현장 지향 돌연변이 발생은 RNA-RNA 및 RNA 단백질 상호 작용과 같은 분자 상호 작용을 연구하는 데 유용합니다. 이 프로토콜은 2단계 또는 3단계 PCR 접근 방식을 사용하여 사이트 지향 돌연변이 발생을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 방법의 주요 장점은 통합 될 수있는 다른 돌연변이의 다양성뿐만 아니라 상대적 용이성과 비용을 수행하는 것입니다.
시작하려면, 야생형 DNA 템플릿과 프라이머 쌍을 2단계, 2, 3, 2단계, 또는 프라이머 쌍 3, 1, 3, 4, PCR 제품 1개를 획득한다. 아가로즈 젤 전기포광에 의한 PCR 제품의 유효성을 검사하려면 전자레인지를 사용하여 1X TAE 버퍼 100밀리리터에 아가로즈 2그램을 용해하여 2%의 아가로즈 젤을 만듭니다. 밀리리터당 0.5 마이크로그램의 최종 농도에서 에티듐 브로마이드를 추가합니다.
그런 다음 아가로즈 젤을 캐스팅합니다. 고형화되면 전기 전도 장치에 놓습니다. 알려진 크기의 DNA 사다리를 적재하고, PCR 샘플을 DNA 적재염료와 혼합하여 우물에 넣습니다.
샘플을 75볼트에서 45분간 실행합니다. 또한 UV 트랜틸루미나이터 또는 젤 이미징 시스템으로 밴드를 시각화합니다. 다음으로, 제조업체 프로토콜에 따라 젤 추출 키트로 PCR 제품을 정화하고 분광계로 정제된 DNA의 농도를 측정한다.
그런 다음 정제 된 DNA를 TE 버퍼에 영하 20 섭씨로 저장합니다. 2단계 PCR로 사이트 지향 돌연변이 발생을 시작하려면 먼저 야생형 DNA 템플릿을 사용한 다음 프라이머는 5개의 프라이머 돌연변이에 대해 2, 1, 2, 2, 프라이머 쌍을 2, 2, 2, 3개, 3개의 프라이머 돌연변이에 대해 PCR 제품 2개를 얻습니다. 젤 전기전도에 의한 PCR 제품을 검증하고, PCR 제품을 정화하고, 앞에서 설명한 바와 같이 농도를 측정한다.
이어서 야생형 DNA 템플릿과 PCR 제품 2를 프라이머로 사용하고, 프라이머 2, 5개의 프라이밍 돌연변이에 대해 3개, 프라이머 2개, 3개의 프라이밍 돌연변이에 대해 1개, PCR 생성물 3개를 획득한다. 젤 전기전도에 의한 PCR 제품을 검증하고, PCR 제품을 정화하고, 앞에서 설명한 바와 같이 농도를 측정한다. 그런 다음 정제 된 DNA를 TE 버퍼에 영하 20도의 섭씨로 저장합니다.
3단계 PCR로 사이트 직접 돌연변이 발생을 시작하려면 먼저 야생형 DNA 템플릿과 프라이머 쌍을 3, 1, 3, 2로 사용하여 PCR 제품 2를 얻습니다. 야생형 DNA 템플릿과 프라이머 쌍 3, 3, 3, 4를 사용하여 PCR 제품 3개를 얻습니다. 야생형 DNA 템플릿과 프라이머 쌍 3, 3, 3, 4를 사용하여 PCR 제품 3개를 얻습니다.
젤 전기전도에 의한 PCR 제품을 검증하고, PCR 제품을 정화하고, 앞에서 설명한 바와 같이 농도를 측정한다. 마지막으로 PCR 제품의 2 ~ 5 나노 그램을 프라이머 쌍 3, 1 및 3, 4와 함께 템플릿으로 사용하여 PCR 제품 4개를 얻습니다. 젤 전기전도에 의한 PCR 제품을 검증하고, PCR 제품을 정화하고, 앞에서 설명한 바와 같이 농도를 측정한다.
정제된 DNA를 TE 버퍼에 영하 20도에 저장합니다. 이 연구에서는, 2단계 및 3단계 사이트 지향 돌연변이 발생은 CsgD의 전사 후 조절에 관한 RNA 상호 작용을 조사하기 위해 사용되었다. 야생형 CsgD는 PCR 제품 IA를 산출하기 위해 PCR증폭되었고, 야생형 맥아S는 PCR 제품 IB를 산출하기 위해 증폭되었다. 3단계 PCR 전략을 사용하여 PCR 제품 IIA 및 IIIA는 처음 두 단계로 합성되었으며, CSGD에서 돌연변이를 도입하는 세 번째 단계에서 IVA가 합성되었습니다.
유사하게, 무료 사이트 지향 돌연변이는 처음 두 단계에서 PCR 제품 IIB, IIIB, 및 제 3 단계에서 IVB를 산출하기 위해 mcaS에 도입되었다. 서양 얼룩 분석은 야생 형 mcaS의 발현이 야생 형 CsgD의 번역을 방지하지만 mcaS 또는 CsgD의 돌연변이는 관찰 된 억압을 완화한다는 것을 보여주었습니다. 그러나, CsgD와 mcaS 둘 다에 있는 돌연변이는 CsgD의 번역을 방지합니다.
2단계 PCR 전략을 사용하여 PCR 제품 IIC, IID, IIE, IIF 및 IIG를 첫 번째 단계에서 합성하고, PCR 제품 IIIC, IIID, IIIE, IIIF 및 IIIG를 통합하여 전체 CsgD DNA에 돌연변이를 도입하였다. 시험관 내 전사CsGD 와일드 타입 및 돌연변이 RNA에 대한 HFQ 결합의 EMSA 결과는 PCR 제품 IIIC, IIID, IIIE, IIIF 및 IIIG를 사용하여 합성되어 돌연변이 선제의 KD 값이 증가하는 것을 보여주었다. 이것은 HFQ가 돌연변이에 덜 효율적으로 결합할 수 있다는 것을 증명했습니다.
또한 HFQ는 CsgD에 대한 여러 결합 부위를 가지고 있으며, 이는 야생 형 RNA에 대해 관찰된 세 교대에 의해 나타난다. 그러나 다른 돌연변이 RNA에 대해 두 개의 바인딩 사이트만 관찰됩니다. 따라서 현장 지향 돌연변이 접근법은 HFQ의 완전한 결합에 중요한 CsgD mRNA의 1차 또는 이차 구조를 식별합니다.
여기에 설명된 사이트 지향 돌연변이 발생에 대한 방법은 PCR에 의존합니다. 좋은 PCR 관행은 이 방법에 매우 중요하며 성공하려면 최적화가 필요할 수 있습니다. 현장 지향 돌연변이 발생은 EMSA 및 웨스턴 블로팅과 같은 세 가지 방법 모두에서만 강력합니다.
다른 방법, 예를 들어, 다양 한 구조 적인 해석 및 일부 활동 에세이를 포함, 번역 수정 연구 후.
