This study was supported by a K08 Award (DK090154-01) from the National Institutes of Health (NIH; to F.M.S.).

내시경 역행 췌담 관 조영술에 의한 환자에서 담즙을 취득 (ERCP)는 임상 시험 심사위원회에 의해 인간 대상 연구 프로토콜의 승인을 필요로한다. 여기에 제시된 모든 작업은 존스 홉킨스 대학의 임상 시험 심사위원회의 승인을했다. 담즙 1. 엑소 좀 격리 <ol><li> 내시경 역행 췌담 관 조영술 (ERCP)을 수행합니다. 앙와위에서 환자를 놓고 삽관. <ol><li> 환자의 구강을 통해 십이지장을 전달하고 십이지장의 두 번째 부분에 삽입하고 주요 유두를 식별합니다. </li><li> 선택적 트리플 루멘은 0.035 인치 (0.9 mm) 가이드 와이어 친수성 ​​사전로드 sphincterotome 삽입하여 담관을 cannulate. </li><li> 경우에는 바로 간 덕트에서 담낭 관을 구별하기 어려울 수 있기 때문에 왼쪽 간장 덕트 투시하에 가이드 와이어를 사전, 다음을 발전안정된 위치를 취득하는 담관에 5cm를 sphincterotome. </li><li> 루어 잠금 장치를 통해 가이드 와이어 포트에 10 ML의 주사기를 연결, 가이드 와이어를 제거하고 부압 10 ㎖를 사용하여 담즙을 대기음. </li><li> 가이드 와이어를 다시 삽입하여 담즙 트리를 opacify하기 위해 주입 포트를 통해 조영제를 주입하여 ERCP를 진행하는 담즙이 들어있는 주사기를 제거합니다. </li><li> 얼음에 15 ML 튜브에 수집 된 담즙을 전송하고 원심 분리 단계를 진행하기 위해 준비가 될 때까지 얼음에 보관하십시오. 주의 : 자신과 샘플을 보호하기 위해 장갑을 착용! 이 A 형 간염 바이러스 입자를 포함 할 수있는 감염의 잠재적 인 소스로 담즙 치료! </li><li> 얼음 샘플 (들)을 유지합니다. 어느 10 분 동안 4 ° C에서 500 XG에 단계 1.2 원심 분리기를 진행 한 후 추가로 사용할 때까지 -80 ℃에서 동결. 참고 : 몇 년 동안 이런 식으로 저장 샘플은 일상적으로 좋은 결과를 19로 사용되어왔다. </li></ol&gt; </li><li> 미세 원심 튜브에 전송 담즙의 400 μl를 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리하여 세포와 세포 파편을 수집합니다. </li><li> , 피펫으로 상층 액을 제거 신선한 microcentrifuge 관에 전송하고 더 파편의 상층 액을 취소 4 ° C에서 또 다른 20 분 동안 16,500 XG에서 샘플 (들)을 원심 분리기. 생물 학적 폐기물 튜브를 폐기하십시오. 이와 달리, 대신 초 원심 분리기에서 샘플을 스핀. </li><li> 상층 액을 수집하고 왼쪽 내지 200 nm보다 큰 모든 입자를 제거하는 바인딩 좋은 흐름 속도와 낮은 단백질이 0.2 μm의 폴리 에테르 설폰 (PES) 멤브레인 필터 주사기와 바이오 안전성 캐비닛을 필터링 할 수 있습니다. </li><li> 피펫 필터링 된 상층 액을 튜브를 초 원심 분리기와 튜브가 2/3 이상 전체되도록 PBS를 추가합니다. 튜브는보다 작은 액체를 포함 할 경우, 튜브는 원심 분리 동안 붕괴 것입니다! 튜브, 세정 및 멸균을 여러 번 재사용 될 수있다. </li><li> 펠등 4 ° C에서 70 분 동안 120,000 XG에 초 원심 분리를 통해 엑소 좀. 때로는 작은 노란색 알약을 볼 수있는 초원 심 분리기 튜브의 하단에있는 원심 분리 봐 후, 이러한 엑소 좀이있다. </li><li> 조심스럽게 경사에 의해 뜨는을 취소하고 10 % v / V를 최종 농도 표백제를 추가하여 폐기물을 소독하고 20 분 동안 서 보자. </li><li> 하류 실험 어느 적절한 용액의 소량의 펠릿 (들)을 처리 (즉, radioimmunoprecipitation 분석 (RIPA) 단백질 격리 미르 격리를위한 RNA 용해 버퍼 버퍼) 또는 인산 50-150 μL 그것을 재현 탁 버퍼링 어느 TEM 또는 나노 입자의 광학 분석하여 엑소 제제 특성 -80 나중에 사용할 °의 C (정량적 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (QRT-PCR) 또는 단백질의 추출 등)에 저장 또는 사용할 수있는 생리 식염수 (PBS) . </li></ol> 2. 