This study was supported by a K08 Award (DK090154-01) from the National Institutes of Health (NIH; to F.M.S.).

A obtenção da bile de pacientes por colangiopancreatografia retrógrada endoscópica (CPRE) requer a aprovação de um protocolo de estudo seres humanos pela Institutional Review Board. Todo o trabalho aqui apresentado foi aprovado pela Johns Hopkins University Institutional Review Board. 1. exossomo Isolamento da Bile <ol><li> Execute colangiopancreatografia retrógrada endoscópica (CPRE). Colocar o paciente em decúbito dorsal e entubar. <ol><li> Passar um duodenoscópio através da boca do paciente e inseri-lo na segunda parte do duodeno e identificar a papila. </li><li> Seletivamente canular do ducto biliar comum através da inserção de um lúmen triplo sphincterotome pré-carregado com um fio-guia hidrofílico 0,035 polegadas (0,9 mm). </li><li> Avançar o fio-guia sob orientação fluoroscópica ao ducto hepático esquerdo, uma vez na ocasião, pode ser difícil diferenciar o ducto cístico do ducto hepático direito, em seguida, avançar osphincterotome 5 cm no ducto biliar para adquirir uma posição estável. </li><li> Remova o fio-guia, anexar uma seringa de 10 ml para a porta de fio guia através do bloqueio Luer e aspirar a bile usando 10 ml de pressão negativa. </li><li> Retire a seringa contendo a bile para prosseguir com a CPRE por reinserir o fio-guia e injeção de contraste através da porta de injeção para opacificar da árvore biliar. </li><li> Transferir a bílis recolhido para um tubo de 15 ml em gelo e manter em gelo até estar pronto para prosseguir com o passo de centrifugação. Cuidado: Use luvas para proteger a si mesmo e as amostras! Tratar a bile como uma fonte potencial de infecção, pois ele pode conter partículas virais de hepatite A! </li><li> Manter a amostra (s) em gelo. Ou prosseguir com o passo 1.2 ou centrifugar a 500 xg, a 4 ° C durante 10 min e, em seguida, congelar a -80 ° C até à sua utilização. Nota: As amostras armazenadas dessa maneira por vários anos têm sido rotineiramente utilizado com bons resultados 19. </li></ol&gt; </li><li> Transferir 400 ul da bílis para um tubo de microcentrífuga e recolher as células e os resíduos celulares por centrifugação a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante por pipetagem, transferir para um tubo de microcentrífuga fresco e centrifuga-se a amostra (s) a 16500 xg durante mais 20 min a 4 ° C para limpar o sobrenadante ainda mais de detritos. Descartar os tubos na resíduos de risco biológico. Alternativamente, girar as amostras em uma ultracentrífuga vez. </li><li> Recolhe-se o sobrenadante e filtrá-la numa câmara de biosegurança com uma seringa através de um filtro de membrana de 0,2 m de polietersulfona (PES) que tem boas taxas de fluxo e de baixa ligação às proteínas para remover quaisquer partículas maiores do que 200 nm para a esquerda. </li><li> Pipeta-se o sobrenadante filtrado para ultracentrífuga tubos e adicionar PBS de modo a que os tubos são mais do que 2/3 cheio. Se os tubos contêm menos líquido do que isso, os tubos entrará em colapso durante a centrifugação! Os tubos podem ser lavado, esterilizado e reutilizado várias vezes. </li><li> Pellet os exossomas através de ultracentrifugação a 120000 xg durante 70 min a 4 ° C. Após centrifugação a aparência na parte inferior do tubo de ultracentrífuga para ver, por vezes, pequenos peletes amarelos; estes são os exossomos. </li><li> Descartar o sobrenadante por decantação-lo com cuidado e desinfectar os resíduos através da adição de água sanitária para uma concentração final de 10% v / v e deixe repousar por 20 min. </li><li> Para as experiências de jusante, quer processar o pelete (s) em um pequeno volume da solução apropriada (isto é, o ensaio de radio-imunoprecipitação (RIPA) de tampão para o isolamento de proteína, tampão de lise de ARN para o isolamento MIR) ou que ressuspender em 50-150 ul de fosfato tamponada salino (PBS), que pode ser armazenado a -80 ° C para uso futuro (quantitativo em tempo real da reacção em cadeia da polimerase (qRT-PCR) ou a extracção de proteínas, etc.) ou utilizados para a caracterização da preparação exossomo por TEM ou óptica nanopartícula . </li></ol> 