Name: three-dimensional alginate-bead culture of human pituitary adenoma cells
Uploaded: 2016-02-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells at JoVE.com

We thank Mr. O. Rios for his technical assistance.

Bu çalışma Tıp Kurumu ve Ulusal Politeknik Enstitüsü Araştırma ve Avans Çalışmaları Merkezi&#39;nin yerel etik kurullar tarafından insan malzemesi kullanımı için onaylanmıştır. 1. Tümör Örnek Toplama <ol><li> Bir transsfenoid cerrahi işlem 14 ile bir hastadan hipofiz adenomu doku biyopsisi edinin. </li><li> hipofiz adenomları örnek toplamak ve taze,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile zenginleştirilmiş 199 kültür ortamı (M199), 0.6 mg / mL sodyum bikarbonat, 2.4 mg / ml HEPES ve 1, 50 mL% ihtiva eden steril bir cam şişe içine yerleştirin pH 7.4&#39;te antibiyotik (penisilin / streptomisin). Buz üzerinde bir cam şişe içinde örnek koruyun. Not: Tümör dokusu cerrahi sonra birkaç saat işlenebilir. </li><li> buz üzerinde cam şişede laboratuvara tümör örneği taşıyın. </li></ol> Enzimatik Doku Ayrılma Çözümleri 2. hazırlanması,Tripsin inhibitörü Çözelti ve alginat solüsyonlarından Not: Hücre kültürü prosedürü öncesinde aşağıdaki çözümleri hazırlamak. Kullanmadan önce 0.22 um zar filtre kullanılarak tüm çözümler, filtre. <ol><li> M199-serumsuz 5 ml kollajenaz (tip I) &#39;in 5 mg çözülmesiyle kolajenaz% 1 çözeltisi hazırlayın. </li><li> PBS-EDTA% 0.3 10 ml tripsin 0.01 g çözülerek% 0.01 çözelti tripsin hazırlayın. </li><li> M199-serumsuz 20 ml soya tripsin inhibitörü, 2 mg çözülmesiyle% 0.1 tripsin inhibitörü çözeltisi hazırlayın. </li><li> tripsin inhibitörü çözeltisi 4 ml DNase I 134 U / ml 20 ul çözülmesiyle DNAz çözeltisi hazırlayın. </li><li> 155 mM NaCI, 40 ml EGTA 22.8 mg çözülmesiyle EGTA çözeltisi (1.2 M) hazırlayın. PH 7.4 ayarlayın. 50 ml&#39;lik bir son hacme kadar devam edin. </li><li> 155 mM NaCI, 50 ml 238 mg HEPES eritilerek HEPES çözeltisi (20 mM) hazırlanır. </li><li> 1.2 çözerek% 1.2 aljinat çözeltisi hazırlayınHEPES çözeltisi, 100 ml g sodyum alginat yer alır. aljinat çözeltisi Otoklav. </li><li> 7.4 pH ayarlamak, 50 mi HEPES çözeltisi içinde CaCI2 750 mg çözülmesiyle kalsiyum çözeltisi (102 mM) hazırlanması </li></ol> 3. Primer Hücre Kültürü ve Aljinat Kapsülleme <ol><li> Laminer akış kabini içinde, yaklaşık olarak 20 mi ari PBS Ca + 2 ve Mg + 2, pH 7.4 (PBS *) ihtiva eden bir 35 mm Petri kabı, tümör dokusu yerleştirin. </li><li> hafifçe doku yıkama, cerrahi pens ile doku almak ve taze PBS * içeren başka petri yerleştirin. kırmızı kan hücreleri ve enkaz kaldırılana kadar bu adımı tekrarlayın. </li><li> cerrahi cımbız kullanarak, hipofiz adenomu doku tutun ve küçük cerrahi makas, küçük parçalar halinde kesin. yuvarlak kenarlı bir Pasteur pipeti ile, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 68 xg, 15 ml&#39;lik bir tüp içine Santrifüjü doku parçaları ve PBS * aktarın. Not: Bir Pasteur kenarlarını yuvarlamak içinPipet, biraz Bunsen beki içinde pipet ucu Alev. </li><li> Pasteur pipeti kullanarak PBS * çıkarın ve (yaklaşık olarak doku 65 mm3 5 mi), ters çevirme, iki ya da üç kez karışımı kolajenaz çözeltisi 3-5 ml ekleyin. sabit dönüş, 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca kolajenaz doku inkübe edin. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 68 xg&#39;de tüpü santrifüjünde bir Pasteur pipeti ile kollajenaz çıkarın. </li><li> daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 68 xg tüp santrifüj, DNAz 5 ml ilave edilir ve üst edilerek, iki ya da üç kez karıştırılır. Not: doku tamamen ayrışmış değilse, 37 ° C&#39;de 3 dakika boyunca tripsin ile ikinci bir enzimatik sindirim gerçekleştirin. tripsin inhibitör çözeltisinin 2 hacim eklenerek sindirim durdurun. </li><li> Pasteur pipeti ile süpernatant aspire ve atın. EGTA çözeltisi 1 hacim pelet yeniden askıya ve aljinat çözeltisi 2 hacim ile karıştırın. </li><li> Yavaşça hücre süspansiyonu ve aljinat mixPasteur pipeti ile pipetleme. Bir 21 G iğne ile steril bir şırınga alın piston kaldırmak; aljinat ve hücre çözeltisi şırınga yüklemek için bir pipet kullanın. </li><li> Yavaşça şırıngaya pistonu yerleştirin ve dikkatli bir şekilde aljinat hücre çözeltisi damla ile damla kalsiyum açısından zengin çözeltinin yaklaşık 30 ml ihtiva eden bir cam behere dağıtın. </li><li> Yaklaşık 5 cm kadar CaCl2 çözeltisine şırınga iğnesi yerleştirin. CaCI2 ile temas halinde alginat hücreli bir süspansiyon jeli küresel tanecikler oluşturulur. 