niveles de la tinción de fondo de color similar a tiñeron células o células no removidos de la parte trasera de la membrana, probablemente producir inPrecisión resultados. Estas partículas no deseadas normalmente pueden eliminarse de varias maneras: aumentando el brillo de la fuente o el tiempo de exposición de luz, modificando el umbral de color a ser más estrictos, o eliminado de forma manual a través de &#39;Abrir imagen con recuento&#39; (10.4). Es importante señalar que este protocolo produce la calidad óptima de imagen requerida para CCC y TC para mantener la precisión. Sin embargo, el TC es capaz de contar de imágenes significativamente menor calidad, diferentes aumentos, o diferentes manchas de color, por lo general sólo requiere más tiempo dedicado a los ajustes manuales (10.4). Durante la calibración de cualquier imagen membrana ensayo de migración es importante tener en cuenta la resolución de la imagen y el tamaño relativo de las células. Como se ha descrito anteriormente, Calidad de imagen (Q) y la recomendación de calibración (CR) dependen de las métricas de frecuencia parcela de superficie de las partículas. De las imágenes analizadas, cada célula ocupa en promedio 1 / 100.000 de laárea de la imagen total. Cuando el uso de imágenes de sólo millones de píxeles con una pequeña relación de tamaño de célula, la variación en el tamaño de la celda es también pequeña. Es decir, la varianza solamente puede variar desde 10 hasta 60 px. Pero a medida que el área de la celda a la proporción de área de la imagen se hace más grande, la distribución de los tamaños de célula aumenta, la reducción de la curtosis de el tamaño de celda de distribución normal por la disminución de la frecuencia de cualquier área dada. Esto a su vez puede hacer que el cálculo automático del área de la celda más difícil o imposible debido a que un área mínima definida no se puede determinar. Del mismo modo, esto también se aplica a las imágenes con pocos números de células en las que la frecuencia de los diferentes tamaños de células puede ser muy baja (&lt;50). Como resultado, cuando el análisis de imágenes con diferentes resoluciones que las utilizadas en este estudio o diferentes distribuciones de tamaño de las células, puede ser necesaria la identificación manual del intervalo de tamaño de célula (10.3.3). Importancia y direcciones futuras El contador de plug-in de la célula ImageJ fue inicialmente RelEasándose en 2001 por el Dr. Kurt De Vos y ha servido como un elemento básico para el recuento celular manual para el día de hoy. Para continuar con la tendencia de las herramientas libremente disponibles para la comunidad biológica, la calculadora de concentración de células y el contador de ensayo de migración ofrecen el siguiente paso en herramientas gratuitas para ayudar a aumentar el rendimiento y la reproducibilidad inter-experimental de los ensayos de migración. El resultado final de los ensayos de migración es dependiente del número de células sembradas altamente. Ergo un recuento de células fiable es una necesidad para la reproducibilidad. De este modo, CCC ofrece tanto una mayor precisión debido a una mayor certeza estadística de la concentración celular y la reducción de los tiempos de recuento de preservar la salud celular. Por otra parte, el resultado final de ambos plugins es un recuento del número de células y no un índice relativo tal como fluorescencia. Varios otros protocolos existen medida que la fluorescencia después de la tinción, pero estos métodos adolecen de falta de sensibilidad 13. Photoshop de Adobe ofrece su propio análisis de partículas tool pero el programa debe ser comprado para su uso y no ofrece el análisis post-conteo disponible de la migración contador de ensayo de 20. Ambos plugins se basan en la función de recuento de partículas de ImageJ y en consecuencia pueden ser modificados por el usuario final mediante la edición de las macros utilizadas por ImageJ. Esto ofrece una mayor flexibilidad para el usuario para ampliar el alcance de los plugins a otras partículas mediante la creación de nuevas macros. Un mayor desarrollo para aumentar la amplitud de partículas contables e incorporar las contribuciones del usuario final es el siguiente paso lógico. Mediante la combinación de los principios básicos del contador de células con un análisis automatizado algoritmo de conteo y post-escrutinio, esto aumenta en gran medida la facilidad con la que los ensayos de migración se pueden procesar sin ninguna pérdida de precisión. Los plugins son de libre acceso para descargar las instrucciones de instalación de: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

