Diese Arbeit wurde durch die Gewährung von den National Institutes of Health (HL115578 A. Makino) unterstützt.

Die Forschung an Mäusen wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) von der University of Arizona genehmigt und wurde nach dem National Institute of Health (NIH) Richtlinien durchgeführt. HINWEIS: Die Ziffern 1, 2 und 3 sollte am Tag vor dem Experiment als Setup durchgeführt werden. 1. Vorbereiten Lösungen <ol><li> CD31-Puffer (50 ml) <ol><li> 50 ml 1 × phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in ein 50 ml Röhrchen. Man wiegt 0,05 g Rinderserumalbumin (BSA) und 0,037 g Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und zu der 50-ml-Röhrchen und setzen Sie den Schlauch für etwa 1 h bis das Pulver löst sich zu drehen. PH-Wert auf 7,4, filtriert durch ein 0,2 um-Filter in ein neues 50 ml Rohr und lagern bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li></ol></li><li> Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) mit HEPES (500 ml) <ol><li> In 1,1915 g HEPES bis 10 mM HEPES in HBSS-Lösung zu machen und gut mischen. Messung des pH-Wertes und Einstellen auf 7,4. Filter und lagern bei 4˚C. </li></ol></li><li> 1x Kreb-Lösung (1 l) <ol><li> In 100 ml 10 × Kreb-Lösung [Tabelle 1] destilliertem Wasser in einem 1 - Liter - Kolben zu verdoppeln. Man wiegt 2,1 g Natriumbikarbonat und 2 g D-Glucose und fügen Sie in den Kolben. Mischen Sie und passen Sie das Gesamtvolumen auf 1 L. </li><li> Bubble - Lösung mit 95% O 2/5% CO &amp; sub2 ; -Gas für 30 min und Filterlösung im Innern der Haube. Lagerung bei 4 ° C und halten auf dem Eis während Experiment. </li></ol></li></ol> 2. Vorbereitung der Magnetic Beads <ol><li> 1 ml CD31-Puffer in jede 1,5-ml-Röhrchen (ein Röhrchen pro Probe). Mischen Sie die Schaf - Anti-Ratten - IgG - Perlen und fügen Sie die entsprechende Menge zu jeder Probe [Tabelle 1]. Schütteln Sie die Röhrchen kräftig 30 Mal und legen Sie sie in der magnetischen Platte für 1 min schütteln. Öffnen Sie die Rohre während auf der Platte und Dump-Lösungen in einen Eimer. </li><li> 1 ml CD31 Puffer in jedes Röhrchen. Hinzufügen 2 &amp; mgr; l Ratten-anti-Maus-CD31 AntiKörper in jedes Röhrchen und drehen Rohre O / N bei 4 ºC. </li></ol> 3. Autoklavierung <ol><li> Autoclave alle chirurgische Werkzeuge und Pipettenspitzen. Schneiden Sie die Enden der Pipettenspitzen, so dass es Spitzen mit 4 verschiedenen Durchmessern, von breitesten engste. Ungefähren Durchmesser für die Spitzen sind 3 mm, 2,5 mm, 2 mm und 1,5 mm. Schneiden Sie die Spitzen und Autoklaven am Tag vor der mit 30 Minuten der Sterilisation bei einer Temperatur von 121 ° C. HINWEIS: Sections 4-11 sollte am Tag des Experiments durchgeführt werden. </li></ol> 4. Vorbereitung Lösungen <ol><li> Bereiten Waschpuffer mit 2% Eisen angereicherte Kälberserum (IFCS) in M199. Für die Bildgebung, Herstellung von 30 ml / Maus. </li><li> Bereiten Enzymlösung (10 ml / Probe). Wiegen 0,6 Einheiten / ml Dispase und 1 mg / ml Kollagenase Typ II in ein 50 ml Röhrchen. In M199 und drehen Sie das Rohr bei 4 ° C für 15 min. Man filtriert durch 0,2 um Filter in eine neue 50-ml-Tube inside die Haube und halten bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Bereiten Sie HBSS / HEPES mit Heparin. 