5 dakika boyunca, kalsiyum çözeltisi aljinat tanelerinden tutun. Not: boncuk düştü edildiği cam beher karıştırın. birbirine yapışmasını önlemek için, dairesel hareketlerle elle yavaşça hareket ettirin. </li><li> Dikkatle Pasteur pipeti ile kalsiyum çözeltisi kaldırmak ve FBS% 20 ile zenginleştirilmiş M199 3-5 ml ile iki kez boncuk yıkayın. </li><li> Düzenli T25 doku kültürü içine aljinat boncuk aktarınsteril bir spatula kullanılarak şişe,% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C &#39;de M199 4-5 ml% 20 FBS ile zenginleştirilir ve inkübe ekleyin. Her üç günde bir kültür ortamı değiştirin. </li></ol> 4. Aljinat gelen Hücreleri Özgürleştirin Not: Ön aljinat tanelerinden hücreleri serbest bırakılması için, poli-D-lisin ile kat 13 mm çapında lamelleri. DİKKAT: Sülfürik Asit A ​​ÇOK KOROZİV ASİT NEDİR VE APTS GÖZ VE cilt tahrişine neden olabilir. Bu reaktiflerin KOLU İÇİN LATEX ELDİVEN KULLANIN. <ol><li> Bir çeker ocak içinde, bir noktadan cımbız ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 20 sulu sülfürik asit ihtiva eden bir cam petri lamelleri bırakın. </li><li> sülfürik asit tortusundan ayırma, ve her biri 5 dakika için damıtılmış su ile lamelleri beş kez yıkayın. Bir noktaya cımbız yer oda sıcaklığında 15 ° C&#39;de 5 dakika için 0.1 M NaOH içeren bir petri tabağına temiz lamelleri kullanılması. </li><li> NaOH Durusu ve imbikle ile bir kez yıkayınled su, su aspire ve lamelleri kurulayın. </li><li> 4 dakika boyunca APTS (aminopropil-trietoksilanın) ile kaplamak için lamelleri bir mikropipet kullanın distile su ile Petri kabı sel (6 lamelleri için 500 ul kullanın). Hızla su aspire ve su altında girmesine izin gelin cımbız ile lamelleri hareketli, damıtılmış su ile yıkayın devam ediyor. </li><li> su aspire ve lamelleri kuru, temiz bir Petri kabı içine bir nokta cımbız yer lamelleri kullanarak ve 3 kez, 45 saniye, her sırasında mikrodalga içinde sterilize. poli-D-lisin, 100 ug (0.1 mg / ml) steril su 1000 ul ekle. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca poli-D-lizin, yaklaşık 50 ul lamelleri inkübe edin. Tamamen poli-D-lisin aspire. Not: kültür ortamında çözünebilir poli-D-lizin hücresi çoğalmasını inhibe olduğu için önemlidir. </li><li> Her biri 5 dakika lamelleri, steril su ile beş kez çalkalayın. st aspireerile su ve izin lamelleri bir laminer akış kabini içinde kurumaya. </li><li> aktin hücre iskeletinin analiz etmek, aljinat gelen hipofiz hücreleri kurtarmak. 1 ml bir pipet kullanılarak kültür şişesi aljinat taneleri bazı alın ve 15 ml&#39;lik bir tüp içine yerleştirin. </li><li> 55 mM sodyum sitrat 5 ml oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 68 xg ve santrifüj (323.6 Na 3 C6Hs 5 O 7 mg, 2H 2 O 20 ml HEPES çözeltisi çözülür). Süpernatantı aspire ve atın. </li><li> % 20 FSB ile zenginleştirilmiş ılık M199 1 ml pelet yeniden askıya; hafifçe Pasteur pipeti ile bir hücre süspansiyonu karıştırılır. DİKKAT: faloidin VE DAPI ZEHİRLİ DEĞİLDİR. Bu reaktiflerin KOLU İÇİN ELDİVEN KULLANIN. </li><li> , Hücreleri saymak 1.5 ml tüp% 0.4 Tripan mavisi çözeltisinin 125 ul aktarmak için. M199 75 ul, son aşama (seyreltme faktörü = 5) &#39;de elde edilen hücre süspansiyonu 50 ul ekle. İyice karıştırın. </li><li> plac bir mikropipet ucu kullanınhemositometre odasında Tripan mavisi hücre süspansiyonu e yaklaşık 10 ul. </li><li> Faz kontrast aydınlatma bir ters mikroskop kullanılarak hemositometre sayacında hücreleri sayın. 1 mm merkezi kare ve dört 1 mm köşe kareler tüm hücreleri saymak. Seyreltme faktörü ile kare başına ortalama sayısı çarpılarak mililitre başına hücre yoğunluğu elde etmek -. 10 4 Örneğin, kare başına ortalama sayıları 45 hücreleri x 5 x 104 = 2.25 x 106 hücre / ml ise. Not: hemositometre odasının on meydanlarında hücreleri saymak. alt ve sağ kenarlarında orta çizgiye temas hücreleri saymayın. </li><li> Tohum poli-D-lizin kaplı 13 mm çapında cam lameller üzerine 35.000 hücre. </li></ol> 5. Aktin Hücre iskeleti Düzenlemesi <ol><li> Kültür içerisinde 48 saat sonra, bir Pasteur pipeti ile kültür ortamı ortadan kaldırmak ve hızlı bir şekilde PBS lamel 500 ul hemen PBS kaldırmak. </li><li> t Fix ve permeabilize37 ° C&#39;de 10 dakika boyunca tespit tamponu (0.1 M BORU, pH 6.75,% 4, PEG-6000, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO 4,% 0.5 Triton X-100 ve% 2 formaldehid) lamel 500 ul O hücrelerin C </li><li> sabitleme tamponunu çıkarın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS içinde% 3.5 paraformaldehit lamel 500 ul ilave edin. paraformaldehit çözüm çıkarın. </li><li> Her biri 5 dakika için PBS lamel 500 ul ilave edilerek lamelleri üç kez yıkayın. Sabit çalkalamada olarak, oda sıcaklığında lamelleri yıkayın. </li><li> 10 dakika boyunca 50 mM amonyum klorür ile inkübe hücreleri amonyum klorür çözeltisi aspire adım 5.4 tekrarlayın. </li><li> 30 dakika boyunca PBS içinde% 1 BSA (IgG içermez, proteazlar içermez) ile hücrelerin inkübe BSA çözeltisi çıkarın ve adım 5.4 tekrarlayın. </li><li> RT&#39;de 7 dakika, tekrar adımı 5.4 için rodamin-konjuge Phalloidin 50 uM inkübe hücreleri. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika tekrar adım 5.4 PBS içinde seyreltilmiş DAPI 255 uM hücreleri inkübe edin. Sonunda t montajO bir montaj ortamı ile lamelleri ve oje ile mühür. </li><li> 541 nm eksitasyon dalga boyunda bir 63x objektif ile konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak aktin sitoskeletal düzenlemelerin görüntüleri elde edin. </li></ol>