En el recuento de células in vitro es una importante técnica básica en una amplia gama de experimentos de cultivo de tejidos. Determinar con precisión el número de células en un cultivo es esencial para la reproducibilidad experimental y 1,2 normalización. El recuento de células se puede realizar manualmente usando un hemocitómetro, así como el uso de una variedad de métodos automatizados, cada uno con sus propias ventajas y desventajas 3,4,5. La mayoría de los métodos automatizados para el recuento de células pertenecen a una de dos clases, los que utilizan el principio de Coulter o citometría de flujo. Contador Coulter toman ventaja de las células resistencia eléctrica para determinar el número y tamaño de las células. Ellos son rápidos, precisos y más barato que los citómetros de flujo. Sin embargo, rara vez se utilizan sólo para el recuento de células debido a su costo considerable en comparación con el conteo manual 3. Citómetros de flujo, por otro lado, son caros pero tienen muchas aplicaciones tales como el recuento de células, el análisis de la forma de las células, structure y la célula de medida interna Marcadores de 4,5. Las máquinas que utilizan cualquiera de estos dos principios están disponibles de muchos fabricantes. Conteo manual es asequible, pero consume tiempo y sujeto a un sesgo, mientras que los métodos automatizados vienen con una fracción del tiempo necesario para que el recuento manual, pero el uso de máquinas costosas 6. Otros procedimientos de cultivo celular común están en ensayos de motilidad de las células in vitro, a saber, la migración celular y la invasión 7. ensayos de migración y la invasión se utilizan comúnmente para investigar la motilidad celular y la invasión en respuesta a una respuesta quimiotáctica. Además, se utilizan ampliamente para estudiar el desarrollo embrionario, la diferenciación, la respuesta inflamatoria, y la metástasis de múltiples tipos de células 7-11. Las células que han migrado o invadido través de la membrana porosa de un ensayo de migración se pueden cuantificar de dos maneras diferentes. En primer lugar, mediante la tinción de las células con un colorante fluorescente, la disociación from de la membrana, y la cuantificación utilizando un lector fluorescente 12. Una limitación de este método de cuantificación es que ningún registro puede ser retenido de las membranas y no hay posibilidad de un mayor análisis 13. El segundo método de cuantificación es para emigrado / células para ser fijados y teñidos con colorante fluorescente o más comúnmente, con colorantes citológicos como cristal violeta, colorante azul de toluidina o hematoxilina invadió; a continuación, las células se cuantificaron utilizando manualmente las imágenes microscópicas invertidas de estas membranas, que es una tarea que consume mucho tiempo 12,13. Para superar los inconvenientes de conteo de células manual, se desarrollaron dos contadores de células automatizadas fiables y precisos para la concentración de células y para el ensayo de migración. Estos algoritmos contador de células automatizado fueron desarrollados para ImageJ como un plugin usando lenguaje de programación Java de Oracle. ImageJ es una herramienta de procesamiento de imagen pública y ampliamente usada desarrollado por el Instituto Nacional del ciLTH (NIH) 14,15; por lo tanto, escribir estos plugins para ImageJ facilita una fácil integración en la comunidad biológica. Automatización de recuento de células garantiza un alto rendimiento y reproducibilidad en comparación con el conteo manual. Aunque otro software y plugins disponibles se pueden utilizar para calcular la concentración de células a través de análisis de imágenes 5,16,17, Cell Concentración Calculadora Plugin es rápido y también puede manejar diluciones de células y tratamientos. Por otra parte, todos los resultados y cálculos de estos dos contadores se pueden guardar y exportar. Los dos plugins descritos en este documento están optimizados para el uso de un microscopio de contraste de fases de imágenes de células vivas y gran campo de visión (toda la captura de membrana) de imágenes para membranas de ensayo de migración a través del uso de un microscopio de disección. Los plugins son de libre acceso para descargar las instrucciones de instalación de: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1175">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">HyClone Classical Liquid Media: 
			RPMI 1640 - With L-Glutamine</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SH3002702</td>
			<td style="width:692px;">Cell culturing media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">Fetal bovian serum (FBS)</td>
			<td style="width:124px;">GIBCO BRL</td>
			<td style="width:119px;">P00015</td>
			<td>Media suppliment</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:107px;width:240px;">HTR8/SVneo trophoblast cell line</td>
			<td style="width:124px;">Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen&#8217;s University, Kingston, Canada)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software is designed to work with any cell line.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">Trypsin</td>
			<td style="width:124px;">GIBCO BRL</td>
			<td style="width:119px;">27250-018</td>
			<td>Prepared as 0.20% (w/v) in 10uM EDTA&#160; 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:240px;">Accutase</td>
			<td style="width:124px;">Innovative Cell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">10 cm cell culture plates</td>
			<td style="width:124px;">SARSTEDT</td>
			<td style="width:119px;">833902</td>
			<td>Any tissue culture treated plates will be suitable</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">Transwell Polyester Membrane Inserts - 8.0&#181;m Pore size</td>
			<td style="width:124px;">Costar 3422 ordered from Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">7200150</td>
			<td>For 24-well plates; Pore size: 8.0&#181;m; 6.5mm diameter; 0.33cm2 growth area</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 &#38; 3</td>
			<td style="width:124px;">EMD Millipore and ordered from VWR</td>
			<td style="width:119px;">65044A, B, &#38; C</td>
			<td>Hemacolor stain set consists of three 500mL (16.9oz.) poly bottles &#38; includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">Cotton Tipped Applicator</td>
			<td style="width:124px;">Puritan Medical</td>
			<td style="width:119px;">806-WC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Single-edge industrial razor blades</td>
			<td style="width:124px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">55411 - 055</td>
			<td>Thickness: 0.30 mm (0.012&#34;)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">Microscope Slides - Precleaned/Plain</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12550A3</td>
			<td>Dimentions: 25 X 75 X 1.0 mm</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">Fisherbrand Cover Glasses - Rectangles no. 1</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-545E</td>
			<td>Thickness: 0.13 to 0.17mm; Size: 50 x 22mm</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">Fisher Chemical Permount Mounting Medium</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="124">
			<td height="124" style="height:124px;width:240px;">Leica Stereo dissecting microscope</td>
			<td style="width:124px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:692px;">The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD &#38; camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts:&#160; LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90mm Model: MOB306 &#38; Objective achromat 0.32X, WD=303mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293,&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:124px;">Assistant Germany&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>0.100 mm Depth - 0.0025 mm2</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">Olympus inverted light microscope</td>
			<td style="width:124px;">Olympus Corporation</td>
			<td style="width:119px;">CKX41SF</td>
			<td>The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2&#160;&#160; 2.0 Megapixel CMOS Color Camera &#38; camera software is Infinity analyze Version 6.5.2</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">Laminar flow cabinet 1300 Series A2</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Model: 1375</td>
			<td>Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">Cell culture incubator</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Model: 370</td>
			<td>Any cell culture incubator will be suitable - Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:67px;width:240px;">ImageJ</td>
			<td style="width:124px;">NIH</td>
			<td>Version 1.50e</td>
			<td>Minimum version required</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:240px;">Java Runtime Environment</td>
			<td style="width:124px;">Oracle</td>
			<td style="width:119px;">Version 1.8.0_66</td>
			<td>Minimum version required</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated quantification and analysis of cell counting procedures using imagej plugins