엑소 좀 확인투과 전자 현미경 (TEM) 또는 CryoEM <ol><li> 피펫 팅에 의해 PBS 100 ㎕의 세포 외 소포를 재현 탁. 처음으로 분리를 수행 할 때 특히 이상적으로, -20 ° C에서 저장되거나되지 않은 -80 ° C 엑소 좀을 사용한다. </li><li> 2 분 동안 400 메쉬 탄소 코팅 Parlodion 구리 그리드에 20 μL 나누어지는 (약 2 μg의)를 흡착하고 실온에서 건조 할 수 있습니다. </li><li> 건조 준비에 신중 방울을 배치하여 실온에서 5 분 동안 1 % (v / v)의 글루 타르 알데히드 (EM-등급)의 엑소 좀을 수정합니다. </li><li> 5 분 동안 물을 두 번 그리드를 세척 한 다음 30 초 동안 1 % 인 텅스텐 산 (PTA)와 얼룩 전기 자동차를 대조. </li><li> 80 킬로 볼트의 가속 전압 20,000X의 배율에서 시작하여 입자의 크기를 결정할 때까지 증가 100,000X 전자 현미경 이미지를 획득. 참고 : 다른 최상의 상태로 준비를 Formvar 탄소 코팅 200 메쉬 구리 또는 니켈 그리드 및 대비 염색 리에 레이어처럼10-15 분 KE 1 % 2 % 우라 닐 아세테이트 또한 가능하다. </li><li> (: 3 비율 1) CryoEM를 들어, 60 ㎕의 단백질 G 골드 10 나노와 20 μL 나누어지는 (약 2 μg의)를 섞는다. 이 엑소 직경을 결정하는 것을 도울 것이다. </li><li> 글로우 방전 C-평면 구멍 투성이의 탄소 격자에 샘플을 전송하고 모래 바닥으로 물기를 제거합니다. 액체 에탄에 즉시 침지하여 그리드를 고정. </li><li> 액체 질소에 cryoholder에서 그리드를 탑재합니다. </li><li> 20,000X 및 100,000X의 배율 200 kV로의 이미지를 획득. </li></ol> 다중 매개 변수 나노 입자 광학 분석 3. 엑소 좀 확인 <ol><li> 피펫 팅에 의해 PBS 100 ㎕에 고립 된 엑소 좀을 재현 탁. </li><li> 여러 비율로 600 ㎕의 PBS에 희석 엑소 좀 (같은 1시 50분, 1 : 100, 1 : 300, 1 : 600, 1 : 1200). </li><li> manufactu는에 따라 실시간으로 해당 기기와 소프트웨어 레이저 광의 산란에 의한 엑소 좀 시각화총통의 프로토콜 20. </li><li> 입자가 표시 될 때까지 입자가 부드럽게 보이도록 포커스 조정 촬영 모드에서 카메라의 수준을 증가시킨다. </li><li> 표준 모드에서, 입자는 여전히 볼 수있는 최저 레벨에 카메라를 감소하는 동안 필요한 카메라 셔터 게인을 조정하는 경우,이를 달성하기 위해. </li><li> 시각적 장치를 세척하고 PBS에 희석을 조정하지 않을 경우, 20 ~ 100 입자가 화면에 볼 수 있습니다 보장하기 위해 확인합니다. </li><li> 그런 다음 30 ~ 60 사이의 초 캡처 시간을 조정합니다. 비디오가 캡처 된 후에, 모든 입자가 화면에 확인 될 때​​까지 처리 파라미터를 조정하고 비디오 파일을 처리한다. </li></ol> 서쪽 오점 4. 엑소 좀 특성 <ol><li> 얼음처럼 차가운 radioimmunoprecipitation 분석 100 ㎕에서 담즙의 2-5 ml의의를 Lyse의 엑소 좀 펠릿 (RIPA)는 최대 피펫 팅하여 단백질 분해 효소 억제제와 버퍼 아래 철저하게 30 초 동안 적극적으로 해물을 섞어소용돌이에 효과적으로 단백질을 가용화합니다. </li><li> 대부분의 시간에 필요하지는 않지만, 완전한 용해를 보장하기 위해 10 초마다 2 펄스 얼음 샘플의 초음파 펄스를 사용한다. </li><li> 5 분 동안 4 ° C에서 15,000 XG에서 원심 분리하여 불용성 물질을 펠렛 깨끗한 튜브에 뜨는을 전송합니다. </li><li> 선택의 방법은 제조사의 프로토콜에 따라 (즉, bicinchoninic 산 (BCA), 쿠마 수정 로리 660 nm의 단백질 분석 등)으로 단백질 농도를 결정한다. 