이 작품은 건강 (A. 마키노에 HL115578)의 국립 연구소에서 보조금에 의해 지원되었다.

쥐에 대한 연구는 아리조나 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을하고, 국립 보건 연구소 (NIH) 지침에 따라 수행 하였다. 주 : 섹션 1, 2, 3은 설치와 실험 하루 전에 수행되어야한다. 1. 준비 솔루션 <ol><li> CD31 완충액 (50 mL) 중 <ol><li> 50 ML 튜브에 50 ㎖ × 1 인산 버퍼 식염수 (PBS)를 추가합니다. 0.05 g 소 혈청 알부민 (BSA) 및 0.037 g 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)를 달아 50 ML 튜브에 추가 분말 용해 될 때까지 약 1 시간 동안 회전 튜브를 넣어. 7.4으로 산도를 조정 새로운 50 ML 튜브에 0.2 μm의 필터를 통해 필터링하고, 사용할 때까지 4 ℃에서 저장한다. </li></ol></li><li> HEPES와 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS) (500 mL) 중 <ol><li> HBSS 용액에 10 mM의 HEPES을 잘 혼합 HEPES의 1.1915 g을 추가합니다. pH를 측정하고 7.4로 조정한다. 4에서 필터 및 저장기음. </li></ol></li><li> 1 배 Kreb의 솔루션 (1 L) <ol><li> 1 L 플라스크에 증류수를 두 배로 10 × Kreb의 솔루션 [표 1] 100 ㎖를 추가합니다. 2.1 g 중탄산 나트륨 2 g D-포도당을 달아 플라스크에 추가 할 수 있습니다. 혼합 1 L.에 총 볼륨을 조절 </li><li> 후드 안쪽에 30 분 및 필터 솔루션 95 % O 2 / 5 % CO 2 가스 버블 솔루션입니다. 4 ℃에서 보관하고 실험 기간 동안 얼음에 보관하십시오. </li></ol></li></ol> 2. 자기 비즈 준비 <ol><li> 각 1.5 ML 튜브 (샘플 당 하나의 튜브)에 1 ml의 CD31 버퍼를 추가합니다. 양 반대로 쥐 IgG의 구슬을 혼합하고 각 샘플 [표 1]에 해당하는 금액을 추가합니다. 적극적으로 30 회 튜브를 흔들어 흔들어 1 분 동안 자기 접시에 배치합니다. 접시에있는 동안 튜브를 열고 물통에 솔루션을 덤프. </li><li> 각각의 튜브에 1 ML의 CD31 버퍼를 추가합니다. 2 μL 쥐 항 마우스 CD31 안티 추가각각의 튜브에 몸과 4 ºC에서 튜브 O / N을 돌립니다. </li></ol> 3. 고압 증기 멸균 <ol><li> 모든 수술 도구와 피펫 팁을 압력솥. 4 가지 직경 팁이되도록 좁은 데 넓은에서, 피펫 팁의 끝을 잘라. 팁에 대한 대략 직경 3 mm, 2.5 mm, 2mm, 각각 1.5 mm이다. 팁을 잘라 121 ºC의 온도에서 살균 30 분으로 전날 오토 클레이브. 주 : 섹션 4-11은 실험 당일에 수행되어야한다. </li></ol> 4. 준비 솔루션 <ol><li> M199의 2 % 철 요새 송아지 혈청 (IFCS)를 포함하는 세척 버퍼를 준비합니다. 영상의 경우, 30 ㎖ / 마우스를 준비합니다. </li><li> 효소 용액 (10 ㎖ / 샘플)을 준비한다. 50 ML 튜브에 0.6 단위 / 스파 아제 (Dispase) ml의 1 밀리그램 / 콜라게나 유형 II ml의 무게. M199을 추가하고 15 분 동안 4 ºC에서 튜브를 회전합니다. insid 새로운 50 ML 튜브에 0.2 μm의 필터를 통해 필터전자 후드와 사용할 때까지 4 ℃에서 보관하십시오. </li><li> 헤파린과 HBSS / HEPES를 준비합니다. 15 ml의 튜브에 10 mM의 HEPES와 HBSS의 10 ML을 추가합니다. 튜브에 헤파린의 100 μl를 추가하고 사용할 때까지 4 ℃에서 보관하십시오. </li></ol> 5. 세탁 구슬 <ol><li> 4 ºC에서 회에서 구슬 튜브를 타고 후드에 가져다. 자기 접시에 튜브를 넣고 1 분간 흔들어. 솔루션을 덤프하고 각 튜브에 1 ML의 CD31 버퍼를 추가합니다. </li><li> 자기 판에서 튜브를 가지고 적극적으로 30 회를 흔들. 자기 접시에 튜브를 다시 넣고 3 세척 총 반복합니다. 완료 후, 4C 다시 튜브를 넣어 사용할 때까지 회전 유지. </li></ol> 6. 해부 <ol><li> 혈액 응고를 방지하기 위하여 헤파린 0.1 ml를 복강 내 주사 한 마우스. 다음 펜토 바르 비탈 0.01 ml를 복강 내 주사를 사용하여 마우스를 마취, 10 분을 기다립니다. 마우스가 기분이되어 있는지 확인발을 곤란으로 고통. </li><li> 머리 폴리스티렌 보드에 마우스를 놓고 핀으로 팔을 개최합니다. 목구멍까지 상부 흉부 영역에서 피부를 잘라 집게 힘든 컷 가위를 사용합니다. </li><li> 바로 다이어프램 위의 흉곽의 중앙에 상처를 확인합니다. 심장과 폐를 노출 삼각형을 만들기 위해 목을 향해 옆으로 위쪽 뼈를 잘라. 단지 다이어프램 위의 대동맥을 잘라. </li><li> 당기없이 집게로 흉선을 잡고 함께 폐와 심장을 제거하기 위해 조심스럽게 결합 조직을 잘라 가위를 사용합니다. 1 × Kreb의와 비커에 넣어 조직은 집게로 흔들어 1 × Kreb의와 6cm 접시에 전송할 수 있습니다. </li><li> 가위와 집게를 사용하여 폐 로브를 제거합니다. 대동맥로 20 G 멸균 카테터를 삽입합니다. HBSS / 헤파린과 관상 동맥 순환계에 피를 플래시합니다. , 심실의 작은 상처를 확인 마음을 흔들 M199의 샘플 튜브에 전송할 수 있습니다. 