Name: three-dimensional alginate-bead culture of human pituitary adenoma cells
Uploaded: 2016-02-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells at JoVE.com

We thank Mr. O. Rios for his technical assistance.

Diese Studie wurde für die Verwendung von menschlichem Material von den lokalen Ethikkommissionen der medizinischen Einrichtung und dem Zentrum für Forschung und Voraus Studien des Nationalen Polytechnischen Institut genehmigt. 1. Tumorprobe Acquisition <ol><li> Beziehen Sie die Hypophysenadenom Gewebebiopsie aus einem Patienten durch eine trans-Keilbein chirurgischen Eingriff 14. </li><li> Sammeln Sie die Hypophysenadenom Probe und legen Sie sie in eine sterile Glasflasche mit 50 ml frischem 199 Kulturmedium (M199), angereichert mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 0,6 mg / ml Natriumbicarbonat, 2,4 mg / ml HEPES und 1% Antibiotika (Penicillin / Streptomycin) bei pH 7,4. Pflegen Sie die Probe in einer Glasflasche auf Eis. Hinweis: Das Tumorgewebe mehrere Stunden nach der Operation verarbeitet werden können. </li><li> Transportieren Sie das Tumorprobe an das Labor in der Glasflasche auf Eis. </li></ol> 2. Herstellung der Gewebedissoziation Lösungen enzymatische, dieTrypsininhibitorlösung und das Alginat-Lösungen Hinweis: Vor dem Zellkulturverfahren die folgenden Lösungen vorbereitet. Filter alle Lösungen unter Verwendung eines 0,22 um Membranfilter vor der Verwendung. <ol><li> Bereiten Kollagenase 1% ige Lösung durch Auflösen von 5 mg Collagenase (Typ I) in 5 ml M199-Serum frei. </li><li> Bereiten 0,01% Trypsin-Lösung durch Auflösen von 0,01 g Trypsin in 10 ml PBS-EDTA 0,3%. </li><li> Bereiten 0,1% Trypsin-Inhibitor-Lösung durch Auflösen von 2 mg Soja-Trypsin-Inhibitor in 20 ml M199-Serum frei. </li><li> Bereiten DNAse-Lösung von 20 &amp; mgr; l DNAse I 134 U / ml in 4 ml der Trypsin-Inhibitor-Lösung auflöst. </li><li> Bereiten EGTA-Lösung (1,2 M) durch Auflösen von 22,8 mg EGTA in 40 ml von 155 mM NaCl. Den pH-Wert auf 7,4. Weiterhin auf ein Endvolumen von 50 ml. </li><li> Bereiten HEPES-Lösung (20 mM) durch Auflösen von 238 mg HEPES in 50 ml von 155 mM NaCl. </li><li> Bereiten 1,2% Alginat-Lösung um 1,2 Auflöseng Natriumalginat in 100 ml des HEPES-Lösung. Autoklavieren die Alginat-Lösung. </li><li> Bereiten Calciumlösung (102 mM) durch Auflösen von 750 mg CaCl 2 in 50 ml HEPES-Lösung, pH-Wert auf 7,4 </li></ol> 3. Primärzellkultur und Alginat Encapsulation <ol><li> Innerhalb einer Sterilbank, legen Sie das Tumorgewebe in einer Schale 35 mm Petri etwa 20 ml PBS Ca enthält 2+ und Mg 2+ frei, pH 7,4 (PBS *). </li><li> Nehmen Sie das Gewebe mit einem chirurgischen Pinzette und legen Sie sie in eine andere Petrischale mit frischem PBS *, sanft in das Gewebe zu waschen. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die roten Blutzellen und Schmutz entfernt werden. </li><li> Mit Hilfe eines chirurgischen Pinzette, halten Sie die Hypophysenadenom Gewebe, und mit einem kleinen chirurgischen Schere, schneiden Sie sie in kleine Stücke schneiden. Mit einer Pasteur-Pipette mit abgerundeten Kanten, übertragen Sie die Gewebefragmente und die PBS * in einen 15-ml-Tube, Zentrifugieren bei 68 × g für 10 min bei RT. Hinweis: Um die Kanten einer Pasteur rundenPipette, leicht die Spitze der Pipette in Flamme eines Bunsenbrenners. </li><li> Entfernen Sie die PBS * mit einer Pasteurpipette und 5.3 ml der Collagenase-Lösung hinzu (ca. 5 ml für 65 mm 3 von Gewebe), zwei bis drei Mal mischen durch Umdrehen. Inkubieren des Gewebes in der Kollagenase für 30 min bei 37 ° C in ständiger Rotation. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 68 g für 10 min bei RT und entfernen Sie die Collagenase mit einer Pasteur-Pipette. </li><li> 5 ml DNAse und zwei- bis dreimal durch Invertieren mischen, dann Zentrifugieren der Röhre bei 68 × g für 10 min bei RT. Hinweis: Wenn das Gewebe nicht völlig losgelöst ist, führen bei 37 ° C eine zweite enzymatische Verdauung mit Trypsin für 3 min. Stoppen Sie die Verdauung durch die Zugabe von 2 Volumina Trypsininhibitorlösung. </li><li> Saugen Sie den Überstand mit einer Pipette Pasteur und entsorgen. Resuspendieren des Pellets in 1 Volumen EGTA-Lösung und mit 2 Volumina Alginatlösung mischen. </li><li> Vorsichtig mischen die Zellsuspension und Alginatdurch Pipettieren mit einer Pasteur-Pipette. Nehmen Sie eine sterile Spritze mit einer 21 G-Nadel, entfernen Sie den Kolben; Verwendung einer Pipette die Spritze mit dem Alginat und Zelllösung zu laden. </li><li> Vorsichtig den Kolben in die Spritze und sorgfältig das Alginat-Zell-Lösung tropfen von Drop in ein Becherglas, das etwa 30 ml der kalziumreiche Lösung verzichtet werden kann. </li><li> Legen Sie die Nadel der Spritze ca. 5 cm bis zu der CaCl 2 -Lösung. Die Alginat-Zellsuspension Gele bei Kontakt mit der CaCl 2 sphärische Kügelchen zu bilden. Halten Sie die Alginat-Perlen in der Calcium-Lösung für 5 min. Hinweis: Rühren Sie die Becherglas, in dem die Kugeln fallen gelassen werden. Bewegen Sie es langsam mit der Hand in kreisförmigen Bewegungen, um zu verhindern, miteinander verkleben. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Calciumlösung mit einer Pasteur-Pipette, und Waschen der Kügelchen zweimal mit 3-5 ml M199 mit 20% FBS angereichert. </li><li> Übertragen Sie die Alginat-Perlen in eine reguläre T25-Gewebekulturbei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 Kolben mit einem sterilen Spatel verwenden, fügen Sie 4-5 ml M199 mit 20% FBS angereichert und inkubiert. jeden dritten Tag Ändern des Kulturmediums. </li></ol> 4. Befreien Zellen aus dem Alginat Hinweis: Vor der Zellen aus dem Alginat-Perlen zu befreien, Mantel Durchmesser von 13 mm Deckgläser mit Poly-D-Lysin. ACHTUNG: Schwefelsäure ist stark korrosiv Säure und APTS CAN Reizungen der Augen und der Haut verursachen. Latexhandschuhe verwenden diese Reagenzien zu behandeln. <ol><li> In einer Abzugshaube, mit einem Punkt Pinzette die Deckgläser in einer Glaspetrischale mit 20% igen wässrigen Schwefelsäure 1 h bei RT eintauchen. </li><li> Man dekantiert die Schwefelsäure, und waschen Sie die Deckgläser fünfmal mit destilliertem Wasser für jeweils 5 Minuten. Mit einem Punkt Pinzette Platz die sauberen Deckgläser in einer Petrischale mit 0,1 M NaOH für 5 min bei RT 15. </li><li> Man dekantiert die NaOH und wasche einmal mit destillierenführte Wasser, das Wasser abzusaugen und die Deckgläser trocknen. </li><li> Mithilfe einer Mikropipette zu beschichten die Deckgläser mit APTS (Aminopropyltriethoxysilan) für 4 min (verwenden Sie 500 ul 6 Deckgläser) mit destilliertem Wasser, um die Petrischale überfluten. Schnell das Wasser ansaugen und weiterhin mit destilliertem Wasser zu waschen, die Deckgläser mit Punkt Pinzette bewegen, damit das Wasser unter einzudringen. </li><li> Saugen Sie das Wasser ab und trocknen Sie die Deckgläser, die Deckgläser in eine saubere Petrischale einen Punkt Pinzette Ort mit und sterilisieren sie in der Mikrowelle bei 3-mal, 45 sec jeder. Hinzufügen 1.000 ul sterilem Wasser auf 100 &amp; mgr; g poly-D-Lysin (0,1 mg / ml). </li><li> Inkubiere die Deckgläser mit ca. 50 &amp; mgr; l Poly-D-Lysin für 5 min bei RT. Absaugen Poly-D-Lysin vollständig. Anmerkung: Dies ist wichtig, weil löslichen Poly-D-Lysin in