동일한 방법은 실험간에 비교할 수 결과를 달성하기 위해 지속적으로 사용되는 방법은 긴만큼 중요하지 않다. </li><li> 전기 영동 (PAGE)하는 폴리 아크릴 아미드 겔의 웰에 5 분 동안 95 ℃에서 시료를 가열 한 후 부하 램리 버퍼에 샘플 당 50 μg의 단백질을. </li><li> 1.5 시간의 PAGE 겔에 샘플을 Electrophorese 및 나일론 막에에서 분리 된 단백질을 전송합니다. </li><li> 비이어서 희석 항 CD63, 항 TSG-101와 같은 엑소 특이 항체 부화 1 시간 동안 0.1 % 트윈 20 (TBS-T)를 TBS 버퍼에서 5 % 무 지방 우유 멤브레인 (들)을 잠금 1 : 500, 바람직 O / N 4 ° C에서. </li><li> TBS-T 3 × 10 분으로 막을 세척 한 다음 실온에서 1-2 시간 동안 TBS-T에서 5 % 무 지방 우유에 HRP - 복합 이차 항체와 일치하는 적절한으로 품어. </li><li> 멤브레인 (들) TBS-T와 3 × 5 분을 씻고 제조 업체의 프로토콜에 따라 화학 발광 시약으로 특정 단백질을 검출한다. </li><li> 이미지 필름 제조자의 프로토콜에 따른 디지털 이미징 시스템 멤브레인. </li></ol> 격리 된 엑소 좀 5. 마이크로 RNA 분리 주 : 담즙 엑소 좀에서의 miRNA의 분리는 시판되는 키트에 기초하여 변형 된 miRNA의 분리를 사용하여 수행되지만, 기타 RNA 분리 방법이 사용되거나 적용될 수있다. <ol><li> 추가 300# 181; 리터 용해 / (400 ㎕의 담즙에서 격리) 엑소 좀 펠렛, 소용돌이, 피펫 또는 완전히 균일 한 해물을 얻기 위해 엑소 좀을 용균하는 바늘 / 주사기 통과에 건물 버퍼입니다. </li><li> miRNA의 균질 현탁액 첨가제의 1/10 (30 μL) 볼륨을 추가하고 텍싱 또는 튜브 몇 시간을 반전하여 잘 섞는다. </li><li> 얼음에 10 분 동안 믹스를 품어. </li><li> 산 페놀의 볼륨을 추가 : 초기 균질 (300 μL)와 동일한 클로로포름. </li><li> 30 ~ 60 초 동안 5 5 fmol / μL CEL-은 miR 39 μL와 소용돌이를 추가합니다. </li><li> 10,000 RT는 수성 (위) 분리에 XG 및 유기 (아래) 단계에서 5 분 동안 원심 분리기. </li><li> 이전 볼륨을 지적하면서 조심스럽게 새로운 튜브에 피펫 및 전송하여 상위 단계를 대기음. 적절한 유기 폐기물 용기에 유기 상을 폐기하십시오. </li><li> 작은 RNA를 철저하게 TU을 텍싱 또는 반전에 의해 복구 된 수상에 1/3 볼륨 100 % 에탄올을 추가하고 혼합에 대한 풍부합니다여러 번합니다. </li><li> 피펫으로 한 번에 최대 700 μL의 필터 카트리지 상 해물 / 에탄올 혼합물. </li><li> 10,000 XG의 최대 15 초 동안 카트리지를 원심 분리기 또는 필터를 통해 혼합물을 통과 진공을 적용합니다. </li><li> 여액을 수집하고, 용 해물 / 에탄올 혼합물 700 μl를 초과하는 경우, 새로운 튜브에 관류 전송할 모든 여액을 수집하는 절차를 반복한다. 이러한 필터는 작은 RNA를 결여 RNA 분획을 포함하고 이러한 큰 RNA를 복구하는데 사용될 수있다. </li><li> 총 여과 액을 RT 100 % 에탄올의 2/3 볼륨을 추가하고 텍싱에 의해 철저하게 섞는다. </li><li> 피펫 제 2 필터 카트리지 상에 여과 액 / 에탄올 혼합물. 동시에인가 할 수있는 최대 부피는 700 μL 체감 전에. </li><li> 10,000 XG에 15 초 동안 원심 분리기 또는 단계 5.10에 설명 된대로 진공을 적용합니다. </li><li> 흐름을-통해 폐기, 여과 된 여과 물 / 에탄올 혼합물의 모든 때까지 반복합니다. </li><li> (700)를 적용(81) 상기 필터 카트리지 (L)의 miRNA 세척 용액 1, 5-10 초 또는 진공을 적용하고, 통과 물을 폐기 원심 분리기. </li><li> 단계 5.16에서 수행으로 500 ㎕의 세척 용액을 2/3로 필터를 씻으십시오. </li><li> 단계 516에서와 같이 세척을 세척액 2/3 500 μL로 두 번 반복하여 플로우 스루를 버리고 다시 포집 관에서 필터를 배치했다. </li><li> 필터 모든 잔류 유체를 제거하기 만 XG에서 1 분 동안 필터 카트리지 스핀. </li><li> 새로운 포집 관에 필터 카트리지를 전송하고, 필터의 중심 열 (95 ° C) 클레아없는 물 100 μL를 적용한다. </li><li> RNA를 복구하는 최대 속도로 20 ~ 30 초 동안 스핀 어셈블리. </li><li> 용출액을 수집하고 즉시 사용 또는 -80 ° C에 저장합니다. </li></ol>

