This study is supported by American Heart Association Scientist Development Grant 13SDG16930098 and the National Science Foundation of China Youth Award 81300240 (PI: Wang). We thank Roberto Mendez from Wayne State University for assisting in the preparation of the manuscript.

마우스에서 대동맥 1. 분리 여기에 설명 된 모든 절차가 웨인 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. <ol><li> 마취 기계의 유도 챔버에 마우스를 넣습니다. 25 % 신선한 공기와 75 % O 2와 함께 4 %의 이소 플루 란 흐름을 설정합니다. 전용 코 콘 뒤에 유도 챔버를 통해 25 %의 신선한 공기와 75 % O 2와 함께 이소 플루 란 (유도 4 %가 유지 보수를 위해 ± 1.0 %)의 흡입에 의해 마우스를 마취. 주 : 이소 플루 란 마취 75 % 산소 / 25 % 공기, 100 % 산소로 전달 될 수있다. </li><li> 마취의 적절한 수준 (발가락 핀치에 철수의 부족)에 도달 할 때까지 마우스마다 5 분을 확인합니다. </li><li> 유도 챔버에서 마우스를 가지고 마취 기계에 연결되어있는 전용 코 콘하지만 이소 플루 란 흡입을 계속합니다. 스위치이소 플루 란 마취를 유지하기 위해 1 % 흐른다. </li><li> 이 마취이지만, 그 뒷면에 위치하는 수술 패드에 마우스를 넣어. 사지를 확보하기 위해 실험실 테이프를 사용합니다. </li><li> 마우스 따뜻하게 유지하기 위해 가열 램프를 사용합니다. 마우스를하지 않습니다 과열 있도록 마우스에서 적절한 거리에 램프를 유지합니다. </li><li> 70 % 에탄올로 가슴 스프레이. </li><li> 정중선에서 복부를 열고 복부 대동맥을 노출 해부 가위를 사용합니다. 흉강을 열고 심장과 폐를 노출합니다. </li><li> 피를 해제 해부 가위로 중간에서 복부 대동맥을 잘라. </li><li> 헤파린 1000 U / mL로 포함하는 PBS 1 mL를 (25 G 바늘) 1 ML의 주사기를 입력합니다. 좌심실에 헤파린 1000 U / mL로 포함 된 PBS를 주입하고 대동맥을 관류. 흉부 대동맥을 노출 마우스의 오른쪽에 큰 동맥에서 집게로 심장과 폐를 밀어 넣습니다. </li><li> 신속 마이크로 다이를 사용하여 대동맥을 제거ssection 집게와 얼음처럼 차가운 1X PBS (멸균)에 넣어은 다음 층류 후드에 컨테이너를 운반 할 것. </li><li> 대동맥의 한쪽 끝으로 25 G 바늘 장착 된 1 ML의 주사기를 삽입하고 부드럽게 혈액을 제거하는 얼음처럼 차가운 PBS와 대동맥을 세척하십시오. </li><li> 가능한 한 첨부 된 지방 조직의 훨씬 작은 측면 혈관을 제거하기 위해 마이크로 해부 집게를 사용합니다. </li><li> 즉시 성장 배지 내피 대동맥 옮긴다. </li><li> 멸균 메스 블레이드를 사용하여 1mm 반지로 대동맥을 잘라. 수확 약 8 - 대동맥 당 10 반지입니다. </li><li> 마이크로 해부 가위를 사용하여 각 대동맥 고리를 엽니 다. </li></ol> 2. 종자 매트릭스의 대동맥 세그먼트 <ol><li> 사용하지 않을 응고 방지 -20 ° C에서 성장 인자 - 감소 된 매트릭스를 유지하는 경우. 완전한 해빙을 허용하기 위해 적어도 하룻밤 4 ° C에서 성장 인자 감소 행렬을 넣습니다. </li><li> 적어도 -20 ℃로 6 웰 플레이트 및 피펫 팁을 사전 냉각10 분. 공기 방울을 도입하지 않고 행렬의 1 mL를 플레이트의 얼음과 코트에 잘 하나를 6 웰 플레이트를 넣습니다. 20 분 행렬이 응고 할 수 있도록하기위한 37 ° C 배양기에서 접시를 놓습니다. </li><li> 멸균 미세 해부 집게를 사용하여 응고 매트릭스 상 대동맥 개 임플란트. 내피를 건드리지 않고 루멘 측 다운 행렬에이 조각을 놓습니다. 매트릭스에 서로에 가까운 4 대동맥 세그먼트 - 3를 배치합니다. </li><li> (~ 200 μL) 젖은 세그먼트를 유지하기 위해 충분한 내피 세포 성장 매체를 추가합니다. </li><li> 4 ~ 6 시간 동안 5 % CO 2에서 37 ° C에서 접시를 품어. 하루가 끝날 때, 대동맥 세그먼트를 커버하도록 충분한 매체를 추가한다. </li><li> 위상 대비 현미경으로 주기적으로 돋아 대동맥 세그먼트를 관찰한다. 중간 수준 및 세포 성장 매일 확인합니다. 