2. Identificação por exossomoMicroscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) ou CryoEM <ol><li> Ressuspender vesículas extracelulares em 100 ul de PBS por pipetagem. Idealmente, os exossomas usar que não foram armazenados a -20 ° C ou -80 ° C, especialmente quando se realiza o isolamento para a primeira vez. </li><li> Adsorver uma alíquota de 20 ul (cerca de 2 ug) a 400 grelhas de cobre revestidas com carbono Parlodion malha durante 2 min e deixa-se secar à temperatura ambiente. </li><li> Corrigir o exosoma em 1% (v / v) de glutaraldeído (EM-grau) durante 5 min à temperatura ambiente, colocando gotas cuidadosamente sobre a preparação seca. </li><li> Lavam-se as grades, duas vezes com água durante 5 minutos e, em seguida, contrastar VE mancha com ácido fosfotúngstico a 1% (PTA) durante 30 seg. </li><li> Aquisição de imagens com um microscópio electrónico com uma voltagem de aceleração de 80 kV de partida com ampliações de 20,000X e aumentando a 100,000X quando a determinação do tamanho das partículas. Nota: Outras preparações como camadas sobre 200 cobre ou níquel redes de malha revestido de carbono Formvar e li coloração contrasteKe 1% ou 2% de acetato de uranilo durante 10-15 min, também são possíveis. </li><li> Para CryoEM, misturar uma alíquota de 20 ul (cerca de 2 ug) com 60 ul de proteína G de ouro de 10 nm (proporção 1: 3). Isso vai ajudar a determinar o diâmetro exosome. </li><li> Transferir as amostras para grades de carbono holey descarregada-glow C-flat e remover o excesso de líquido borrando. Congelar as grades mergulhando-as imediatamente em etano líquido. </li><li> Montar as grelhas num cryoholder em azoto líquido. </li><li> Adquirir as imagens em 200 kV, com ampliações de 20,000X e 100,000X. </li></ol> 3. Identificação exossomo por Multi-parâmetro nanopartículas análise óptica <ol><li> Ressuspender as exossomas isolado em 100 ul de PBS por pipetagem. </li><li> Diluir exossomas em 600 ul de PBS em várias proporções diferentes (como 1:50, 1: 100, 1: 300, 1: 600 e 1: 1200). </li><li> Visualizar os exossomas por espalhamento de luz laser com o instrumento e software apropriado em tempo real de acordo com a Fábricasprotocolo de rer 20. </li><li> Aumentar o nível da câmera no modo de captura até que as partículas tornam-se visíveis, em seguida, ajustar o foco para fazer as partículas parecer suave. </li><li> Enquanto no modo padrão, diminua a câmera para o nível mais baixo que as partículas ainda pode ser visto, se necessário, ajustar obturador da câmera e ganho para alcançar este objectivo. </li><li> Verificar visualmente para garantir 20-100 partículas são visíveis na tela, se não liberar a unidade e ajustar a diluição em PBS. </li><li> Em seguida, ajuste a duração de captura para entre 30-60 seg. Depois que o vídeo é capturado, ajustar os parâmetros de processamento até que todas as partículas são identificados na tela e processar o arquivo de vídeo. </li></ol> 4. exossomo Caracterização por Western Blot <ol><li> Lyse exossomo pelotas de 2-5 ml de bile em 100 ul de ensaio radioimunoprecipitaï¿½o gelada (RIPA) tampão com um inibidor da protease pipetando cima e para baixo completamente e misture lisados ​​vigorosamente por 30 segundosnum vortex para solubilizar as proteínas de forma eficaz. </li><li> Embora a maior parte das vezes não é necessário, usar-pulso sonicação das amostras em gelo com pulsos de 2 para 10 segundos cada para assegurar a lise completa. </li><li> Peletizar o material insolúvel por centrifugação a 15.000 xg, a 4 ° C durante 5 min e transferir o sobrenadante para um tubo limpo. </li><li> Determinar a concentração de proteína com um método de escolha (isto é, ácido bicinconínico (BCA), de Coomassie, Lowry modificado, 660 nm, ensaio de proteína, etc.) de acordo com o protocolo do fabricante. O método não é tão importante, desde que o mesmo método é utilizado de forma consistente para obter resultados que podem ser comparados através de experiências. </li><li> Carga de 50 mg de proteína por amostra em tampão de Laemmli após o aquecimento da amostra a 95 ° C durante 5 min num poço de um gel de poliacrilamida para electroforese (PAGE). </li><li> Electroforese as amostras sobre