<ol>
	<li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+Extracellular+Matrix+Mimics+for+3D+Cell+Culture.">Hydrogels as Extracellular Matrix Mimics for 3D Cell Culture.</a> Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).</li><li>Amsden, B., Turner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+characteristics+of+calcium+alginate+gels.">Diffusion characteristics of calcium alginate gels.</a> Biotechnol. Bioeng. 65 (5), 605-610 (1999).</li><li>Andersen, T., Strand, B., Formo, K., Alsberg, E., Christensen, B., Rauter, A. P., Lindhorst, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginates+as+biomaterials+in+tissue+engineering.">Alginates as biomaterials in tissue engineering.</a> Carbohydrate chemistry. Vol. 37, 227-258 (2012).</li><li>Jonitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+capacity+of+human+chondrocytes+embedded+in+alginate+matrix.">Differentiation capacity of human chondrocytes embedded in alginate matrix.</a> Connect. Tissue. Res. 52 (6), 503-551 (2011).</li><li>Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+scaffolds+to+enhance+transplanted+myoblast+survival+and+migration.">Designing scaffolds to enhance transplanted myoblast survival and migration.</a> Tissue. Eng. 12 (5), 1295-1304 (2006).</li><li>Purcell, E. K., Singh, A., Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+composition+effects+on+a+neural+stem+cell-seeded+scaffold.">Alginate composition effects on a neural stem cell-seeded scaffold.</a> Tissue. Eng. Part. C. Methods. 15 (4), 541-550 (2009).</li><li>Wee, S., Gombotz, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+release+from+alginate+matrices.">Protein release from alginate matrices.</a> Adv. Drug. Deliv. Rev. 31 (4), 267-285 (1998).</li><li>Tashjian, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+strains+of+hormone-producing+pituitary+cells.">Clonal strains of hormone-producing pituitary cells.</a> Methods. Enzymol. 58, 527-535 (1979).</li><li>Fasekas, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+pituitary+adenomas+in+cell+cultures+by+light+and+electron+microscopic+morphology+and+immunolabeling.">Characterization of human pituitary adenomas in cell cultures by light and electron microscopic morphology and immunolabeling.</a> Folia. Histochem. Cytobiol. 43 (2), 81-90 (2005).</li><li>Kohler, P. O., Bridson, W. E., Rayford, P. L., Kohler, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone+Production+by+Human+Pituitary+Adenomas+in+Culture.">Hormone Production by Human Pituitary Adenomas in Culture.</a> Metabolism. 18 (9), 782-788 (1969).</li><li>Kletzkky, O. A., Marrs, R. P., Rundall, T. T., Weiss, M. H., Beierle, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+and+suspension+culture+of+human+prolactin-secreting+pituitary+adenoma.">Monolayer and suspension culture of human prolactin-secreting pituitary adenoma.</a> Am. J. Obstet. Gynecol. 138 (6), 660-664 (1980).</li><li>Melmed, S., Odenheimer, D., Carlson, H. E., Hershman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+functional+human+pituitary+tumor+cell+cultures.">Establishment of functional human pituitary tumor cell cultures.</a> In Vitro. 18 (1), 35-42 (1982).</li><li>Thompson, K. W., Vincent, M. M., Jensen, F. C., Price, R. T., Schapiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+hormones+by+human+anterior+pituitary+cells+in+serial+culture.">Production of hormones by human anterior pituitary cells in serial culture.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 102 (2), 403-408 (1959).</li><li>Cappabianca, P., Cavallo, L. M., Solari, D., Stagno, V., Esposito, F., de Angelis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoscopic+endonasal+surgery+for+pituitary+adenomas.">Endoscopic endonasal surgery for pituitary adenomas.</a> World neurosurg. 82 (6 Suppl), S3-S11 (2014).