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None of the authors have competing financial interests.

확실 담즙 분리 엑소 좀을 이용하기 위해, 창에 고품질의 샘플을 얻기 위해 일관된 고품질의 분리 방법을 채용하는 것이 중요하다. 이 논문에 정의 된 방법론은 인간의 담즙에서 엑소 좀과의 miRNA를 분리하는 잘 확립 된 방법입니다. 그것은 최소한 전자 현미경이나 나노 입자의 광학 분석 및 웨스턴 블롯을 포함한다 고립 엑소 좀의 특성 몇 가지 중요한 단계를 강조한다. 이 miRNA의 안정성에 관해서 엑소 좀의 분리에서 가장 중요한 단계는 적어도 가능한 빨리 신선한 담즙 처리하는 것이다. RT 또는 여러 동결 - 해동 사이클을 받고 저장하더라도 달리 격리 엑소 좀은 매우 안정한 반면 RT에서 전체 담즙 또는 하나의 동결 - 해동 사이클의 장기간 보관 크게 miRNA의 함량을 감소시킬 수있다. 한 문제의 샘플은 -80 ° C, 엑소 좀 미르의 성공적인 분리에 저장되어있는로담즙의 NA는 샘플에서 miRNA의 서명을 식별하는 데 좋은 재현성으로 수행 될 수있다. 초기에 적절한 miRNA의 무결성을 보장하기 위해 신선한 담즙으로 시작하는 것이 좋습니다. 이는 환자 샘플의 경우되는 바와 같이 시간의 경과 담즙 샘플의 수집을 구축하려고 중요한 고려 사항이다. 또한 동시에 처리되고 평가 될 수 개월 또는 수년 동안 수집 된 샘플을 처리하기 위해 하나를 가능하게한다. 이것은 크게 암과 같은 질병 상태의 존재 또는 치료 개입에 대한 질병의 응답을 확인 miRNA의 서명을 검색하거나, 진단 목적 담즙의 사용을 향상시킨다. 실제로, 임상 샘플로부터 결과 담관암 19 생체로의 miRNA 서명을 설정하는 데 사용되어왔다. 첫 번째 원심 분리 단계는 담즙에 존재하는 그대로 세포를 제거합니다. 두 번째에서는, 고속 원심 셀 DEBRIS, 세포 사멸 기관 및 다른 큰 소기관은 펠렛된다. 단지 작은 200nm 이하의 초 원심 분리 단계에서 수집 된 입자가되도록하여, 낮은 단백질 결합 필터로 여과 공정이 중요하다. 일부 프로토콜은이 단계를 생략하지만, 우리는 그것이 필요하다고 생각합니다. 120,000 XG에서 초 원심 분리 후 얻어진 펠렛은 -80 ° C에서 보관 PBS 즉시 또는 재 부유 한 후 처리 할 수​​ 있습니다 매우 순수한 엑소 좀이 포함되어 있습니다. 이 방법의 한계를 얻을 펠릿은 매우 엑소 좀에 충실하지만이 같은 크기 배제 및 고분자 침전 등의 농축 방법에 대한 사실이다. 또한 처리 자당 기울기 또는 항체 코팅 자석 구슬에 결합하여 다른 정제 단계를 수반 할 수 있습니다. 엑소 좀의 소스가 (예처럼 플라즈마) 응고의 결과로 석출물이 포함되어있는 경우 이들 미립자들은 엑소 좀의 크기를 가질 수 있기 때문에, 이러한 추가적인 정제가 필요할 수있다.특히, 면역 정제보다 엑소 마커 풍부한 제제로 이끈다. 단점이 상기 엑소 좀 및 / 또는 miRNA의 존재 량을 감소시키고, 대부분의 경우 시간과 자원 소모 과정을 정당화하지 않는다는 것이다. 그러나, 웨스턴 블롯 분석을 기반으로 특정 면역 분리 이러한 calnexin, 추가의 정제와 같은 소포체 단백질을 통해 마이크로 좀 오염의 존재를 감지하면 좋습니다. 하나는 면역 기반 정제 단계가 권장된다 생물학적 유체의 다른 소스를 사용하는 경우 우리의 경험이 거의 담즙의 경우입니다. 담즙 액에서 엑소 좀을 분리하고 농축 차동 초 원심 분리의 이용은 상대적으로 신속하고 비용 효율적인 방법이다. 그것은 초 원심 분리기의 사용을 필요로하지만, 바람직하게는 스윙 버킷 로터,이 디바이스는 일반적으로 많은 기관에서 발견된다. 밀도 원심 분리를 통해 더 정제되어 possibl동일한 장비와 튜브 전자는 세척 및 멸균 후 재사용 여러 번 있습니다. 폴리머 계 침전 XG 10,000 이하의 속도로 침전 펠렛 microcentrifuges 또는 표준 원심 분리기의 사용을 필요로하지만, 일반적으로 지질 단백질을 포함한 비 소포 오염물 공동 분리. 리포 단백질은 담즙으로 존재하지는 않지만, 종종 독점적 특허 중합체의 비용 비교 분리 비싼 만든다. 중합체는 또한, 질량 분석 등의 하류 어플리케이션과 호환 종종 있지만 하류 분석은 중합체 (RNA 또는 단백질 분리)과 호환되는 경우, 상기 방법은 빠르고 용이하고 특정 장치를 필요로하지 않는다. 크기 배제 크로마토 그래피를 장시간 실행 시간의 단점 및 특수 장비의 요구 사항이 있지만, 큰 입자와 작은 입자의 정확한 분리를 허용한다. 면역 정제 최고 purit를 얻을심지어 exosomal 소체 및 Y는 상피 유래 특정 exosomal 분획의 분리를 허용하지만, 이것은 총 수율을 희생 온다. 대량 처리 될 상기 절연 엑소 좀 인해 결합 항체 기능적 활성을 잃게되거나 변경 생물학적 기능을 나타낼 수있는 경우 또한, 제 농축 공정을 필요로하는 작은 샘플 볼륨으로 제한된다. 엑소 좀의 분리에 관해서 하류 어플 특수 장비의 가용성을 고려하는 것이 중요하다. 분리 / 농축 된 입자의 특성에 관계없이 사용되는 분리 방법에 중요하다. 초 원심 지금까지 exosomal 의한 입자의 견고한 빠르게 (그리고 비용 효율적인 초 원심 분리기가 사용 가능한 경우) 농축 많은 실험실에서 사용되는 &quot;금 표준&quot;이었다.