as PRINCIPAL géis durante 1,5 h e transferir as proteínas separadas para uma membrana de nylon. </li><li> Bbloquear a membrana (s) com leite magro a 5% em solução salina tamponada com Tris com Tween 20 0,1% (TBS-T) durante 1 hora, depois incubar com anticorpos específicos de exossoma como anti-CD63 e anti-GST-101, a uma diluição de 1: 500 de um modo preferido O / N a 4 ° C. </li><li> Lavam-se as membranas com TBS-T 3 x 10 min, depois incubar com um apropriado, combinando anticorpo secundário conjugado com HRP em 5% de leite magro em TBS-T, durante 1-2 horas à temperatura ambiente. </li><li> Lava-se a membrana (s) 3 x 5 min com TBS-T e detectar as proteínas específicas com reagentes de quimioluminescência de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Imagem as membranas com uma película ou um sistema de imagem digital, de acordo com o protocolo do fabricante. </li></ol> 5. MicroRNA Isolamento dos isolados exossomas Nota: Isolamento de exossomas a partir de miARN biliares é levada a cabo usando um isolamento miARN modificado baseado em um kit disponível comercialmente, mas qualquer outro método de isolamento de RNA pode ser usada ou adaptada. <ol><li> Adicionar 300 &amp;# 181; l lise / tampão de construção para o sedimento exossomo (isolado a partir de 400 ul biliar), vortex, pipeta ou passar através de uma agulha / seringa para lisar completamente as exossomas para obter um lisado homogénea. </li><li> Adicionar 1/10 volume de (30 ul) de miARN homogeneizado aditivo, e misturar bem com vortex ou invertendo o tubo várias vezes. </li><li> Incubar a mistura durante 10 min em gelo. </li><li> Adicionar um volume de ácido-fenol: clorofórmio igual ao homogenato inicial (300 ul). </li><li> Adicionar 5 uL de 5 fmol / ul CEL-miR 39 e vortex durante 30-60 seg. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 10000 xg à temperatura ambiente para separar a fase aquosa (superior) e as fases orgânicas (inferior). </li><li> Aspirar cuidadosamente a fase superior por pipetagem e transferência para um novo tubo ao anotar o volume transferido. Descarte a fase orgânica no recipiente de lixo orgânico apropriado. </li><li> Para enriquecimento em pequenos RNAs adicionar 1/3 de volume de 100% de etanol à fase aquosa recuperada e misturar por vortex completamente ou invertendo a TUser várias vezes. </li><li> Pipetar a mistura lisado / etanol para o cartucho de filtro, até 700 uL de cada vez. </li><li> Centrifugar os cartuchos de 15 segundos a um máximo de 10.000 xg ou aplicar vácuo para passar a mistura através do filtro. </li><li> Recolher o filtrado e se a mistura lisado / etanol superior a 700 l, transferir o flow-through para um tubo novo e repita o procedimento para recolher todos os filtrados. Estes filtros contém fracções desprovidas de ARN pequenos RNAs e pode ser utilizado para recuperar estes ARN maiores. </li><li> Adicione 2/3 volume de RT 100% de etanol ao filtrado total e misturar bem em vórtice. </li><li> Pipeta a mistura filtrado / etanol para um segundo elemento do filtro. Como antes o volume máximo que pode ser aplicado ao mesmo tempo é de 700 uL. </li><li> Centrifugar durante 15 segundos a 10.000 xg ou aplicar de vácuo tal como descrito no passo 5.10. </li><li> Descartar o flow-through, e repetir até que todos mistura filtrado / etanol foi filtrada. </li><li> aplicar 70081; l de solução de lavagem miARN 1 para o cartucho de filtro, centrifuga-se durante 5-10 seg ou aplicar vácuo e descartar o fluxo de passagem. </li><li> Lavar o filtro com solução de lavagem 500 ul 2/3 como feito no passo 5.16. </li><li> Repetir a lavagem uma segunda vez com 500 ul de solução de lavagem 2/3 como no passo 5.16, descartar o fluxo de passagem e colocar o filtro para trás no tubo de recolha. </li><li> A rotação do cartucho do filtro durante 1 min a 10000 xg para remover todo o líquido residual a partir do filtro. </li><li> Transferir o cartucho de filtro num tubo de colheita fresco e aplicar 100 ul de água quente livre (95 ° C) de nuclease para o centro do filtro. </li><li> Gire os conjuntos para 20-30 seg a velocidade máxima para recuperar o RNA. </li><li> Recolhe-se o eluato e usar imediatamente ou armazenar a -80 ° C. </li></ol>