</li><li>Aplin, J., Curtis, A. S. G., Lackie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+Matrices+for+Studing+Cell+Adhesion.">Model Matrices for Studing Cell Adhesion.</a> Measuring cell adhesion. , 110-111 (1991).</li><li>Guiraud, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+prolactin-producing+pituitary+adenomas+in+three-dimensional+culture.">Human prolactin-producing pituitary adenomas in three-dimensional culture.</a> In. Vitro. Cell. Dev. Biol. 27 (3), 188-190 (1991).</li><li>Ma, H. L., Hung, S. C., Lin, S. Y., Chen, Y. L., Lo, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenesis+of+human+mesenchymal+stem+cells+encapsulated+in+alginate+beads.">Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 64 (2), 273-281 (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu protokol pek çok kritik adımlar vardır. İlk hücre kültürünün tüm besinler ve gazların difüzyonu aynı koşullar korumak için gerekli olan boncuk büyüklüğü homojenliği vardır. Bizim tecrübelerimize göre, aljinat boncuk yapmak için bir 21 G iğne kullanımı üniforma boncuk boyutu verimli bir kültür edinimi için izin verir. İkinci önemli faktör iğne mesafedir; Bu mesafe, kalsiyum çözeltisinden 5 cm kalsiyum çözeltisinin yüzeyinde ile aljinat / hücre çözümü akışı çarpışması nedeniyle deforme inci ve ölü hücreleri önlemek için daha fazla olmalıdır. Üçüncü kritik bir adım boncuklar birbirine yapışmasını önlemek için bırakılan edildiği cam karıştırma olduğunu. düzensiz hücre kapsülleme sonuçları tutunan. Bu protokole bazı değişiklikler Deneyimlerimize göre, örneğin, bir araştırma söz konusu bağlı olarak ağ karıştırılabilir sodyum aljinat çözeltisi gerçekleştirilebilirBir bazal membran tip IV kolajen gibi protein ve daha önce tarif edilen protokol takip i, üç boyutlu bir aljinat iskele elde edin. Bir diğer olasılık 15 mm çap kuyu aljinat minderler yüzen yapmaktır; Bu jellerin içindeki hücreler üzerinde ya da içlerinde tohumlanır edilebilir. Herhangi bir deney onların Ca 2 + veya Mg 2 + konsantrasyonlarda değişiklikler gerekiyorsa aljinat çalışırken Giderme gerekli olabilir. Hidrojel stabilite değiştirilebilir olmasıdır. Ba2 + -ve Cu2 + -crosslinked alginat jeller, sulu çözeltiler içinde nispeten kararlı olan, ne yazık ki, bu katyonlar genellikle 3 sitotoksiktir. Bu hipofiz adenomları dokular gibi tümör dokularında çalışırken, bu tekniğin bir sınırlama temin küçük bir doku örnektir. Bu nedenle, elde edilen aljinat tanelerinin sayısı doku numunesi uzunluğuna bağlıdır. Daha önce, bir sistemiüç boyutlu bir kültürde hipofiz adenomları hücreleri korumak tarif edilmiştir. Yazarlar, farklı dönemlere 16 Bu durumda hücreler agrega oluşturmak için sallayarak gyratory hücreleri teslim ve yapılmaktadır. bu hücre süspansiyon kültürünün kullanımı kültür odası içinde sarmal dönüşlü ekipman gerektirir. Burada tarif edilen protokolün bir avantajı, ekstra laboratuar tertibat için ihtiyaç olmaksızın, üç boyutlu bir sistemin hücre kültür için izin vermesidir. Üç boyutlu alginat sistemi gömülü hücrelerin düzenli bir şişe içinde düzenli bir kuluçka makinesi içinde muhafaza edilir. Bir başka avantaj aljinat iskeleti, diğer üç boyutlu sistemlerinin aksine olarak, hücrelerin daha fazla araştırma 7 hidrojel serbest kalması izin vermesidir. Ayrıca, aljinat taneleri içinde kültürlenmesi önemli bir yönü, bu sistemde gömülü hücrelerin de novo hücre dışı matrisi sentezlemek için mümkün olmasıdır. Bir alternatifalginat gömülü hücrelerin incelenmesi için bir yöntem takip eden kesit ve immunohistokimyasal 17 analizler için polietilen glikol artan konsantrasyonları ile kurutulmasından sonra, aljinat tanelerin fiksasyondur. Biz üç boyutlu ortamda etkileşimlerini analiz etmek için gömülü birincil kültür, normal hipofiz sıçan hücrelere üç boyutlu aljinat taneleri sistemini uygulamak için gelecekte ilgilenen ve aynı zamanda hipofiz adenomu kültür, diğer tip vardır.