El Instituto Nacional de Salud de ImageJ es una suite de software de libre acceso de gran alcance, el procesamiento de imágenes. ImageJ tiene algoritmos de análisis de partículas integrales que se pueden utilizar con eficacia para contar diversas partículas biológicas. Al contar un gran número de muestras de células, el hemocitómetro presenta un cuello de botella en cuanto a tiempo. Del mismo modo, contando membranas a partir de ensayos de migración / invasión con la célula Contador ImageJ plugin, aunque precisa, es la mano de obra intensiva excepcionalmente, subjetiva, y la mala fama por causar dolor en la muñeca. Para hacer frente a esta necesidad, hemos desarrollado dos plugins dentro de ImageJ con la única tarea de hemocitómetro automático (o volumen conocido) y el recuento de células de migración / invasión. Ambos plugins se basan en la capacidad de adquirir micrografías de alta calidad con el fondo mínimo. Son fáciles de usar y optimizado para el conteo rápido y análisis de muestras de gran tamaño con herramientas de análisis incorporadas para ayudar a la calibración de los recuentos. Al combinar el principio básicos de contador de células con un análisis automatizado algoritmo de recuento y post-conteo, esto aumenta en gran medida la facilidad con la que los ensayos de migración pueden ser procesados ​​sin pérdida de precisión.