다른 생물 즉, 유체, 모유, 플라즈마 또는 소변과 마찬가지로, 담즙은 엑소 좀, 지질이 풍부한 소포 1-4가 포함되어 있습니다. 엑소 좀을 유도하거나받는 셀 (5), (6), 정상 기능 (4), 7-9의 일부일 수도 세포 간 통신의 형태 생물학적 기능을 변경할 수있다. 엑소 좀 진단 (10)에 대한 바이오 마커의 가치있는 소스를 제공 할 수 miRNA의 종을 포함 할 수 있습니다. miRNAs의 프로파일 질환 11-14의 다양한 진단 및 예후 표지자로서 최근에 상당한 관심을 얻고있다. miRNA의 자체는 생물학적 유체, 아마도 죽은 세포에 의해 발표 및 창고 세포의 양이 크게 기저 질환에 의해 영향을받을 수에서 찾을 수 있습니다. 엑소 좀의 miRNA의 프로필은 반드시 원래 셀 6, 10, 15 ~ 17의 miRNA의 프로파일을 반영하지 않는, 아직 엑소 좀은 부모 가전에 대한 특성 수 있습니다 miRNA의 서명을 수행 할 수있다종양 세포를 원하는 것이다. 종양 유래 엑소 좀은 폐 선암, 전립선 암 등의 종양이 8, 16, 18을 가진 환자의 혈장에서 발견되었다. 이 방법의 목적은 자신의 이전 처리 절차의 대부분 독립적 인 인간의 담즙 시료에서 엑소 좀의 안정적이고 강력한 격리입니다. 그것은 이러한 담관암 (19) 담관 질환의 전위 진단의 miRNA의 신뢰성있는 소스로서 담즙을 이용하기 위해 개발되었다. 이 엑소 좀을 분리 속도가 증가함에 따라 원심 여러 단계로 구성되며, 다른 생물학적 유체에 적용 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;micro;m Polyethersulfone (PES) membrane filter</td><td>Corning</td><td>431229</td><td></td></tr><tr><td>thinwall polyallomer ultracentrifuge tubes&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>331374</td><td></td></tr><tr><td>SW40Ti rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LM10-HS&amp;nbsp;</td><td>Nanosight</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) software&amp;nbsp;</td><td>Nanosight</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mirVANA</td><td>Life Technologies</td><td>AM1560</td><td></td></tr><tr><td>Complete Protease Inhibitor</td><td>Roche distributed by Sigma-Aldrich</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon PSQ</td><td>Millipore, Bedford MA</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD63 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab59479</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tsg101</td><td>Abcam</td><td>ab30871</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and profiling of microrna-containing exosomes from human bile

지난 3 년간의 엑소 좀 연구는 크게 바이오 마커 및 치료 용도의 식별 및 특성으로 범위를 확장했다. 엑소 좀 최근 마이크로 RNA (미르)을 함유하는 것으로 나타났다. 미르 자체 진단을 위해 가치있는 바이오 마커로 제기했다. 진료소와 병원에서 표본 수집이 매우 변수이기 때문에, 전체 담즙에서 miRNA의 분리가 실질적으로 변화한다. 간단하게 수집 담즙 샘플들로부터 강력한 정확하고 재현성 miRNA의 프로파일을 달성하기 위해서 분리 담즙에서 엑소 좀을 특징 고품질 프로토콜의 개발이 필요했다. 이 방법은 몇 회 원심 분리 및 엑소 좀 펠렛 최종 초 원심 분리 공정과 여과 단계를 필요로한다. 전자 현미경, 웨스턴 블랏은 유동 세포 계측법 및 다중 파라미터 나노 광학 분석이 가능하며, 전자의 품질을 확인하는 것이 중요 특성화 단계는xosomes. 즉, 예쁜 꼬마 선충, 같은 종에서 비특이적, 합성의 miRNA와 해물을 급상승 이러한 엑소 좀에서의 miRNA의 분리를 위해, CEL-은 miR-39, RNA 추출 효율의 정상화를 위해 중요하다. 이 방법에 따라 담즙 액에서 엑소 좀의 분리는 성공의 miRNA는 -80 ° C에서 몇 년 동안 저장된 담즙 샘플에서 프로파일 링 할 수 있습니다.