Bunlar kültür edilmiş hücreler için üç boyutlu bir yapısal destek ve hücreden hücreye iletişimde 1 bakımını sağlamak için, üç boyutlu iskele kapsamlı hücre kültürü kullanılmıştır. Doğal olarak elde edilmiş polimer malzemeleri, tip I kollajenin, kitosan ve alginat da dahil olmak üzere, üç boyutlu bir yapı iskelesi yapmak için kullanılmıştır. Aljinat kahverengi deniz yosunu Macrocystispyrifera (deniz yosunu) elde edilen doğal bir polimerdir. Bu polimer β-D-mannuronik asit (M) ve α-L-guluronik asit (G), kalsiyum ve baryum gibi bazı iki değerli katyonların mevcudiyetinde 2 ve şekiller stabil jeller tekrarlanan birimlerden oluşur. Kalsiyum klorür (CaCI2) çözeltileri yaygın olarak, aljinat tanelerini oluşturmak üzere çapraz bağlama maddesi olarak kullanılmaktadır. Aljinat çözeltiler hemen üç boyutlu küresel jel oluşturmak CaCI2 düştü. alginat çözeltisi hücreleri ile karıştırılır, hücreler aljinat B içine kapsüllenirEADS 3. Aljinat sağlamıştır olan özellikleri kondroitler 4 iskelet miyoblastların 5 ve nöral kök hücreler 6 da dahil olmak üzere hücreleri, çeşitli kapsüllenmesi için bir matris olarak kullanılmak zorundadır. Bu inert bir malzemedir ve besin, oksijen ve hücre yaşamını ve işlevini korumak metabolik ürünlerin dağıtılması için; Üstelik, diğer jel esaslı kültür sistemleri farklı olarak, aljinat taneleri içinde kültürlenmiş hücreler aynı zamanda, sodyum sitrat, kalsiyum şelatlar kullanılarak iskele serbest bırakılabilecektir ve hücreler daha sonra daha ileri araştırmalar 7 hasat edilebilir. Hipofiz adenomları tipik olarak düşük çoğalma oranları ile iyi huylu tümörlerdir. Fare hipofiz adenomları hücre çizgileri, iki boyutlu bir sistemin 8 başarılı kültürlenmiştir. Ancak, salgı insan hipofiz hücre tümörlerinin bu kültür verimli bir gelişme değildir; dağınık tümör hipofiz hücrelerinin zayıf büyüyecekkültürde hücreler yayılan sınırlı eki ve sergilemek ve hücreler genellikle kültür çanak 9,10 yüzen agregatlar oluştururlar. Birçok deneme enzimatik ve mekanik dispersiyon yaklaşım 11, salt mekanik bir dispersiyon yaklaşım 12 ve tümör eksplantlannın 10 kültür de dahil olmak üzere, bir tümör hipofiz hücresi süspansiyonu elde etmek için yapılmıştır. Bu yaklaşımlar ile farklı yazarlar farklı zaman aralıklarında için geçerli yapışık kültürleri elde edilmiştir. Tümör hücrelerinin salgı kapasiteleri tümör tipi ve üremeleri oranları 9 bağlıdır, bu iki boyutlu sistemlerde hayatta kalmak için. Ancak, uzun vadeli kültürlerde, fibroblast fenotipleri ile hücreleri 11,13 hakim. Bu makale ayrıca analizleri sağlayan alginat iskele onları açığa aljinat tanelerinde kapsüllenmiş hipofiz adenomları hücrelerinden bir birincil hücre elde edilmesi için bir yöntem tarif ederkendi hücre biyolojisi, örneğin, kendi iskelet düzenlemelerin yönleri.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>199 culture medium&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>31100-027</td><td>For culture, warm in a 37 &amp;deg;C water bath before use&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum&amp;nbsp;</td><td>PAA</td><td>A15-751</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate (NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Merck</td><td>106329</td><td></td></tr><tr><td>N-(2-Hydroxyethyl) piperazine-N&amp;acute;-2ethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>H-4034</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline)</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>21600-044</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type I</td><td>Worthington</td><td>4176</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>27250-018</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Research Organics</td><td>3002E</td><td></td></tr><tr><td>Sorbean trypsin inhibitor&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Worthington</td><td>2139</td><td></td></tr><tr><td>Alginic acid, From Macrocystis Pyrifera (Kelp)</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>A-2158</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>J.T. Baker</td><td>1332</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate (Na3C6H5O7)</td><td>J.T. Baker</td><td>3646</td><td></td></tr><tr><td>Piperazine-N,N&amp;prime;-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)</td><td>Research Organics</td><td>9624P</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol 6000 (PEG 6000)</td><td>Calbiochem</td><td>528877</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)</td><td>Research Organics</td><td>9574E</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>J.T. Baker</td><td>2500</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>J.T. Baker</td><td>2106</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium chloride (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl)</td><td>J.T. Baker</td><td>660</td><td></td></tr><tr><td>BSA Bovine Serum Albumin IgG-Free</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>001-000-161</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin&amp;ndash;Tetramethylrhodamine B isothiocyanate</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td>Toxic. Use gloves to handle this reagent&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>D1306</td><td>Toxic. Use gloves to handle this reagent&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sulfuric acid (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>J.T. Baker</td><td>9681</td><td>Highly corrosive. Use gloves to handle this reagent&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NAOH)</td><td>Merck</td><td>1.06498</td><td>Can cause eye and skin irritation.Use gloves to handle this reagent&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTS)</td><td>Sigma</td><td>A-3648</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>Sigma</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue solution</td><td>Sigma</td><td>T8154&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>Toxic: May cause cancer. Use gloves to handle this reagent&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Rotator&amp;nbsp;</td><td>Boekel Scientific</td><td>Model 230300</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>DuPont Corporation&amp;nbsp;</td><td>Model sorvall TC6</td><td></td></tr><tr><td>shaker&amp;nbsp;</td><td>Lab-line Instruments</td><td>Model 314-820&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