얼음에 튜브를 유지합니다. </li></ol><p<html> 클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 7. 조직 소화 <ol><li> 효소 용액 10ml를 가득 6cm 접시에 마음을 전송하고 가위를 사용하여 작은 조각으로 말하다. 15 분 동안 37 ºC 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. 조직을 쉽게 통과 할 수 있도록 절단 끝이 팁을 통해 아래로 30 회를 피펫 팅에 의해 소화 물질을 교반. </li><li> 또 다른 15 분 동안 37 ºC 인큐베이터에 다시 넣습니다. 교반을 세 번 반복, 가장 큰 구멍에서 피펫 팁을 사용하여 각 시간이 좁은 각 사이에 15 분 배양합니다. </li><li> 마지막 15 분 부화 후, 출력 및 후드로 샘플을 채취. 피펫 솔루션 위로 피펫 팁 좁은 개구하고 새로운 50 ML 튜브에 40 μm의 셀 스트레이너 통과를 사용하여 아래로 30 회. </li><li> 10 ML의 피펫을 사용하여 10 ml의 세척 버퍼 접시를 씻고 셀 스트레이너에 전송합니다. 실온에서 10 분 동안 400g의 원심 분리기 스핀에​​ 50 ㎖ 튜브를 넣어. </li></ol>비즈와 &#39;타이틀 &quot;&gt; 8. 세척 및 활용 <ol><li> 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거합니다. 두 번 5 ml의 세척 버퍼와 세포를 씻으십시오. </li><li> 이전 중 하나가 한 번에 하나의 튜브에 구슬과 작품에 1.5 ml의 튜브를 준비 가져옵니다. 자기 접시에 하나의 1.5 ML 튜브를 넣어 3 회 흔들어 엽니 다. </li><li> 마지막으로 원심 분리 후, 펠렛을 방해하지 않고 가능한 한 많이 뜨는을 제거합니다. 적극적으로 쓸어 넘겨 세포 덩어리를 해제합니다. </li><li> 50 ML 튜브에 1 ㎖의 세척 버퍼를 추가하고 1 ml를 피펫으로 세포를 섞는다. 1.5 ㎖의 튜브의 용액을 버리고 비드에 50 ㎖ 튜브에서 세포 현탁액 1 ㎖를 추가한다. 튜브 30 번 가볍게 한 다음 30 분 동안 4 ºC로 회전. </li></ol> 9. 세포 배양 / 이미징 준비 <ol><li> 세포를 도금을위한 챔버를 준비합니다. 코팅 표면을 잘 챔버에 젤라틴 용액 (V / W 5 %, 300 μL)를 첨가하고, 37 ºC에서 30 분 동안 배양한다. 배양, REM 수면 후비켜 젤라틴 건조 표면. </li><li> 회전 30 분 후에 비즈 / 세포와 튜브를 타고 후드 내부의 자기 접시에 넣어. 2 분, 덤프 흔들어 1 ml의 세척 버퍼를 추가합니다. </li><li> 플레이트에서 튜브를 가지고, 적극적으로 30 배 다음 영화 30 번 흔들어. 자기 판에서 그들을 다시 넣고 1 분간 흔들어. 5 세척 총 4 회 반복하지만, 1 분은 접시에 진탕. </li><li> 마지막 세척 후, 하나의 튜브를 꺼내 한 번에 각각의 튜브 하나에서 작동합니다. 다음 30 배를 가볍게 30 회 흔들어. 자기 접시에 넣어 1 분간 흔들어. 덤프 및 (37 ºC에서 미리 예열) 1 ml의 20 % IFCS EC 미디어를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 적극적으로 30 배는 30 배를 가볍게 흔들어. 500 μL에 피펫을 조정하고 최대 피펫 10 배 아래로. 각 챔버에 500 μl를 전송합니다. </li><li> 37 ºC 배양기에 넣고 / N을 O를 둡니다. 다음 날, 10 % FBS EC 매체와 세포를 씻는다. </li></ol> 웨스턴 블롯 (WB) 샘플 (10)을 준비 <ol><li> 탁회전 1 시간 후 비즈 / 세포와 튜브를 전자. 자기 접시에 넣어 2 분간 흔들어. 상층 액을 버리고 1 ml의 차가운 HBSS를 추가합니다. 적극적으로 30 배는 30 배를 가볍게 흔들어. 3 세척 두 번 반복하지만, 1 분은 접시에 진탕. </li><li> 마지막 세척 후, 자기 접시에 튜브를 넣고 1 분간 흔들어. 피펫을 사용하여 버퍼를 제거하는 방법은 이전에 11, 12 설명 사용 WB의 세포를 용균. 수집 된 해물은 일반적으로 약 30 μg의 단백질이 포함되어 있습니다. </li></ol> 11. 영상 <ol><li> 챔버 250 μL의 최종 볼륨, 미디어 세포를 3 회 반복한다. 세포에 DIL-acLDL의 1.5 μl를 추가합니다. 이 시점에서, 어둠 속에서 세포를 유지합니다. </li><li> 37 ℃에서 3.5 시간 동안 품어. , 훽스트 (Hoechst)의 1.5 μl를 추가 잘 혼합과 PBS 37 ˚C.Wash 세포에서 30 분 동안 배양하고 실온에서 20 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 고정한다. </li><li> 30 마일에 대한-PBS를 BSA PBS로 두 번 세척하고 5 %로 차단실온에서 N. 1 % BSA-PBS로 두 번 씻는다. ml의 2 μg의 /의 농도가 1 % BSA-PBS를 사용하여 BS-렉틴-FITC를 희석하고 각 실에 300 μl를 추가합니다. </li><li> 실온에서 30 분 동안 진탕 기의 챔버를 넣는다. PBS 3 회 씻는다. </li><li> FITC (렉틴 염색, EC 마커, 여기 / 방출 488 ㎚ / 519 ㎚), DAPI (훽스트, 358 nm에서 핵 염색, 여기 / 방출 / 30 밀리 초 200 밀리의 노출 시간을 형광 현미경으로 세포를 시각화 461 ㎚), 및 557 ㎚ / 576 ㎚)에서 TRITC (acLDL 염색, EC 마커, 여기 / 방출 300 밀리 초. 20 배의 대물 렌즈를 사용하여 이미지를 획득. </li></ol>