엑소 좀 일반 현미경에 의해 검출 또는 유세포하기에는 너무 작기 때문에, 전자 현미경 또는 나노 입자의 광학 분석이 수행되어야한다. 나노 입자의 광학 분석은 또한 정량적이고 크기 분포 및 농도를 제공하는 전자 현미경 위에 이점을 갖는다. 장비는 시료에 유리 프리즘을 통해 정밀하게 초점을 맞춘 레이저 빔을 소개합니다. 격리 소포 브라운 운동은 EMCCD 고감도 카메라로 캡처 프레임마다 추적한다. 나노 입자 추적 분석 (NTA) 소프트웨어 대책이 브라운 운동 프레임. 크기 모드 및 담즙 엑소 제제의 분포를 계산하는 프레임 (1) 인간 담즙 샘플로부터 단리 엑소 전형적인 NTA 분석의 결과를 나타낸도. 또는, 전자 현미경을 이용할 수있다도 2A는 인간으로부터 분리 엑소 담즙에 대한 투과 전자 현미경의 전형적인 결과를 나타낸다 않고 정량. 불구 분리 된 입자의 크기를 확인한다. 분리 된 입자의 exosomal 성질의 추가 확인을 위해,도 2b에 도시 된 바와 같은 또는 Tsg101 tetraspanin CD63 단백질의 존재를 웨스턴 블랏 프로빙이 사용되어야한다. 엑소 좀 특이 단백질은 그 자체로 존재하지 않지만, 엑소 좀은 TSG101과로 Alix (21) 등의 엑소 좀 형성에 관여하는 클래식 엑소 좀 마커 단백질 언급 CD63 및 CD81과 tetraspanins, 특히 CD9, CD63, CD81 및 CD82에 충실. 다른 열 충격 단백질 동족 70 (Hsc70) 73 (Hsc73) 같은 단백질뿐만 아니라 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 클래스 II 분자는 Hsc73와 주변 막 관련 보호 자전거와 같은 일부 엑소 좀이 풍부한 발견 할 수있다수지상 세포 (21)로부터 분비되는 엑소 좀을위한 매우 구체적인되는 표피 성장 인자 알파 - 인자 8 (Mfge8) - 우유의 지방 소구한다. 도 3은 인간 담즙 엑소 좀으로부터 추출 된 miRNA 종의 다양한 대표적인 실시간 증폭 플롯을 나타낸다. 엑소 좀 때문에, 세포와는 달리, 18S 또는 28S rRNA의 또는 정상화 GAPDH 또는 β - 굴지 같은 가사 유전자와 같은 신뢰할 수있는 기준을 부족, 합성 miRNA를 가진 급상승 중요하다. 합성 miRNA를 효과적으로 발현 수준을 정상화하기 위해 하나를 사용하도록 예쁜 꼬마 선충에서 CEL-39은 miR 같은 다른 종으로부터 유래한다. 재현성을 위해 그것은 담즙 가능한 한 빨리 아니라 처리 이러한 조건이 담즙에 존재의 miRNAs의 저하로 이어질로 처리하기 전에 동결하는 것이 중요합니다. 한편, 한번 exoso 격리<html> 관심의 miRNA에 대한 안정성이 실험적으로 결정되어야하지만 MES는 매우 안정하고 동결 - 해동 사이클이 miRNA를 적어도 두 종류의 레벨의 무시할만한 영향을 일으킬 48 시간 또는 최대 3 RT에서 스토리지와 같은 매우 저항성이다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54036/54036fig1.jpg" /> 도 1 (나노 입자) NTA 분석 인간 담즙 엑소 좀을 특징 담즙 엑소 좀 1의 비율로 PBS로 희석 하였다 :. 600. 인간 담즙 분리 전기차의 (A) 크기 분포 및 농도. (X 축 : 크기, Y 축 엑소 좀 각 크기 농도 엑소 좀)의 평균 크기는 샘플이 약 97 nm 인 것으로 측정되었다. A. 크기 범위에서 분석 동일한 샘플의 (B) 샘플 스냅 샷은 30-110 나노 미터에 이르기까지 소포를 보여줍니다.= &quot;_ 빈&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54036/54036fig2.jpg" /> 크기가 인간의 담즙 70-110 나노 미터의 투과 전자 현미경 및 웨스턴 블롯. (A) 전송 전자 현미경 (TEM) 현재 구형 구조에 의해 준비의 exosomal 자연 그림 2. 확인. 스케일 바는 100 ㎚이다. (B) 담도 엑소 좀의 웨스턴 블롯 분석은 일반적인 엑소 좀 마커 단백질 TSG101 및 CD63의 존재를 보여줍니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54036/54036fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54036/54036fig3.jpg" /> 담즙 엑소 좀 분리의 miRNA 종의 그림 3. 실시간 PCR. 진짜-time 미르 배열의 PCR은 인간의 담즙 엑소 좀 (x 축, PCR 사이클 번호, y 축, 상대 강도)에서 추출 된 여러 미르 종의 증폭을 보여줍니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54036/54036fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

격리 및 프로파일 링 마이크로 RNA-포함하는 인간의 담즙에서 엑소 좀을

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

isolation-profiling-microrna-containing-exosomes-from-human

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

10.2K 조회수.  Johns Hopkins University School of Medicine. Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

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Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most interestingly, sRNAs are also found outside of cells and are stably present in all biological fluids. As such, extracellular sRNAs represent a novel class of disease biomarkers and are likely involved in cell signaling and intercellular communication networks. To assess their potential as biomarkers, sRNAs can be quantified in plasma, urine, and other fluids. Nevertheless, to fully understand the impact of extracellular sRNAs as endocrine signals, it is important to determine which carriers are transporting and protecting them in biological fluids (e.g., plasma), which cells and tissues contribute to extracellular sRNA pools, and cells and tissues capable of accepting and utilizing extracellular sRNA. To accomplish these goals, it is critical to isolate highly pure populations of extracellular carriers for sRNA profiling and quantification. We have previously demonstrated that lipoproteins, particularly high-density lipoproteins (HDL), transport functional microRNAs (miRNA) between cells and HDL-miRNAs are significantly altered in disease. Here, we detail a new protocol that utilizes tandem HDL isolation with density-gradient ultracentrifugation (DGUC) and fast-protein-liquid chromatography (FPLC) to obtain highly pure HDL for downstream profiling and quantification of all sRNAs, including miRNAs, using both high-throughput sequencing and real-time PCR approaches. This protocol will be a valuable resource for the investigation of sRNAs on HDL.

This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.

작은 RNA 정량 비는 코딩을위한 고밀도 지방 단백질의 분리

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

연구

생화학

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and RNAs, are unique to the cells from which they are derived and can be used as indicators of disease. Several common enrichment protocols, including ultracentrifugation, yield exosomes laden with soluble protein contaminants. Specifically, we have found that the most abundant proteins within blood often co-purify with exosomes and can confound downstream proteomic studies, thwarting the identification of low abundance biomarker candidates. Of additional concern is irreproducibility of exosome protein quantification due to inconsistent representation of non-exosomal protein levels. The protocol detailed here was developed to remove non-exosomal proteins that co-purify along with exosomes, adding rigor to the exosome purification process. Five methods were compared using paired blood plasma and serum from five donors. Analysis using nanoparticle tracking analysis and micro bicinchoninic acid protein assay revealed that a combined protocol utilizing ultrafiltration and size exclusion chromatography yielded the optimal vesicle enrichment and soluble protein removal. Western blotting was used to verify that the expected abundant blood proteins, including albumin and apolipoproteins, were depleted.

