Name: three-dimensional alginate-bead culture of human pituitary adenoma cells
Uploaded: 2016-02-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells at JoVE.com

We thank Mr. O. Rios for his technical assistance.

본 연구는 의료 기관 및 국립 폴리 테크닉 대학의 연구 및 고급 연구 센터의 로컬 윤리위원회에 의해 인간의 물질의 사용이 승인되었다. 1. 종양 샘플 획득 <ol><li> 트랜스 접형골 수술 14 환자에서 뇌하수체 선종 조직 생검을 얻습니다. </li><li> 뇌하수체 샘종 샘플을 수집하고 신선한 10 % 소 태아 혈청 (FBS)이 풍부한 199 배지 (M199), 0.6 ㎎ / ㎖, 중탄산 나트륨, 2.4 ㎎ / ㎖ HEPES, 1 % 50 ㎖를 함유하는 멸균 된 유리 병에 배치 pH가 7.4에서 항생제 (페니실린 / 스트렙토 마이신). 얼음에 유리 병에 샘플을 유지한다. 주 : 종양 조직은 수술 후 몇 시간을 처리 할 수​​있다. </li><li> 얼음에 유리 병 실험실에 종양 샘플을 전송. </li></ol> 효소 조직 해리 솔루션 2. 준비,트립신 억제제 용액 및 알긴산 솔루션 참고 : 세포 배양 과정에 앞서 다음과 같은 솔루션을 준비합니다. 사용하기 전에 0.22 ㎛의 멤브레인 필터를 사용하여 모든 솔루션 필터. <ol><li> M199-혈청 5 ml의 콜라겐 (유형 I) 5 ㎎을 용해시켜 1 % 콜라게나 제 용액을 제조 하였다. </li><li> PBS-0.3 % EDTA 10 ml의 트립신 0.01 g을 용해하여 0.01 % 트립신 용액을 준비한다. </li><li> M199-혈청 20ml에 대두 트립신 억제제 2 ㎎을 용해시켜, 0.1 % 트립신 억제제 용액을 제조한다. </li><li> 트립신 저해제 용액 4 ㎖에의 DNase I 134 U / ml의 20 ㎕의 용해 DNase의 용액을 준비한다. </li><li> 155 mM의 NaCl을 40 mL의 EGTA 22.8 mg을 용해시켜 EGTA 용액 (1.2 M)를 준비한다. 7.4 pH를 조정합니다. 50 ㎖의 최종 부피를 계속합니다. </li><li> 155 mM의 NaCl을 50 mL에 238 mg을 용해시켜 HEPES HEPES 용액 (20 mm)를 준비한다. </li><li> 1.2에 용해시켜 1.2 % 알지네이트 용액을 준비HEPES 용액 100ml에 g 알긴산 나트륨. 알긴산 솔루션을 압력솥. </li><li> pH는 7.4로 조정 한 50 ㎖ HEPES 용액에 CaCl2를 750 mg을 용해시켜 칼슘 용액 (102 mm)를 준비 </li></ol> 3. 주요 세포 배양 및 알긴산 캡슐 <ol><li> 층류 캐비닛 내부, 약 20 ml의 PBS 자유 칼슘 및 마그네슘 2+의 pH 7.4 (PBS *)를 함유하는 35mm 페트리 접시에서 종양 조직을 배치했다. </li><li> 부드럽게 조직을 씻어 외과 트위터와 조직을 가지고 신선한 PBS * 포함 된 다른 배양 접시에 넣습니다. 적혈구 나 이물질이 제거 될 때까지이 단계를 반복합니다. </li><li> 수술 집게를 사용하여, 뇌하수체 선종 조직을 보유하고 작은 수술 용 가위로 작은 조각으로 잘랐다. 둥근 모서리 파스퇴르 피펫, RT에서 10 분 동안 68 XG에, 15 mL의 원심 분리 튜브에가 조직 단편 PBS * 옮긴다. 참고 : 파스퇴르의 가장자리를 둥글게하기피펫은, 약간 분젠 버너에 피펫의 끝을 불꽃. </li><li> 파스퇴르 피펫을 사용하여 PBS *를 제거하고 (약 조직의 65mm 3 5 ml)을, 반전에 의해 2 ~ 3 배를 혼합 콜라겐 솔루션의 3-5 ml를 추가합니다. 일정한 회전에서 37 ° C에서 30 분 동안 콜라게나 제의 조직을 인큐베이션. </li><li> 실온에서 10 분 동안 68 XG에 튜브를 원심 분리기와 파스퇴르 피펫으로 콜라게나 제를 제거합니다. </li><li> 다음, RT에서 10 분 동안 68 XG에서 튜브를 원심 분리하여, DNase를 5 mL를 첨가하고, 반전하여 2 ~ 3 배를 섞는다. 주 : 조직이 완전히 해리되지 않는 경우 37 ° C에서 3 분간 트립신 제 효소 소화를 수행한다. 트립신 저해제 용액이 양의 첨가에 의해 분해를 정지. </li><li> 파스퇴르 피펫으로 뜨는을 대기음 및 폐기합니다. EGTA 용액 1 볼륨의 펠렛을 다시 중단하고 알긴산 용액의 2 권과 혼합. </li><li> 조심스럽게 세포 현탁액과 알긴산 염을 혼합파스퇴르 피펫과 피펫 팅에 의해. , 21 G 바늘 멸균 주사기를 가지고 플런저를 제거; 알긴산 및 세포 용액으로 주사기를로드 피펫을 사용합니다. </li><li> 부드럽게 주사기에 플런저를 삽입하고 신중 알긴산 세포 용액을 드롭하여 드롭 칼슘이 풍부한 용액 약 30 ㎖를 함유하는 유리 비커에 분배. </li><li> 약 5cm까지 염화칼슘 2 용액을 주사기의 바늘을 놓습니다. CaCl2를 접촉에 알긴산 세포 현탁액 겔 구형 비드를 형성한다. 5 분 동안 용액에 칼슘 알기 네이트 비드 유지. 참고 : 구슬이 삭제되는 유리 비커를 저어. 서로 달라 붙는 것을 방지하기 위해, 원형 운동에서 손으로 천천히 이동합니다. </li><li> 조심스럽게 파스퇴르 피펫과 칼슘 용액을 제거하고, FBS의 20 %로 농축 M199의 3 ~ 5 ㎖로 두 번 구슬을 씻는다. </li><li> 일반 T25 조직 배양에 알긴산 비드 전송멸균 플라스크 주걱을 사용하여 5 % CO 2의 가습 인큐베이터에서 37 ° C에서 M199 4-5 ml를 20 % FBS가 풍부한 배양 추가한다. 