적용 대동맥 세그먼트를 유지하기 위해 필요한 경우 매체를 추가합니다. </li><li> 4 번째 날, 부드럽게 매체를 제거하고 대동맥 세그먼트 (F)을 제거성장 내피 세포의 중단없이 멸균 바늘을 사용하여 매트릭스 ROM. </li><li> 새로운 내피 세포 성장 배지 2 mL를 넣고과 내피 세포가 2 매트릭스 증식을 계속 허용 - 삼일. </li></ol> 마우스 대동맥 내피 세포의 3. 초기과 Passaging <ol><li> 젤라틴 코트 (0.1 %)로 새로운 T12.5 플라스크를 30 분 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 멸균 37 ° C PBS로 조심스럽게 매트릭스 판을 씻으십시오. </li><li> 매트릭스 판에 중립 단백질 분해 효소 (50 U / ㎖)의 2 mL를 넣고 가끔 흔들어와 플랫폼 로커에 실온에서 품어. 세포의 대부분이 분리되어 있는지 확인하기 위해 위상차 현미경으로 세포를 확인합니다. </li><li> 중립 단백질 분해 효소를 불 활성화 D-발 2 ML을 추가합니다. </li><li> 15 mL의 원심 분리기 튜브에 조심스럽게 상층 액을 수집합니다. 2 mL의 D-발과 접시를 씻고 뜨는를 수집합니다. </li><li> 타나에서 5 분 동안 900 XG에 세포 현탁액을 원심m 온도. </li><li> 젤라틴으로 코팅 T12.5 플라스크 내피 세포 성장 배지 플레이트 4 ㎖의 세포 펠렛을 다시 일시. 2 시간 동안 37 ° C에서 5 % CO 2에서 세포를 인큐베이션. </li><li> 매체를 교체합니다. 90 % 합류 -가 85 %가 될 때까지 37 ° C, 5 % CO 2에서 세포를 인큐베이션. </li></ol> 마우스 대동맥 내피 세포의 (4)과 Passaging <ol><li> 코트 두 개의 새로운 T12.5 플라스크는 젤라틴 (0.1 %)로, 30 분 동안 37 ° C에서 품어. 약 15 분 동안 37 ℃에서 예열 트립신 - EDTA (0.25 % 트립신, PBS 0.02 EDTA) 및 멸균 PBS. </li><li> 멸균 37 ° C PBS로 조심스럽게 세포를 씻으십시오. </li><li> 트립신 - EDTA (0.25 % 트립신, PBS 0.02 EDTA) 0.5 mL를 추가하고 ~ 1 분 또는 세포의 대부분이 라운드를 설정할 때까지 37 ° C에서 품어. </li><li> 소화를 중지 내피 세포 성장 매체의 2 ML을 추가합니다. 위아래로 수회 플라스크 내의 세포 현탁액 피펫. 필요한 경우, 셀을 사용세포를 수집하는 스크레이퍼. </li><li> 15 mL의 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 수집한다. 실온에서 5 분 동안 900 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기. </li><li> 젤라틴으로 코팅이 T12.5 플라스크 내피 세포 성장 배지 플레이트 4 ㎖의 세포 펠렛을 다시 일시. 2 시간 동안 37 ° C에서 5 % CO 2에서 세포를 인큐베이션. </li><li> 매체를 교체합니다. 90 % 합류 -가 85 %가 될 때까지 37 ° C, 5 % CO 2에서 세포를 인큐베이션. </li><li> 3 통로 -이 후 마우스 대동맥 내피 세포를 사용합니다. </li></ol> 마우스 대동맥 내피 세포의 5. 특성 <ol><li> 다시 플레이트 세포. <ol><li> 젤라틴 코트 (0.1 %)을 6- 웰 플레이트는 30 분 동안 37 ℃에서 배양한다. PBS와 함께 접시를 씻어. </li><li> 사전 가열 약 15 분 동안 37 ° C에 트립신 - EDTA 및 멸균 PBS를. </li><li> 멸균 PBS 3 회 세포를 씻으십시오. 세포에 0.5 트립신의 용액이 / EDTA를 추가, 37 ° C 오에 ~ 1 분 동안 품어세포의 대부분까지 r은 라운드를 켭니다. </li><li> 소화를 중지 내피 세포 성장 매체의 2 ML을 추가합니다. 위아래로 수회 플라스크 내의 세포 현탁액 피펫. 필요한 경우, 세포를 수집하고 세포 스크레이퍼를 사용한다. </li><li> 15 mL의 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 수집한다. 실온에서 5 분 동안 900 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기. </li><li> 내피 세포 성장 배지에서 세포를 다시 일시 중지, 상층 액을 버린다. 잘 3 × 10 5 /의 밀도에 젤라틴으로 코팅 된 6 웰 플레이트에서 세포를 시드. </li><li> 세포 배양 표면에 부착 할 수 있도록 밤새 37 ° C, 5 % CO 2에서 세포를 인큐베이션. </li></ol></li><li> DIL-AC-LDL 바인딩 -lectin uptaken 및 Ulex. <ol><li> 의 1,1&#39;- 디 옥타 데실 3,3,3- &#39;를 저장 3&#39;- tetramethylindo - 카보시 과염소산 염 표지 -20 ° C에서 아세틸 화 LDL (DIL-AC-LDL). 