Name: isolation of murine coronary vascular smooth muscle cells
Uploaded: 2016-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
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이 작품은 (PAL 및 K99HL116769 AJT에하는 R01HL056046) 국립 보건원에서 지원하고, 전국 어린이 병원에서 연구소 (PAL 및 AJT에)했다.

윤리 진술 : 본 연구는 건강 지침의 국립 연구소에 따라 실시하고,이를 전국 어린이 병원에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다. 1. 준비 / 설정 주 :이 분리 기술은 링 스탠드에 나란히 위치하는 두 랑겐 돌프 가열 코일을 필요로하고, 순환 수조에 병렬로 연결된다. <ol><li> 물 목욕을 순환 켜고 랑겐 돌프 정맥의 끝에서 33 ~ 34 ° C의 최종 온도를 달성하기 위해 온도를 조절 (이에 사용 된 수조 인해 6-7 ° C를 손실 40 ° C로 설정 설정 튜브를 가로 지르는 온도). 관류 펌프의 전원을 켜고 0.5 ml / 분으로 관류 속도를 설정합니다. <ol><li> 멸균 초순수 100 ml의 다음 70 % 에탄올 50 ㎖, 각 플러싱에 의해 물 자켓 가열 코일의 모두 연결된 배관 및 25 게이지 뉼러를 청소한다. </li><li> 가열 코일을 취소합니다주사기로 공기를 밀어 페놀 레드없이 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 10 mL로 씻는다. 가열 코일 튜브에 HBSS를 남겨주세요. </li><li> 튜브에 페놀 레드없이 실온 HBSS 가득 멸균 10 ㎖의 루어 락 주사기를 연결합니다. 이 부정적인 혈관 평활근 세포의 분리에 영향을 소화하는 동안 공기 색전을 일으킬 수로 HBSS 채워진 주사기를 부착 할 때 공기 방울이 튜브 가열 코일 안에 갇혀 있지 않은지 확인합니다. </li></ol></li><li> 페놀 레드없이 얼음처럼 차가운 HBSS로 채워진 다른 멸균 10 ML의 주사기에 가열 코일과 장소에서 25 게이지 정맥을 제거합니다. 사용할 준비가 될 때까지 얼음이 보관하십시오. 다른 캐 뉼러에 대해 반복합니다. </li><li> 효소 소화 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 소화 용액 75 ml를 300 단위 / ㎖의 최종 농도를 달성하기 위해 특정 로트 번호에 따른 콜라게나 제 2 형을 단다. </li><li> 페놀 레드 HBSS의 75 ml의 콜라게나 제를 녹여. 다음으로, 0, 1.5를 가하여0.1 ㎎ / ㎖ 대두 트립신 억제제를 첨가하고, 혼합물을 1 M CaCl2를 75 μL. </li></ol></li><li> 즉시 소화 용액을 사용하는 경우, 37 ℃로 따뜻하게. 그렇지 않은 경우, 최대 6 시간 동안 4 ° C에 배치합니다. 이 솔루션은 신선한 매일해야합니다. </li><li> 스톱 솔루션 / 도금 미디어를 준비합니다. <ol><li> 100 ㎖ 고 글루코스 (4.5 g / L) DMEM 500 ml의 FBS, primocin의 L 글루타민 5 ㎖, 비 필수 아미노산 5 ㎖, HEPES 5 ㎖, 1 ml의 열 불 활성화 추가한다. 필터 살균하는 것이 좋습니다. </li><li> 나누어지는 4 °의 C에서 A1-A6 번호 열두 15 ML 원뿔 튜브의 각에 스톱 솔루션 및 B1-B6, 장소의 6 ml의. 분취 액을 37 ° C의 배양기에서 50 ㎖ 원뿔 제자리 정지 용액 50 ㎖. 주 : 필요한 경우,이 단계는 또한 이전에 단리 날을 제조 할 수있다. 이 정지 용액을 세포 격리 다음 도금 매체로 사용한다. </li></ol></li><li> 30 G 바늘 장착이 1 ml의 주사기를 준비합니다헤파린 100 ㎕와 (1,000 개 / ㎖). </li><li> 5-0 수술 실크의 5cm 조각을 잘라. 다른 배만큼 일단 수술 실크 느슨한 오버 핸드 매듭을 묶어. 25 게이지 캐 뉼러에 배치하지만 조하지 않습니다. 다른 25 G 정맥을 반복합니다. </li><li> 살균, 얼음처럼 차가운, HBSS없이 페놀 레드 2 ㎖ 4 개의 35mm 멸균 페트리 접시 (# 1-4)를 입력합니다. 얼음에 보관하십시오. </li></ol> 2. 안락사, 심장 절연 및 캐 뉼러 <ol><li> 심장 분리하기 전에 스톱 솔루션의 소화 용액 50 ㎖ 원뿔 따뜻한되어 있는지 확인하십시오. 링 스탠드에 뷰렛 클램프 (또는 링 스탠드 클램프)에서 얼음과 장소에서 부착 된 25 G 정맥으로 HBSS 채워진 주사기를 제거합니다. </li><li> 3 % 이소 플루오 란을 사용하여 마우스를 마취. 마우스를 각 뒷다리의 발가락 터치에 의해 마취 확인합니다. 다리 경련 경우, 마우스는 아직 그렇게 1 분을 기다린 발가락 터치를 반복 마취되지 않습니다. </li><li> 모피 a를 제거하여 경정맥을 노출가위로 목의 앞쪽에 차 피부. 다음, 조심스럽게 경정맥을 둘러싸고있는 지방을 제거하기 위해 집게를 사용합니다. 지방을 제거한 후, 천천히 헤파린 100 ㎕ (1,000 개 / ㎖)을 주입. 과도한 출혈을 방지하기 위해 정맥을 통해 수술 스폰지를 놓습니다. </li><li> 1 분 후, 열린 가슴은 첫 번째 팔 머리 지점을 통해 그대로 상행 대동맥을 유지해야하고, 곡선 집게 심장, 리프트 마음을 노출 가위를 사용하여 절제합니다. 즉시 페놀없이 35mm 접시에 빨간색 얼음처럼 차가운 HBSS와 (# 1) 마음을 놓고 씻어. 참고 : 해부 범위를 사용하여 다음 4 단계를 수행합니다. </li><li> 끝이 접시 # 2 단지 얼음처럼 차가운 HBSS의 표면 아래에 명확하게 해부 현미경을 통해 볼되도록 링에 장착 된 25 G 정맥는 45 ° 각도로 서 놓습니다. 