모든 셋째 날 문화 매체를 변경합니다. </li></ol> 4. 알긴산에서 세포를 해방 주 : 앞서가 알긴산 비드로부터 세포를 해방하는 폴리 D 리신 코트 13mm 직경을 커버 슬립. 주의 : 황산은 부식성이 강한 산성이며, APTS는 눈과 피부에 자극을 줄 수 있습니다. 이러한 시약을 처리하기 위해 라텍스 장갑을 사용합니다. <ol><li> 흄 후드에서 포인트 집게와 RT에서 1 시간 동안 20 % 수성 황산을 함유하는 유리 페트리 접시에 몰입 된 커버. </li><li> 황산을 경사 분리하고, 5 분마다 증류수로 커버 슬립 다섯 번 세척 하였다. 포인트 트위터 장소 RT 15에서 5 분 동안 0.1 M 수산화 나트륨을 포함하는 배양 접시에서 깨끗한 커버 슬립을 사용. </li><li> 수산화 나트륨을 가만히 따르다 및 증류하여 한 번에 씻어인도 물, 물을 기음과 커버 슬립을 건조. </li><li> 4 분 APTS (아미노 프로필 - 트리에 톡시 실란)로 코팅 된 커버를 마이크로 피펫을 사용 증류수로 페트리 접시 홍수 (6 커버 슬립 500 μl를 사용). 빨리 물을 기음과 물이 아래에 침투 할 수 있도록 포인트 핀셋으로 된 커버를 이동, 증류수로 세척하는 것을 계속한다. </li><li> 물을 기음과 커버 슬립을 건조, 깨끗한 페트리 접시에 포인트 트위터 장소를 커버 슬립을 사용하여 3 시간, 45 초 각시 전자 레인지 내부를 소독. 폴리 D 라이신 100 μg의 (0.1 ㎎ / ㎖)을 멸균 1,000 μl를 추가합니다. </li><li> RT에서 5 분 동안 폴리 D 라이신 약 50 μL로 커버 슬립을 부화. 완전히 폴리 D 라이신 대기음. 주 : 배지에 가용성 폴리 -D- 라이신 세포 증식을 억제 할 수 있기 때문에 중요하다. </li><li> 5 분마다 커버 슬립을 멸균 수로 5 회 헹군다. 일을 기음erile 물과 허용 된 커버는 층류 캐비닛 내부 건조합니다. </li><li> 액틴 세포 골격을 분석, 알긴산에서 뇌하수체 세포를 유리. 1 ML의 피펫 팁을 사용하여 배양 플라스크에서 알지네이트 비드의 일부를 가지고 15 ML 튜브에 배치합니다. </li><li> 55 mM의 시트르산 나트륨 5 ㎖ 추가 RT에서 10 분 동안 68 XG에 원심 분리기 (323.6 나 3 C 6 H 5 O 7 ㎎, 2 H 2 O 20 ML의 HEPES 용액을 용해). 뜨는을 대기음 및 폐기합니다. </li><li> 20 % FSB 풍부 따뜻한 M199 1 ㎖의 펠렛을 다시 일시 중지; 부드럽게 파스퇴르 피펫 세포 현탁액을 혼합한다. 주의 : Phalloidin의 및 DAPI는 독성이. 이러한 시약을 처리하기 위해 장갑을 사용합니다. </li><li> 세포를 계산 1.5 ML 튜브에 0.4 % 트리 판 블루 용액 125 μl를 전송합니다. M199 75 μL와 마지막 단계 (희석 배수 = 5)에서 수득 된 세포 현탁액 50 μL를 추가한다. 철저하게 섞는다. </li><li> PLAC하는 마이크로 피펫 팁을 사용하여혈구 챔버의 트립 판 블루 세포 현탁액 즉 약 10 μL. </li><li> 위상차 조명 도립 현미경을 이용하여 혈구 계수기의 셀 개수. 1mm 센터 광장과 네 1mm 코너 사각형의 모든 세포를 계산합니다. 희석 인자에 의해 단위 면적당 평균 개수를 곱하여 밀리리터 당 세포 밀도를 얻기 -. 10 (4), 예를 들어 단위 면적당 평균 개수는 45 셀 × 5 × 104 = 2.25 × 106 세포 / ml 인 경우. 참고 : 혈구 챔버의 열 사각형의 셀을 계산합니다. 아래쪽과 오른쪽에 중간 선을 터치 세포를 계산하지 마십시오. </li><li> 시드 폴리 D 라이신으로 피복 13mm 직경 커버 글라스에 35,000 세포. </li></ol> 5. 액틴 세포 뼈대 배열 <ol><li> 문화 48 시간 후, 파스퇴르 피펫으로 배양액을 제거하고 신속 PBS의 커버 슬립 당 ​​500 μl를 추가, 즉시 PBS를 제거합니다. </li><li> t 수정하고 Permeabilize 하시려면37 °에서 10 분 동안 고정 완충액 (0.1 M PIPES, pH가 6.75, 4 %의 PEG-6000, 1mM의 EGTA, 1mM의 황산, 0.5 % 트리톤 X-100, 2 % 포름 알데히드)의 커버 슬립 당 500 μL와 그 셀 기음 </li><li> 고정 버퍼를 제거하고 실온에서 30 분 동안 PBS에서 3.5 % 파라 포름 알데히드의 coverslip에 500 μl를 추가합니다. 파라 포름 알데히드 용액을 제거합니다. </li><li> 5 분마다 PBS의 커버 슬립 당 ​​500 μl를 추가하여 커버 슬립을 세 번 씻으십시오. 일정한 교반에, RT에서 커버 슬립을 씻어. </li><li> 10 분 동안 50 mM의 염화 암모늄으로 세포를 인큐베이션 염화 암모늄 용액을 흡인하고, 단계 5.4를 반복한다. </li><li> 30 분 동안 PBS에 1 % BSA (IgG의 프리 프로테아제 무)로 세포를 인큐베이션 BSA 용액을 제거하고, 단계 5.4를 반복한다. </li><li> 실온에서 7 분, 단계를 반복 5.4 로다 민 - 복합 팔로이 딘의 50 μM과 세포를 품어. </li><li> RT에서 5 분, 단계를 반복 5.4 PBS에 희석 DAPI의 255 μM와 세포를 품어. 마지막으로 t 마운트그는 장착 매체로 된 커버와 매니큐어로 밀봉. </li><li> 541 nm의 여기 파장 63X 대물 렌즈와 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용 액틴 세포 골격 배열의 이미지를 획득. </li></ol>