10 ml HBSS mit 10 mM HEPES in 15-ml-Tube. 100 l Heparin auf das Rohr und halten bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li></ol> 5. Waschen Sie die Perlen <ol><li> Nehmen Sie die Röhrchen mit Perlen aus dem Rotor bei 4 ° C und an der Haube zu bringen. Die Röhrchen in der magnetischen Platte und schütteln für 1 min. Sichern Sie die Lösung und 1 ml CD31 Puffer in jedes Röhrchen. </li><li> Nehmen Sie die Rohre aus der Magnetplatte und kräftig schütteln, 30-mal. Setzen Sie die Rohre in der magnetischen Platte zurück und wiederholen Sie für insgesamt 3 Wäschen. Nach der Fertigstellung setzen die Rohre 4 ° C zurück und halten bis zur Verwendung drehen. </li></ol> 6. Dissection <ol><li> Injizieren die Mäuse intraperitoneal mit 0,1 ml Heparin Blutgerinnungs zu verhindern. Warten Sie 10 Minuten, dann betäuben die Mäuse intraperitoneale Injektion von 0,01 ml Pentobarbital verwendet. Überprüfen Sie, ob die Maus fühltSchmerzen, die durch den Fuß einklemmen. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf einer Polystyrolplatte mit Kopf nach oben und halten Sie die Arme mit Stiften. Verwenden einer Pinzette und zäh-cut-Schere die Haut an der oberen Brustbereich zu schneiden bis zum Hals. </li><li> Machen Sie einen Schnitt in der Mitte des Brustkorbs knapp über der Membran. Schneiden Sie den Knochen seitlich und nach oben in Richtung der Kehle ein Dreieck zu machen Aussetzen des Herzens und der Lunge. Schneiden Sie die Aorta knapp über der Membran. </li><li> Halten Sie die Thymusdrüse mit einer Pinzette, ohne zu ziehen und mit einer Schere jede Bindegewebe zu schneiden sorgfältig Lunge und Herz zusammen zu entfernen. Platz Gewebe in einem Becherglas mit 1 × Kreb, schütteln mit einer Pinzette und Transfer zu 6 cm Schale mit 1 × Kreb. </li><li> Entfernen Sie die Lungenlappen mit einer Schere und Pinzette. Legen Sie eine 20 G sterile Katheter in die Aorta. Spülen Sie das Blut in das Herz-Kreislauf-System mit HBSS / Heparin. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Ventrikel, schütteln das Herz und Transfer in ein Probenröhrchen von M199. Halten Sie Röhrchen auf Eis. </li></ol><p<html> class = &quot;jove_title&quot;&gt; 7. Tissue Verdauung <ol><li> Übertragen Sie das Herz auf eine 6 cm Schale mit 10 ml Enzymlösung gefüllt und Hackfleisch in kleine Stücke mit einer Schere. Die Schalen werden in den 37 ° C Inkubator für 15 min. Rühre verdauten Materialien durch Auf- und Abpipettieren 30 mal durch eine Spitze mit einem abgeschnittenen Ende das Gewebe zu ermöglichen, durch leichter zu passieren. </li><li> Legen Sie es für weitere 15 Minuten im 37 ° C-Inkubator zurück. Wiederholen Aufregung drei Mal, jedes Mal mit Pipettenspitzen von größten Öffnungen engste und 15 min Inkubation zwischen den einzelnen. </li><li> Nach letzten 15 min Inkubation Proben zu nehmen und in die Haube. Pipettieren Lösung nach oben und unten 30-mal mit Pipettenspitze mit der engsten Öffnung und durch ein 40 &amp; mgr; m Zelle Sieb in eine neue 50-ml-Tube. </li><li> Waschen Sie die Schale mit 10 ml Waschpuffer eine 10 ml Pipette und übertragen auf Zellsieb verwenden. Stellen die 50-ml-Röhrchen in der Zentrifuge und Schleudern bei 400 g für 10 min bei RT. </li></ol>itle &quot;&gt; 8. Waschen und Konjugation mit Perlen <ol><li> Überstand entfernen, ohne das Pellet zu stören. Wash-Zellen mit 5 ml Waschpuffer zweimal. </li><li> Holen Sie sich eines der zuvor 1,5 ml Röhrchen hergestellt mit Perlen und die Arbeit an einem Rohr zu einem Zeitpunkt. Setzen Sie ein 1,5-ml-Röhrchen in der magnetischen Platte, schütteln 3-mal und öffnen. </li><li> Nach dem letzten Zentrifuge, entfernen Sie so viel Überstand wie möglich, ohne das Pellet zu