접시 # 2에 마음을 전송합니다. </li><li> 듀 집게를 사용하여 부드럽게 P에 무딘 절개를 통해 과량의 지방을 제거하여 대동맥을 노출하지 못하 천공 또는 대동맥 파열. 다음으로, 25 G 정맥을 통해 대동맥을 밀어 집게를 사용합니다. </li><li> 따라서 역행 관류 밸브의 무결성을 손상 할 것이다 가까이에 있지만 대동맥 판막 이상으로 대동맥을 통해 아래로 정맥을 안내합니다. 정맥 자리에되면, 대동맥을 통해 사전 묶여 실크를 밀어 조입니다. 심장을 확보하기 위해 대동맥 주위에 사각형 매듭을 형성​​하기 위해 두 번째 매듭을 묶어. </li><li> 대동맥이 제대로 연결되면, 부드럽게 25 G 정맥에 부착 된 주사기에 얼음처럼 차가운 HBSS와 관상 동맥에 남아있는 혈액을 세척하십시오. 과도한 관상 동맥 압력을 피하기 위해 너무 많이 넣지주의하십시오. 만 매우 느리고 부드러운 플러시가 플러시를 완료하는 데 필요합니다. 누출이없는 대동맥 삽관도이 부드러운 플러시 동안 관찰 할 수있다. </li><li> HBSS의 흐름을 시작합니다 관류 펌프를 켭니다. 에주의하면서 HBSS 채워진 주사기에서 (첨부 된 마음으로) 25 G 정맥을 제거HBSS 가득 캐 뉼러 허브를 유지하고, 따뜻한 HBSS 채워진 가열 코일에 연결합니다. 8 분 동안 0.5 ㎖ / 분의 속도로 관류 펌프 심장 관류 시작. </li><li> 제 마음 유관되고 시스템에 관류 된 후, 반복 두 번째 심장 2.1-2.8이 단계를 반복합니다. 이 절연 부 따라서 신중한 계획과 타이밍이 요구되는 각각의 마음에 대해 엇갈리게됩니다. </li></ol> 3. 소화 <ol><li> HBSS로 세척 한 후, 미리 예열 소화 용액 10 ml를 가득 하나에 펌프에 현재 10 ml의 HBSS 주사기를 변경합니다. / 분 0.5 ML의 속도로 12 분 동안 소화 용액으로 각각의 마음을 관류. 이 모든 잔여 혈액과 혈관 내피 세포를 포함하므로이 첫 번째 소화에 따른 분수를 수집하지 않습니다. </li><li> 12 분 후, 0.4 ㎖ / 분으로 관류 속도를 변경 냉간 정류장 오디오 솔루션 가득 (각 소화 첫번째 또는 두번째 심장에 대응 튜브 A1 또는 B1) 15 mL를 삼각 배치혈관 평활근 세포가 풍부한 관류 수집을 시작하기 위해 심장 아래에 얼음 양동이에 이온. </li><li> 15 분 후, 즉시 두 분수의 수집 후 10 분 동안 89 XG에 튜브 A2 또는 B2 스핀 원뿔 튜브 A1과 B1에 수집 원뿔을 변경합니다. 펌프에 소화 용액으로 가득 주사기 솔루션의 1 ml의가있는 경우, 소화 용액의 갓 가득한 10 ML의 주사기로 교체합니다. </li><li> 원심 분리 후, 각 수집 튜브에서 흡 상등액 약 0.5 ㎖에두고. 따뜻한 스톱 솔루션 (또는 도금 미디어)의 2 mL를 A1에서 재현 탁 펠렛. 느슨한 모자와 37 ° C 배양기에서 B1 튜브와 장소 튜브에 A1 관에서 재 부유를 추가합니다. </li><li> 반복 90 분 총 수집 시간에 사용된다 (A6 및 B6를 통해) 모든 튜브까지 3.3 및 3.4 단계를 반복합니다. 소화 80 분에서 튜브 A6 및 B6, respe에서 이러한 세포를 뇌실 안에 갇혀 될 수있는 세포를 세척하고 수집하는 심장 정점을 열 절단ctively. 참고 : 때때로 심장은 90 분 시점 이전에 정맥 떨어질 것입니다. 이 경우, 소화 용액 2 ㎖로 가득 멸균 35mm 페트리 접시에 마음과 장소를 검색 할 수 있습니다. 마음의 정점을 잘라 부드럽게 소화 용액과 마음을 씻어. 이어서, 50ml의 원뿔형으로 멸균 100 μm의 셀 스트레이너를 통하여 소화 용액 2ml를 필터링 및 튜브 A6 또는 B6에 추가. </li><li> 이후 튜브 (A2와 B2)의 각 스핀 후 (A1과 B1 결합) 이전 포집 관에 재 부유 혈관 평활근 세포를 추가합니다. 또한, 펌프의 소화 용액이 밖으로 실행하고 소화을 통해 필요에 따라 10 ml의 주사기를 전환 할 수 않도록주의하십시오. </li><li> 모든 튜브를 조합 한 후, 10 분 동안 89 XG에 VSMC 풍부한 현탁액을 원심 분리기. </li><li> 가능한 한 수집 관에서 대기음 많이 뜨는. 하나 35mm 배양 접시에서 미디어 접시 도금 2 ㎖에 남아있는 펠렛을 재현 탁. 장소 배양 접시의 난24 시간 동안 37 ° C를 인큐베이터 N. </li></ol> 4. 세포 배양 참고 : 바이오 안전성 캐비닛의 나머지 단계를 완료합니다. <ol><li> 24 시간 후, 부드럽게 도금 미디어를 대기음. 배양은 일반적으로 잔해를 다량 가질 것이다. 세포를 씻어, 따뜻한, 멸균 PBS 2 ㎖를 추가하고 시계 방향으로 운동에서 회전하면서 부드럽게 두 손가락에 접시를 누릅니다. </li><li> 360 ° 회전 한 후, PBS를 흡인하고, 두 번 반복한다. PBS를 대기음 및 살균, 따뜻한 PBS의 다른 2ml를 추가합니다. 접시에 어떤 이물질이 거의이 있는지 확인하기 위해 현미경으로 배양 접시를 확인합니다. 셀 합류 또한 이때 결정될 수있다. </li><li> 파편이 배양 접시에 남아있는 경우, 단계 4.2를 반복합니다. 배양 접시 파편의 명확한 경우, PBS를 대기음 따뜻한 도금 미디어 2 ㎖를 추가합니다. </li><li> 24 시간 후, 문화에서 어떤 최종 파편이나 죽은 세포를 제거하는 따뜻한, 멸균 PBS로 다시 세포를 씻는다. PBS를하고 페이지를 대기음세포에 따뜻한 도금 미디어의 또 다른 2 ml의 레이스. </li><li> 매일 세포에 확인하고 신선한 따뜻하게 도금 미디어의 모든 48 시간 공급. 이 시점에서, 세포는 표준 세포 배양 분석에 사용될 수있다. 프로 시저가 완성 될 때까지 최대 7 일이 걸릴 수 있지만, 혈관 평활근 세포는 도금 후 약 80 %의 합류 4-5일해야합니다. 다음 구절에 분할은, (1) 최대 사용하는 경우 : 4 35mm 요리를 (또는 문화 요리의 비교 지역). </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