<ol>
	<li>Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+functions.">Endothelial cell functions.</a> J Cell Physiol. 196, 430-443 (2003).</li><li>Sumpio, B. E., Riley, J. T., Dardik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+in+focus:+endothelial+cell.">Cells in focus: endothelial cell.</a> Int J Biochem Cell Biol. 34, 1508-1512 (2002).</li><li>Cines, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+in+physiology+and+in+the+pathophysiology+of+vascular+disorders.">Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders.</a> Blood. 91, 3527-3561 (1998).</li><li>Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+function+and+dysfunction:+testing+and+clinical+relevance.">Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance.</a> Circulation. 115, 1285-1295 (2007).</li><li>Jin, Y., Liu, Y., Antonyak, M., Peng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+vascular+endothelial+cells+from+murine+heart+and+lung.">Isolation and characterization of vascular endothelial cells from murine heart and lung.</a> Methods Mol Biol. 843, 147-154 (2012).</li><li>Makino, A., Platoshyn, O., Suarez, J., Yuan, J. X., Dillmann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+connexin40+is+associated+with+coronary+endothelial+cell+dysfunction+in+streptozotocin-induced+diabetic+mice.">Downregulation of connexin40 is associated with coronary endothelial cell dysfunction in streptozotocin-induced diabetic mice.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295, C221-C230 (2008).</li><li>Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissue.">Isolation of endothelial cells from murine tissue.</a> J Immunol Methods. 244, 205-215 (2000).</li><li>van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+endothelial+cells+from+fresh+tissues.">Isolation of endothelial cells from fresh tissues.</a> Nat Protoc. 3, 1085-1091 (2008).</li><li>Nolan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signatures+of+tissue-specific+microvascular+endothelial+cell+heterogeneity+in+organ+maintenance+and+regeneration.">Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration.</a> Dev Cell. 26, 204-219 (2013).</li><li>Sobczak, M., Dargatz, J., Chrzanowska-Wodnicka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+pulmonary+endothelial+cells+from+neonatal+mice.">Isolation and culture of pulmonary endothelial cells from neonatal mice.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Makino, A., Dai, A., Han, Y., Youssef, K. D., Wang, W., Donthamsetty, R., Scott, B. T., Wang, H., Dillmann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=O-GlcNAcase+overexpression+reverses+coronary+endothelial+cell+dysfunction+in+type+1+diabetic+mice.">O-GlcNAcase overexpression reverses coronary endothelial cell dysfunction in type 1 diabetic mice.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 309, C593-C599 (2015).</li><li>Sasaki, K., Donthamsetty, R., Heldak, M., Cho, Y., Scott, B. T., Makino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VDAC:+old+protein+with+new+roles+in+diabetes.">VDAC: old protein with new roles in diabetes.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 303, C1055-C1060 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