Here, we present a protocol to purify exosomes from both plasma and serum with reduced co-purification of non-exosomal blood proteins. The optimized protocol includes ultrafiltration, protease treatment, and size exclusion chromatography. Enhanced purification of exosomes benefits downstream analyses, including more accurate quantification of vesicles and proteomic characterization.

단백질 소화, 한, 및 크기 배제 크로마토그래피 인간의 혈장 및 혈 청에서 Exosomes의 절연을 최적화 하

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, and intrinsic capability in intercellular delivery of various biomolecules. This work establishes an isolation protocol to achieve high yield and high purity of exosomes for siRNA delivery. Human Embryonic Kidney cells (HEK-293 cells) are cultured in bioreactor flasks and the culture supernatant (hereon referred to as conditioned medium) is harvested on a weekly basis to allow for enrichment of HEK-293 exosomes. The conditioned medium (CM) is pre-cleared of dead cells and cellular debris by differential centrifugation and is subjected to ultracentrifugation onto a sucrose cushion followed by a washing step, to collect the exosomes. Isolated HEK-293 exosomes are characterized for yield, morphology and exosomal marker expression by nanoparticle tracking analysis, protein quantification, electron microscopy and flow cytometry, respectively. Small interfering RNA (siRNA), fluorescently labeled with Atto655, is loaded into exosomes by electroporation and excess siRNA is removed by gel filtration. Cell uptake in PANC-1 cancer cells, after 24 h incubation at 37 &#176;C, is confirmed by flow cytometry. HEK-293 exosomes are 107.0 &#177; 8.2 nm in diameter. The exosome yield and particle-to-protein ratio (P:P) ratio are 6.99 &#177; 0.22 &#215; 1012 particle/mL and 8.3 &#177; 1.7 &#215; 1010 particle/&#181;g, respectively. The encapsulation efficiency of siRNA in exosomes is ~ 10-20%. Forty percent of the cells show positive signals for Atto655 at 24 h post-incubation. In conclusion, exosome isolation by ultracentrifugation onto sucrose cushion offers a combination of good yield and purity. siRNA could be successfully loaded into exosomes by electroporation and subsequently delivered into cancer cells in vitro. This protocol offers a standard procedure for developing siRNA-loaded exosomes for efficient delivery to cancer cells.

An exosome is a new generation of drug delivery carriers. We established an exosome isolation protocol with high yield and purity for siRNA delivery. We also encapsulated fluorescently labelled non-specific siRNA into exosomes and investigated the cellular uptake of siRNA-loaded exosomes in cancer cells.

SiRNA 암 세포에 배달에 대 한 Exosomes의 준비

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

암 연구학

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, milk and urine. One subset of these RNAs are the posttranscriptional regulators &#8211; microRNAs (miRNAs). To delineate the miRNAs produced by specific cell types, in vitro culture systems can be used to harvest and profile exRNAs derived from one subset of cells. The secreted factors of mesenchymal stem cells are implicated in alleviating numerous diseases and is used as the in vitro model system here. This paper describes the process of collection, purification of small RNA and library generation to sequence extracellular miRNAs. ExRNAs from culture media differ from cellular RNA by being low RNA input samples, which calls for optimized procedures. This protocol provides a comprehensive guide to small exRNA sequencing from culture media, showing quality control checkpoints at each step during exRNA purification and sequencing.

This protocol demonstrates how to purify extracellular microRNAs from cell culture media for small RNA library construction and next generation sequencing. Various quality control checkpoints are described to allow readers to understand what to expect when working with low input samples like exRNAs.

격리, 시퀀싱 및 인간 중간 엽 줄기 세포에서 세포 외 MicroRNAs 분석

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

유전학

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

HIV-1 양성 개인의 플라즈마에서 엑소 좀의 분리

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

면역학 및 감염병학

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

RNA 함유 Exosomes의 분리 및 특성

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

생물학

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during physiological and pathological states. The isolation of EVs continues to be a major challenge in this field, due to limitations intrinsic to each technique. The differential ultracentrifugation with density gradient centrifugation method is a commonly used approach and is considered to be the gold standard procedure for EV isolation. However, this procedure is time-consuming, labor-intensive, and generally results in low scalability, which may not be suitable for small-volume samples such as bronchoalveolar lavage fluid. We demonstrate that an ultrafiltration centrifugation isolation method is simple and time- and labor-efficient yet provides a high recovery yield and purity. We propose that this isolation method could be an alternative approach that is suitable for EV isolation, particularly for small-volume biological specimens.

Here, we describe two extracellular vesicle isolation protocols, ultrafiltration centrifugation and ultracentrifugation with density gradient centrifugation, to isolate extracellular vesicles from murine bronchoalveolar lavage fluid samples. The extracellular vesicles derived from murine bronchoalveolar lavage fluid by both methods are quantified and characterized.