stören. Distanziere die Zellklumpen durch kräftiges Ausklopfen. </li><li> 1 ml Waschpuffer zu den 50-ml-Röhrchen und Mischen der Zellen mit einer 1 ml Pipette. Sichern Sie die Lösung aus dem 1,5-ml-Röhrchen und 1 ml Zellsuspension aus dem 50-ml-Röhrchen an die Kügelchen. Flick die Rohre 30-mal drehen dann bei 4 ° C für 30 min. </li></ol> 9. Vorbereitung für Zellkultur / Imaging <ol><li> Bereiten Kammern für Zellen Plattierung. In Gelatinelösung (5% w / v, 300 &amp; mgr; l) in die Kammer und die Oberfläche zu beschichten und Inkubation bei 37 ° C für 30 min. Nach der Inkubation remove Gelatine und trocken die Oberfläche. </li><li> Nehmen Sie die Röhrchen mit Perlen / Zellen nach 30 min Dreh und in der Magnetplatte im Inneren der Kapuze setzen. Schütteln für 2 min, dump und 1 ml Waschpuffer. </li><li> Nehmen Sie Rohre aus der Platte, kräftig schütteln, 30-mal dann flick 30 mal. Setzen Sie sie in Magnetplatte zurück und schütteln für 1 min. Wiederholen 4 mal für insgesamt 5 Wäschen, jedoch mit 1 min auf der Platte ausgeschüttelt. </li><li> Nach der letzten Waschung, nehmen Sie einen Schlauch heraus und zu einer Zeit, an jedem Rohr ein arbeiten. Schütteln Sie 30-mal dann 30-mal Flick. Legen Sie es auf der Magnetplatte und schütteln für 1 min. Dump und 1 ml 20% IFCS EG-Medien (vorgewärmt auf 37 ° C). </li><li> Kräftig schütteln 30 mal Flick dann 30-mal. Stellen Sie pipettieren bis 500 &amp; mgr; l und pipettieren nach oben und unten 10-mal. Übertragen Sie 500 ul zu jeder Kammer. </li><li> Setzen Sie bei 37 ºC-Inkubator und lassen O / N. Am nächsten Tag, waschen Sie die Zellen mit 10% FBS EG-Medien. </li></ol> 10. Vorbereitungen für die Western Blot (WB) Proben <ol><li> Take aus der Röhrchen mit Perlen / Zellen nach 1 Stunde der Rotation. Setzen Sie sie in der magnetischen Platte und schütteln für 2 min. Dump Überstand und 1 ml kaltem HBSS. Kräftig schütteln 30 mal Flick dann 30-mal. Wiederholen Sie zweimal für 3 Waschungen, aber mit 1 min auf der Platte schütteln. </li><li> Nach dem letzten Waschen, legen Rohre auf Magnetplatte und schütteln für 1 min. Entfernen Pufferpipette und Lyse der Zellen für WB unter Verwendung eines Verfahrens zuvor 11,12 beschrieben. Gesammelte Lysat enthält in der Regel etwa 30 ug Protein. </li></ol> 11. Imaging <ol><li> Waschen Sie die Zellen 3 mal mit Medien, mit der endgültigen Volumen von 250 &amp; mgr; l für eine Kammer. Fügen 1,5 ul Dil-acLDL zu den Zellen. Von diesem Punkt halten die Zellen im Dunkeln. </li><li> Inkubieren für 3,5 Stunden bei 37 ° C. In 1,5 ul Hoechst, gut mischen und Inkubation für 30 min bei 37 ˚C.Wash Zellen mit PBS und fixieren mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min bei RT. </li><li> Zweimal waschen mit PBS und Block mit 5% BSA-PBS für 30 min bei RT. Wasche zweimal mit 1% BSA-PBS. Verdünnte BS-Lectin-FITC unter Verwendung von 1% BSA-PBS auf eine Konzentration von 2 ug / ml und 300 &amp; mgr; l zu jeder Kammer. </li><li> Setzen Sie die Kammer auf dem Orbitalschüttler bei RT für 30 min. Waschen mit PBS 3 mal. </li><li> Visualisieren Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop mit Belichtungszeit von 200 ms für FITC (Lektin-Färbung, eine EG-Marker, Anregung / Emission 488 nm / 519 nm), 30 ms für DAPI (Hoechst, eine Kernfärbung, Anregung / Emission bei 358 nm / 461 nm) und 300 ms für TRITC (acLDL Färbung, eine EG-Marker, Anregung / Emission bei 557 nm / 576 nm). Erwerben Sie Bilder mit einem 20X Objektiv verwendet wird. </li></ol>