Calculadora Concentración celular La Figura 1 presenta el proceso general de calibración CCC y adquisición de imágenes contable. Figura 1A y 1B representan la imagen de calibración P-cuadrado y cálculo de la longitud P-cuadrado en píxeles. CCC determina la concentración de células en un volumen dado mediante la fórmula: <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/54719/54719eq1.jpg" /> P-cuadrado de un hemocitómetro tiene un volumen de 100 nL (1 mm x 1 mm x 0,1 mm) y dada esta constante, el volumen total de la imagen se puede calcular después de convertir píxeles a milímetros. La figura 1C es una imagen ideal, con numerable de enfoque células presentan la iluminación de fase característica y no hay graduaciones fondo hemocitómetro. Por último, el gráfico de dispersión de Figure 1D muestra una alta correlación, manual frente a recuento automatizado de las células de 57 imágenes tomadas a través de varios experimentos y tipos de células incluyendo HTR8, ES-2, y Swan71. Es de destacar que el rango superior de concentración fue de ~ 5,6 x 10 6 células / ml con un extremo inferior de ~ 2.3 x 10 3 células / ml (≈ 5 células por imagen). Se sugiere que si los recuentos están por debajo de 10-15 células por imagen, la muestra debe ser suspendido en un volumen más pequeño para aumentar el poder estadístico. Adquisición y Procesamiento de Imágenes para la Migración Ensayo Contador Cientos de membranas ensayo de migración se obtuvieron imágenes lo largo de muchos experimentos, todos los cuales se sembraron con la línea celular humana trofoblasto HTR8, Swan71, o una línea celular de cáncer de ovario ES-2. De estas imágenes, múltiples fueron escogidos para representar una gama de categorías de muy pobre a excelente calidad basado en el brillo, la claridad y el color de stainecélulas D, y el grado de tinción de fondo y partículas no deseadas (ruido). El uso de estas imágenes, los valores de color RGB umbral por defecto (≈ 150, 120, 0) se determinaron (Figura 2C) y se utilizan como una línea de base en todos los desarrollos posteriores del algoritmo. El objetivo era maximizar el color relación entre núcleo de color total, es decir, la mayoría de los píxeles de colores debe estar dentro de los núcleos celulares. El panel superior de la Figura 2A representa el brillo de la imagen ideal, célula claridad núcleos y el color, y el ruido de fondo insignificante. El brillo de la imagen es importante para asegurarse de que existe una gran suficiente contraste entre las células y el fondo para producir una imagen binaria en blanco y negro. Si no se cumple esta diferencia, las áreas grandes o impredecibles podrán ser contados por el ImageJ Analizar la función de las partículas; el mejor de los casos es un fondo totalmente blanco. En oposición, el panel inferior de Fifigura 2A tiene la tinción de fondo extrema y las células que son casi indistinguibles. Las membranas con este grado de coloración lo más probable es producir resultados poco fiables desde el contador de ensayo de migración. En algunos casos, el aumento de brillo al nivel ideal puede afectar fidelidad de la imagen por la sobreexposición de la imagen. Del mismo modo, la alta exposición o el brillo pueden producir efectos sistémicos cromáticas con luz progresiva o irregular y regiones oscuras. Con la corrección flatfield, estos efectos pueden ser minimizados o eliminados por completo como se muestra en la Figura 2B (vs. superior panel inferior). Además, la corrección flatfield es una buena manera de igualar el brillo de las imágenes múltiples de membrana. Calibración y Validación de la Migración de ensayo Contador Para ayudar a los EE.UU.er en una mejor determinación de si las imágenes de membrana ensayo de migración cumplen los criterios requeridos para el recuento exacto, dos calificadores fueron diseñados, de la especie llamada imagen (Q), y calibración de recomendación (CR). Es importante destacar que ambos calificadores, como su nombre sugiere CR, son sólo recomendaciones y actuar como guías más que los jueces absolutos de la rendición de cada imagen. Tanto Q y CR se basan en las métricas del gráfico de dispersión de partículas frecuencia de área (10.3.2). Para simplificar, una métrica puede ser considerada como las diversas formas de la curva que componen la trama de frecuencia. La métrica deseada de un Q adecuada (≥0.5) se determinó por la distribución normal aproximada observada de tamaño de celda. Comúnmente, las células que son irresolubles unos de otros, sobre-manchada, o simplemente particularmente grande, desplazan la asimetría de una distribución normal de extremo derecho (Figura 3B). Como tal, esta es la métrica ideal de una imagen calibrada típico. Conla adición de ruido de fondo, esto normalmente conduce a un gran número de partículas en el rango de 1-5 área de píxeles (Figura 3A). Para el cálculo de las métricas de la trama, los datos se ajustan con diez Savitzky-Golay curvas suavizadas de diferentes grados polinómicas producidos por la Biblioteca de Java Científica del Dr. Michael Thomas Flanagan (http://www.ee.ucl.ac.uk/~mflanaga /Java/). Esencialmente, esto crea múltiples puntos en la región aproximada de cada extremum. A través de una serie de mapas de racimo densidad de los mínimos y máximos locales, un cuadro general de las métricas de la trama puede calcularse como una lista ordenada, es decir, mínimo, máximo, mínimo / máximo solapamiento, ..., n º valor extremo. En pocas palabras, el grado en que adaptarse a las curvas suavizadas los datos de frecuencia determina la forma apretada los extremos son puntos. Cuanto mayor es la agrupación de la no superposición-extrema, la mayor Q se hace. En teoría, Q representa la claridad de la imagen completa basada en tque la distribución de tamaños de partículas diferentes. Si el CR booleana es verdadera o no depende de la secuencia de extremos. De la Figura 3A, la lista ordenada sería mínimo, máximo, y una secuencia de extremos superpuestos sobre la base de las propiedades de la curva de Savitzky-Golay. Desde la Figura 3A representa una secuencia general de este banderas Extrema CR como verdaderos imagen sin calibrar,, lo que sugiere al usuario que la imagen puede necesitar calibración. En el futuro, se puede ver que a partir de la figura 3B, esta lista sería idéntica pero con la exclusión de la primera mínimo. De esta manera se determinaron los parámetros de las imágenes no calibradas y calibrado ideales. Las desviaciones de estas métricas generalmente marcar una imagen para la calibración y reducir Q ≤ 0, como es el caso con el alto fondo de membrana de ruido en la Figura 3C. La aplicación de estos calificativos a una selecciónde modesto a excelentes imágenes, con lo que respecta a brillo y el ruido de fondo, es evidente que los recuentos de imagen calibrada son significativamente más cerca de recuentos manuales que no calibrada (1,9% ± 0,3 vs. 21,7 ± 2,9%, respectivamente; Figura 3D, E). Dada la alta calidad general de las imágenes elegidas para el análisis (sin calibrar <img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/54719/54719eq2.jpg" /> = 0,71 ± 0,04; media ± SE), se produjo un aumento modesto de esperar sólo en Q tras la calibración ( <img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/54719/54719eq2.jpg" /> = 0,90 ± 0,04). Tomados en conjunto, Q sugiere el potencial global de rendición de una imagen mientras que CR es un fuerte indicador de si la calibración es correcta o no. Las comparaciones de temporización Tanto Contador Concentración celular y la migración de ensayo Contador <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Dos