Extracellular 소포 Murine Bronchoalveolar 게 유체는 한 원심 분리 기법을 사용 하 여에서 격리

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs are protected from degradation by sequestration in small vesicles called exosomes. Exosomes can fuse with the plasma membrane resulting in the transfer of RNA and proteins to the target cell. Their biological functions include immune response, antigen presentation, and intracellular communication. Delivery of miRNAs that can regulate gene expression in the recipient cells via blood has opened novel avenues for target intervention. In addition to offering a strategy for delivery of drugs or RNA therapeutic agents, exosomal contents can serve as biomarkers that can aid in diagnosis, determining treatment options and prognosis.	Here we will describe the procedure for quantitatively analyzing miRNAs and messenger RNAs (mRNA) from exosomes secreted in blood and cell culture media. Purified exosomes will be characterized using western blot analysis for exosomal markers and PCR for mRNAs of interest. Transmission electron microscopy (TEM) and immunogold labeling will be used to validate exosomal morphology and integrity. Total RNA will be purified from these exosomes to ensure that we can study both mRNA and miRNA from the same sample. After validating RNA integrity by Bioanalyzer, we will perform a medium throughput quantitative real time PCR (qPCR) to identify the exosomal miRNA using Taqman Low Density Array (TLDA) cards and gene expression studies for transcripts of interest.	
 These protocols can be used to quantify changes in exosomal miRNAs in patients, rodent models and cell culture media before and after pharmacological intervention. Exosomal contents vary due to the source of origin and the physiological conditions of cells that secrete exosomes. These variations can provide insight on how cells and systems cope with stress or physiological perturbations. Our representative data show variations in miRNAs present in exosomes purified from mouse blood, human blood and human cell culture media.	
 Here we will describe the procedure for quantitatively analyzing miRNAs and messenger RNAs (mRNA) from exosomes secreted in blood and cell culture media. Purified exosomes will be characterized using western blot analysis for exosomal markers and PCR for mRNAs of interest. Transmission electron microscopy (TEM) and immunogold labeling will be used to validate exosomal morphology and integrity. Total RNA will be purified from these exosomes to ensure that we can study both mRNA and miRNA from the same sample. After validating RNA integrity by Bioanalyzer, we will perform a medium throughput quantitative real time PCR (qPCR) to identify the exosomal miRNA using Taqman Low Density Array (TLDA) cards and gene expression studies for transcripts of interest.
 These protocols can be used to quantify changes in exosomal miRNAs in patients, rodent models and cell culture media before and after pharmacological intervention. Exosomal contents vary due to the source of origin and the physiological conditions of cells that secrete exosomes. These variations can provide insight on how cells and systems cope with stress or physiological perturbations. Our representative data show variations in miRNAs present in exosomes purified from mouse blood, human blood and human cell culture media

The presence of stable microRNAs (miRNAs) in exosomes has generated immense interest as a novel mode of intercellular communication, for their potential utility as biomarkers and as a route for therapeutic intervention. Here we demonstrate exosome purification from blood and culture media followed by quantitative PCR to identify miRNAs being transported.

혈액과 문화 매체에서 파생 Exosomes의 정화 및 마이크로 RNA 프로파일

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs  are protected from degradation by sequestration in small vesicles called  ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are found in mammalian cells. These small RNAs are potent gene regulators controlling vital pathways such as growth, development and death and much interest has been directed at their expression in bodily fluids. This is due to their dysregulation in human diseases such as cancer and their potential application as serum biomarkers. However, the analysis of miRNA expression in serum may be problematic. In most cases the amount of serum is limiting and serum contains low amounts of total RNA, of which small RNAs only constitute 0.4-0.5%1. Thus the isolation of sufficient amounts of quality RNA from serum is a major challenge to researchers today. In this technical paper, we demonstrate a method which uses only 400 &#181;l of human serum to obtain sufficient RNA for either DNA arrays or qPCR analysis. The advantages of this method are its simplicity and ability to yield high quality RNA. It requires no specialized columns for purification of small RNAs and utilizes general reagents and hardware found in common laboratories. Our method utilizes a Phase Lock Gel to eliminate phenol contamination while at the same time yielding high quality RNA. We also introduce an additional step to further remove all contaminants during the isolation step. This protocol is very effective in isolating yields of total RNA of up to 100 ng/&#181;l from serum but can also be adapted for other biological tissues.

This protocol describes a method for extracting small RNAs from human serum. We have used this method to isolate microRNAs from cancer serum for use in DNA arrays and also singleplex quantitative PCR. The protocol utilizes phenol and guanidinium thiocyanate reagents with modifications to yield high quality RNA.

인간 혈청에서 작은 비 암호화 RNA를의 분리

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Fast and Simplified Method for High Through-put Isolation of miRNA from Highly Purified High Density Lipoprotein

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for diagnosis and prognosis or may serve as targets for drug development, respectively. Recently it has been shown that miRNAs are carried in lipoproteins, particularly high density lipoproteins (HDL) and are delivered to recipient cells for uptake. This raises the possibility that miRNAs play a critical and pivotal role in cellular and organ function via regulation of gene expression as well as messenger for cell-cell communications and crosstalk between organs. Current methods for miRNA isolation from purified HDL are impractical when utilizing small samples on a large scale. This is largely due to the time consuming and laborious methods used for lipoprotein isolation. We have developed a simplified approach to rapidly isolate purified HDL suitable for miRNA analysis from plasma samples. This method should facilitate investigations into the role of miRNAs in health and disease and in particular provide new insights into the variety of biological functions, outside of the reverse cholesterol transport, that have been ascribed to HDL. Also, the miRNA species which are present in HDL can provide valuable information of clinical biomarkers for diagnosis of various diseases.

MicroRNAs play an important regulatory role and are emerging as novel therapeutic targets for various human diseases. It has been shown that miRNAs are carried in high density lipoproteins. We have developed a simplified method to rapidly isolate purified HDL suitable for miRNA analysis from human plasma.

고도로 정제 된 고밀도 지단백질에서의 miRNA의 높은 넣어 관통 분리에 대한 신속하고 단순화 된 방법

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for ...