<ol>
	<li>Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+functions.">Endothelial cell functions.</a> J Cell Physiol. 196, 430-443 (2003).</li><li>Sumpio, B. E., Riley, J. T., Dardik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+in+focus:+endothelial+cell.">Cells in focus: endothelial cell.</a> Int J Biochem Cell Biol. 34, 1508-1512 (2002).</li><li>Cines, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+in+physiology+and+in+the+pathophysiology+of+vascular+disorders.">Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders.</a> Blood. 91, 3527-3561 (1998).</li><li>Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+function+and+dysfunction:+testing+and+clinical+relevance.">Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance.</a> Circulation. 115, 1285-1295 (2007).</li><li>Jin, Y., Liu, Y., Antonyak, M., Peng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+vascular+endothelial+cells+from+murine+heart+and+lung.">Isolation and characterization of vascular endothelial cells from murine heart and lung.</a> Methods Mol Biol. 843, 147-154 (2012).</li><li>Makino, A., Platoshyn, O., Suarez, J., Yuan, J. X., Dillmann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+connexin40+is+associated+with+coronary+endothelial+cell+dysfunction+in+streptozotocin-induced+diabetic+mice.">Downregulation of connexin40 is associated with coronary endothelial cell dysfunction in streptozotocin-induced diabetic mice.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295, C221-C230 (2008).</li><li>Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissue.">Isolation of endothelial cells from murine tissue.</a> J Immunol Methods. 244, 205-215 (2000).</li><li>van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+endothelial+cells+from+fresh+tissues.">Isolation of endothelial cells from fresh tissues.</a> Nat Protoc. 3, 1085-1091 (2008).</li><li>Nolan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signatures+of+tissue-specific+microvascular+endothelial+cell+heterogeneity+in+organ+maintenance+and+regeneration.">Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration.</a> Dev Cell. 26, 204-219 (2013).</li><li>Sobczak, M., Dargatz, J., Chrzanowska-Wodnicka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+pulmonary+endothelial+cells+from+neonatal+mice.">Isolation and culture of pulmonary endothelial cells from neonatal mice.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Makino, A., Dai, A., Han, Y., Youssef, K. D., Wang, W., Donthamsetty, R., Scott, B. T., Wang, H., Dillmann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=O-GlcNAcase+overexpression+reverses+coronary+endothelial+cell+dysfunction+in+type+1+diabetic+mice.">O-GlcNAcase overexpression reverses coronary endothelial cell dysfunction in type 1 diabetic mice.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 309, C593-C599 (2015).</li><li>Sasaki, K., Donthamsetty, R., Heldak, M., Cho, Y., Scott, B. T., Makino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VDAC:+old+protein+with+new+roles+in+diabetes.">VDAC: old protein with new roles in diabetes.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 303, C1055-C1060 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Die am häufigsten verwendeten Endothelzellen in Forschung sind menschliche Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) wegen ihrer Bequemlichkeit und Leichtigkeit der Kultivierung. Jedoch erfordert eine Menge Forschung die Verfügbarkeit eines physiologischen Modells durch die Isolierung von Endothelzellen aus anderen spezifischen Organen 10 erreicht. Endothelial-Zellen machen einen sehr geringen Population von Zellen in dem Herzgewebe auf; ihre Isolation und Kultivierung kann sich als sehr schwierig erwiesen. Es gibt drei wichtige Schritte innerhalb dieses Protokolls. Die erste ist, Blut gut zu spülen. Dies ist notwendig, da Leukozyten im Blut auch CD31 als ein Zelloberflächenmarker exprimieren, und wird im Wettbewerb gegen ECs für die Bindung des CD31-Antikörper. Als andere Endothelzellen auch in dem Blut vorhanden sein können, ist Spülung wesentliche Verunreinigung durch solche Zellen zu verhindern. Der zweite entscheidende Schritt ist eine sterile Umgebung während des gesamten Isolationsprozess aufrecht zu erhalten. Jede Verunreinigung results in einer dramatischen Abnahme in der Anzahl der Zellen erreicht. Schließlich ist der dritte kritische Schritt des pH des CD31-Puffer, wie Versagen einzustellen, so zu tun, wird die Effizienz der Isolierung zu verringern. Zellqualität ist sehr wichtig, während dieser Isolation. Glattmuskelzellwachstum kann durch Zugabe einer geeigneten Menge an Heparin zu dem Kulturmedium inhibiert werden. Fibroblastproliferation konnte durch Zugabe von D-Valin zu den Medien verlangsamt werden. Endotheliale Zellen kann durch die Aufnahme von Dil-AcLDL und Co-Färbung mit BS-Lectin zu testen, um die Reinheit des population.The endothelialen Zell-Phänotyp charakterisiert werden instabil und ihr Verhalten schnell ändern kann, wenn aus dem ursprünglichen Gewebe entnommen und kultiviert. Eine Begrenzung der Technik ist, dass die Zellen nicht nach 5 Tagen der Kultivierung verwendet werden, um sicherzustellen, dass sie noch ihren Phänotyp beibehalten. Es wird dringend nicht passieren die Zellen empfohlen. Die primären Zellen wird eine konsistente resu liefernlt. Insgesamt ergibt sich die Technik in einer guten Anzahl von Zellen hervorragender Reinheit. Mit den erforderlichen Fähigkeiten kann der Isolationsprozess innerhalb von 6 Stunden abgeschlossen sein. Es bietet eine großartige Methode für entweder für Zellkultur oder molekularbiologischen Experiment Maus-Koronar-Endothelzellen zu erhalten.