이 연구의 목적은 쥐 하트 매끄러운 관상 혈관의 수율을 높이기 위해 기존의 셀 분리 프로토콜을 적용 하였다. 혈관 평활근 생물학에서 선구적인 작업의 대부분은 배양 된 쥐의 대동맥 평활근 세포로 하였다. 이 연구는 혈관 평활근 세포의 성장, 마이그레이션 및 비대 (7)을 제어하는 분자 메커니즘의 기초 지식을 제공했다. 필드가 진행하지만, 그것은 VSMC 표현형 및 기능 혈관계 특정 요인에 의해 제어되는 것을 명백하게되었다. 예를 들어, 말초 혈관에 비해 관상 동맥는 다른 기능의 응답을 표시 부상에 대한 응답 성장의 고유 한 패턴을 전시 및 채널, 수용체 및 신호 분자 (10, 11)의 독특한 배열을 표시합니다. 혈관이 수축 심근에 의해 수축기 동안 압축되기 때문에 관상 침대는 고유 한 혈역학 적 힘에 노출된다. 우리의 최근 작업은 코론을 제안합니다제 2 형 당뇨병 dB / db 마우스에서 진 미세 혈관 리모델링은 대동맥 및 장간막 저항 혈관, 12 달랐다. 낮은 통로 혈관 평활근 세포가 필요하여 시험 관내 연구에서, 이러한 차이를 설명 분자 메커니즘을 이해합니다. 분리 및 쥐의 대동맥 또는 장간막 동맥 혈관 평활근 세포를 배양 다른 잘 확립 된 다양한 방법이 있지만, 현재, 마우스 관상 동맥 3에서 혈관 평활근 세포의 분리에 게시 된 하나의 연구가있다. 이 프로토콜에서 우리는 관상 동맥에서 주 쥐의 혈관 평활근 세포의 분리를위한 개선 된 방법을 보여줍니다. 우리의 프로토콜은 느슨하게 탱 등 출판 일을 기준으로합니다. 3. 우리는 원래 기술에 적용한 수정은 풍부한 인구와 혈관 평활근 세포의 높은 수율을 제공한다. 이러한 결과를 달성하기 위해 필요한 주요 단계는 캐 뉼러의 정확한 위치를 포함하는, 부드러운 플러시마음의 ING는 여분의 혈액을 제거하고 소화의 말에 마음의 정점을 절단합니다. 세 가지 중 정맥의 위치는 매우 중요하다. 관상 동맥 순환은 대동맥 판막 단지 원위부​​ 관상 오스 티아에서 관류한다. 따라서 좌심실 챔버에 캐 뉼러를 삽입을 통해 밸브의 무결성의 중단이 좋지 관상 동맥 관류 및 가능한 혈관 평활근 세포의 수가 크게 감소로 이어질 것입니다. 관상 동맥 순환의 부드러운 세정 문화에 사용되는 최종 펠릿에서 여분의 혈액을 제거 할뿐만 아니라, 캐 뉼러의 정확한 위치가 달성 여부를 확인할 수 있습니다. 마지막으로 소화하는 동안, 일부 혈관 평활근 세포 따라서 세포를 해제하고 도금에 더 합류를 얻을 것이다 소화의 결론에 정점을 절단, 심실 내부에 갇혀 될 수 있습니다. 이용 될 수있는 중요한 수정 25 G 위관 영양법 바늘 또는 하버드 장치 마우스 대동맥 cannul의 사용이다니들 캐 뉼러 대신에. 위관 영양법 바늘을 사용하는 경우에는, 하나의 바늘 끝에 공 관상 오스티을 차단하는 추가 처리하지 취한다. 바늘의 조정은 종래의 관류 할 필요가있는 경우, 부드러운 플러싱 공정 드러내. 또한, 소화 용액에 사용 콜라게나 제의 유형은 최적의 VSMC 분리 중요하다. 유형 II 콜라겐은 순수하지 않다 - 그러한 트립신, clostripain 및 caseinase 같은 다른 효소가 포함되어 있습니다. 따라서, 대두 트립신의 양은 소화 이용게나 특정 로트에 기초하여 조정해야 할 수도 소화 용액에 첨가 억제제. 기술의 한 가지 제한은 전체 관상 동맥 혈관 평활근 세포로부터 격리된다는 것이다. 관상 동맥 미세 혈관에 초점을 맞춘 우리의 이전 연구 (직경 80 ~ 120 μm의) 1, 2, 그러나 생쥐의 주요 관상 동맥 큰 (&gt; 160 μm의) (13)이다. 또한,이 기술nique 또한 관상 정맥 순환 아니라 동맥 순환으로부터 세포를 분리. 랑겐 돌프 기술이 100 년 동안 사용되었지만, 마우스 게놈 조작의 최근 발전 (예를 들면 노크에서 녹아웃 돌연변이)가 다양한 애플리케이션에 대한 업데이트 된 기술을 이용할 수있는 독특한 기회를 제공한다. 단리 및 배양 후에, 세포는 약물 제제와 바이러스 감염 치료를 포함하여 추가 실험을 위해 사용될 수있다. 유전자 변형 마우스 및 표준 세포 배양의 공동 사용은 쥐의 관상 동맥에서 혈관 평활근 세포의 더 깊은 조사를 위해 수 있습니다.