연구에서 가장 널리 사용되는 혈관 내피 세포 때문에 편리 성과 용이성 배양 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC에)에있다. 그러나, 많은 연구가 다른 특정 기관 (10)으로부터 내피 세포의 분리에 의해 달성 생리 모델의 이용을 필요로한다. 내피 세포는 심장 조직에서 세포의 매우 작은 인구를 구성; 자신의 분리 및 배양이 매우 어려운 것으로 증명할 수 있습니다. 이 프로토콜 내에서 세 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 혈액을 잘 세척하는 것입니다. 혈액 내의 백혈구는 세포 표면 마커로서 CD31을 발현하고, 상기 CD31 항체의 결합에 대해 경쟁되는 EC 바와 같이이 필요하다. 다른 내피 세포는 또한 세척, 혈액에 존재할 수있는 바와 같은 세포에 의한 오염을 방지하기 위해 필수적이다. 두번째 중요한 단계는 분리 과정 전반에 걸쳐 무균 환경을 유지하는 것이다. 모든 오염 resu얻어 세포의 수를 극적으로 감소 LTS. 마지막으로 세 번째 중요한 단계 분리의 효율을 감소 그렇지 정전 등 CD31 완충액의 pH를 조정할 수있다. 셀의 품질이 차단 중 가장 중요하다. 평활근 세포는 성장 배지에 헤파린 적절한 양의 첨가에 의해 억제 될 수있다. 섬유 아세포 증식 미디어에 D-발린을 추가로 둔화 될 수있다. 내피 세포는 population.The 내피 세포 표현형의 순도를 테스트하기 위해 BS-렉틴 DIL-AcLDL 공동 염색의 흡수에 의해 특징 지어 질 수있는 것은 불안정하고 그 동작을 빠르게 회 원 조직 취출 변경할 수 배양. 기술의 한계는 세포들이 여전히 표현형을 유지하도록 배양 5 일 후에 사용되지 않아야한다는 것이다. 강력하게 세포를 통과하지 않는 것이 좋습니다. 차 전지는 일관된 resu을 제공 할 것입니다LT. 전반적으로,이 기술은 뛰어난 순도 세포의 좋은 숫자가 발생합니다. 필요한 기술을 가진, 상기 분리 공정은 6 시간 내에 완료 될 수있다. 그것은 세포 배양 또는 분자 생물학적 실험 중 하나에 대한 마우스 관상 동맥 내피 세포를 얻기위한 좋은 방법을 제공한다.