염색하기 전에 얼음에 DIL-AC-LDL을 해동. 주식 DIL-AC-LDL의 SOLU기는 / mL의 1 밀리그램이다. 4 ° C에서 FITC 표지 Ulex의 europaeus의 응집소 (Ulex -Lectin, 1 μg의 / ㎖)를 저장합니다. 주식 Ulex -Lectin 솔루션은 1 ㎎ / ㎖이다. 저장 4 ° C에서의 Hoechst 33342. 주식의 Hoechst 33342 솔루션은 100 μg의 / mL로한다. </li><li> 10 μg / ML의 최종 농도를 만들어 배지 1 ㎖에 DIL-AC-LDL 스톡 용액 10 μL를 추가한다. </li><li> 염색하기 전에, 구 배지를 제거하고 새로운 배지를 각 웰에 세포를 세척 하였다. </li><li> 새로운 매체를 제거하고 DIL-AC-LDL 염색 매체를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 1 시간 동안 37 ℃로, 5 % CO 2에서 세포를 인큐베이션. </li><li> 멸균 1X PBS 3 회 세포를 씻으십시오. </li><li> 세포를 해결하기 위해 10 % 포르말린 1 ML을 추가합니다. 약 30 분 동안 실온에서 접시를 넣습니다. </li><li> 멸균 1X PBS 3 회 세포를 씻으십시오. 빛을 피하십시오. </li><li> Ulex -Lectin 10 μL를 포함 1 mL의 멸균 1X PBS를 추가합니다. </li><li> 객실 temperatu에서 세포를 품어1 시간 동안 어둠 속에서 재. </li><li> 멸균 1X PBS 3 회 세포를 세척하여 Ulex-렉틴을 제거합니다. </li><li> 1 μg의 / ㎖의 최종 농도 훽스트 33342를 추가 어둠 속에서 10 분을 품어. </li><li> DIL-AC-LDL (빨강, 576 나노 미터의 여기 파장), Ulex -Lectin (녹색, 519 나노 미터의 여기 파장) 및 훽스트의 형광보기 (파란색, 361 나노 미터의 여기 파장) 거꾸로 형광 현미경. </li></ol></li><li> CD31, VEGFR2, eNOS에 대한 형광 염색, VE-cadherin의 및 Calponin합니다. <ol><li> 스토어 FITC 접합 항 - 마우스 CD31 항체, eNOS의 항체, VE-cadherin의의 4 ° C에서 항체, FITC 접합 항 - 토끼 IgG를을 어두운. -20 ° C에 보관 VEGFR2 항체. </li><li> 멸균 1X PBS 3 회 세포를 씻으십시오. </li><li> 세포를 해결하기 위해 10 % 포르말린 1 ML을 추가합니다. 약 30 분 동안 실온에서 접시를 넣습니다. </li><li> 멸균 1X PBS 3 회 세포를 씻으십시오. </li><li> CD31 얼룩하려면 1 mL의 멸균 1 배를 추가CD31-FITC 항체의 10 μL를 포함 PBS. 각각-VE cadherin의 또는 차 항체 calponin, 얼룩 하나 VEGFR2은 이노스는-VE cadherin의 또는 calponin, VEGFR2, eNOS의 4 μL를 포함 멸균 1X PBS의 1 mL를 넣어합니다. </li><li> 어둠 속에서 1 시간 동안 얼음에 세포를 품어. </li><li> 멸균 PBS 3 회 세포를 세척하여 항체를 제거합니다. </li><li> VEGFR2의 염색을 위해 이노스는, VE-cadherin의 또는 calponin, FITC 접합 된 항 - 토끼 IgG를 10 μL를 포함 멸균 1X PBS의 1 mL를 넣어. 어둠 속에서 1 시간 동안 얼음에 세포를 품어. 멸균 PBS 3 회 세포를 세척하여 IgG를 제거합니다. </li><li> 1 μg의 / ㎖의 최종 농도 훽스트 33342를 추가 어둠 속에서 10 분을 품어. </li><li> CD31, VEGFR2 이노스의 형광보기, VE-cadherin의 반전 형광 현미경, calponin (녹색, 518-535 나노 미터의 여기 파장) 및 훽스트 (파란색, 361 나노 미터의 여기 파장은). </li></ol></li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+endothelial-myocardial+signaling:+its+role+in+cardiac+growth,+contractile+performance,+and+rhythmicity.">Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity.</a> Physiological reviews. 83, 59-115 (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