dem Kulturmedium der Zellproliferation hemmen können. </li><li> Spülen Sie die Deckgläser fünfmal mit sterilem Wasser für jeweils 5 Minuten. Saugen Sie das sterile Wasser und lassen Deckgläser in einer Sterilbank zu trocknen. </li><li> Um das Aktin-Zytoskelett analysieren, befreien die Hypophyse Zellen aus dem Alginat. Nehmen Sie einige der Alginat-Perlen aus der Kulturflasche ein 1 ml Pipettenspitze und legen Sie sie in einen 15-ml-Tube. </li><li> 5 ml 55 mM Natriumcitrat (auflösen 323,6 mg Na 3 C 6 H 5 O 7, H 2 O 2 in 20 ml HEPES-Lösung) und Zentrifugation bei 68 × g für 10 min bei RT. Saugen Sie den Überstand und entsorgen. </li><li> Resuspendieren des Pellets in 1 ml warmem M199 mit 20% FSB angereichert; sanft die mit einer Pasteur-Pipette Zellsuspension mischen. ACHTUNG: Phalloidin UND DAPI sind giftig. Handschuhe verwendet werden diese Reagenzien behandeln. </li><li> Um die Zellen zu zählen, Transfer 125 ul von 0,4% Trypanblau Lösung in ein 1,5-ml-Tube. Hinzufügen von 75 ul M199 und 50 ul der Zellsuspension in der letzten Stufe (Verdünnungsfaktor = 5). Gründlich mischen. </li><li> Verwenden Sie einen Mikropipettenspitze zu place etwa 10 ul des Trypanblau-Zellsuspension in die Kammer Hämozytometer. </li><li> Zählen Sie die Zellen in der Zählkammer Zähler ein inverses Mikroskop mit Phasenkontrast-Beleuchtung. Graf alle Zellen in der 1 mm Mitte Platz und vier 1 mm Eckquadrate. Besorgen Sie sich die Zelldichte pro Milliliter durch die durchschnittliche Anzahl an pro Quadrat mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert -. 10 4 Zum Beispiel, wenn die gemessenen Durchschnittswerts pro Quadrat 45 Zellen x 5 x 104 = 2,25 x 106 Zellen / ml. Hinweis: Zählen Sie die Zellen in zehn Plätzen der Hemocytometer Kammer. Zählen Sie nicht Zellen, die die Mittellinie am unteren und rechten Seite zu berühren. </li><li> Seed 35.000 Zellen auf 13 mm Durchmesser Deckgläschen abgedeckt mit Poly-D-Lysin. </li></ol> 5. Aktin-Zytoskelett Arrangement <ol><li> Nach 48 Stunden in Kultur, entfernen Sie das Kulturmedium mit einer Pipette Pasteur und schnell 500 ul pro Deckglas PBS hinzufügen, sofort die PBS zu entfernen. </li><li> Fix und Permeabilisierung ter Zellen mit 500 ul pro Deckglas Fixierungspuffer (0,1 M PIPES, pH 6,75, 4% PEG-6000, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO 4, 0,5% Triton X-100 und 2% Formaldehyd) für 10 min bei 37 &amp; deg; C </li><li> Entfernen Sie die Fixierung Puffer und fügen 500 ul pro Deckglas von 3,5% Paraformaldehyd in PBS für 30 min bei RT. Entfernen Sie die Paraformaldehydlösung. </li><li> Waschen Sie die Deckgläser dreimal durch Zugabe von 500 ul pro Deckglas von PBS für jeweils 5 Minuten. Spülen Sie die Deckgläser bei RT, in ständiger Bewegung. </li><li> Inkubieren der Zellen mit 50 mM Ammoniumchlorid für 10 min, um das Ammoniumchlorid-Lösung ansaugen und wiederholen Schritt 5.4. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen mit 1% BSA (IgG-frei, Proteasen frei) in PBS für 30 Minuten, entfernen Sie die BSA-Lösung und wiederholen Sie Schritt 5.4. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen mit 50 &amp; mgr; M Rhodamin-Phalloidin für 7 min bei RT, wiederholen Sie Schritt 5.4. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen mit 255 &amp; mgr; M DAPI in PBS für 5 min bei RT, wiederholen Sie Schritt 5.4. Schließlich montieren ter Deckgläser mit einer Montage Medium und versiegeln sie mit Nagellack. </li><li> Erwerben Sie Bilder der Zytoskelett-Arrangements Aktin mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop mit einer 63X Ziel verwenden, bei 541 nm Anregungswellenlänge. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Dieses Protokoll hat mehrere wichtige Schritte. Die erste ist Perlgröße Homogenität, die erforderlich ist, die gleichen Bedingungen der Diffusion der Nährstoffe und Gase in der gesamten Zellkultur aufrecht zu erhalten. Nach unserer Erfahrung ist die Verwendung einer 21 G Nadel der Alginatkügelchen ermöglicht die Übernahme eines effizienten Kultur einheitliche Perlengrße zu machen. Der zweite wichtige Faktor ist der Abstand von der Nadel; Dieser Abstand darf nicht mehr als 5 cm von der Calciumlösung verformt Perlen und tote Zellen durch die Kollision des Stroms von dem Alginat / Zell-Lösung mit der Oberfläche der Calciumlösung zu vermeiden. Ein dritter entscheidender Schritt ist die Glas Rühren in dem die Kügelchen fallen gelassen werden, um sie miteinander Verkleben zu verhindern. Das Festhalten zu einer ungleichmäßigen Zellverkapselung. Einige Modifikationen an diesem Protokoll kann in Abhängigkeit von der Fragestellung durchgeführt werden, zum Beispiel in unserer Erfahrung die Lösung von Natriumalginat gemischt werden kann with einer Basalmembran Protein wie Kollagen Typ IV und gemß dem Protokoll vorher beschrieben, erhalten, um ein dreidimensionales Gerüst Alginat. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, Alginat Kissen in 15 mm Durchmesser Brunnen machen schwimmt; innerhalb dieser Gele können die Zellen über oder in ihnen angeimpft werden. Fehlersuche, wenn sie mit dem Alginat arbeiten könnte notwendig sein, wenn eine bestimmte Experiment Änderungen in ihre Ca 2+ oder Mg 2+ Konzentrationen benötigt. Dies ist, weil das Hydrogel Stabilität verändert werden kann. Ba 2+ Cu 2+ -und -crosslinked Alginatgelen relativ stabil sind in wäßrigen Lösungen leider diese Kationen sind oft zytotoxischen 3. Wenn mit Tumorgeweben, wie Hypophysenadenom Gewebe Arbeiten, Eine Einschränkung dieser Technik ist die kleine Gewebeprobe bereitgestellt. Daher erhalten die Anzahl der Alginatkügelchen hängt von der Größe der Gewebeprobe. Bisher ist ein System zurHypophysenadenom Zellen in einer dreidimensionalen Kultur aufrechterhalten wurde beschrieben. Die Autoren vorgelegt, die Zellen zu Kreisel Schütteln Aggregate zu bilden und aufrechterhalten, um die Zellen in diesem Zustand für verschiedene Zeiträume 16. Die Verwendung dieser Zellsuspensionskultur erfordert Kreiselgeräte innerhalb der Kulturkammer. Ein Vorteil der hier beschriebene Protokoll ist, dass es für die Kultivierung von Zellen in einem dreidimensionalen System ohne die Notwendigkeit für zusätzliche Laboreinrichtungen ermöglicht. Die eingebetteten Zellen in die dreidimensionale Alginat System in einer regelmäßigen Inkubator in einem regelmäßigen Kolben gehalten. Ein weiterer Vorteil ist, dass die Alginat-Gerüst, im Gegensatz zu anderen dreidimensionalen Systemen ermöglicht die Zellen aus dem Hydrogel zur weiteren Untersuchung 7 befreit werden. Weiterhin ist ein wichtiger Aspekt Zellen in Alginatkügelchen des Kultivierens ist, dass die in diesem System eingebetteten Zellen können de novo extrazelluläre Matrix zu synthetisieren. Eine AlternativeVerfahren zur Untersuchung von in Alginat eingebetteten Zellen ist die Fixierung der Alginatkügelchen durch ihre Dehydratisierung mit Konzentrationen von Polyethylenglykol für die nachfolgende Schneide und immunhistochemischen Analysen 17 erhöht. Wir sind in der Zukunft interessiert die dreidimensionale Alginatkügelchen System eingebettet Primärkultur normaler Hypophyse Rattenzellen anzuwenden, um ihre Wechselwirkungen in einer dreidimensionalen Umgebung zu analysieren, und auch auf eine andere Art von Kultur Hypophysenadenome.