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	<li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+Extracellular+Matrix+Mimics+for+3D+Cell+Culture.">Hydrogels as Extracellular Matrix Mimics for 3D Cell Culture.</a> Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).</li><li>Amsden, B., Turner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+characteristics+of+calcium+alginate+gels.">Diffusion characteristics of calcium alginate gels.</a> Biotechnol. Bioeng. 65 (5), 605-610 (1999).</li><li>Andersen, T., Strand, B., Formo, K., Alsberg, E., Christensen, B., Rauter, A. P., Lindhorst, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginates+as+biomaterials+in+tissue+engineering.">Alginates as biomaterials in tissue engineering.</a> Carbohydrate chemistry. Vol. 37, 227-258 (2012).</li><li>Jonitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+capacity+of+human+chondrocytes+embedded+in+alginate+matrix.">Differentiation capacity of human chondrocytes embedded in alginate matrix.</a> Connect. Tissue. Res. 52 (6), 503-551 (2011).</li><li>Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+scaffolds+to+enhance+transplanted+myoblast+survival+and+migration.">Designing scaffolds to enhance transplanted myoblast survival and migration.</a> Tissue. Eng. 12 (5), 1295-1304 (2006).</li><li>Purcell, E. K., Singh, A., Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+composition+effects+on+a+neural+stem+cell-seeded+scaffold.">Alginate composition effects on a neural stem cell-seeded scaffold.</a> Tissue. Eng. Part. C. Methods. 15 (4), 541-550 (2009).</li><li>Wee, S., Gombotz, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+release+from+alginate+matrices.">Protein release from alginate matrices.</a> Adv. Drug. Deliv. Rev. 31 (4), 267-285 (1998).</li><li>Tashjian, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+strains+of+hormone-producing+pituitary+cells.">Clonal strains of hormone-producing pituitary cells.</a> Methods. Enzymol. 58, 527-535 (1979).</li><li>Fasekas, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+pituitary+adenomas+in+cell+cultures+by+light+and+electron+microscopic+morphology+and+immunolabeling.">Characterization of human pituitary adenomas in cell cultures by light and electron microscopic morphology and immunolabeling.</a> Folia. Histochem. Cytobiol. 43 (2), 81-90 (2005).</li><li>Kohler, P. O., Bridson, W. E., Rayford, P. L., Kohler, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone+Production+by+Human+Pituitary+Adenomas+in+Culture.">Hormone Production by Human Pituitary Adenomas in Culture.</a> Metabolism. 18 (9), 782-788 (1969).</li><li>Kletzkky, O. A., Marrs, R. P., Rundall, T. T., Weiss, M. H., Beierle, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+and+suspension+culture+of+human+prolactin-secreting+pituitary+adenoma.">Monolayer and suspension culture of human prolactin-secreting pituitary adenoma.</a> Am. J. Obstet. Gynecol. 138 (6), 660-664 (1980).</li><li>Melmed, S., Odenheimer, D., Carlson, H. E., Hershman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+functional+human+pituitary+tumor+cell+cultures.">Establishment of functional human pituitary tumor cell cultures.</a> In Vitro. 18 (1), 35-42 (1982).</li><li>Thompson, K. W., Vincent, M. M., Jensen, F. C., Price, R. T., Schapiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+hormones+by+human+anterior+pituitary+cells+in+serial+culture.">Production of hormones by human anterior pituitary cells in serial culture.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 102 (2), 403-408 (1959).</li><li>Cappabianca, P., Cavallo, L. M., Solari, D., Stagno, V., Esposito, F., de Angelis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoscopic+endonasal+surgery+for+pituitary+adenomas.">Endoscopic endonasal surgery for pituitary adenomas.</a> World neurosurg. 82 (6 Suppl), S3-S11 (2014).</li><li>Aplin, J., Curtis, A. S. G., Lackie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+Matrices+for+Studing+Cell+Adhesion.">Model Matrices for Studing Cell Adhesion.</a> Measuring cell adhesion. , 110-111 (1991).</li><li>Guiraud, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+prolactin-producing+pituitary+adenomas+in+three-dimensional+culture.">Human prolactin-producing pituitary adenomas in three-dimensional culture.</a> In. Vitro. Cell. Dev. Biol. 27 (3), 188-190 (1991).</li><li>Ma, H. L., Hung, S. C., Lin, S. Y., Chen, Y. L., Lo, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenesis+of+human+mesenchymal+stem+cells+encapsulated+in+alginate+beads.">Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 64 (2), 273-281 (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