다양한 심장 혈관 질병 및 대사성 질환의 마우스 모델은 환자에서 발견되는 것과 유사한 생체 분자 변화를 견딜. 또한, 마우스의 유전 적 변화는 우리 질환의 발생 및 진행에 특정 유전자의 병원성 역할을 조사 할 수있는 강력한 도구이다. 현재, 세포 유형 특이 적 유전자의 노크 또는 -out 생쥐 쉽게 마우스 진정 유전자 변형되었는지 여부를 결정하는 첫 번째 단계는 특정 유형의 세포에서 많은 실험실 mRNA를 측정 및 단백질 수준에서 발생한다. 내피 세포는 혈관 내피 세포되는 EC () 라인 안쪽 혈관 벽의 얇은 단일 층이다. 내피 세포는 혈관 장력, 혈관 투과성, 새로운 혈관 형성 1,2- 조절에 중요한 역할을한다. 내피 기능 장애는 많은 병리학 적 조건과 내피 세포 기능의 변화의 특징은 다양한 자동차로 이어질 수있다diovascular 질병 3,4. 이 병태 생리 학적 조건하에 내피 세포의 기능을 연구하는 것이 중요하다. 가 EC에 5-8을 분리하는 방법에는 여러 가지가 있으며, 상기 분리 방법은 조직과 종 사용될에 따라 최적화되어야한다. 다양한 조직으로부터의 EC가 표면 마커에 대한 단백질 발현 9 이질성의 높은 수준을 표시하기 때문이다. 내피 세포의 성공적인 분리는 종종 도전하고 훈련과 연습의 어느 정도를 필요로 할 수 있습니다. 달성되면,이 프로토콜에서 제안 된 분리 방법은 안정적이고 효율적인 것으로 증명한다. 이 방법의 전체 목표는 높은 품질과 양의 관상 마우스의 EC (MCECs)을 획득하는 것이다. 심장에서 수집 된 세포의 양이 다른 기술을 이용하여 다른 조직에서 수집 된 세포보다 작은 경우에도,이 방법은 여전히​​ 내기 제공터 품질. 얻어진 인구 내피 세포의 순도는 90 %보다 크다. 따라서,이 기술은 세포 이미징 순전히 절연 내피 세포에 의존하는 애플리케이션에 적합하다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="876">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:239px;">BSA</td>
			<td style="width:251px;">Sigma</td>
			<td style="width:108px;">A3311-10G</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH3026801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Bicarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-(+)-Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Sheep anti-rat IgG beads&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>F-410L</td>
			<td style="width:280px;">DynaBeads pan mouse IgG , Thermo Fisher Scientific, cat# 11035</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rat anti-mouse PECAM Antibody&#160;</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>550274</td>
			<td>BD Biosciences</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IFCS&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH30072.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">M199</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT10060-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dispase (Neutral Protease)</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp./Fisher</td>
			<td>LS02109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase Type II&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp./Fisher</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP381-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Igepal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>13021-50ml</td>
			<td>I3021-50 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0044-1ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8340-1 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heparin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS&#160;</td>
			<td>Fisher/Mediatech</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-Valine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V1255-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGS</td>
			<td>BD</td>
			<td>356006</td>
			<td>Corning</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Fisher/Mediatech</td>
			<td>MT-30-002-Cl</td>
			<td>MT-30-002-CI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse coronary endothelial cells