investigadores (Usuario 1 y Usuario 2) se utilizaron para probar las comparaciones de velocidad entre los métodos manuales y automatizados. Tanto los investigadores tuvieron una experiencia sustancial con el conteo celular y el ensayo de migración, sino Usuario 1 fue experimentado en el uso de ambos CCC y TC mientras Usuario 2 tenía que seguir las instrucciones escritas. La figura 4A compara el tiempo de calibración CCC entre el usuario 1 y 2. Como era de esperar, el Usuario 1 era considerablemente más rápido que el usuario 2, en conjunto, teniendo un promedio de aproximadamente cinco minutos para la calibración de la CCC. Con el fin de comparar el conteo de hemocitómetro manual y automatizado de las tasas, la tasa de conteo manual de uso de un contador-registrador se comparó con el tiempo que se tardó en tomar nueve imágenes de la cámara de hemocitómetro y se contó en CCC (Figura 4B). Una concentración celular típica de 1,15 x 10 6 células / ml se utilizó para comparar los tiempos, lo que lleva a un promedio de aumento 1x en el rendimiento. Esta tasa variará dependiendo del número de células cargado en elhemocitómetro como el tiempo total necesario para capturar imágenes y procesarlos es independiente del número de células. Por último, los tiempos que abarcan la adquisición de imágenes de las membranas, la cuantificación dentro de TC, y los ajustes manuales de estas imágenes se midió en la Figura 4C. En particular, las membranas 12 Migración de ensayo con bajo número de células (células totales = 10.571) y sustancial tinción de fondo y los desechos celulares fueron elegidos para facilitar el peor escenario que requeriría ajustes manuales en el número de células. Esto se refleja en el ajuste de la figura 4C columna (Adj) donde tomó un promedio de 13 minutos para eliminar los recuentos de células no deseadas y añadir perdidas. Para la comparación de recuento manual, las tasas de recuento de células óptimas se determinaron con contador de células; Se utilizaron imágenes de membrana de alta calidad con alta densidad celular (resultados no mostrados). Esto produjo una tasa máxima media entre el usuario 1 y 2 de 9,1 x 10 3 células / h(~ 2,5 células / s). Usando estos números, las membranas de la Figura 4C se contaron 4.4x más rápido con TC de lo que sería de esperar en tasa manual de máxima. El ahorro de tiempo son directamente dependientes de número de células y la calidad de imagen, contando membranas de migración que requieren poco o ningún ajuste y una alta densidad celular (~ 7.000 células / membrana), TC genera recuentos de células 1,395x más rápido que la tasa manual de máxima. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54719/54719fig1.jpg" /> Figura 1: Concentración de la calculadora de la célula. Micrografía de contraste (A) Fase de la plaza principal central del hemocitómetro tomada en un aumento de 40X total. La barra de escala representa 200 micras. (B) Una versión de la imagen recortada de (A) representa lo que la longitud a medir en el hemocitómetro. La columna de longitud de la ventana Resultados se puso de relieve para facilitar su identificación. barra amarilla= 1 mm. (C) Una micrografía ideal de un hemocitómetro que contiene células HTR8 después de microscopio y software de calibración a 40X ampliación total con una resolución de 1600 x 1200 píxeles. Barra de escala = 200 micras. (D) Un gráfico de dispersión comparando los recuentos manuales utilizando el plugin de ImageJ Contador celular en comparación con el recuento automatizado de las mismas imágenes que usa la calculadora concentración celular. n = 57 imágenes. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54719/54719fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54719/54719fig2.jpg" /> Figura 2: Ensayo de Migración contador de imágenes representativas. (A) El panel superior es una octava parte de un total de membrana que representa una imagen ideal con el fondo mínimo; Barra de escala = 200 micras. lapanel inferior contiene una imagen con la tinción de fondo significativo que afecta gravemente a la exactitud de la cuenta automática; Barra de escala = 585 micras. (B) El panel superior representa una imagen oscura de buena calidad que produce conteos inexactos. El panel inferior es una versión contable de la misma imagen después de la corrección flatfield. Barras de escala = 593 m. (C) El panel superior representa una vista ampliada de una membrana típica. El panel inferior es la misma imagen seguido por el umbral de color ImageJ deseado (umbral RGB = 150, 120, 0) para eliminar el fondo intercelular y la mayoría del citoplasma visiblemente manchadas. Todas las imágenes fueron tomadas en 1.35x ampliación total con un microscopio de disección calibrada a una resolución de 2.592 x 1.944 píxeles de múltiples invasiones ensayo de migración de HTR8 teñidas con hematoxilina. Barras de escala = 100 m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54719/54719fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para competir</a>wa versión más grande de esta figura. <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54719/54719fig3.jpg" /> Figura 3: La calibración y validación del ensayo de migración c ounter. (A) Un ejemplo típico de una imagen sin calibrar de alta calidad. (B) La versión calibrada de (A) mediante la migración recuento de contador de ensayo&gt; &#39;El tamaño sugerido&#39;. (C) Un gráfico de frecuencia típica de una membrana de baja calidad de imagen con una significativa mancha de fondo u oscuridad total. (D) Un gráfico de dispersión comparando los recuentos manuales utilizando el plug-in de contador celular ImageJ y el contador de ensayo de migración de los recuentos automáticos. (E) Un gráfico de barras que muestra la diferencia porcentual promedio de calibrado frente a los recuentos automáticos calibrados. Los datos son media ± SE. P &lt;0,0001, n = 30, t-test no pareado con corre de Welchcción. Las mismas imágenes se utilizaron para D y E. La calibración de ambos se hizo con el recuento&gt; &#39;El tamaño sugerido&#39; y recuento&gt; &#39;&#39; Los ajustes manuales para refinar aún más el tamaño mínimo de contado y el umbral de color. No se requieren ajustes manuales de conteo se hicieron utilizando la &quot;imagen abierta con recuentos &#39;función. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54719/54719fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54719/54719fig4.jpg" /> Figura 4: El tiempo del contador de concentración de células y la utilización de contador de ensayo de migración. (A) Comparación de las horas de calibración CCC (pasos 1 y 2) entre el usuario 1 (CCC / experto TC) y Usuario 2 (CCC / TC novatos). (B) tiempos de conteo de células manual se promediaron durante cinco ensayos y se expresaron en células contadas por min. Automatic recuentos se calcularon los tiempos promedio para capturar nueve imágenes de una cámara de hemocitómetro y se contaron con la CCC. La concentración celular utilizada fue ~ 1,15 x 10 6 células / ml. Los datos son media ± SE. n = 5. (C) los tiempos de Transwell contador se compararon más de tres categorías: las de adquisición (Acq; los pasos 7 y 8), cuantificación (Qnt; 10.1-10.3.3 pasos usando los valores de configuración por defecto), y ajuste manual (Adj; steps 10.4 -1.4.2). Las membranas cuantificados tenían un alto grado de tinción de fondo y los residuos con el fin de hacer necesario un ajuste manual considerable para recuentos exactos. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54719/54719fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