three-dimensional alginate-bead culture of human pituitary adenoma cells

Üç boyutlu bir kültür yöntemi tarif edildiği primer hipofiz adenomları hücreleri aljinat taneleri yetiştirilir. Aljinat kahverengi deniz yosunu elde edilen bir polimerdir. Kısaca, tümör dokusu küçük parçalar halinde kesilmiş ve kolajenaz ve tripsin ile enzimatik sindirme sunulur. Daha sonra, bir hücre süspansiyonu elde edilir. Tümör hücre süspansiyonu% 1.2 sodyum alginat ile karıştırılmış ve bir CaCl2 solüsyonu içine düştü ve aljinat / hücre süspansiyonu küresel boncuklar oluşturmak üzere CaCI2 ile temas halinde jelleştirilmiş olmasıdır. Aljinat taneleri gömülü hücreleri,% 20 FBS ile zenginleştirilmiş kültür ortamı tarafından sağlanan besin sağlanır. aljinat taneleri üç boyutlu kültürü dört ay kadar uzun bir süre için adenom hücrelerin canlılığını muhafaza eder. Ayrıca, hücreler, sodyum sitrat olan boncuk yıkayarak alginat açığa çıkartılır ve daha immünositokimyasal analizler için cam lameller üzerine tohumlanabilir. Bir cel kullanımıl kültür modeli asgari örgütsüzlük ile aktin hücre iskeletinin fiksasyon ve görselleştirme için izin verir. Özet olarak, aljinat taneleri pituiter adenoma hücrelerinin bakımı için güvenilir bir kültür sistemi sağlar.

Bu protokol kültür ve farklı zaman dilimlerinde için aljinat boncuk adenom hipofiz hücrelerinin korunmasında başarı ile tatbik edilmiştir üç ay sonra Şekil 1 aljinat boncuk gömülü hücreleri Şekil.; Bu hücreler. ters ışık mikroskobu (Şekil 1) altındaki iki refraktif yuvarlak şekiller Şekil 2 alginat gömülü fare hipofiz adenomları Hücrelerinde N-kaderin lokalizasyonunu göstermektedir. N-kadherin, hücre-hücre temas (Şekil 2A ve 2C) lokalizedir ve çekirdek (Şekil 2B ve 2C) genişletilmiş kromatin göstermiştir. aljinat taneleri tümör hücrelerinin kültürde 4 ay için geçerli kalır; Bu nedenle, hücreleri farklı yönlerinin analizler sağlar farklı zamanlarda aljinat taneleri, serbest bırakılabilecektirAynı hücre kültüründe hücre biyolojisi. Örneğin, proliferasyon indeksi çalışmayan Ki-67 immün reaktivite ve 19.2 ± 1.5 ortalama% etiketleme indeksi kullanılarak insan hipofiz adenomları elde edilmiştir (± SEM demek), on elde edilmiştir. Şekil 3 kültürlü insan hipofiz gösterir Ki-67 için immunohistokimyasal adenom hücreleri. non-invazif hücrelerinin aktin cytoskeletons immünositokimyasal protokole göre boyandı, yukarıda tarif eder. Kültür hücreleri küçük aktin stres lifleri (Şekil 4A) kültür sisteminden bağımsız hipofiz adenomu ile çeşitli hayranlarıyla morfolojileri ve aktin filament düzenlemeleri ile uzun şekiller sergilendi; Örneğin, çalışmayan bir invazif adenomu, bu hücreler arasında baskın şekli sürekli kortikal halkalarda da aktin filamentler bir düzenleme ile tamamlanmıştır. (Şekil 4B). Şekil 1. 3 ay boyunca aljinat taneleri içine gömülü hücreler. Hücreler ters ışık mikroskobu altında iki kırılma yuvarlak şekiller gösterirler. aljinat gömülü Sağ panel invaziv makroadenom hücrelerinde gösterilir ve sol panelde non-invazif makroadenom hücreleri gösterilmektedir. Ölçek çubuğu = 15 mikron <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53637/53637fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53637/53637fig2.jpg" /> Aljinat taneleri fare hipofiz adenomları Hücrelerinde N-kaderin (GH3) kültür Şekil 2. immuno-sitokimyasal analizi. GH3 hücreleri, alginat kültürlenmiştir, N-kadherin (kırmızı) için boyandı alginat sistemi gömülü sabit ve çekirdeği (mavi ). Hücreler bir cum düzenlemek vardırUlus hücre-hücre sınırları (A ve C) &#39;de N-kaderin gösteriliyor. Çekirdek (B ve C) genişletilmiş kromatinli gösterilmektedir. Ölçek çubuğu = 15 mikron <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53637/53637fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53637/53637fig3.jpg" /> Nükleer antijen ki-67 kültürlü insan hipofiz adenomu hücrelerinin Şekil 3. İmmünoboyama. Aljinat boncuk kültüründe 2.5 ay sonra, invaziv olmayan işleyen adenom hücreler tespit edildi ve daha sonra Ki-67 (Kırmızı) ve çekirdek (mavi) için immunohistokimyasal. Bazı adenom hücreleri Ki-67 pozitif immün göstermektedir. Ölçek çubuğu = 15 mikron <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53637/53637fig3large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> &lt;keep-together.within sayfa = &quot;1&quot;&gt;: fo p class = &quot;jove_content&quot; <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53637/53637fig4.jpg" /> Şekil aljinat boncuk kurtuldu hipofiz adenomu hücrelerinin 4. Aktin hücre iskeleti düzenlemeleri. Hücreler sabit ve TRITC-Phalloidin sahip filamentler aktin için boyandı. Non-invazif adenomu hücreler, küçük aktin stres elyafların (A) gösteren alt-tabaka üzerine uzatılmıştır. Invazif adenomu hücreler sürekli aktin halkaları (B), bir yuvarlak şekil göstermiştir. Ölçek çubuğu = 15 mikron <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53637/53637fig4large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells at JoVE.com