Mausmodelle verschiedener kardiovaskulärer Erkrankungen und Stoffwechselstörungen tragen physiologischen und molekularen Veränderungen, die mit denen in Patienten gefunden ähnlich sind. Weiterhin ist die genetische Veränderung von Mäusen ein leistungsfähiges Werkzeug, das uns die pathogene Rolle spezifischer Gene bei der Entwicklung und dem Fortschreiten der Krankheiten zu untersuchen erlaubt. Heutzutage zelltypspezifische Gen-Knock-in oder -out Mäuse werden in vielen Labors und die Messung von mRNA und Protein-Ebene in spezifischen Zelltypen ist der erste Schritt bei der Bestimmung, ob die Mäuse wurden wirklich genetisch veränderten leicht erzeugt. Das Endothel ist eine dünne einzelne Schicht aus Endothelzellen (ECs), die Linien der inneren Gefäßwand. Endothelial - Zellen spielen eine entscheidende Rolle 1,2 Gefäßspannung, die vaskuläre Permeabilität und neue Gefäßbildung bei der Regulierung. Endotheliale Dysfunktion ist ein Markenzeichen vieler pathologischer Zustände und Veränderungen in der Endothelfunktion zu verschiedenen Auto führen kannKreislauf- Erkrankungen 3,4. Es ist somit signifikant die Funktion von Endothelzellen unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen zu studieren. Es gibt mehrere Möglichkeiten , um ECs isolieren 5-8 und die Isolierungsmethode muss optimiert werden , abhängig von dem Gewebe und Arten verwendet. Dies liegt daran , ECs aus verschiedenen Geweben hinsichtlich ihrer Oberflächenmarker und Proteinexpression 9 eine hohe Heterogenität anzuzeigen. Erfolgreiche Isolierung von Endothelzellen kann oft schwierig sein und erfordert ein gewisses Maß an Ausbildung und Praxis. Einmal erreicht, erweist sich die Methode der Isolierung in diesem Protokoll vorgeschlagen, stabil und effizient zu sein. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist, Maus koronarer ECs (MCECs) von hoher Qualität und Quantität zu erhalten. Auch wenn die Menge der Zellen, die aus einem Herzen gesammelt weniger als aus anderen Geweben gesammelten Zellen unter Verwendung anderer Techniken, diese Technik bietet noch better Qualität. Die Reinheit von Endothelzellen in der resultierenden Population größer ist als 90%. Somit wäre diese Technik ideal für Anwendungen, die auf rein isolierten Endothelzellen verlassen wie Cell Imaging.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="876">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:239px;">BSA</td>
			<td style="width:251px;">Sigma</td>
			<td style="width:108px;">A3311-10G</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH3026801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Bicarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-(+)-Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Sheep anti-rat IgG beads&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>F-410L</td>
			<td style="width:280px;">DynaBeads pan mouse IgG , Thermo Fisher Scientific, cat# 11035</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rat anti-mouse PECAM Antibody&#160;</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>550274</td>
			<td>BD Biosciences</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IFCS&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH30072.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">M199</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT10060-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dispase (Neutral Protease)</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp./Fisher</td>
			<td>LS02109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase Type II&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp./Fisher</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP381-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Igepal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>13021-50ml</td>
			<td>I3021-50 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0044-1ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8340-1 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heparin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS&#160;</td>
			<td>Fisher/Mediatech</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-Valine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V1255-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGS</td>
			<td>BD</td>
			<td>356006</td>
			<td>Corning</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Fisher/Mediatech</td>
			<td>MT-30-002-Cl</td>
			<td>MT-30-002-CI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse coronary endothelial cells