이 방법의 목적은 세포 배양 및 표준 세포 배양 분석에 사용하기 위해 뮤린 관상 동맥에서 혈관 평활근 세포 (혈관 평활근 세포)를 분리한다. 우리는 당뇨병에서 혈관 재 형성의 분자 메커니즘을 평가하기 위해이 기술을 개발했다. 우리는 이전에 당뇨병 (1)의 모델 db / db 마우스에서의 관상 동맥에 중격 비대 리모델링 내측보고 하였다. 때문에 쥐의 중격 관상 동맥에있는 조직의 제한된 양, dB / dB 및 제어 마우스에서 단백질의 변화 (예를 들어, 웨스턴 블롯을) 조사 표준 실험 방법은 가장 어렵습니다. 또한, 우리는 이전에 안지오텐신 수용체 차단제 (ARB)의 로사 르탄이 dB / db 마우스 2에서 관찰 된 리모델링을 감소하는 것으로 나타났습니다. 따라서, 관상 동맥에서 주요 혈관 평활근 세포의 분리는 우리가 더 contribu 수있다 당뇨병 쥐의 혈관 평활근 세포 표현형의 변화 또는 신호 활성화 경로를 조사 할 수 있습니다이상 관상 동맥 세동맥 리모델링에 팅. 많은 연구가 아니라 각 특정 혈관 침대에서보다 쥐 대동맥에서 고립 된 혈관 평활근 세포를 사용하여 표준 신호 전달 경로를 밝혀왔다. 그러나, 우리는 다를 수 있습니다 각 혈관 침대에서 혈관 평활근 세포를 제안, 혈관 침대에게 관상 동맥, 대동맥의 특정 리모델링 및 dB / db 마우스 (1)의 장간막 순환을 증명하고있다. 따라서, 더 혈관 평활근 세포의 각 세트에서 일어나는 병리학 적 변화를 이해하기 위하여 각 혈관계의 혈관 평활근 세포를 분리 할 필요가있다. 분리 및 대동맥 혈관 평활근 세포를 배양하기위한 다른 방법의 과다가 있습니다. 그러나, 현재, 마우스 관상 동맥 3에서 혈관 평활근 세포의 분리에 게시 된 하나의 연구가있다. 탱 등은. 마우스 관상 동맥의 혈관 평활근 세포를 분리하는 방법을보고하는 첫번째이었다; 그러나 상당히 프로토콜을 수정 한 또한 내피 CEL 절연로서LS. 다른 연구소는 탱 등의 등의 프로토콜을 사용하고 있습니다. 관상 동맥 근육 세포와기도 평활근 세포 4,5를 분리 할 수 있습니다. 우리가 통합 한 변경은 높은 관상 동맥의 혈관 평활근 세포에 대한 풍부한 세포의 인구를 얻을 것입니다. 분리 된 포유 동물의 심장, 또는 랑겐 돌프 기술의 역 행성 관류는 오스카 랑겐 돌프에 의해 1897 6 년에 설립되었으며, 여전히 널리 심장 혈관 세포의 분리를 위해 오늘 사용된다. 현대 쥐의 유전자 변형의 발전과 함께 여기에 제시된 기술은, 관상 순환에서 혈관 평활근 세포의 분자 행동 가까이 조사를위한 유용한 도구를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M solution</td><td>Fisher</td><td>MT-25-060</td><td></td></tr><tr><td>Primocin - 20 ml</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA 10 mM 100x</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>L-Glut 200 mM - Gibco</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Cell Strainer 100 &amp;micro;m nylon mesh</td><td>Fisher</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm</td><td>Fisher</td><td>12-565-91</td><td></td></tr><tr><td>Harvard Apparatus black silk suture 5-0</td><td>Fisher</td><td>14-516-124</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type-2&amp;nbsp;</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Soybean Trypsin Inhibitor 25 mg</td><td>Sigma</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid (clear)</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid (phenol red)</td><td>Life Technologies</td><td>14170-161</td><td></td></tr><tr><td>5.0 ml heating coil with degassing bubble trap</td><td>Radnoti</td><td>158830</td><td></td></tr><tr><td>11 plus pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-2208</td><td></td></tr><tr><td>Circulating heated water pump</td><td></td><td></td><td>any brand will work</td></tr></tbody></table>