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None of the authors have competing financial interests.

Para utilizar de forma confiável exosomes isoladas de bile, é importante empregar métodos de alta qualidade consistente de isolamento para obter amostras de alta qualidade em troca. A metodologia definida neste trabalho é uma forma bem estabelecida para isolar exossomos e miRNA de bílis humana. Ele destaca várias etapas cruciais na caracterização dos exossomos isolados, que no mínimo deve incluir microscopia eletrônica ou óptica de nanopartículas e Western blot. O passo mais importante no isolamento de exossomas, pelo menos quando se trata de estabilidade miARN, é processar biliar fresco o mais rapidamente possível. O armazenamento prolongado de bílis toda a RT ou até mesmo um único ciclo de congelação-descongelação pode reduzir significativamente o teor de miARN enquanto, em contraste os exossomas isoladas são muito estáveis ​​mesmo quando armazenados a temperatura ambiente ou submetidos a vários ciclos de congelamento-descongelamento. Enquanto as amostras em questão ter sido armazenado a -80 ° C, isolamento de exossomas e miRNA de bílis pode ser realizado com grande reprodutibilidade para identificar assinaturas de miARN nas amostras. Recomenda-se começar inicialmente com bile fresca para garantir a integridade miRNA adequada. Esta é uma consideração importante quando se tenta construir-se um conjunto de amostras biliares ao longo do tempo, como seria o caso para as amostras do paciente. Ele permite um para processar amostras que foram recolhidos ao longo de meses ou mesmo anos a ser processados ​​e avaliados ao mesmo tempo. Isto melhora grandemente a utilização da bílis para fins de diagnóstico, quer para olhar para as assinaturas de miARN que confirmam a presença de um estado de doença como o cancro ou a resposta de uma doença de intervenções terapêuticas. De facto, os resultados a partir de amostras clínicas foram utilizados para estabelecer as assinaturas de miARN como biomarcadores para colangiocarcinoma 19. O primeiro passo de centrifugação remove células intactas que estão presentes na bílis. Na segunda, celular centrifugação maior velocidade debRIS, corpos apoptóticos e outros organelos maiores são sedimentadas. Para assegurar que apenas partículas menor do que 200 nm são recolhidas na etapa de ultracentrifugação, o passo de filtração com filtro de ligação de uma proteína de baixa é importante. Alguns protocolos omitir este passo, mas nós pensamos que é necessário. Após a ultracentrifugação a 120000 xg, o sedimento obtido contém exossomas bastante puros que podem ser processados ​​imediatamente ou após ressuspensão em PBS ser armazenado a -80 ° C. Uma limitação deste método é que o sedimento obtido só é altamente enriquecido em exossomas, mas isso é verdade para outros métodos de enriquecimento, tais como exclusão de tamanho e precipitação polimérico. O processamento adicional pode implicar um outro passo de purificação por gradiente de sacarose ou de ligação a esferas magnéticas revestidas com anticorpo. Se a fonte dos exossomas (como, por exemplo, plasma) contém precipita como resultado da coagulação, esta purificação adicional pode ser necessário uma vez que estas partículas podem muitas vezes ter o tamanho de exossomas.Em particular, a imuno-purificação conduz a uma preparação mais marcador enriquecido exossoma. A desvantagem é que esta reduz ainda mais a quantidade de exossomos e / ou miRNA presente, e para a maioria dos fins não justifica o tempo eo processo que consome recursos. Se, no entanto, a análise de mancha de Western detecta a presença de contaminação de proteína de microssoma através de um retículo endoplasmático, tais como calnexina, purificação adicional, em particular imuno-isolamento baseado, é aconselhável. Na nossa experiência isso raramente é o caso para a bílis, se utiliza uma fonte de outros fluidos biológicos de um passo de purificação de base imune, recomenda-se. O uso de ultracentrifugação diferencial para isolar e enriquecer exossomas a partir de fluido biliar é um método relativamente rápido e de baixo custo. Enquanto isso requer a utilização de uma ultracentrifugadora, de preferência com um rotor de balanço do balde, estes dispositivos são comumente encontrados em muitas instituições. A purificação adicional por meio de centrifugação de densidade são pose com o mesmo equipamento e os tubos são reutilizáveis ​​várias vezes após a limpeza e esterilização. Embora a precipitação à base de polímero requer apenas o uso de microcentrífugas ou centrífugas padrão para sedimentar os precipitados a uma velocidade de 10000 x g ou menos, geralmente de co-isola contaminantes não vesiculares, incluindo lipoproteínas. Enquanto as lipoproteínas não estão geralmente presentes na bílis, o custo dos polímeros muitas vezes patenteadas fazer o isolamento caro em comparação. Os polímeros também são por vezes incompatíveis com aplicações a jusante, tais como espectrometria de massa, mas quando a análise a jusante é compatível com o polímero (ARN ou isolamento de proteínas), o método é fácil, rápida e não requerem equipamento específico. cromatografia de exclusão de tamanho tem a desvantagem de tempos de execução longos ea exigência de equipamento especial, mas permite a separação precisa de partículas de grandes e pequenos. Purificação por imunoafinidade produz o maior purity de vesículas exosomal e até mesmo permite o isolamento de frações exosomal específicos, tais como epitelial derivada, mas isso vem com o custo de produção total. Além disso, ela é limitada a pequenos volumes de amostras que necessitam de um primeiro passo de enriquecimento se um grande volume está a ser processado e os exossomas isoladas podem perder a actividade funcional ou exibem função biológica alterada devido aos anticorpos ligados. É importante ter em conta a aplicação a jusante (s) e a disponibilidade de equipamento especializado no que se refere ao isolamento de exossomas. A caracterização das partículas isoladas enriquecidas / é importante, independentemente do método de isolamento utilizado. Ultracentrifugação tem sido até agora um &quot;padrão ouro&quot; usada por muitos laboratórios devido ao seu enriquecimento robusto e rápido (e de baixo custo, se uma ultracentrífuga está disponível) de partículas exosomal.

Como outros fluidos biológicos, ou seja, leite materno, plasma ou urina, na bílis contém exossomas, lípidos ricos vesículas 1-4. Exossomos podem induzir ou alterar funções biológicas em células receptoras 5, 6, uma forma de comunicação célula-célula que pode ser parte da sua função normal 4, 7-9. Exossomos podem conter espécies de miRNA que podem fornecer uma valiosa fonte de biomarcadores para o diagnóstico 10. perfis miARNs ganharam substancial atenção nos últimos anos como marcadores de diagnóstico e de prognóstico para uma variedade de doenças 11-14. si miARN pode ser encontrado em fluidos biológicos, possivelmente libertados por células mortas e a quantidade de células vertente pode ser grandemente influenciado por uma doença subjacente. O perfil de miRNA de exossomos não reflete necessariamente o perfil de miRNA da célula originária 6, 10, 15-17, ainda exossomos podem transportar assinaturas miRNA que pode ser característica da ce parentalll como uma célula tumoral. Exossomas derivado de tumor foram identificados no plasma de doentes com adenocarcinoma do pulmão, cancro da próstata e outros tumores 8, 16, 18. O objetivo deste método é o isolamento fiável e robusta de exossomos de espécimes biliares humanos, em grande parte independentes dos seus procedimentos de manuseio anteriores. Foi desenvolvido para utilizar biliar como uma fonte segura de miARN potencial para o diagnóstico de doenças do ducto biliar, tais como colangiocarcinoma 19. É constituída por vários passos de centrifugação com o aumento das velocidades de isolar exossomas e pode ser aplicável a outros fluidos biológicos.