이 프로토콜은 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 제는 세포 배양 물 모두에서 영양소와 가스 확산 동일한 조건을 유지하는 데 필요한 비드 크기의 균일 성이다. 우리의 경험에 의하면, 알긴산 비드를 만들기 위해 21 G 바늘의 사용은 균일 한 비드 크기의 효율적인 문화의 취득이 가능합니다. 두번째 중요한 요소는 바늘의 거리이고; 이 거리는 칼슘 용액을 5 센티미터 칼슘 용액의 표면에 알긴산 / 세포 용액의 흐름의 충돌에 의한 변형 진주 사균을 방지하는 것보다 더 없어야한다. 세 번째 중요한 단계는 비드가 서로 달라 붙는 것을 방지하기 위해 감소 된 유리 교반한다. 고르지 세포 캡슐화의 결과를 나와. 이 프로토콜의 일부 수정이 경험은, 예를 들면, 연구 문제의 와트 따라 혼합 될 수 알긴산 나트륨 용액을 수행 할 수있다기저막 IV 형 콜라겐 등의 단백질, 및 전술 한 프로토콜에 따라 i 번째, 입체 알긴산 지지체를 얻었다. 또 다른 가능성은 15mm 직경의 우물의 알긴산 쿠션을 부유하게하는 것입니다; 이 젤 내부 세포는 위 또는 그 내부에 접종 할 수있다. 특정 실험이 자신의 칼슘 또는 마그네슘 2+ 농도에 수정을 필요로하는 경우 알지네이트로 작업 할 때 문제 해결해야 할 수 있습니다. 하이드로 겔의 안정성이 변경 될 수 있기 때문이다. 바 2 + - 그리고 구리 2+ -crosslinked 알긴산 겔은 수용액에서 상대적으로 안정, 불행하게도,이 양이온은 종종 3 세포 독성 있습니다. 이러한 뇌하수체 선종 조직으로 종양 조직하여 작업하는 경우,이 기술의 하나 제한이 제공하는 작은 조직 샘플입니다. 따라서, 얻어진 알긴산 비드의 개수가 조직 샘플의 크기에 달려있다. 이전 시스템입체 뇌하수체 선종 배양 세포를 유지하는 것이 설명되었다. 저자는 다른 기간 (16)이 상태에서 세포 응집체를 형성하도록 진탕 이러 토리 세포에 제출하고 유지 하였다. 이 세포 현탁 배양의 사용은 배양 챔버 내부 이러 토리 장비를 필요로한다. 여기에 설명 된 프로토콜의 장점은 별도의 실험실 장비를 사용하지 않고도 입체 시스템에서 세포 배양을 가능하게한다는 것이다. 입체 알긴산 시스템에 포함 된 세포를 일반 플라스크 안에 일정한 배양기에서 유지된다. 또 다른 장점은 알긴산 지지체가 다른 입체 시스템과 대조적으로, 세포는 추가 조사 7 겔에서 해방 될 수있게한다는 것이다. 또한, 알기 네이트 비드에 세포를 배양하는 중요한 양태는이 시스템에 포함 된 세포 외 매트릭스 드 노보 synthetize을 할 수 있다는 것이다. 대안알긴산에서 임베디드 세포 연구에있어서 후속 절편 및 면역 조직 화학적 분석은 17 폴리에틸렌 글리콜의 농도가 증가함에 따라 그 탈수 하였다 알긴산 비드를 고정한다. 우리는 삼차원 환경에서의 상호 작용을 분석하기 위해 내장 일차 배양 정상적인 뇌하수체 쥐 세포 입체 알긴산 비드 시스템을 적용 장래 관심 또한 뇌하수체 선종 배양 외의 형태이다.