내피 세포는 혈관의 내벽 라인 혈관 톤, 혈관 투과성, 새로운 혈관 형성의 조절에 중요​​한 역할을한다. 내피 세포 기능 장애, 허혈성 심장 질환을 포함한 다양한 심혈 관계 질환의 발생 및 진행에 관여한다. 함수 관상 내피 세포의 특성을 조사하기 위해, 세포 격리 첫 단계이며 이후의 실험을 높은 순도 및 품질을 필요로한다. 이 프로토콜은 성인 마우스 관상 동맥 내피 세포를 분리하는 효율적인 방법을 설명합니다. 마우스 심장 해부 및 작은 조각으로 다진된다. 디스 파제 II와 콜라게나 제를 사용하여 심장의 소화 후, 세포를 세척하고, 항 CD31 항체가 결합되는 자성 비드와 인큐베이션. 내피 세포와 구슬은 세척 몇 번이고 이미징 및 분자 생물학적 experime 등 다양한 애플리케이션에서 사용할 준비가국세청. 효율적인 분리는 90 % 이상의 순도 하나의 심장 당 약 104 세포를 얻을 수 있습니다.

마우스 마음에서 관상 동맥 내피 세포의 성공적인 분리는 일반적으로 조약돌 모양으로 90 % 이상의 순도 약 10 4 세포를 얻을 수 있습니다. 내피 세포의 순수한 인구를 들어,주의는 오염이없는 무균 환경을 보장하기 위해 프로토콜을 통해주의해야한다. 신장 세포 집단 내 세포의 확대 외관은 다른 유형의 세포, 평활근 세포 및 섬유 아세포 오염을 나타낸다. 내피 세포의 순도 시험 내피 세포 표면 마커, BS-렉틴 acLDL (도 1)으로 세포를 염색하여 수행된다. 두 색을 나타내는 양성 세포의 비율은 MCEC에서 90 % 이상이었다. 이러한 결과는 기술이 성공적으로 수행되었음을 나타냅니다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3"> PBS (10 배) (1 L) </td><td> &lt;/ TD&gt; </tr><tr><td> 자료 </td><td> MW </td><td> 양 (g) </td><td></td></tr><tr><td> 염화나트륨 </td><td> 58.44 </td><td> (80) </td><td></td></tr><tr><td> KCl을 </td><td> 74.55 </td><td> 이 </td><td></td></tr><tr><td> 나 2 HPO 4 </td><td> 141.96 </td><td> 6.1 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 136.08 </td><td> 이 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> 크렙스 (10 배) (1 L) </td></tr><tr><td> 자료 </td><td> MW </td><td> 진한 (㎜) </td><td> 양 (g) </td></tr><tr><td> 염화나트륨 </td><td> 58.44 </td><td> (118) </td><td> 69 </td></tr><tr><td> KCl을 </td><td> 74.56 </td><td> 4.7 </td><td> 3.5 </td></tr><tr><td> 염화칼슘 2 • 2H 2 O </td><td> 147 </td><td> 1.8 </td><td> 2.6 </td></tr><tr><td> 황산 • 7H 2 O </td><td> 246.5 </td><td> 1.2 </td><td> 2.96 &lt;/ TD&gt; </tr><tr><td> 의 NaH 2 PO 4 </td><td> (120) </td><td> 1.2 </td><td> 1.44 </td></tr><tr><td colspan="2"> EC 미디어 (20 %) (500 mL) 중 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 자료 </td><td> 양 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> M199 </td><td> 444.5 ml의 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10-20 U / ㎖ 헤파린 </td><td> 500 μL </td><td></td><td></td></tr><tr><td> D-발린 </td><td> 25 mg의 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> IFCS </td><td> 100 ㎖ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> EGS </td><td> 10 mg의 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> 5 ml의 </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 구슬의 양 한 마우스에 사용되는 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 이미징을위한 </td><td> 5 μL </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 에프또는 WB / PCR </td><td> 10 μL </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 표 1. 사용 솔루션의 화학 성분. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53985/53985fig1.jpg" /> MCECs. 형광 이미지 그림 1. 대표 이미지는 마음에서 고립 된 마우스 관상 동맥되는 EC (MCEC)는 EC 인구의 높은 순도를 나타내는 것으로 나타났다. 순도는 MCEC에서 녹색 (B)에 붉은 색 (A) 및 렉틴 염색의 두 acLDL 흡수하여 확인 시험을 실시하고 있습니다. 핵은 푸른 색에 훽스트 (C)에 의해 염색 하였다. 두 색을 나타내는 양성 세포의 비율은 MCEC에서 90 % 이상이었다. 바는 20 μm의 대표입니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53985/53985fig1large.jpg" target="_blank">더 큰 적이있는을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 이온.