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;micro;m Polyethersulfone (PES) membrane filter</td><td>Corning</td><td>431229</td><td></td></tr><tr><td>thinwall polyallomer ultracentrifuge tubes&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>331374</td><td></td></tr><tr><td>SW40Ti rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LM10-HS&amp;nbsp;</td><td>Nanosight</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) software&amp;nbsp;</td><td>Nanosight</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mirVANA</td><td>Life Technologies</td><td>AM1560</td><td></td></tr><tr><td>Complete Protease Inhibitor</td><td>Roche distributed by Sigma-Aldrich</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon PSQ</td><td>Millipore, Bedford MA</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD63 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab59479</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tsg101</td><td>Abcam</td><td>ab30871</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and profiling of microrna-containing exosomes from human bile

pesquisa exossomo nos últimos três anos tem muito alargou o âmbito para a identificação e caracterização de biomarcadores e seus usos terapêuticos. Os exossomas foram recentemente mostrado para conter microARNs (miRs). Mirs-se ter surgido como biomarcadores valiosos para fins de diagnóstico. Como a coleta da amostra em clínicas e hospitais é bastante variável, o isolamento miRNA de bile toda varia substancialmente. Para atingir perfis de miARN robustos, precisos e reprodutíveis a partir de amostras biliares recolhidos de uma maneira simples necessário o desenvolvimento de um protocolo de alta qualidade para isolar e caracterizar os exossomas a partir de bílis. O método requer diversas centrifugações e um passo de filtração com um passo final de ultracentrifugação para sedimentar os exossomas isolado. microscopia eletrônica, Western blot, citometria de fluxo e multi-parâmetro de nanopartículas análise óptica, quando disponíveis, são passos de caracterização cruciais para validar a qualidade do exosomes. Para o isolamento de miARN a partir destes exossomas, spiking com o lisado, um miARN sintético não específico de uma espécie, como Caenorhabditis elegans, ou seja, Cel-miR-39, é importante para a normalização da eficácia da extracção do ARN. O isolamento de exossoma a partir do fluido bílis após este método permite que a miARN bem sucedida de perfis a partir de amostras biliares armazenados durante vários anos a -80 ° C.

Desde exossomas são demasiado pequenos para serem detectados por microscopia regular ou citometria de fluxo, microscopia de electrão ou óptica nanopartículas tem de ser realizada. A análise óptica de nanopartículas tem a vantagem sobre a microscopia de electrões que é também quantitativa e proporciona uma distribuição de tamanho e concentração. O aparelho apresenta um feixe de laser focado finamente através de um prisma de vidro para a amostra. O movimento browniano das vesículas isoladas é capturada através de uma câmera de alta sensibilidade EMCCD e monitorados em uma base quadro-a-quadro. A análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) medidas de software esse quadro movimento browniano para enquadrar para calcular o tamanho, modo e distribuição dos preparativos exossomo biliares. A Figura 1 mostra o resultado de uma análise típica NTA de exosome isolado a partir de uma amostra de bílis humana. Alternativamente, microscopia eletrônica pode ser utilizadapara confirmar o tamanho das partículas isoladas, se bem que sem quantificação. A Figura 2A mostra o resultado típico de microscopia electrónica de transmissão para exossomo isolado a partir de bílis humana. Para mais verificação da natureza exosomal das partículas isoladas, Western blots de sondagem para a presença de proteínas como tetraspaninas Tsg101 ou CD63, mostrado na Figura 2b, tem que ser utilizado. Proteínas específicas de exossoma não existe per se, mas são exossomas enriquecidos em tetraspanins, especialmente CD9, CD63, CD81 e CD82 com CD63 e CD81 referidos marcadores de exossoma como clássicos, e proteínas envolvidas na formação exossomo como TSG101 e Alix 21. Outras proteínas como a proteína de choque térmico cognato 70 (Hsc70) e 73 (Hsc73), bem como moléculas complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe II também podem ser encontradas enriquecido em exossomos com alguns, como Hsc73 eo prote associada à membrana periféricano leite de gordura glóbulo - factor de crescimento epidérmico factor-8 (Mfge8) sendo bastante específico para exossomos secretados a partir de células dendríticas 21. A Figura 3 mostra os gráficos de amplificação em tempo real típica de uma variedade de espécies de miARN extraídos de exossomas de bílis humana. Desde exossomos, ao contrário das células, não têm padrões de confiança como 18S ou 28S rRNA ou genes de limpeza como GAPDH ou β-actina para a normalização, o spiking com um miRNA sintética é importante. Os miARN sintéticas deve ser derivado de uma espécie diferente como CEL-miR 39 de Caenorhabditis elegans para permitir uma para normalizar os níveis de expressão de forma eficaz. Para reprodutibilidade é fundamental que a bile é processado o mais rápido possível e não congelados antes do processamento como essas condições levam à degradação dos miRNAs presentes na bile. Por outro lado, uma vez isolado, exoso<html> mes são muito estáveis ​​e muito resistente como o armazenamento à temperatura ambiente durante 48 h ou até três ciclos de congelação-descongelação causar efeitos insignificantes sobre os níveis de pelo menos duas espécies de miARN, embora a estabilidade da miARN de interesse tem de ser determinada empiricamente. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54036/54036fig1.jpg" /> Figura 1. Análise (nanopartículas) NTA para caracterizar exossomas biliares humanos exossomas biliares foram diluídas em PBS, na proporção de 1:. 600. (A) distribuição de tamanho e concentração de EVs isoladas de bílis humana. O tamanho médio foi determinada como sendo cerca de 97 nm para esta amostra (eixo do x: exossomas tamanho, eixo y: exossomas concentração para cada tamanho). Pressão (B) Amostra tiro de uma mesma amostra analisada em A. A gama de tamanhos mostra vesículas que variam de 30-110 nm.= &quot;_ Blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54036/54036fig2.jpg" /> Figura 2. A verificação da natureza exosomal da preparação por microscopia eletrônica de transmissão e Western blot. (A) Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) de estruturas esféricas presentes na bile humana 70-110 nm de tamanho. barra de escala é de 100 nm. (B) Análise de Western blot de exossomos biliares mostra presença dos típicos proteínas exosome marcador TSG101 e CD63. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54036/54036fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54036/54036fig3.jpg" /> Figura 3.-PCR em tempo real de espécies de miARN isolados exossomas a partir biliares. Real-time PCR de uma matriz de miR demonstra a amplificação de múltiplas espécies miR extraídos de exossomos humanos biliares (eixo X, número de ciclos PCR; eixo y, intensidade relativa). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54036/54036fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