This paper describes the quantification of hemocytometer and migration/invasion micrographs through two new open-source ImageJ plugins Cell Concentration Calculator and migration assay Counter. Furthermore, it describes image acquisition and calibration protocols as well as discusses in detail the input requirements of the plugins.

Automatizado de cuantificación y análisis de los procedimientos de recuento de células usando ImageJ Plugins

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis ...

automated-quantification-analysis-cell-counting-procedures-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

46.7K vistas.  York University. This paper describes the quantification of hemocytometer and migration/invasion micrographs through two new open-source ImageJ plugins Cell Concentration Calculator and migration assay Counter. Furthermore, it describes image acquisition and calibration protocols as well as discusses in detail the input requirements of the plugins.

Video: Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

Contar y determinar la viabilidad de las células cultivadas

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Investigación

Biología

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

Semi-automatizado de análisis óptico latido de los corazones pequeños

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. 

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK pathway in zebrafish embryos. The zebrafish embryo is an ideal system for in vivo high-content chemical screens. The 1-day old embryo is approximately 1mm in diameter and can be easily arrayed into 96-well plates, a standard format for high throughput screening. During the first day of development, embryos are transparent with most of the major organs present, thus enabling visualization of tissue formation during embryogenesis. The complete automation of zebrafish chemical screens is still a challenge, however, particularly in the development of automated image acquisition and analysis. We previously generated a transgenic reporter line that expresses green fluorescent protein (GFP) under the control of FGF activity and demonstrated their utility in chemical screens 1. To establish methodology for high throughput whole organism screens, we developed a system for automated imaging and analysis of zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in 96-well plates 2. In this video we highlight the procedures for arraying transgenic embryos into multiwell plates at 24hpf and the addition of a small molecule (BCI) that hyperactivates FGF signaling 3. The plates are incubated for 6 hours followed by the addition of tricaine to anesthetize larvae prior to automated imaging on a Molecular Devices ImageXpress Ultra laser scanning confocal HCS reader. Images are processed by Definiens Developer software using a Cognition Network Technology algorithm that we developed to detect and quantify expression of GFP in the heads of transgenic embryos. In this example we highlight the ability of the algorithm to measure dose-dependent effects of BCI on GFP reporter gene expression in treated embryos.