Dreidimensionale Gerüste wurden in Zellkultur ausgiebig verwendet, weil sie eine dreidimensionale strukturelle Unterstützung für kultivierte Zellen und die Aufrechterhaltung der Zell-zu-Zell-Kommunikation 1 bereitzustellen. Natürlich abgeleitete Polymer-Materialien wurden zu machen dreidimensionalen Gerüsten einschließlich Typ I-Kollagen, Chitosan und Alginat. Alginat ist ein natürliches Polymer, abgeleitet von dem braunen Meeresalgen Macrocystispyrifera (Kelp). Dieses Polymer besteht aus wiederkehrenden Einheiten von β-D-Mannuronsäure (M) und α-L-Guluronsäure (G) 2 und bildet stabile Gele in Gegenwart von bestimmten zweiwertigen Kationen, wie Calcium und Barium. Calciumchlorid (CaCl 2) Lösungen werden als Vernetzungsreagens zu bilden Alginatkügelchen verwendet. Alginat-Lösungen fiel in CaCl2 sofort dreidimensionale kugelförmige Gele bilden. Wenn die Alginat-Lösung mit Zellen gemischt wird, werden die Zellen in das Alginat b eingekapseltEADS 3. Alginat hat Eigenschaften, die es ermöglicht haben als Matrix für die Verkapselung von einer Vielzahl von Zellen verwendet werden, einschließlich Chondrozyten 4, Skelettmyoblasten 5 und 6 neuralen Stammzellen. Es ist ein inertes Material und ermöglicht die Diffusion von Nährstoffen, Sauerstoff und Stoffwechselprodukte, die das Überleben der Zelle und Funktion aufrechtzuerhalten; Darüber hinaus im Gegensatz zu anderen Gelbasis Kultursystemen, in Alginatperlen kultivierten Zellen können auch aus dem Gerüst unter Verwendung von Calciumchelatoren, wie Natriumcitrat, und die Zellen können dann für weitere Untersuchungen 7 geerntet werden freigesetzt werden. Hypophysenadenomen sind in der Regel gutartige Tumoren mit niedrigem Proliferationsraten. Ratte Hypophysenadenom Zelllinien wurden in einem zweidimensionalen System 8 erfolgreich gezüchtet worden. Allerdings ist diese Kultur des sekretorischen menschlichen Hypophysen-Zelltumoren keine effiziente Entwicklung; schlecht dispergiert Tumor der Hypophyse Zellen wachsenin Kultur zeigen die Zellen begrenzte Anhaftung und Ausbreitung, und die Zellen bilden typischerweise Floating-Aggregate in der Kulturschale 9,10. Mehrere Versuche wurden unternommen, einen Tumor hypophysären Zellsuspension, einschließlich einer enzymatischen und mechanischen Dispersion Ansatz 11 ist eine ausschließlich mechanische Dispersion Ansatz 12 und der Kultivierung von Tumor Explantate 10 zu erhalten, hergestellt. Mit diesen Ansätzen wurden verschiedene Autoren erhaltene lebensfähige anhaftende Kulturen für unterschiedliche Zeiträume. Die Kapazitäten der Tumor sekretorischen Zellen in diesen zweidimensionalen Systemen hängen von der Tumorart und ihre Proliferationsraten 9 zu überleben. Jedoch wird in Langzeitkulturen, Zellen mit Fibroblasten-Phänotypen wiegen 11,13. Dieser Beitrag beschreibt ein Verfahren zur Herstellung einer Primärkultur von Hypophysenadenom Zellen in Alginatbeads eingekapselt zu erhalten, die weiter sie von der Alginat-Gerüst befreit, die detaillierte ermöglicht Analysen vonAspekte ihrer Zellbiologie, zB deren Zytoskelett-Arrangements.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>199 culture medium&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>31100-027</td><td>For culture, warm in a 37 &amp;deg;C water bath before use&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum&amp;nbsp;</td><td>PAA</td><td>A15-751</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate (NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Merck</td><td>106329</td><td></td></tr><tr><td>N-(2-Hydroxyethyl) piperazine-N&amp;acute;-2ethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>H-4034</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline)</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>21600-044</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type I</td><td>Worthington</td><td>4176</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>27250-018</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Research Organics</td><td>3002E</td><td></td></tr><tr><td>Sorbean trypsin inhibitor&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Worthington</td><td>2139</td><td></td></tr><tr><td>Alginic acid, From Macrocystis Pyrifera (Kelp)</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>A-2158</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>J.T. Baker</td><td>1332</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate (Na3C6H5O7)</td><td>J.T. Baker</td><td>3646</td><td></td></tr><tr><td>Piperazine-N,N&amp;prime;-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)</td><td>Research Organics</td><td>9624P</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol 6000 (PEG 6000)</td><td>Calbiochem</td><td>528877</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)</td><td>Research Organics</td><td>9574E</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>J.T. Baker</td><td>2500</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>J.T. Baker</td><td>2106</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium chloride (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl)</td><td>J.T. Baker</td><td>660</td><td></td></tr><tr><td>BSA Bovine Serum Albumin IgG-Free</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>001-000-161</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin&amp;ndash;Tetramethylrhodamine B isothiocyanate</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td>Toxic. Use gloves to handle this reagent&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>D1306</td><td>Toxic. Use gloves to handle this reagent&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sulfuric acid (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>J.T. Baker</td><td>9681</td><td>Highly corrosive. Use gloves to handle this reagent&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NAOH)</td><td>Merck</td><td>1.06498</td><td>Can cause eye and skin irritation.Use gloves to handle this reagent&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTS)</td><td>Sigma</td><td>A-3648</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>Sigma</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue solution</td><td>Sigma</td><td>T8154&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>Toxic: May cause cancer. Use gloves to handle this reagent&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Rotator&amp;nbsp;</td><td>Boekel Scientific</td><td>Model 230300</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>DuPont Corporation&amp;nbsp;</td><td>Model sorvall TC6</td><td></td></tr><tr><td>shaker&amp;nbsp;</td><td>Lab-line Instruments</td><td>Model 314-820&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