Isolamento e Caracterização do perfil de exossomas de bílis humana contendo MicroRNA-

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

isolation-profiling-microrna-containing-exosomes-from-human

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

10.2K visualizações.  Johns Hopkins University School of Medicine. Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

Vídeo: Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most interestingly, sRNAs are also found outside of cells and are stably present in all biological fluids. As such, extracellular sRNAs represent a novel class of disease biomarkers and are likely involved in cell signaling and intercellular communication networks. To assess their potential as biomarkers, sRNAs can be quantified in plasma, urine, and other fluids. Nevertheless, to fully understand the impact of extracellular sRNAs as endocrine signals, it is important to determine which carriers are transporting and protecting them in biological fluids (e.g., plasma), which cells and tissues contribute to extracellular sRNA pools, and cells and tissues capable of accepting and utilizing extracellular sRNA. To accomplish these goals, it is critical to isolate highly pure populations of extracellular carriers for sRNA profiling and quantification. We have previously demonstrated that lipoproteins, particularly high-density lipoproteins (HDL), transport functional microRNAs (miRNA) between cells and HDL-miRNAs are significantly altered in disease. Here, we detail a new protocol that utilizes tandem HDL isolation with density-gradient ultracentrifugation (DGUC) and fast-protein-liquid chromatography (FPLC) to obtain highly pure HDL for downstream profiling and quantification of all sRNAs, including miRNAs, using both high-throughput sequencing and real-time PCR approaches. This protocol will be a valuable resource for the investigation of sRNAs on HDL.

This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.

O isolamento de lipoproteínas de alta densidade para não codificante pequeno ARN Quantificação

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Bioquímica

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and RNAs, are unique to the cells from which they are derived and can be used as indicators of disease. Several common enrichment protocols, including ultracentrifugation, yield exosomes laden with soluble protein contaminants. Specifically, we have found that the most abundant proteins within blood often co-purify with exosomes and can confound downstream proteomic studies, thwarting the identification of low abundance biomarker candidates. Of additional concern is irreproducibility of exosome protein quantification due to inconsistent representation of non-exosomal protein levels. The protocol detailed here was developed to remove non-exosomal proteins that co-purify along with exosomes, adding rigor to the exosome purification process. Five methods were compared using paired blood plasma and serum from five donors. Analysis using nanoparticle tracking analysis and micro bicinchoninic acid protein assay revealed that a combined protocol utilizing ultrafiltration and size exclusion chromatography yielded the optimal vesicle enrichment and soluble protein removal. Western blotting was used to verify that the expected abundant blood proteins, including albumin and apolipoproteins, were depleted.

Here, we present a protocol to purify exosomes from both plasma and serum with reduced co-purification of non-exosomal blood proteins. The optimized protocol includes ultrafiltration, protease treatment, and size exclusion chromatography. Enhanced purification of exosomes benefits downstream analyses, including more accurate quantification of vesicles and proteomic characterization.