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

We report the development of a system for automated imaging and analysis of zebrafish transgenic embryos in multiwell plates. This demonstrates the ability to measure dose dependent effects of a small molecule, BCI, on Fibroblast Growth Factor reporter gene expression and provide technology for establishing high-throughput zebrafish chemical screens.

Desarrollo de la imagen y el análisis automatizado de pantallas de química de pez cebra.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Determination of Mammalian Cell Counts, Cell Size and Cell Health Using the Moxi Z Mini Automated Cell Counter

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A critical breakthrough in cell/particle counting technologies was the development of the Coulter technique by Wallace Coulter over 50 years ago. The technique involves the application of an electric field across a micron-sized aperture and hydrodynamically focusing single particles through the aperture. The resulting occlusion of the aperture by the particles yields a measurable change in electric impedance that can be directly and precisely correlated to cell size/volume. The recognition of the approach as the benchmark in cell/particle counting stems from the extraordinary precision and accuracy of its particle sizing and counts, particularly as compared to manual and imaging based technologies (accuracies on the order of 98% for Coulter counters versus 75-80% for manual and vision-based systems). This can be attributed to the fact that, unlike imaging-based approaches to cell counting, the Coulter Technique makes a true three-dimensional (3-D) measurement of cells/particles which dramatically reduces count interference from debris and clustering by calculating precise volumetric information about the cells/particles. Overall this provides a means for enumerating and sizing cells in a more accurate, less tedious, less time-consuming, and less subjective means than other counting techniques6.
Despite the prominence of the Coulter technique in cell counting, its widespread use in routine biological studies has been prohibitive due to the cost and size of traditional instruments. Although a less expensive Coulter-based instrument has been produced, it has limitations as compared to its more expensive counterparts in the correction for "coincidence events" in which two or more cells pass through the aperture and are measured simultaneously. Another limitation with existing Coulter technologies is the lack of metrics on the overall health of cell samples. Consequently, additional techniques must often be used in conjunction with Coulter counting to assess cell viability. This extends experimental setup time and cost since the traditional methods of viability assessment require cell staining and/or use of expensive and cumbersome equipment such as a flow cytometer.
The Moxi Z mini automated cell counter, described here, is an ultra-small benchtop instrument that combines the accuracy of the Coulter Principle with a thin-film sensor technology to enable precise sizing and counting of particles ranging from 3-25 microns, depending on the cell counting cassette used. The M type cassette can be used to count particles from with average diameters of 4 - 25 microns (dynamic range 2 - 34 microns), and the Type S cassette can be used to count particles with and average diameter of 3 - 20 microns (dynamic range 2 - 26 microns). Since the system uses a volumetric measurement method, the 4-25 microns corresponds to a cell volume range of 34 - 8,180 fL and the 3 - 20 microns corresponds to a cell volume range of 14 - 4200 fL, which is relevant when non-spherical particles are being measured. To perform mammalian cell counts using the Moxi Z, the cells to be counted are first diluted with ORFLO or similar diluent. A cell counting cassette is inserted into the instrument, and the sample is loaded into the port of the cassette. Thousands of cells are pulled, single-file through a "Cell Sensing Zone" (CSZ) in the thin-film membrane over 8-15 seconds. Following the run, the instrument uses proprietary curve-fitting in conjunction with a proprietary software algorithm to provide coincidence event correction along with an assessment of overall culture health by determining the ratio of the number of cells in the population of interest to the total number of particles. The total particle counts include shrunken and broken down dead cells, as well as other debris and contaminants. The results are presented in histogram format with an automatic curve fit, with gates that can be adjusted manually as needed.
Ultimately, the Moxi Z enables counting with a precision and accuracy comparable to a Coulter Z2, the current gold standard, while providing additional culture health information. Furthermore it achieves these results in less time, with a smaller footprint, with significantly easier operation and maintenance, and at a fraction of the cost of comparable technologies.

The Moxi Z miniature automated cell counter is a novel instrument that combines the Coulter Principle with patented thin-film sensor technology and a proprietary software algorithm to perform sizing and counting of a broad size range of particles as well as to determine the overall health of monodisperse mammalian cell cultures. This protocol describes the use of this instrument for counting and assessing the health of cell cultures.