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

İnsan Hipofiz Adenom Hücreleri üç boyutlu Aljinat-boncuk Kültür

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

three-dimensional-alginate-bead-culture-human-pituitary-adenoma

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

9.9K Görüntüleme.  Center for Research and Advanced Studies (CINVESTAV-IPN). Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

Video: Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

Yumurtalıklar ve fallop borularında Üç Boyutlu Organ Kültür Aljinatta Hidrojeller

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Biyomühendislik

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

3 boyutlu montaj Self-Peptid Hidrojel İnsan Sinir Progenitör Hücreler Yetiştiriciliği

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred to as patient-derived organoids (PDO), are an invaluable resource for studying the mechanism of tumorigenesis and metastasis of prostate cancer. Their main advantage is that they maintain the distinctive genomic and functional heterogeneity of the original tissue compared to conventional cell lines that do not. Furthermore, 3D cultures of PDO can be used to predict the effects of drug treatment on individual patients and are a step towards personalized medicine. Despite these advantages, few groups routinely use this method in part because of the extensive optimization of PDO culture conditions that may be required for different patient samples. We previously demonstrated that our prostate cancer bone metastasis PDX model, PCSD1, recapitulated the resistance of the donor patient&rsquo;s bone metastasis to anti-androgen therapy. We used PCSD1 3D organoids to characterize further the mechanisms of anti-androgen resistance. Following an overview of currently published studies of PDX and PDO models, we describe a step-by-step protocol for 3D culture of PDO using domed or floating basement membrane (e.g., Matrigel) spheres in optimized culture conditions. In vivo stitch imaging and cell processing for histology are also described. This protocol can be further optimized for other applications including western blot, co-culture, etc. and can be used to explore characteristics of 3D cultured PDO pertaining to drug resistance, tumorigenesis, metastasis and therapeutics.

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Three-dimensional cultures of patient BMPC specimens and xenografts of bone metastatic prostate cancer maintain the functional heterogeneity of their original tumors resulting in cysts, spheroids and complex, tumor-like organoids. This manuscript provides an optimization strategy and protocol for 3D culture of heterogeneous patient derived samples and their analysis using IFC.

Hasta Prostat Kanseri Kemik Metastazı Örneklerinden ve Ksenogreftlerinden Elde Edilen Üç Boyutlu (3D) Organoidlerin Oluşturulması ve Analizi

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Kanser Araştırmaları

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

3D Kültürde Kanser Hücre İstilası ve T-Hücre Sitotoksisitesi İzleme

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is limited to cell proliferation and gene expression endpoints. However, in the organism, mammary morphogenesis occurs in a 3D environment. 3D culture systems help bridge the gap between monolayer cell culture (2D) and the complexity of the organism. Herein, we describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action. It uses the commercially available hormone-responsive human breast epithelial cell line, T47D, and rat tail collagen type 1 as a matrix. This 3D culture model responds to the main mammotropic hormones: estradiol, progestins and prolactin. The influence of these hormones on epithelial morphogenesis can be observed after 1- or 2-week treatment according to the endpoint. The 3D cultures can be harvested for analysis of epithelial morphogenesis, cell proliferation and gene expression.

We describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action.