Digestão de proteínas, ultrafiltração e cromatografia de exclusão para otimizar o isolamento do Exosomes do Plasma de sangue humano e soro

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, and intrinsic capability in intercellular delivery of various biomolecules. This work establishes an isolation protocol to achieve high yield and high purity of exosomes for siRNA delivery. Human Embryonic Kidney cells (HEK-293 cells) are cultured in bioreactor flasks and the culture supernatant (hereon referred to as conditioned medium) is harvested on a weekly basis to allow for enrichment of HEK-293 exosomes. The conditioned medium (CM) is pre-cleared of dead cells and cellular debris by differential centrifugation and is subjected to ultracentrifugation onto a sucrose cushion followed by a washing step, to collect the exosomes. Isolated HEK-293 exosomes are characterized for yield, morphology and exosomal marker expression by nanoparticle tracking analysis, protein quantification, electron microscopy and flow cytometry, respectively. Small interfering RNA (siRNA), fluorescently labeled with Atto655, is loaded into exosomes by electroporation and excess siRNA is removed by gel filtration. Cell uptake in PANC-1 cancer cells, after 24 h incubation at 37 &#176;C, is confirmed by flow cytometry. HEK-293 exosomes are 107.0 &#177; 8.2 nm in diameter. The exosome yield and particle-to-protein ratio (P:P) ratio are 6.99 &#177; 0.22 &#215; 1012 particle/mL and 8.3 &#177; 1.7 &#215; 1010 particle/&#181;g, respectively. The encapsulation efficiency of siRNA in exosomes is ~ 10-20%. Forty percent of the cells show positive signals for Atto655 at 24 h post-incubation. In conclusion, exosome isolation by ultracentrifugation onto sucrose cushion offers a combination of good yield and purity. siRNA could be successfully loaded into exosomes by electroporation and subsequently delivered into cancer cells in vitro. This protocol offers a standard procedure for developing siRNA-loaded exosomes for efficient delivery to cancer cells.

An exosome is a new generation of drug delivery carriers. We established an exosome isolation protocol with high yield and purity for siRNA delivery. We also encapsulated fluorescently labelled non-specific siRNA into exosomes and investigated the cellular uptake of siRNA-loaded exosomes in cancer cells.

Preparação do Exosomes de siRNA entrega para as células cancerosas

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

Pesquisa do câncer

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, milk and urine. One subset of these RNAs are the posttranscriptional regulators &#8211; microRNAs (miRNAs). To delineate the miRNAs produced by specific cell types, in vitro culture systems can be used to harvest and profile exRNAs derived from one subset of cells. The secreted factors of mesenchymal stem cells are implicated in alleviating numerous diseases and is used as the in vitro model system here. This paper describes the process of collection, purification of small RNA and library generation to sequence extracellular miRNAs. ExRNAs from culture media differ from cellular RNA by being low RNA input samples, which calls for optimized procedures. This protocol provides a comprehensive guide to small exRNA sequencing from culture media, showing quality control checkpoints at each step during exRNA purification and sequencing.

This protocol demonstrates how to purify extracellular microRNAs from cell culture media for small RNA library construction and next generation sequencing. Various quality control checkpoints are described to allow readers to understand what to expect when working with low input samples like exRNAs.

Isolando, sequenciamento e análise MicroRNAs extracelular das células-tronco mesenquimais humanas

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Genética

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Isolamento de exossomas a partir do plasma de indivíduos HIV-1 positivos

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Imunologia e Infecção

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

Isolamento e Caracterização de RNA-Contendo exossomos

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Biologia

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during physiological and pathological states. The isolation of EVs continues to be a major challenge in this field, due to limitations intrinsic to each technique. The differential ultracentrifugation with density gradient centrifugation method is a commonly used approach and is considered to be the gold standard procedure for EV isolation. However, this procedure is time-consuming, labor-intensive, and generally results in low scalability, which may not be suitable for small-volume samples such as bronchoalveolar lavage fluid. We demonstrate that an ultrafiltration centrifugation isolation method is simple and time- and labor-efficient yet provides a high recovery yield and purity. We propose that this isolation method could be an alternative approach that is suitable for EV isolation, particularly for small-volume biological specimens.

Here, we describe two extracellular vesicle isolation protocols, ultrafiltration centrifugation and ultracentrifugation with density gradient centrifugation, to isolate extracellular vesicles from murine bronchoalveolar lavage fluid samples. The extracellular vesicles derived from murine bronchoalveolar lavage fluid by both methods are quantified and characterized.

Isolamento das vesículas extracelulares de fluido broncoalveolar murino, usando uma técnica de centrifugação de ultrafiltração