들은 배양 된 세포에 대한 입체 구조적지지 및 세포 간 통신 (1)의 유지 보수를 제공하기 때문에 삼차원 지지체 광범위 세포 배양에 사용되어왔다. 천연 유래 고분자 물질은 I 형 콜라겐, 키토산, 알긴산 등 3 차원 지지체를 만들기 위해 사용되었다. 알긴산은 갈색 해조류의 Macrocystispyrifera (다시마)에서 파생 된 천연 중합체이다. 이러한 중합체는 β-D-만누 산 (M) 및 α-L-guluronic 산 (G), 예컨대 칼슘 및 바륨과 같은 특정 가의 양이온의 존재 하에서 2 형태 안정한 겔 반복 단위로 구성된다. 염화칼슘 (CaCl2를) 솔루션은 일반적 알긴산 비드를 형성하는 가교 결합 시약으로 사용된다. 알긴산 솔루션은 즉시 입체 구형 겔을 형성 염화칼슘 (2)로 떨어졌다. 알지네이트 용액을 세포와 혼합 될 때, 세포는 알긴 B로 캡슐화EADS 3. 알긴산은 그것을 활성화 특성 연골 4, 5 및 골격 근육 모세포 신경줄 기세포 6 포함한 세포의 다양한 밀봉 용 매트릭스로서 사용되어야한다. 불활성 물질이며, 영양분, 산소 및 세포의 생존과 기능을 유지 대사 산물의 확산을 허용한다; 또한, 다른 겔 기반 배양 시스템과 달리, 알긴산 비드 내 배양 세포는 소듐 시트 레이트, 칼슘 킬 레이터를 사용하여 지지체로부터 유리 될 수 있고, 세포를 추가로 조사 7 수확 할 수있다. 뇌하수체 선종은 일반적으로 낮은 확산 속도와 양성 종양이다. 쥐 뇌하수체 선종 세포주 이차원 시스템 (8)에서 성공적으로 배양되었다. 그러나, 인간의 뇌하수체 분비 세포 종양이 배양 효율적인 발전 아니다; 분산 뇌하수체 종양 세포 성장 저조한배양, 세포 부착 및 확산 제한을 나타내고, 상기 세포는 전형적으로 배양 접시 9,10 부동 응집체를 형성한다. 몇몇 시도가 효소 및 기계적 분산 방식 (11)만으로 기계식 분산 방식 (12) 및 암 (10)의 이식편 배양 포함한 뇌하수체 종양 세포 현탁액을 수득되었습니다. 이러한 방식으로, 다른 저자는 시간의 다른 기간 동안 가능한 자기편 문화를 얻었다. 종양 분비 세포의 용량은 종양 유형 및 확산 속도에 의존하는 이들 9 이차원 시스템에서 생존한다. 그러나, 장기간 배양 섬유 아세포 표현형을 가진 세포를 11,13은 우세. 이 논문은 상기의 상세한 분석이 가능 알긴산 지지체 그들을 해방 알긴산 비드 캡슐화 뇌하수체 선종 세포 초대 배양을 얻는 방법을 설명자신의 세포 생물학, 예를 들어, 자신의 세포 골격 준비의 측면.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>199 culture medium&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>31100-027</td><td>For culture, warm in a 37 &amp;deg;C water bath before use&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum&amp;nbsp;</td><td>PAA</td><td>A15-751</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate (NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Merck</td><td>106329</td><td></td></tr><tr><td>N-(2-Hydroxyethyl) piperazine-N&amp;acute;-2ethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>H-4034</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline)</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>21600-044</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type I</td><td>Worthington</td><td>4176</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>27250-018</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Research Organics</td><td>3002E</td><td></td></tr><tr><td>Sorbean trypsin inhibitor&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Worthington</td><td>2139</td><td></td></tr><tr><td>Alginic acid, From Macrocystis Pyrifera (Kelp)</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>A-2158</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>J.T. Baker</td><td>1332</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate (Na3C6H5O7)</td><td>J.T. Baker</td><td>3646</td><td></td></tr><tr><td>Piperazine-N,N&amp;prime;-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)</td><td>Research Organics</td><td>9624P</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol 6000 (PEG 6000)</td><td>Calbiochem</td><td>528877</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)</td><td>Research Organics</td><td>9574E</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>J.T. Baker</td><td>2500</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>J.T. Baker</td><td>2106</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium chloride (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl)</td><td>J.T. Baker</td><td>660</td><td></td></tr><tr><td>BSA Bovine Serum Albumin IgG-Free</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>001-000-161</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin&amp;ndash;Tetramethylrhodamine B isothiocyanate</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td>Toxic. Use gloves to handle this reagent&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>D1306</td><td>Toxic. Use gloves to handle this reagent&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sulfuric acid (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>J.T. Baker</td><td>9681</td><td>Highly corrosive. Use gloves to handle this reagent&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NAOH)</td><td>Merck</td><td>1.06498</td><td>Can cause eye and skin irritation.Use gloves to handle this reagent&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTS)</td><td>Sigma</td><td>A-3648</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>Sigma</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue solution</td><td>Sigma</td><td>T8154&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>Toxic: May cause cancer. Use gloves to handle this reagent&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Rotator&amp;nbsp;</td><td>Boekel Scientific</td><td>Model 230300</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>DuPont Corporation&amp;nbsp;</td><td>Model sorvall TC6</td><td></td></tr><tr><td>shaker&amp;nbsp;</td><td>Lab-line Instruments</td><td>Model 314-820&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