İnsan Meme Bezi Epitelinin Bir Hormon duyarlı 3D Kültür Modeli

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The interplay of signals between cancer cells and their microenvironment exerts a powerful influence on breast cancer growth and biological behavior1. However, most of these signals from the extracellular matrix are lost or their relevance is understudied when cells are grown in two dimensional culture (2D) as a monolayer. In recent years, three dimensional (3D) culture on a reconstituted basement membrane has emerged as a method of choice to recapitulate the tissue architecture of benign and malignant breast cells. Cells grown in 3D retain the important cues from the extracellular matrix and provide a physiologically relevant ex&#160;vivo system2,3. Of note, there is growing evidence suggesting that cells behave differently when grown in 3D as compared to 2D4. 3D culture can be effectively used as a means to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype and for underpinning the cellular and molecular signaling involved3. One of the distinguishing characteristics of benign epithelial cells is that they are polarized so that the apical cytoplasm is towards the lumen and the basal cytoplasm rests on the basement membrane. This apico-basal polarity is lost in invasive breast carcinomas, which are characterized by cellular disorganization and formation of anastomosing and branching tubules that haphazardly infiltrates the surrounding stroma. These histopathological differences between benign gland and invasive carcinoma can be reproduced in 3D6,7. Using the appropriate read-outs like the quantitation of single round acinar structures, or differential expression of validated molecular markers for cell proliferation, polarity and apoptosis in combination with other molecular and cell biology techniques, 3D culture can provide an important tool to better understand the cellular changes during malignant transformation and for delineating the responsible signaling.

Three dimensional culture of mammary epithelial cells on a reconstituted basement membrane is a useful method to recapitulate the in vivo architecture of the benign breast, and to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype. Importantly, this system can be applied to study invasive carcinomas in other tissues.

Üç Boyutlu Kültürler: Meme hücrelerinin malign Dönüşüm vs Normal Asiner Mimari Eğitim için Bir Aracı

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Tıp

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal cells. The tumor microenvironment is comprised of a variety of cell types, such as fibroblasts, immune cells, vascular endothelial cells, pericytes and bone-marrow-derived cells, embedded in the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs) have a pro-tumorigenic role through the secretion of soluble factors, angiogenesis and ECM remodeling. The experimental models for cancer cell survival, proliferation, migration, and invasion have mostly relied on two-dimensional monocellular and monolayer tissue cultures or Boyden chamber assays. However, these experiments do not precisely reflect the physiological or pathological conditions in a diseased organ. To gain a better understanding of tumor stromal or tumor matrix interactions, multicellular and three-dimensional cultures provide more powerful tools for investigating intercellular communication and ECM-dependent modulation of cancer cell behavior. As a platform for this type of study, we present an experimental model in which cancer cells are cultured on collagen gels embedded with primary cultures of CAFs.

Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.

Tümör-stromal Etkileşim için üç boyutlu Co-kültür Modeli

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular matrix (ECM) of the unique brain environment, such as hyaluronic acid (HA), facilitates GBM progression and invasion. However, most in vitro culture models include GBM cells outside of the context of an ECM. Murine xenografts of GBM cells are used commonly as well. However, in vivo models make it difficult to isolate the contributions of individual features of the complex tumor microenvironment to tumor behavior. Here, we describe an HA hydrogel-based, three-dimensional (3D) culture platform that allows researchers to independently alter HA concentration and stiffness. High molecular weight HA and polyethylene glycol (PEG) comprise hydrogels, which are crosslinked via Michael-type addition in the presence of live cells. 3D hydrogel cultures of patient-derived GBM cells exhibit viability and proliferation rates as good as, or better than, when cultured as standard gliomaspheres. The hydrogel system also enables incorporation of ECM-mimetic peptides to isolate effects of specific cell-ECM interactions. Hydrogels are optically transparent so that live cells can be imaged in 3D culture. Finally, HA hydrogel cultures are compatible with standard techniques for molecular and cellular analyses, including PCR, Western blotting and cryosectioning followed by immunofluorescence staining.

Here, we present a protocol for three-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells within orthogonally tunable biomaterials designed to mimic the brain matrix. This approach provides an in vitro, experimental platform that maintains many characteristics of in vivo glioblastoma cells typically lost in culture.

Hyaluronik asit Hydrogels hasta kaynaklı Glioblastoma hücreleri 3 boyutlu kültür için dayalı.

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells often generates unwanted artifacts. Therefore, cell culture in a three-dimensional (3D) environment, often using extracellular matrix components, emerged as an interesting alternative due to its close similarity to the native in vivo tissue or organ. We developed a 3D cell culture system using two compartments, namely (i) a central compartment containing cancer cells embedded in a collagen gel acting as a pseudo-primary macrospherical tumor and (ii) a peripheral cell-free compartment made of a fibrin gel, i.e. an extracellular matrix component different from that used in the center, in which cancer cells can migrate (invasion front) and/or form microspherical tumors representing secondary or satellite tumors. The formation of satellite tumors in the peripheral compartment is remarkably correlated to the known aggressiveness or metastatic origin of the native tumor cells, which makes this 3D culture system unique. This cell culture approach might be considered to assess cancer cell invasiveness and motility, cell-extracellular matrix interactions and as a method to evaluate anti-cancer drug properties.

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

Kanser hücre istilası ve Uydu Tümör oluşumu keşfedin Kültür Testi Üç Boyutlu

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Establishing a Three-Dimensional Culture of Rat Brain-Derived Glial Cells

Source: Koss, K. M, et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/56615">Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a technique to establish a three-dimensional culture of glial cells. Rat-brain-derived glial cells are encapsulated within a photocrosslinkable polymer matrix containing extracellular matrix components. Upon incubating in a growth medium, the glial cells proliferate within the supporting matrix to create a three-dimensional culture.

Sıçan Beyninden Elde Edilen Glial Hücrelerin Üç Boyutlu Bir Kültürünün Oluşturulması

The protocol for the brain tissue extraction from day 1 Sprague Dawley rat pups, euthanized by decapitation, was approved by the Animal Care and Use ...