이 연구는 특별한 장비없이 마우스 대동맥에서 세포를 분리 및 배양 내피하는 간단한 방법을 보여줍니다. 면역 염색 세포의 대부분이 제 2 통로 후 내피 세포이었던 것으로 나타났다. 제 3 통로에 두 번째의 세포는 시험 관내 및 내피 세포 생물학을 연구하는 생체 실험에 적합한 것이 좋습니다. 이 의정서에서 키 노트 절차에 오 중요한 포인트가 있습니다. 우선, 혈관 내강 내피 세포 활성화 및 혈전 형성을 최소화하기 위해 PBS 함유 헤파린 플러싱된다. 둘째, 심장 정지 및 매트릭스 상 대동맥 세그먼트의 시드들 사이의 시간은 내피 세포의 생존에 중요하다. 요정 - 동맥 지방 조직과 결합 조직을 삭제하는 동안, 대동맥 스트레칭 방지하고 10이 단계에 소요되는 시간 제한 - 15 분. 셋째, 부어그들은 접종 후 충분한 미디어 세그먼트를 커버합니다. 너무 많은 미디어가 대동맥 세그먼트가 떠하게됩니다. 넷째, 배양 배지는 내피 세포보다 빠르게 성장하게 내피 세포 성장 보충 고농도로 포함되어있는 경우 내피 성장 배지에서 배양 -2-. 내피 세포의 생장은 평활근 세포 및 섬유 아세포와 같은 다른 유형의 세포를 억제한다. 다섯째, 행렬로부터 대동맥 세그먼트를 삭제하는 타이밍은 내피 세포의 순도 중요하다. 이 단계는 섬유 아세포 및 평활근 세포에 의한 오염을 방지한다. 세그먼트는 튜브 네트워크의 발달 이전에 제거되어야한다. 대동맥 세그먼트 지연 제거는 섬유 아세포 또는 평활근 세포와 같은 다른 세포 유형의 오염을 초래할 것이다. 이 방법은 또한 생체 외 및 구조와 같은 모세 혈관의 형성에 혈관 신생을 연구하는 데 사용된다는 점에 유의하시기 바랍니다는 대동맥 세그먼트의 혈관 신생 능력을 나타냅니다. 우리의 예를 바탕xperience 모세관 형 구조가 완전히 극적 평활근 세포의 오염 증가의 발생을 개발 한 후 부분을 제거하는 경우. 따라서, 우리는 최적의 시점에서 네트워크가 표시되기 시작하지만, 완전히 개발되지 않은 경우, 세그먼트가 제거 느낀다. 이러한 방식으로, 우리는 최소의 평활근 세포에 의한 오염을 유지하면서 가능한 한 많은 내피 세포를 수확 할 수있다. 이 의정서의 한계 설명 된 방법 중 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 튜브 네트워크를 개발하기 전에 대동맥 부분이 제거되지 않은 경우 먼저, 섬유 아세포 및 평활근 세포의 오염 가능성이있다. 섬유 아세포 또는 평활근 세포는 기질에 부착 시드 후 3-5 일 확산하기 시작할 수있다. 따라서, 항상 적시에 대동맥 세그먼트를 제거합니다. 매체를 다시 후 2 시간이 변경 이차 예방 조치로서,<html> 새로운 플라스크에 세포를 -plating 또한 섬유 아세포 및 평활근 세포의 가능한 오염을 제거하는 것을 돕는다. 격리 10 일 - 둘째, 이러한 세포는 7 체외에서 배양한다. 그들의 표현형 갓 고립 된 내피 세포와 다를 수 있습니다 가능성이있다. 혈증의 마우스 모델에서 내피 세포 지질 고농도없이 내피 세포 성장 배지에서 배양하는 경우가 있었다 동물 예를 들어, 이들은 고지혈증 환경에 노출되지 않는다. 