three-dimensional alginate-bead culture of human pituitary adenoma cells

삼차원 배양 방법을 설명하는 기본 뇌하수체 샘종 세포 알긴산 비드에서 성장된다. 알긴산 갈색 해조류 유래의 중합체이다. 간략하게, 종양 조직은 작은 조각으로 절단하고 콜라겐와 트립신 효소 소화에 제출된다. 이어서, 세포 현탁액이 얻어진다. 종양 세포 현탁액을 1.2 %의 알긴산 나트륨과 혼합 CaCl2를 적하하고, 알긴산 / 세포 현탁액을 구형 비드를 형성하기 위해 염화칼슘 2 접촉 겔화된다. 알긴산 비드에 포함 된 세포를 20 % FBS가 풍부한 배지에서 제공 영양분 공급된다. 알긴산 비드의 삼차원 배양 4 개월까지 장시간 선종 세포의 생존력을 유지한다. 또한, 세포는 시트르산 나트륨과 함께 비드를 세척하여 알긴산으로부터 해방 또한 면역 세포 화학적 분석을위한 커버 글라스에 접종 할 수있다. CEL의 사용난 문화 모델은 최소한의 해체와 액틴 세포 골격의 고정 및 시각화 수 있습니다. 요약하면, 알긴산 비드 뇌하수체 샘종 세포의 유지를위한 안정적인 배양 시스템을 제공한다.

이 프로토콜은 문화와 다양한 기간에 대한 알지네이트 비드의 선종 뇌하수체 세포의 유지 보수에 성공적으로 적용되었다 삼개월 후 1 쇼를 알지네이트 비드에 포함 된 셀을줍니다.; 이 세포는. 거꾸로 광학 현미경 (그림 1)에서 이중 굴절 둥근 모양을 나타내는 2 알긴산에 포함 된 쥐의 뇌하수체 선종 세포에서 N-cadherin의 국산화를 보여줍니다. N-cadherin의 세포 세포 연락처 (그림 2A와 2C)에서 지역화 및 핵 (그림 2B와 2C) 확장 염색질을 보였다. 알긴산 비드 종양 세포는 문화에 최대 4 개월 동안 생존을 유지; 따라서, 세포의 다양한 측면의 분석을 가능하게 다른 시간 알긴산 비드로부터 해방 될 수있다같은 세포 배양에서 세포 생물학. 예를 들어, 증식 지수가 작동하지 않는 기-67 면역 반응성, 및 19.2 ± 1.5 %의 평균 라벨 인덱스를 사용하여 인간의 뇌하수체 샘종을 얻었다 (SEM 평균 ±) 열로부터 얻어졌다.도 3은 배양 된 뇌하수체를 도시 기-67에 대한 면역 염색 선종 세포. 비 침습적의 세포 액틴 cytoskeletons는 면역 세포 화학 프로토콜에 따라 염색 하였다 위에서 설명한다. 문화 세포는 작은 굴지의 스트레스 섬유 (그림 4A) 문화 시스템의 독립적 인 뇌하수체 선종으로 변화 국지적 인 형태 학적 및 액틴 필라멘트의 배열들에 가늘고 긴 모양을 전시; 예를 들어, 비 작동 침습 선종, 이들 세포 중 주된 형태는 불연속 피질 고리 그들의 액틴 필라멘트의 배열 반올림 하였다. (그림 4B). 도 1 3개월 대 알긴산 비드에 포함 된 세포. 세포를 광학 현미경으로 이중 굴절 둥근 모양을 나타낸다. 알긴산에서 임베디드 오른쪽 패널 침습 macroadenoma 세포에서 도시되고, 왼쪽 패널 비 침습적 macroadenoma 세포를 나타낸다. 스케일 바 = 15 μm의 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53637/53637fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53637/53637fig2.jpg" /> 알긴산 구슬 쥐 뇌하수체 선종 세포에서 N-cadherin의 (GH3) 문화 그림 2. 면역 세포 화학적 분석. GH3 세포는 알긴산의 배양, N-cadherin의 (적색)에 대한 스테인드 알긴산 시스템에 포함 된 고정 핵 (파란색 ). 세포는 정액에 배치된다ulus는 세포 - 세포 테두리 (A 및 C)에서 N 헤린를 도시. 핵 (B 및 C) 확장 염색질로 표시됩니다. 스케일 바 = 15 μm의 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53637/53637fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53637/53637fig3.jpg" /> 핵 항원 기-67 배양 된 인간의 뇌하수체 선종 세포의 그림 3. 면역 염색은. 알지네이트 비드 문화의 2.5 개월 후, 침략 작동하지 않는 선종 세포는 수정 된 후 기-67 (적색)과 핵 (파란색)에 대한 면역 염색. 일부 선종 세포는 기-67에 대한 긍정적 인 면역 염색을 보여줍니다. 스케일 바 = 15 μm의 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53637/53637fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> &lt;유지-together.within 페이지 = &quot;1&quot;&gt; : FO P 클래스 = &quot;jove_content&quot; <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53637/53637fig4.jpg" /> 그림 알긴산 비드에서 해방 뇌하수체 선종 셀의 4. 액틴 세포 골격 준비. 세포는 고정 TRITC-팔로이 딘과 필라멘트를하는 걸 위해 염색 하였다. 비 침습적 macroadenoma의 세포 작은 응력 액틴 섬유 (A)에 도시하는, 기판 상에 연장시켰다. 침략 macroadenoma에서 세포는 불연속 액틴 링 (B)와 둥근 모양을 보여 주었다. 스케일 바 = 15 μm의 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53637/53637fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