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs are protected from degradation by sequestration in small vesicles called exosomes. Exosomes can fuse with the plasma membrane resulting in the transfer of RNA and proteins to the target cell. Their biological functions include immune response, antigen presentation, and intracellular communication. Delivery of miRNAs that can regulate gene expression in the recipient cells via blood has opened novel avenues for target intervention. In addition to offering a strategy for delivery of drugs or RNA therapeutic agents, exosomal contents can serve as biomarkers that can aid in diagnosis, determining treatment options and prognosis.	Here we will describe the procedure for quantitatively analyzing miRNAs and messenger RNAs (mRNA) from exosomes secreted in blood and cell culture media. Purified exosomes will be characterized using western blot analysis for exosomal markers and PCR for mRNAs of interest. Transmission electron microscopy (TEM) and immunogold labeling will be used to validate exosomal morphology and integrity. Total RNA will be purified from these exosomes to ensure that we can study both mRNA and miRNA from the same sample. After validating RNA integrity by Bioanalyzer, we will perform a medium throughput quantitative real time PCR (qPCR) to identify the exosomal miRNA using Taqman Low Density Array (TLDA) cards and gene expression studies for transcripts of interest.	
 These protocols can be used to quantify changes in exosomal miRNAs in patients, rodent models and cell culture media before and after pharmacological intervention. Exosomal contents vary due to the source of origin and the physiological conditions of cells that secrete exosomes. These variations can provide insight on how cells and systems cope with stress or physiological perturbations. Our representative data show variations in miRNAs present in exosomes purified from mouse blood, human blood and human cell culture media.	
 Here we will describe the procedure for quantitatively analyzing miRNAs and messenger RNAs (mRNA) from exosomes secreted in blood and cell culture media. Purified exosomes will be characterized using western blot analysis for exosomal markers and PCR for mRNAs of interest. Transmission electron microscopy (TEM) and immunogold labeling will be used to validate exosomal morphology and integrity. Total RNA will be purified from these exosomes to ensure that we can study both mRNA and miRNA from the same sample. After validating RNA integrity by Bioanalyzer, we will perform a medium throughput quantitative real time PCR (qPCR) to identify the exosomal miRNA using Taqman Low Density Array (TLDA) cards and gene expression studies for transcripts of interest.
 These protocols can be used to quantify changes in exosomal miRNAs in patients, rodent models and cell culture media before and after pharmacological intervention. Exosomal contents vary due to the source of origin and the physiological conditions of cells that secrete exosomes. These variations can provide insight on how cells and systems cope with stress or physiological perturbations. Our representative data show variations in miRNAs present in exosomes purified from mouse blood, human blood and human cell culture media

The presence of stable microRNAs (miRNAs) in exosomes has generated immense interest as a novel mode of intercellular communication, for their potential utility as biomarkers and as a route for therapeutic intervention. Here we demonstrate exosome purification from blood and culture media followed by quantitative PCR to identify miRNAs being transported.

Purificação e microRNA Profiling de Exosomes derivados do sangue e Meios de Cultura

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs  are protected from degradation by sequestration in small vesicles called  ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are found in mammalian cells. These small RNAs are potent gene regulators controlling vital pathways such as growth, development and death and much interest has been directed at their expression in bodily fluids. This is due to their dysregulation in human diseases such as cancer and their potential application as serum biomarkers. However, the analysis of miRNA expression in serum may be problematic. In most cases the amount of serum is limiting and serum contains low amounts of total RNA, of which small RNAs only constitute 0.4-0.5%1. Thus the isolation of sufficient amounts of quality RNA from serum is a major challenge to researchers today. In this technical paper, we demonstrate a method which uses only 400 &#181;l of human serum to obtain sufficient RNA for either DNA arrays or qPCR analysis. The advantages of this method are its simplicity and ability to yield high quality RNA. It requires no specialized columns for purification of small RNAs and utilizes general reagents and hardware found in common laboratories. Our method utilizes a Phase Lock Gel to eliminate phenol contamination while at the same time yielding high quality RNA. We also introduce an additional step to further remove all contaminants during the isolation step. This protocol is very effective in isolating yields of total RNA of up to 100 ng/&#181;l from serum but can also be adapted for other biological tissues.

This protocol describes a method for extracting small RNAs from human serum. We have used this method to isolate microRNAs from cancer serum for use in DNA arrays and also singleplex quantitative PCR. The protocol utilizes phenol and guanidinium thiocyanate reagents with modifications to yield high quality RNA.

Isolamento de ARN a partir de pequenas não-codificante de Soro Humano

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Fast and Simplified Method for High Through-put Isolation of miRNA from Highly Purified High Density Lipoprotein

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for diagnosis and prognosis or may serve as targets for drug development, respectively. Recently it has been shown that miRNAs are carried in lipoproteins, particularly high density lipoproteins (HDL) and are delivered to recipient cells for uptake. This raises the possibility that miRNAs play a critical and pivotal role in cellular and organ function via regulation of gene expression as well as messenger for cell-cell communications and crosstalk between organs. Current methods for miRNA isolation from purified HDL are impractical when utilizing small samples on a large scale. This is largely due to the time consuming and laborious methods used for lipoprotein isolation. We have developed a simplified approach to rapidly isolate purified HDL suitable for miRNA analysis from plasma samples. This method should facilitate investigations into the role of miRNAs in health and disease and in particular provide new insights into the variety of biological functions, outside of the reverse cholesterol transport, that have been ascribed to HDL. Also, the miRNA species which are present in HDL can provide valuable information of clinical biomarkers for diagnosis of various diseases.

MicroRNAs play an important regulatory role and are emerging as novel therapeutic targets for various human diseases. It has been shown that miRNAs are carried in high density lipoproteins. We have developed a simplified method to rapidly isolate purified HDL suitable for miRNA analysis from human plasma.

Rápido e simplificado método para isolamento alto Através-put de miRNA de altamente purificada lipoproteína de alta densidade

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for ...