배양 된 내피 세포 갓 격리 내피 세포 8 다르게 동작 할 수 있습니다. 이 문제는 모든 체외 배양 일차 전지 및 세포주에 존재합니다. 배지에 병적 인 자극을 추가하면 생체 내 환경이 해결책이 될 수 있습니다 모방합니다. 내피 세포는 다른 혈관 지점에서 다른 표현형을 보여준다 e_content는 &quot;&gt; 혈관계 동맥, 정맥 및 모세 혈관으로 이루어진 계층 적 구조이다. 혈관계의 특정 &#39;영역&#39;에있는 내피 세포의 이질성 혈관계의 9,10-에 기능적 다양성을 만드는 많은 부분을 수행한다. 심지어 하나의 혈관 침대에서, 같은 대동맥으로, 내피 이질성이 존재합니다. 대동맥의 직선 부분에서 높은 전단 응력과 층류 혈액 흐름의 직선 부분에있는 내피 세포의 산화 질소 합성 효소와 트롬 (11). 따라서, 내피 세포를 유도 대동맥 항응고제, 항 접착제 및 항염 12,13 보여준다. 동맥 분기 또는 급격히 회전 영역에 대하여, 난류 혈류 (대동맥)의 내피 산화 질소 합성 효소의 발현을 감소시키고, 내피 세포의 죽종 유전자를 유도 세포, 즉, 단핵구 화학 주성 단백질 -1 (MCP-1), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGFs), 프로 염증과 동맥 경화성 혈관 내피 표현형 (6)의 결과. 또한, 각 장기의 혈관 내피 세포는 장기의 기능 (14, 15)에 고유의 해부학 적 및 기능적 적응 변화를 겪는다. 그럼에도 불구하고, 여러 세포 표면 마커 유전자 기능 및 세포 활동은 내피 세포 계통을 특성화하는데 사용될 수 있다는 합의가있다. 이들 세포 표면 마커는 혈소판 내피 세포 부착 분자 (PCAM-1, CD31), 폰 빌레 브란트 인자 (vWF의) 혈관 내피 헤린 (VE-cadherin의, CD144)를 포함한다. 가장 자주 사용되는 기능적인 유전자는 내피 산화 질소 합성 효소 (eNOS의) 및 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR)를 포함한다. 일반적으로 내피 세포 계보에서 볼 수 있습니다 세포 활동 DIL-광고 LDL의 흡수 및 매트릭스 코드와 같은 구조를 형성하는 결합 렉틴을 포함한다. PRI의의 의의와 미래 응용 프로그램메리 배양 된 마우스 대동맥 내피 세포 여기에 기재된 방법은 혈관 내피 세포를 연구하기 위해 사용된다. 이 프로토콜의 중요성은 대상 분자의 내피 특정 활동을 연구 할 수있는 좋은 기회를 제공하고 심장 혈관 연구에 매우 유용하게 녹아웃 및 유전자 변형 마우스 모델에서 수행 될 수 있다는 것이다. 정의 된 조건에 따라 마우스 대동맥 내피 세포의 높은 숫자를 증가 할 수있는 능력은 더 나은 내피 세포의 표현형 및 기능을 정의하는이 이상적인 기술을합니다. 이 방법은 정맥 내 주입 또는 내피 세포의 생착 하나를 통해 쥐 모델에서 혈관 내피 세포 기반 치료의 잠재적 가능성을 테스트의 실용성을 향상시킨다.