isolation of murine coronary vascular smooth muscle cells

격리와 큰 혈관에서 혈관 평활근 세포 (혈관 평활근 세포)의 문화가 잘 확립하는 동안, 우리는 관상 동맥에서 분리하고 배양 혈관 평활근 세포 노력했다. 완전한 대동맥 아치 하트 제거 소화 용액 콜라겐 타입 II, 0.1 ㎎ / ㎖ 대두 트립신 억제제 및 1 M CaCl2를 300 단위 / ㎖를 함유하는 역행 랑겐 돌프 통해 관류 하였다. 관류 도금 배지에서 재현 탁하고 원심 분리하여 펠렛을 90 분 동안 15 분 간격으로 수집하고, 조직 배양 접시에서 배양 하였다. 혈관 평활근 세포는 SM22α의 존재, α-SMA 및 vimentin에 의해 특징했다. 이 기술을 사용하는 중요한 장점 중 하나는 마우스의 관상 동맥에서 혈관 평활근 세포를 분리 할 수​​있는 능력이다. 세포가 이용 될 수있는 애플리케이션들을 제한 할 수 얻어지는 세포의 소수 절연 관상 혈관 평활근 세포는 잘 확립 세포 배양 기술과 ASSA 다양한 사용할 수 있지만YS. 유전자 변형 생쥐에서 혈관 평활근 세포를 조사 연구는 구조 - 기능 및 혈관 병변과 관련된 신호 전달 과정에 대한 자세한 정보를 제공 할 수 있습니다.