Endothelzellen kleiden die Innenwand der Blutgefäße und eine wichtige Rolle bei der Regulation des Gefäßtonus, vaskuläre Permeabilität spielen und neue Gefäßbildung. Endothelzelldysfunktion ist in der Entwicklung und dem Fortschreiten vieler kardiovaskulärer Erkrankungen, einschließlich ischämischer Herzkrankheit beteiligt ist. Um die Funktion und Charakterisierung von koronaren Endothelzellen untersuchen, Zellisolierung ist der erste Schritt, und es erfordert eine hohe Reinheit und Menge zur nachfolgenden Experimenten durchzuführen. Dieses Protokoll beschreibt ein effizientes Verfahren adulten Maus-Koronar-Endothelzellen zu isolieren. Die Maus Herz wird in kleine Stücke zerschnitten und zerkleinert. Nach der Verdauung des Herzens unter Verwendung Dispase und Kollagenase II werden die Zellen gewaschen und mit magnetischen Kügelchen inkubiert, die mit Anti-CD31-Antikörper konjugiert sind. Die Kügelchen mit Endothelzellen sind mehrmals gewaschen und bereit sind, in verschiedenen Anwendungen zu verwenden, einschließlich Bildgebung und molekularbiologische Experiments. Effiziente Isolierung ergibt etwa 10 4 Zellen pro ein Herz mit über 90% Reinheit.