three-dimensional alginate-bead culture of human pituitary adenoma cells

Eine dreidimensionale Kulturverfahren ist in dem primären Hypophysenadenom Zellen sind in Alginatperlen gewachsen. Alginat ist ein Polymer aus Braun Meeresalgen abgeleitet. Kurz gesagt wird das Tumorgewebe in kleine Stücke geschnitten und einer enzymatischen Verdauung mit Collagenase und Trypsin vorgelegt. Als nächstes wird eine Zellsuspension erhalten. Die Tumorzellsuspension wird mit 1,2% Natriumalginat gemischt und in eine CaCl 2 -Lösung und die Alginat / Zellsuspension wird bei Kontakt mit der CaCl 2 gelierten kugelförmigen Kügelchen zu bilden. Die Zellen in den Alginatkugeln eingebettet sind mit Nährstoffen durch die Kulturmedium, angereichert mit 20% FBS vorgesehen geliefert. Dreidimensionalen Kultur in Alginat-Perlen hält die Lebensfähigkeit der Zellen Adenom für längere Zeit, bis zu vier Monate. Darüber hinaus können die Zellen aus dem Alginat befreit werden, indem die Kügelchen mit Natriumcitrat gewaschen und für weitere immunzytochemischen Analysen auf Deckgläser ausgesät. Die Verwendung eines cell Kulturmodell ermöglicht die Fixierung und Visualisierung der Aktin-Zytoskelett mit minimalem Desorganisation. Zusammenfassend bieten Alginatkügelchen eine zuverlässige Kultursystem für die Wartung von Hypophysenadenom Zellen.