우리 인해 관상 혈관 평활근 세포 분리 방법의 신규 한 양상으로, 우리는 세포 분리의 순도를 결정하기 위해 노력했다. 마우스 관상 혈관 평활근 세포는 먼저 세척 후 배양 세포의 형태에 기초하여 통로 (2)에 그 형태 및 면역 형광 염색해서 기초하여 식별하고, 상기 분리 과정은 효과적으로 심장 근육 세포 및 내피 세포를 제거한다. 혈관 평활근 세포는 통로 (2) (그림 1)까지 그 형태를 유지한다. 그러나, 삽입 및 외막 섬유 아세포에 의한 오염의 우려가있다. 이 잠재적 인 혼동을 배제하기 위해, 우리는 SM22α에 대한 분리 된 세포를 염색, α-평활근 액틴 (α-SMA), 혈관 평활근 세포 모두 구절 1-2 (그림 2)에서, 7, 8, 및 vimentin에, 섬유 아세포 마커 (9) 마커. 우리는 우리의 세포 격리가 CD31없는 것을 우리는 또한 보여 통로 (2)를 통해 이러한 마커의 변화가 관찰되지 / PECAM 염색 (인간 코론이 분리 프로토콜을 사용하여 내피 세포 오염의 부족을 나타내는 양의 대조군으로 사용 진 미세 혈관 내피 세포). 총체적으로, 우리의 세포 분리 방법은 관상 동맥에서 혈관 평활근 세포의 거의 순수한 인구를 산출하고 더 이상의 실험에 사용될 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53983/53983fig1.jpg" /> 그림 1 :. 밝은 필드 위상차 조건에서 10 배 배율로 이미징 이형 DB / db 마우스에서 분리 대표 배양 관상 동맥 혈관 평활근 세포 배양 관상 동맥 혈관 평활근 세포 (통로 2). 스케일 바는 100 μm의 =. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53983/53983fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53983/53983fig2.jpg" /> 그림 2 : Immunofl이형에서 관상 동맥 혈관 평활근 세포를 도금 배양 관상 동맥 혈관 평활근 세포의 uorescence 염색. (DB / DB) SM22α, α-SMA, vimentin에 대한 항체로 표지 구절 1-2에서 마우스 및 CD31 / PECAM. 이미지는 10 배 배율로 촬영. 큰 변화는 경과 관찰되지 않았다. 스케일 바는 100 μm의 =. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53983/53983fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

이 프로토콜의 목적은 관상 동맥에서 뮤린 주 혈관 평활근 세포의 분리 및 배양 방법 (혈관 평활근 세포)을 보여주는 것이다. 혈관 평활근 세포가 분리되고 나면, 이들은 많은 표준 배양 기술에 사용될 수있다.

쥐 관상 동맥 혈관 평활근 세포의 분리

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

isolation-of-murine-coronary-vascular-smooth-muscle-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K 조회수.  The Ohio State University College of Medicine.  이 프로토콜의 목적은 관상 동맥에서 뮤린 주 혈관 평활근 세포의 분리 및 배양 방법 (혈관 평활근 세포)을 보여주는 것이다. 혈관 평활근 세포가 분리되고 나면, 이들은 많은 표준 배양 기술에 사용될 수있다. 

비디오: Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Isolation and Excision of Murine Aorta; A Versatile Technique in the Study of Cardiovascular Disease

Cardiovascular disease is a broad term describing disease of the heart and/or blood vessels. The main blood vessel supplying the body with oxygenated blood is the aorta. The aorta may become affected in diseases such as atherosclerosis and aneurysm. Researchers investigating these diseases would benefit from direct observation of the aorta to characterize disease progression as well as to evaluate efficacy of potential therapeutics. The goal of this protocol is to describe proper isolation and excision of the aorta to aid investigators researching cardiovascular disease. Isolation and excision of the aorta allows investigators to look at gross morphometric changes as wells as allowing them to preserve and stain the tissue to look at histologic changes if desired. The aorta may be used for molecular studies to evaluate protein and gene expression to discover targets of interest and mechanisms of action. This technique is superior to imaging modalities as they have inherent limitations in technology and cost. Additionally, primary isolated cells from a freshly isolated and excised aorta can allowing researchers to perform further in situ and in vitro assays. The isolation and excision of the aorta has the limitation of having to sacrifice the animal however, in this case the benefits outweigh the harm as it is the most versatile technique in the study of aortic disease.

Pathology of the aorta can lead to severe morbidity and mortality, therefore research of disease progression and potential therapies is warranted. Here, we present a protocol to isolate and excise the murine aorta to aid researchers in their investigation of cardiovascular disease.

분리 및 설치류 대동맥 절제; 심혈관 질환의 연구에 다목적 기술

Cardiovascular disease is a broad term describing disease of the heart and/or blood vessels. The main blood vessel supplying the body with oxygenated ...