Die erfolgreiche Isolierung von koronaren Endothelzellen aus einer Maus Herz ergibt typischerweise etwa 10 4 Zellen mit über 90% Reinheit mit einer gepflasterten Form. Für eine reine Population von Endothelzellen, Vorsicht sollte im gesamten Protokoll genommen werden, um eine sterile Umgebung, die frei von jeglicher Verunreinigung zu gewährleisten. Das Auftreten von länglichen Zellen oder vergrößerten Zellen innerhalb der Population zeigt an Kontamination mit anderen Zelltypen, glatten Muskelzellen und Fibroblasten. Endothelzell-Reinheitstest wird durch Anfärben der Zellen mit einer endothelialen Zelloberflächenmarker, BS-Lectin und acLDL (Bild 1) durchgeführt. Der Anteil der positiven Zellen, die beide Farben aufweisen war mehr als 90% in MCEC. Ein solches Ergebnis zeigt, daß die Technik erfolgreich durchgeführt wurde. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3"> PBS (10x) (1 l) </td><td> &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Stoff </td><td> MW </td><td> Menge (g) </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,44 </td><td> 80 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,55 </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> 141,96 </td><td> 6.1 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 136,08 </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Krebs (10x) (1 l) </td></tr><tr><td> Stoff </td><td> MW </td><td> Conc (mM) </td><td> Menge (g) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,44 </td><td> 118 </td><td> 69 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,56 </td><td> 4.7 </td><td> 3.5 </td></tr><tr><td> CaCl 2 • 2H 2 O </td><td> 147 </td><td> 1.8 </td><td> 2.6 </td></tr><tr><td> MgSO 4 • 7H 2 O </td><td> 246,5 </td><td> 1.2 </td><td> 2,96 &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 120 </td><td> 1.2 </td><td> 1,44 </td></tr><tr><td colspan="2"> EC Medien (20%) (500 ml) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stoff </td><td> Menge </td><td></td><td></td></tr><tr><td> M199 </td><td> 444,5 ml </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10 - 20 U / ml Heparin </td><td> 500 ul </td><td></td><td></td></tr><tr><td> D-Valin </td><td> 25 mg </td><td></td><td></td></tr><tr><td> IFCS </td><td> 100 ml </td><td></td><td></td></tr><tr><td> EGS </td><td> 10 mg </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> 5 ml </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Anzahl der Perlen für eine Maus verwendet werden </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Für die Bildgebung </td><td> 5 ul </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Foder WB / PCR </td><td> 10 ul </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Chemische Zusammensetzung von Lösungen eingesetzt. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53985/53985fig1.jpg" /> Abbildung 1. Repräsentative Bilder von MCECs. Fluoreszenzbilder zeigen , dass Maus koronarer ECs (MCEC) , isoliert aus Herzen hoher Reinheit der Bevölkerung EG aufweisen. Reinheit wurde sowohl acLDL Aufnahme der roten Farbe (A) und Lektin - Färbung in der grünen Farbe (B) in MCEC getestet. Der Kern wurde von Hoechst in der blauen Farbe (C) gefärbt. Der Anteil der positiven Zellen, die beide Farben aufweisen war mehr als 90% in MCEC. Bar ist repräsentativ für 20 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53985/53985fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um einen größeren vers anzuzeigen</a>Ion dieser Figur.