혈관 내피 세포뿐만 아니라 혈액이나 조직을 분리하는 장벽 층, 그것은 400m2 (1)의 표면적 전체에 걸쳐 뻗어 혈관 트리 광대 내분비선 여겨진다. 내피의 복지는 혈관 항상성에 필수적이다. 역기능 내피는 동맥 경화증, 혈관염 및 허혈 / 재관류 손상 등 2-4 등 다양한 심혈관 질환에 참여하고 있습니다. 현재까지이 질환의 설정에 관련된 특정 세포 및 분자 메커니즘은 잘 의한 내피 세포의 확산 해부학 적 특성으로 이해되지 않습니다. 유전자 조작 기술은 다른 어떤 포유 동물 종에 비해 생쥐에서 개발되어 있기 때문에 마우스 연구의 중요한 모델이다. 대동맥의 작은 크기 enzymat하게 때문에 기본 쥐 대동맥 내피 세포의 분리는 특히 어려운 간주비현실적 내피 세포의 IC 소화. 일부는 분리 및 내장 컴퓨터가 5-7을 필요로 정화하는 과정을보고했다. 이 프로토콜의 목적은 특수한 장치를 사용하지 않고 마우스 대동맥 내피 세포를 분리하고 확장하는 간단한 방법을 사용하는 것이다. 이 프로토콜에서 갓 격리 대동맥 작은 세그먼트로 절단 및 내피 세포 발아 수 있도록 아래로 향하게 내피 세포와 매트릭스에 시드. 세그먼트가 제거 된 후, 내피 세포는 내피 세포 선호 배지에서 확장되고 두 개 또는 세 개의 통로 후 실험에 대한 준비가되어 있습니다. 기술 된 방법의 이점은 그 1) 단일 대동맥 내피 세포 수확의 상당히 높은 수치; 2) 세포 생존 능력은 잘 보존된다 3) 특별한 장비 나 기술이 필요하지 않습니다. 이는 내피 세포의 병태 생리의 특정 세포와 분자 메카니즘을 식별하는 효과적인 수단을 제공한다. 홍보를 공부에 관심이있는 사람들을 위해어느 유전자 녹아웃 마우스에서 imary 배양 내피 세포, 유전자 녹아웃 생쥐 나 쥐 질병 모델이 프로토콜은 매우 유용하고 실천하기 쉽습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4- or 6-week-old mice (Jackson Laboratory, #000664).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1X phosphate-buffered saline (PBS, Gibco, #10010-023).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1X PBS containing 1,000 U/ml of heparin (Sigma Aldrich, H3149).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell growth medium (Dulbeccos&#8217; Modified Eagle&#8217;s Medium[DMEM] with 25mM HEPES[Gibco, #12320-032 ], supplemented with 100&#956;g/ml endothelial cell growth supplement from bovine neural tissue [ECGS, Sigma,#2759], 10% fetal bovine serum [FBS, Gibco, #10082-147], 1,000 U/ml heparin [Sigma Aldrich, H3149], 10,000U/ml penicillin and 10mg/ml streptomycin [Gibco, #15140-122]).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factor reduced matrix (BD Biosciences, #356231).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral proteinase (Dispase, 1U/ml, Fisher Scientific #CB-40235) and D-Val medium (D-Valine, 0.034g/L[Sigma, #1255], in Dulbeccos&#8217; Modified Eagle&#8217;s Medium, low glucose[Gibco, #12320-032 ]).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (100&#8209;200 &#956;g/cm2, Sigma, #G1393).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1`-dioctadecyl-3,3,3`,3`- tetramethylindo- carbocyanine perchlorate-labeled acetylated LDL (Dil-ac-LDL, Life Technologies, #L3484),&#160; FITC-labeled Ulex europeus agglutinin (Ulex-Lectin, Sigma, #L9006),&#160; Anti-mouse CD31-FITC conjugated antibody (BD Biosciences, # 553372).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse vascular endothelial growth factor receptor 2 antibody (Cell signaling, #9698), anti-mouse endothelial nitric oxide synthase (Abcam, #ab5589), anti-mouse vascular endothelium-cadherin (Abcam, #33168), anti-mouse calponin (Abcam, #700), FITC-conjugated anti-rabbit IgG (Sigma, #F6005)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One ml syringe fitted with 25-G needle (Fisher Scientific, #50-900-04222).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm Peri dishes (Fisher Scientific,&#160; #07-202-516).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-well cell culture plates (Fisher Scientific, #08-772-1B).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T12.5 cultuer flask (Fisher Scientific, #50-202-076)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, forceps, microdissection scissors and forceps, Scalpel blade (Fine Science Tools, Inc)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine with isoflurane (Webster Veterianary Supply, #07-806-3204), heating lamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge machine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase-contrast microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted fluorescence microscope.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and primary culture of mouse aortic endothelial cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