연구

의학

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded and their collection does not imply any added risk to the newborn or mother s health. Moreover no ethical concerns are raised. The UC is composed by one vein and two arteries from which both endothelial cells (ECs) 1 and smooth muscle cells (SMCs) 2, two of the main cellular components of blood vessels, can be isolated. In this project the SMCs were obtained after enzymatic treatment of the UC arteries accordingly the experimental procedure previously described by Jaffe et al 3. After cell isolation they were kept in t-flash with DMEM-F12 supplemented with 5% of fetal bovine serum and were cultured for several passages. Cells maintained their morphological and other phenotypic characteristics in the different generations. The aim of this study was to isolate smooth muscle cells in order to use them as models for future assays with constrictor drugs, isolate and structurally characterize L-type calcium channels, to study cellular and molecular aspects of the vascular function 4 and to use them in tissue engineering.

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The umbilical cords are used to isolate smooth muscle cells by different ways. In this work we used the enzymatic treatment to isolated smooth muscle cells.

인간의 탯줄 아티 평활근 세포 절연 (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

생물학

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

기본 Murine 골격 근육 Microvascular 내 피 세포의 고립

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

신경과학

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic by-products, as exemplified by exercising skeletal muscle. Endothelial cells (ECs) line the intima of all resistance vessels and serve a key role in controlling diameter (e.g.&#160;endothelium-dependent vasodilation) and, thereby, the magnitude and distribution of tissue blood flow. The regulation of vascular resistance by ECs is effected by intracellular Ca2+ signaling, which leads to production of diffusible autacoids (e.g.&#160;nitric oxide and arachidonic acid metabolites)1-3 and hyperpolarization4,5 that elicit smooth muscle cell relaxation. Thus understanding the dynamics of endothelial Ca2+ signaling is a key step towards understanding mechanisms governing blood flow control. Isolating endothelial tubes eliminates confounding variables associated with blood in the vessel lumen and with surrounding smooth muscle cells and perivascular nerves, which otherwise influence EC structure and function. Here we present the isolation of endothelial tubes from the superior epigastric artery (SEA) using a protocol optimized for this vessel.
To isolate endothelial tubes from an anesthetized mouse, the SEA is ligated in situ to maintain blood within the vessel lumen (to facilitate visualizing it during dissection), and the entire sheet of abdominal muscle is excised. The SEA is dissected free from surrounding skeletal muscle fibers and connective tissue, blood is flushed from the lumen, and mild enzymatic digestion is performed to enable removal of adventitia, nerves and smooth muscle cells using gentle trituration. These freshly-isolated preparations of intact endothelium retain their native morphology, with individual ECs remaining functionally coupled to one another, able to transfer chemical and electrical signals intercellularly through gap junctions6,7. In addition to providing new insight into calcium signaling and membrane biophysics, these preparations enable molecular studies of gene expression and protein localization within native microvascular endothelium.

We present a preparation for visualizing and manipulating calcium signaling in native, intact microvascular endothelium. Endothelial tubes freshly isolated from mouse resistance arteries supplying skeletal muscle retain in vivo morphology and dynamic signaling within and between neighboring cells. Endothelial tubes can be prepared from microvessels of other tissues and organs.

마우스 저항 동맥의 미세 혈관 내피 튜브의 분리

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling pathways involved in vascular smooth muscle contraction in PASMC from fetal sheep. While sheep make an excellent model of term pulmonary hypertension, they are very expensive and lack the advantage of genetic manipulation found in mice. Conversely, the inability to isolate PASMC from mice was a significant limitation of that system. Here we described the isolation of primary cultures of mouse PASMC from P7, P14, and P21 mice using a variation of the previously described technique of Marshall et al.26 that was previously used to isolate rat PASMC. These murine PASMC represent a novel tool for the study of signaling pathways in the neonatal period. Briefly, a slurry of 0.5% (w/v) agarose + 0.5% iron particles in M199 media is infused into the pulmonary vascular bed via the right ventricle (RV). The iron particles are 0.2 &#956;M in diameter and cannot pass through the pulmonary capillary bed. Thus, the iron lodges in the small pulmonary arteries (PA). The lungs are inflated with agarose, removed and dissociated. The iron-containing vessels are pulled down with a magnet. After collagenase (80 U/ml) treatment and further dissociation, the vessels are put into a tissue culture dish in M199 media containing 20% fetal bovine serum (FBS), and antibiotics (M199 complete media) to allow cell migration onto the culture dish. This initial plate of cells is a 50-50 mixture of fibroblasts and PASMC. Thus, the pull down procedure is repeated multiple times to achieve a more pure PASMC population and remove any residual iron. Smooth muscle cell identity is confirmed by immunostaining for smooth muscle myosin and desmin.

We have developed a novel and reproducible technique to isolate primary cultures of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) from mice as young as P7, thereby allowing better study of the signaling pathways involved in neonatal smooth muscle cell contraction and relaxation.