인간의 뇌하수체 선종 세포의 3 차원 알긴산 비드 문화

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

three-dimensional-alginate-bead-culture-human-pituitary-adenoma

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

9.9K 조회수.  Center for Research and Advanced Studies (CINVESTAV-IPN). Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

비디오: Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

난소와 Oviducts의 3 차원 조직 문화 알긴산의 Hydrogels

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

연구

생체공학

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

3 차원 자기 조립 펩티드 히드로겔에서 인간 신경 전구 세포의 배양

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred to as patient-derived organoids (PDO), are an invaluable resource for studying the mechanism of tumorigenesis and metastasis of prostate cancer. Their main advantage is that they maintain the distinctive genomic and functional heterogeneity of the original tissue compared to conventional cell lines that do not. Furthermore, 3D cultures of PDO can be used to predict the effects of drug treatment on individual patients and are a step towards personalized medicine. Despite these advantages, few groups routinely use this method in part because of the extensive optimization of PDO culture conditions that may be required for different patient samples. We previously demonstrated that our prostate cancer bone metastasis PDX model, PCSD1, recapitulated the resistance of the donor patient&rsquo;s bone metastasis to anti-androgen therapy. We used PCSD1 3D organoids to characterize further the mechanisms of anti-androgen resistance. Following an overview of currently published studies of PDX and PDO models, we describe a step-by-step protocol for 3D culture of PDO using domed or floating basement membrane (e.g., Matrigel) spheres in optimized culture conditions. In vivo stitch imaging and cell processing for histology are also described. This protocol can be further optimized for other applications including western blot, co-culture, etc. and can be used to explore characteristics of 3D cultured PDO pertaining to drug resistance, tumorigenesis, metastasis and therapeutics.

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Three-dimensional cultures of patient BMPC specimens and xenografts of bone metastatic prostate cancer maintain the functional heterogeneity of their original tumors resulting in cysts, spheroids and complex, tumor-like organoids. This manuscript provides an optimization strategy and protocol for 3D culture of heterogeneous patient derived samples and their analysis using IFC.

환자 전립선암 뼈 전이 표본 및 이종이식에서 파생된 3차원(3D) 오르가노이드의 설립 및 분석

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

암 연구학

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

3D 배양에서 암 세포 침략 및 T 세포 세포 독성 을 감시

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is limited to cell proliferation and gene expression endpoints. However, in the organism, mammary morphogenesis occurs in a 3D environment. 3D culture systems help bridge the gap between monolayer cell culture (2D) and the complexity of the organism. Herein, we describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action. It uses the commercially available hormone-responsive human breast epithelial cell line, T47D, and rat tail collagen type 1 as a matrix. This 3D culture model responds to the main mammotropic hormones: estradiol, progestins and prolactin. The influence of these hormones on epithelial morphogenesis can be observed after 1- or 2-week treatment according to the endpoint. The 3D cultures can be harvested for analysis of epithelial morphogenesis, cell proliferation and gene expression.

We describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action.

인간의 유선 상피의 호르몬 응답 3D 문화 모델

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The interplay of signals between cancer cells and their microenvironment exerts a powerful influence on breast cancer growth and biological behavior1. However, most of these signals from the extracellular matrix are lost or their relevance is understudied when cells are grown in two dimensional culture (2D) as a monolayer. In recent years, three dimensional (3D) culture on a reconstituted basement membrane has emerged as a method of choice to recapitulate the tissue architecture of benign and malignant breast cells. Cells grown in 3D retain the important cues from the extracellular matrix and provide a physiologically relevant ex&#160;vivo system2,3. Of note, there is growing evidence suggesting that cells behave differently when grown in 3D as compared to 2D4. 3D culture can be effectively used as a means to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype and for underpinning the cellular and molecular signaling involved3. One of the distinguishing characteristics of benign epithelial cells is that they are polarized so that the apical cytoplasm is towards the lumen and the basal cytoplasm rests on the basement membrane. This apico-basal polarity is lost in invasive breast carcinomas, which are characterized by cellular disorganization and formation of anastomosing and branching tubules that haphazardly infiltrates the surrounding stroma. These histopathological differences between benign gland and invasive carcinoma can be reproduced in 3D6,7. Using the appropriate read-outs like the quantitation of single round acinar structures, or differential expression of validated molecular markers for cell proliferation, polarity and apoptosis in combination with other molecular and cell biology techniques, 3D culture can provide an important tool to better understand the cellular changes during malignant transformation and for delineating the responsible signaling.