내피 세포 돋 자연 내피 세포는 마우스 대동맥 세그먼트에서 시작 발아. 마우스 대동맥 세그먼트는 4 일 동안 내피 세포 성장 배지에서 성장 인자 - 감소 된 매트릭스에서 성장시켰다. 4 일 - 내피 세포의 발아는 보통 2에 나타납니다. 현미경은 4 일 (그림 1)에 촬영했다. 사진에 나타낸 바와 같이, 다수의 내피 세포 떨어진 부분에서 이동한다. 새로 형성된 콩나물 세그먼트와 지점에서 확장하는 것을 계속한다. 내피 세포 표현형 이 세포는 초기 통로 (그림 2A) 후 스핀들 모양과 조약돌 같은 모습을 보여 주었다. 부착 된 세포를 DIL-AC-LDL로 1 시간 Ulex -Lectin로 표지 하였다. 도 2b 내지도 2e에 도시 된 바와 같이, 대부분의 셀은 DIL-AC-LDL 이중 양성인<html> 흡수 (적색)과 Ulex -Lectin 결합 (녹색). 한편, 제 2 통로 후, 세포의 95 % 이상이 혈소판 내피 세포 부착 분자 1 (CD31, PECAM-1,도 2F)에 양성이었다 VEGFR2 (도 2G)은, VE-cadherin의 (도 2H), 에노스 ( 부드러운 근육 세포 마커 인 그림 2I)하지만 Calponin (그림 2J에 대한 부정적). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52965/52965fig1.jpg" /> 그림 1. 내피 세포 돋. 쥐 대동맥 세그먼트 성장 인자 - 감소 된 매트릭스 상에 시드 및 내피 세포 성장 배지에서 배양 하였다. 삼일 (B, C, 바 = 100 μm의) - 내피 세포는 다음 2에 이르면 2 일 (A, 바 = 100 μm의)에 같은 시작 증가 발아. 세그먼트는 4 일 (D, 바 = 500 μm의)에서 제거되었습니다. 엔트 &quot;&gt; <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52965/52965fig2.jpg" /> 그림 2. 내피 세포 표현형. 첨부 된 세포는 방추형과 조약돌 모양의 외관을 표시 (A, 바 = 100 μm의), DIL-AC-LDL과 Ulex -Lectin의 더블 긍정적 인 형광 (BE, 바 = 100 μm의). 한편, 혈소판 내피 세포 부착 분자 1 (CD31은 PECAM-1), VEGFR2은 VE 헤린를 이노스는 제 2 통로 후 세포의&gt; 95 %에서 양성이었다 (FI 바는 100 ㎛ =) 세포의 대부분은 음성이었다 부드러운 근육 세포 마커 인 Calponin 염색, (J, 바 = 100 μm의)에 대한.