Determinación del recuento de células de mamíferos, el tamaño celular y la salud de la célula mediante el Moxi Z Mini contador automatizado de células

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

Análisis específico de célula de<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Hojas usando citometría de flujo

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the primary photosynthetic organ, and their size and shape vary developmentally and environmentally within a plant. For these reasons studies on leaf morphology require measurement of multiple parameters from numerous leaves, which is best done by semi-automated phenomics tools5,6. Canopy shade is an important environmental cue that affects plant architecture and life history; the suite of responses is collectively called the shade avoidance syndrome (SAS)7. Among SAS responses, shade induced leaf petiole elongation and changes in blade area are particularly useful as indices8. To date, leaf shape programs (e.g. SHAPE9, LAMINA10, LeafAnalyzer11, LEAFPROCESSOR12) can measure leaf outlines and categorize leaf shapes, but can not output petiole length. Lack of large-scale measurement systems of leaf petioles has inhibited phenomics approaches to SAS research. In this paper, we describe a newly developed ImageJ plugin, called LeafJ, which can rapidly measure petiole length and leaf blade parameters of the model plant Arabidopsis thaliana. For the occasional leaf that required manual correction of the petiole/leaf blade boundary we used a touch-screen tablet. Further, leaf cell shape and leaf cell numbers are important determinants of leaf size13. Separate from LeafJ we also present a protocol for using a touch-screen tablet for measuring cell shape, area, and size. Our leaf trait measurement system is not limited to shade-avoidance research and will accelerate leaf phenotyping of many mutants and screening plants by leaf phenotyping.

Demonstration of key methods for high throughput leaf measurements. These methods can be used to accelerate leaf phenotyping when studying many plant mutants or otherwise screening plants by leaf phenotype.

LeafJ: Un Plugin para ImageJ Semi-automático Medición Hoja Forma

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

Clock Scan Protocol for Image Analysis: ImageJ Plugins

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a closed or segmented convex-shaped region of interest, leading to the generation of an averaged integral radial pixel-intensity profile. This protocol was originally developed in 2006, as a visual basic 6 script, but as such, it had limited distribution. To address this problem and to join similar recent efforts by others, we converted the original clock scan protocol code into two Java-based plugins compatible with NIH-sponsored and freely available image analysis programs like ImageJ or Fiji ImageJ. Furthermore, these plugins have several new functions, further expanding the range of capabilities of the original protocol, such as analysis of multiple regions of interest and image stacks. The latter feature of the program is especially useful in applications in which it is important to determine changes related to time and location. Thus, the clock scan analysis of stacks of biological images may potentially be applied to spreading of Na+ or Ca++ within a single cell, as well as to the analysis of spreading activity (e.g., Ca++ waves) in populations of synaptically-connected or gap junction-coupled cells. Here, we describe these new clock scan plugins and show some examples of their applications in image analysis.

This paper describes two novel ImageJ plugins for &#39;Clock Scan&#39; image analysis. These plugins expand the functionality of the original visual basic 6 program and, most importantly, make the program available to a large research community by bundling it with the ImageJ free image analysis software package.

Protocolo de análisis de reloj para análisis de imagen: Plugins de ImageJ

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a ...

Measuring the Confluence of iPSCs Using an Automated Imaging System

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence in real time has been established without the need to count cells in single cell suspension to avoid any growth perturbation. A high-content image analysis system was used to assess iPCS confluence on 4 different ECMs over time in an automated manner. Different analysis settings were used to assess cell confluence of adherent iPSCs and only a slight difference (at 24 and 48 hours with laminin) has been observed whether a 60, 80 or 100% mask was applied. We also show that laminin lead to the best confluence compared to Matrigel, vitronectin and fibronectin.

The goal of the protocol is to compare different extracellular matrix (ECM) coating conditions to assess how differential coating affects the growth rate of induced pluripotent stem cells (iPSCs). In particular, we aim to set up conditions to obtain optimal growth of iPSC cultures.

Medición de la confluencia de iPSCs utilizando un sistema automatizado de imágenes.

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

Preparación de la rejilla microscópica crio-electrónica para estudios resueltos en el tiempo utilizando un nuevo sistema robótico, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Automated Detection and Analysis of Exocytosis

Timelapse TIRF microscopy of pH-sensitive GFP (pHluorin) attached to vesicle SNARE proteins is an effective method to visualize single vesicle exocytic events in cell culture. To perform an unbiased, efficient identification and analysis of such events, a computer-vision based approach was developed and implemented in MATLAB. The analysis pipeline consists of a cell segmentation and exocytic-event identification algorithm. The computer-vision approach includes tools for investigating multiple parameters of single events, including the half-life of fluorescence decay and peak &#916;F/F, as well as whole-cell analysis of the frequency of exocytosis. These and other parameters of fusion are used in a classification approach to distinguish distinct fusion modes. Here a newly built GUI performs the analysis pipeline from start to finish. Further adaptation of Ripley&#39;s K function in R Studio is used to distinguish between clustered, dispersed, or random occurrence of fusion events in both space and time.

We developed automated computer vision software to detect exocytic events marked by pH-sensitive fluorescent probes. Here, we demonstrate the use of a graphical user interface and RStudio to detect fusion events, analyze and display spatiotemporal parameters of fusion, and classify events into distinct fusion modes.

Detección y análisis automatizados de exocitosis

Timelapse TIRF microscopy of pH-sensitive GFP (pHluorin) attached to vesicle SNARE proteins is an effective method to visualize single vesicle exocytic ...