Three dimensional culture of mammary epithelial cells on a reconstituted basement membrane is a useful method to recapitulate the in vivo architecture of the benign breast, and to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype. Importantly, this system can be applied to study invasive carcinomas in other tissues.

세 가지 차원 문화 : 유방 세포의 악성 변형 대 일반 선포 건축을 연구하는 도구

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

의학

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal cells. The tumor microenvironment is comprised of a variety of cell types, such as fibroblasts, immune cells, vascular endothelial cells, pericytes and bone-marrow-derived cells, embedded in the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs) have a pro-tumorigenic role through the secretion of soluble factors, angiogenesis and ECM remodeling. The experimental models for cancer cell survival, proliferation, migration, and invasion have mostly relied on two-dimensional monocellular and monolayer tissue cultures or Boyden chamber assays. However, these experiments do not precisely reflect the physiological or pathological conditions in a diseased organ. To gain a better understanding of tumor stromal or tumor matrix interactions, multicellular and three-dimensional cultures provide more powerful tools for investigating intercellular communication and ECM-dependent modulation of cancer cell behavior. As a platform for this type of study, we present an experimental model in which cancer cells are cultured on collagen gels embedded with primary cultures of CAFs.

Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.

종양 기질 상호 작용에 대한 세 가지 차원의 공동 문화 모델

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular matrix (ECM) of the unique brain environment, such as hyaluronic acid (HA), facilitates GBM progression and invasion. However, most in vitro culture models include GBM cells outside of the context of an ECM. Murine xenografts of GBM cells are used commonly as well. However, in vivo models make it difficult to isolate the contributions of individual features of the complex tumor microenvironment to tumor behavior. Here, we describe an HA hydrogel-based, three-dimensional (3D) culture platform that allows researchers to independently alter HA concentration and stiffness. High molecular weight HA and polyethylene glycol (PEG) comprise hydrogels, which are crosslinked via Michael-type addition in the presence of live cells. 3D hydrogel cultures of patient-derived GBM cells exhibit viability and proliferation rates as good as, or better than, when cultured as standard gliomaspheres. The hydrogel system also enables incorporation of ECM-mimetic peptides to isolate effects of specific cell-ECM interactions. Hydrogels are optically transparent so that live cells can be imaged in 3D culture. Finally, HA hydrogel cultures are compatible with standard techniques for molecular and cellular analyses, including PCR, Western blotting and cryosectioning followed by immunofluorescence staining.

Here, we present a protocol for three-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells within orthogonally tunable biomaterials designed to mimic the brain matrix. This approach provides an in vitro, experimental platform that maintains many characteristics of in vivo glioblastoma cells typically lost in culture.

히 알루 론 산 기반 Hydrogels 세포종 환자에서 파생 된 셀의 3 차원 문화에 대 한

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells often generates unwanted artifacts. Therefore, cell culture in a three-dimensional (3D) environment, often using extracellular matrix components, emerged as an interesting alternative due to its close similarity to the native in vivo tissue or organ. We developed a 3D cell culture system using two compartments, namely (i) a central compartment containing cancer cells embedded in a collagen gel acting as a pseudo-primary macrospherical tumor and (ii) a peripheral cell-free compartment made of a fibrin gel, i.e. an extracellular matrix component different from that used in the center, in which cancer cells can migrate (invasion front) and/or form microspherical tumors representing secondary or satellite tumors. The formation of satellite tumors in the peripheral compartment is remarkably correlated to the known aggressiveness or metastatic origin of the native tumor cells, which makes this 3D culture system unique. This cell culture approach might be considered to assess cancer cell invasiveness and motility, cell-extracellular matrix interactions and as a method to evaluate anti-cancer drug properties.

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

암 세포 침윤 및 위성 종양 형성을 탐색하는 문화 분석 세 가지 차원

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Establishing a Three-Dimensional Culture of Rat Brain-Derived Glial Cells

Source: Koss, K. M, et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/56615">Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a technique to establish a three-dimensional culture of glial cells. Rat-brain-derived glial cells are encapsulated within a photocrosslinkable polymer matrix containing extracellular matrix components. Upon incubating in a growth medium, the glial cells proliferate within the supporting matrix to create a three-dimensional culture.

쥐의 뇌 유래 신경교세포(Rat Brain-derived glial cell)의 3차원 배양 확립

The protocol for the brain tissue extraction from day 1 Sprague Dawley rat pups, euthanized by decapitation, was approved by the Animal Care and Use ...