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Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

30.3K 조회수.  Wayne State University. The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

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Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

판막병 내피 세포의 분리

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

연구

생물학

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

신생아 마우스의 폐 내피 세포의 분리 및 문화

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

기본 마우스 Trophoblast 셀 및 Trophoblast의 침략 분석의 절연

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

쥐 간장 세포의 분리 및 차 문화

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

마우스 기본 췌장 포상 세포의 분리 및 문화

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

쥐과 밸브 내피 세포의 분리

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

마우스 관상 내피 세포의 분리

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

신생아 및 성인 마우스 피부의 1 차 마우스 각질 세포의 분리 및 배양

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a suitable organ source. Immune rejection and coagulation are two major hurdles for the success of xenotransplantation. Vascular endothelial cell (EC) injury and dysfunction are important for the development of the inflammation and coagulation responses in xenotransplantation. Thus, isolation of porcine aortic endothelial cells (pAECs) is necessary for investigating the immune rejection and coagulation responses. Here, we have developed a simple enzymatic approach for the isolation, characterization, and expansion of highly purified pAECs from miniature pigs. First, the miniature pig was anaesthetized with ketamine, and a length of aorta was excised. Second, the endothelial surface of aorta was exposed to 0.005% collagenase IV digestive solution for 15 min. Third, the endothelial surface of the aorta was scraped in only one direction with a cell scraper (&#60;10 times), and was not compressed during the process of scraping. Finally, the isolated pAECs of Day 3, and after passage 1 and passage 2, were identified by flow cytometry with an anti-CD31 antibody. The percentages of CD31-positive cells were 97.4% &#177; 1.2%, 94.4% &#177; 1.1%, and 92.4% &#177; 1.7% (mean &#177; SD), respectively. The concentration of Collagenase IV, the digestive time, the direction, and frequency and intensity of scraping are critical for decreasing fibroblast contamination and obtaining high-purity and a large number of ECs. In conclusion, our enzymatic method is a highly-effctive method for isolating ECs from the miniature pig aorta, and the cells can be expanded in vitro to investigate the immune and coagulation responses in xenotransplantation.

An effective enzymatic method for isolation of primary porcine aortic endothelial cells (pAECs) from miniature pigs is described. The isolated primary pAECs can be used to investigate the immune and coagulation response in xenotransplantation.

소형 돼지에서 1 차 대동맥 내피 세포의 격리 및 배양

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

성인 마우스 입천장에서 1 차 구강 각막 세포의 격리 및 문화

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...