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Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

Isolierung von Maus-Koronar-Endothelzellen

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.1K Aufrufe.  University of Arizona, Tucson. This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

Serie: Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

Isolierung humaner Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Forschung

Biologie

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

Isolierung von Valvular Endothelzellen

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolierung und Kultivierung von pulmonaler Endothelzellen aus neugeborenen Mäusen

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

Isolierung von embryonalen ventrikuläre Endothelzellen

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic by-products, as exemplified by exercising skeletal muscle. Endothelial cells (ECs) line the intima of all resistance vessels and serve a key role in controlling diameter (e.g.&#160;endothelium-dependent vasodilation) and, thereby, the magnitude and distribution of tissue blood flow. The regulation of vascular resistance by ECs is effected by intracellular Ca2+ signaling, which leads to production of diffusible autacoids (e.g.&#160;nitric oxide and arachidonic acid metabolites)1-3 and hyperpolarization4,5 that elicit smooth muscle cell relaxation. Thus understanding the dynamics of endothelial Ca2+ signaling is a key step towards understanding mechanisms governing blood flow control. Isolating endothelial tubes eliminates confounding variables associated with blood in the vessel lumen and with surrounding smooth muscle cells and perivascular nerves, which otherwise influence EC structure and function. Here we present the isolation of endothelial tubes from the superior epigastric artery (SEA) using a protocol optimized for this vessel.
To isolate endothelial tubes from an anesthetized mouse, the SEA is ligated in situ to maintain blood within the vessel lumen (to facilitate visualizing it during dissection), and the entire sheet of abdominal muscle is excised. The SEA is dissected free from surrounding skeletal muscle fibers and connective tissue, blood is flushed from the lumen, and mild enzymatic digestion is performed to enable removal of adventitia, nerves and smooth muscle cells using gentle trituration. These freshly-isolated preparations of intact endothelium retain their native morphology, with individual ECs remaining functionally coupled to one another, able to transfer chemical and electrical signals intercellularly through gap junctions6,7. In addition to providing new insight into calcium signaling and membrane biophysics, these preparations enable molecular studies of gene expression and protein localization within native microvascular endothelium.

We present a preparation for visualizing and manipulating calcium signaling in native, intact microvascular endothelium. Endothelial tubes freshly isolated from mouse resistance arteries supplying skeletal muscle retain in vivo morphology and dynamic signaling within and between neighboring cells. Endothelial tubes can be prepared from microvessels of other tissues and organs.

Microvascular Endothelial Isolierung von Rohren aus Maus Widerstand Arterien

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Isolierung von murinen Ventil Endothelzellen

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

Die Isolierung von murinen Coronary glatten Gefäßmuskelzellen

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

Trans-innere Zelle Masse Injektion von embryonalen Stammzellen führt zu höheren Chimerism Raten

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a suitable organ source. Immune rejection and coagulation are two major hurdles for the success of xenotransplantation. Vascular endothelial cell (EC) injury and dysfunction are important for the development of the inflammation and coagulation responses in xenotransplantation. Thus, isolation of porcine aortic endothelial cells (pAECs) is necessary for investigating the immune rejection and coagulation responses. Here, we have developed a simple enzymatic approach for the isolation, characterization, and expansion of highly purified pAECs from miniature pigs. First, the miniature pig was anaesthetized with ketamine, and a length of aorta was excised. Second, the endothelial surface of aorta was exposed to 0.005% collagenase IV digestive solution for 15 min. Third, the endothelial surface of the aorta was scraped in only one direction with a cell scraper (&#60;10 times), and was not compressed during the process of scraping. Finally, the isolated pAECs of Day 3, and after passage 1 and passage 2, were identified by flow cytometry with an anti-CD31 antibody. The percentages of CD31-positive cells were 97.4% &#177; 1.2%, 94.4% &#177; 1.1%, and 92.4% &#177; 1.7% (mean &#177; SD), respectively. The concentration of Collagenase IV, the digestive time, the direction, and frequency and intensity of scraping are critical for decreasing fibroblast contamination and obtaining high-purity and a large number of ECs. In conclusion, our enzymatic method is a highly-effctive method for isolating ECs from the miniature pig aorta, and the cells can be expanded in vitro to investigate the immune and coagulation responses in xenotransplantation.

An effective enzymatic method for isolation of primary porcine aortic endothelial cells (pAECs) from miniature pigs is described. The isolated primary pAECs can be used to investigate the immune and coagulation response in xenotransplantation.

Isolation und Kultur der primären Aorten-Endothelzellen von Miniaturschweinen

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...