신생아 쥐의 폐 동맥 평활근 세포의 분리

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier integrity. However, their tissue-specific functions in the heart are not well understood. Moreover, there is currently no protocol utilizing readily accessible materials to isolate and purify pericytes of cardiac origin. Our protocol focuses on using the widely used mammalian model, the mouse, as our source of cells. Using the enzymatic digestion and mechanical dissociation of heart tissue, we obtained a crude cell mixture that was further purified by fluorescence activating cell sorting (FACS) by a plethora of markers. Because there is no single unequivocal marker for pericytes, we gated for cells that were CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+. Following purification, these primary cells were cultured and passaged multiple times without any changes in morphology and marker expression. With the ability to regularly obtain primary murine cardiac pericytes using our protocol, we hope to further understand the role of pericytes in cardiovascular physiology and their therapeutic potential.

We have optimized a protocol to isolate and purify murine cardiac pericytes for basic research and investigation of their biology and therapeutic potential.

뮤린 심장 pericytes의 격리 및 정화

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

쥐과 밸브 내피 세포의 분리

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

마우스 관상 내피 세포의 분리

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses

The intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated from rat lungs can be used to study the underlying mechanisms of vasoconstriction and vasorelaxation. After isolating the IPA and VSMCs, the characteristics of vascular responses in physiological and pathological conditions can be assessed in the absence of extrinsic factors such as nerve signals, hormones, cytokines, etc. Thus, the IPA and VSMCs serve as excellent models for studying vascular physiology/pathophysiology, along with various experimental investigations, such as modulation by pharmacological agents, patch-clamp electrophysiological analysis, calcium imaging, etc. Here, we have used a technique for isolating the IPA to investigate vascular responses in an organ bath setup. IPA segments were mounted on the organ bath chamber via intraluminal wires and stimulated by various pharmacological agents. The changes in IPA vascular tone (i.e., vasoconstriction and vasorelaxation), were recorded using an isometric force transducer and physiological data analysis software program. We implemented several experimental protocols, which can be adapted to investigate the mechanisms of vasorelaxation/vasoconstriction for studying the pharmacological activities of phytochemical or synthetic drugs. The protocols can also be used to evaluate drugs&#39; roles in modulating various diseases, including pulmonary arterial hypertension. The IPA model allows us to investigate the concentration-response curve, which is crucial in assessing drugs&#39; pharmacodynamic parameters.

Vascular responses of arterial pulmonary circulation can be explored using intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs). The present study describes the isolation of IPA in detail and the protocols used for investigating vasorelaxation in response to physiological stimuli.

혈관 반응을 조사하기 위한 폐동맥 및 평활근 세포의 분리

The intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated from rat lungs can be used to study the underlying mechanisms of ...

혈관벽에서 murine CD34+ 줄기 세포의 분리 및 자기 분리

Immunomagnetic Isolation of the Vascular Wall-Resident CD34+ Stem Cells from Mice

Resident CD34+ vascular wall-resident stem and progenitor cells (VW-SCs) are increasingly recognized for their crucial role in regulating vascular injury and repair. Establishing a stable and efficient method to culture functional murine CD34+ VW-SCs is essential for further investigating the mechanisms involved in the proliferation, migration, and differentiation of these cells under various physiological and pathological conditions. The described method combines magnetic bead screening and flow cytometry to purify primary cultured resident CD34+ VW-SCs. The purified cells are then functionally identified through immunofluorescence staining and Ca2+ imaging. Briefly, vascular cells from the adventitia of the murine aorta and mesenteric artery are obtained through tissue block attachment, followed by subculturing until reaching a cell count of at least 1 &#215; 107. Subsequently, CD34+ VW-SCs are purified using magnetic bead sorting and flow cytometry. Identification of CD34+ VW-SCs involves cellular immunofluorescence staining, while functional multipotency is determined by exposing cells to a specific culture medium for oriented differentiation. Moreover, functional internal Ca2+ release and external Ca2+ entry is assessed using a commercially available imaging workstation in Fura-2/AM-loaded cells exposed to ATP, caffeine, or thapsigargin (TG). This method offers a stable and efficient technique for isolating, culturing, and identifying vascular wall-resident CD34+ stem cells, providing an opportunity for in vitro studies on the regulatory mechanisms of VW-SCs and the screening of targeted drugs.

저자 스포트라이트: Magnetic Bead Screening-Coupled Flow Cytometry를 사용한 혈관벽 거주자 쥐 CD34+ 줄기 세포의 향상된 분리 및 특성 분석

This study has established a stable and efficient method for the isolation, culture, and functional determination of vascular wall-resident CD34+ stem cells (CD34+ VW-SCs). This easy-to-follow and time-effective isolation method can be utilized by other investigators to study the potential mechanisms involved in cardiovascular diseases.

생쥐의 혈관벽 거주자 CD34+ 줄기 세포의 면역자기 분리

Resident CD34+ vascular wall-resident stem and progenitor cells (VW-SCs) are increasingly recognized for their crucial role in regulating vascular injury ...