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Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

마우스 관상 내피 세포의 분리

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.1K 조회수.  University of Arizona, Tucson. This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

비디오: Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

인간 제대 베인 내피 세포의 절연 (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

연구

생물학

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

판막병 내피 세포의 분리

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

신생아 마우스의 폐 내피 세포의 분리 및 문화

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

배아 심실 내피 세포의 분리

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic by-products, as exemplified by exercising skeletal muscle. Endothelial cells (ECs) line the intima of all resistance vessels and serve a key role in controlling diameter (e.g.&#160;endothelium-dependent vasodilation) and, thereby, the magnitude and distribution of tissue blood flow. The regulation of vascular resistance by ECs is effected by intracellular Ca2+ signaling, which leads to production of diffusible autacoids (e.g.&#160;nitric oxide and arachidonic acid metabolites)1-3 and hyperpolarization4,5 that elicit smooth muscle cell relaxation. Thus understanding the dynamics of endothelial Ca2+ signaling is a key step towards understanding mechanisms governing blood flow control. Isolating endothelial tubes eliminates confounding variables associated with blood in the vessel lumen and with surrounding smooth muscle cells and perivascular nerves, which otherwise influence EC structure and function. Here we present the isolation of endothelial tubes from the superior epigastric artery (SEA) using a protocol optimized for this vessel.
To isolate endothelial tubes from an anesthetized mouse, the SEA is ligated in situ to maintain blood within the vessel lumen (to facilitate visualizing it during dissection), and the entire sheet of abdominal muscle is excised. The SEA is dissected free from surrounding skeletal muscle fibers and connective tissue, blood is flushed from the lumen, and mild enzymatic digestion is performed to enable removal of adventitia, nerves and smooth muscle cells using gentle trituration. These freshly-isolated preparations of intact endothelium retain their native morphology, with individual ECs remaining functionally coupled to one another, able to transfer chemical and electrical signals intercellularly through gap junctions6,7. In addition to providing new insight into calcium signaling and membrane biophysics, these preparations enable molecular studies of gene expression and protein localization within native microvascular endothelium.

We present a preparation for visualizing and manipulating calcium signaling in native, intact microvascular endothelium. Endothelial tubes freshly isolated from mouse resistance arteries supplying skeletal muscle retain in vivo morphology and dynamic signaling within and between neighboring cells. Endothelial tubes can be prepared from microvessels of other tissues and organs.

마우스 저항 동맥의 미세 혈관 내피 튜브의 분리

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

쥐과 밸브 내피 세포의 분리

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

쥐 관상 동맥 혈관 평활근 세포의 분리

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

트랜스-내부 세포 배아 줄기 세포의 대량 주입 리드 더 높은 Chimerism 요금

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a suitable organ source. Immune rejection and coagulation are two major hurdles for the success of xenotransplantation. Vascular endothelial cell (EC) injury and dysfunction are important for the development of the inflammation and coagulation responses in xenotransplantation. Thus, isolation of porcine aortic endothelial cells (pAECs) is necessary for investigating the immune rejection and coagulation responses. Here, we have developed a simple enzymatic approach for the isolation, characterization, and expansion of highly purified pAECs from miniature pigs. First, the miniature pig was anaesthetized with ketamine, and a length of aorta was excised. Second, the endothelial surface of aorta was exposed to 0.005% collagenase IV digestive solution for 15 min. Third, the endothelial surface of the aorta was scraped in only one direction with a cell scraper (&#60;10 times), and was not compressed during the process of scraping. Finally, the isolated pAECs of Day 3, and after passage 1 and passage 2, were identified by flow cytometry with an anti-CD31 antibody. The percentages of CD31-positive cells were 97.4% &#177; 1.2%, 94.4% &#177; 1.1%, and 92.4% &#177; 1.7% (mean &#177; SD), respectively. The concentration of Collagenase IV, the digestive time, the direction, and frequency and intensity of scraping are critical for decreasing fibroblast contamination and obtaining high-purity and a large number of ECs. In conclusion, our enzymatic method is a highly-effctive method for isolating ECs from the miniature pig aorta, and the cells can be expanded in vitro to investigate the immune and coagulation responses in xenotransplantation.

An effective enzymatic method for isolation of primary porcine aortic endothelial cells (pAECs) from miniature pigs is described. The isolated primary pAECs can be used to investigate the immune and coagulation response in xenotransplantation.

소형 돼지에서 1 차 대동맥 내피 세포의 격리 및 배양

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...