Dieses Protokoll wurde für unterschiedliche Zeiträume erfolgreich in der Kultur und Wartung von Adenom der Hypophyse Zellen in Alginat-Perlen aufgebracht Abbildung 1 zeigt eingebetteten Zellen in Alginat-Perlen nach drei Monaten. Diese Zellen bi-Brechungs abgerundeten Formen unter einem umgekehrten Lichtmikroskop (Abbildung 1) zeigen, Fig. 2 die Lokalisierung von N-Cadherin in rat Hypophysenadenom Zellen in Alginat eingebettet zeigt. Die N-Cadherin bei Zell-Zell-Kontakte (2A und 2C) lokalisiert und der Kern zeigte die Chromatin verlängert (2B und 2C). Tumorzellen in Alginat-Perlen lebensfähig bleiben für bis zu 4 Monate in Kultur; daher können die Zellen aus dem Alginat-Perlen zu unterschiedlichen Zeiten freigesetzt werden, die für die Untersuchung der verschiedenen Aspekte der ermöglichtZellbiologie in der gleichen Zellkultur. Zum Beispiel wurde die Proliferationsindex, die aus zehn nicht-funktionierenden menschlichen Adenome der Hypophyse, die Immunreaktion für Ki-67 verwenden, und eine mittlere Markierungsindex von 19,2 ± 1,5% (Mittelwert ± SEM) erhalten. Abbildung 3 zeigt kultivierten menschlichen Hypophysen Adenom-Zellen immun für Ki-67. Die Aktin-Zytoskelett von Zellen eines nicht-invasive wurden gefärbt nach dem immunzytochemische Protokoll beschreiben oben. Kultur Zellen länglichen Formen mit kleinen Aktin Stressfasern (4A) ausgestellt .Die Morphologien und Aktin-Filament-Anordnungen variiert mit der Hypophysenadenom unabhängig von der Kultursystem; beispielsweise in einem nicht funktionierenden invasive Adenom, die vorherrschende Form unter diesen Zellen wurde mit einer Anordnung der Aktinfilamente in diskontinuierlichen kortikale Ringe gerundet. (4B). Abbildung 1. Die Zellen für 3 Monate in Alginatbeads eingebettet. Die Zellen weisen Bi-Brech abgerundeten Formen unter einem umgekehrten Lichtmikroskop. Auf der rechten Seite invasive Makroadenom Zellen in Alginat eingebettet angezeigt, und im linken Fensterbereich nicht-invasive Makroadenom Zellen gezeigt. Maßstabsbalken = 15 &amp; mgr; m <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53637/53637fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53637/53637fig2.jpg" /> Abbildung 2. Immuno-cytochemische Analyse von N-Cadherin in Rat Hypophysenadenom Zellen (GH3) Kultur in Alginat-Perlen. GH3-Zellen wurden in Alginat, in dem Alginat System gefärbt N-Cadherin (rot) eingebettet befestigt ist und der Kern (blue ). Die Zellen werden in einem cum arrangierenulus zeigt N-Cadherin an den Zell-Zell-Grenzen (A und C). Der Kern (B und C) sind mit dem erweiterten Chromatin gezeigt. Maßstabsbalken = 15 &amp; mgr; m <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53637/53637fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/53637/53637fig3.jpg" /> Abbildung 3. Immunfärbung von nukleäre Antigen Ki-67 kultivierten menschlichen Hypophysenadenom Zellen. Nach 2,5 Monaten Alginatkugel Kultur, invasive nicht funktionierende Adenom-Zellen wurden fixiert und dann immun für Ki-67 (rot) und dem Zellkern (blau). Einige Adenom-Zellen zeigen positive Immunfärbung für Ki-67. Maßstabsbalken = 15 &amp; mgr; m <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53637/53637fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> &lt;p class = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53637/53637fig4.jpg" /> Abbildung 4. Aktin-Zytoskelett Anordnungen von Hypophysenadenom von Alginat-Perlen befreit Zellen. Die Zellen wurden für Aktinfilamente mit TRITC-Phalloidin fixiert und gefärbt. Zellen von einem nicht-invasiven macroadenoma wurden über das Substrat erstreckt, kleiner Aktin Stressfasern (A) zeigt. Zellen aus einer invasiven macroadenoma zeigte eine abgerundete Form mit diskontinuierlichen Aktin Ringe (B). Maßstabsbalken = 15 &amp; mgr; m <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53637/53637fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

Dreidimensionale Alginat-Perle Kultur der Menschen Hypophysenadenom Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

three-dimensional-alginate-bead-culture-human-pituitary-adenoma

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

9.9K Aufrufe.  Center for Research and Advanced Studies (CINVESTAV-IPN). Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

Serie: Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

Alginat Hydrogele für Three-Dimensional Organ Culture der Eierstöcke und Eileitern

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Forschung

Biotechnik

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

Kultivierung humaner neuronaler Vorläuferzellen in einer 3-dimensionalen Self-Montage Peptide Hydrogel

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred to as patient-derived organoids (PDO), are an invaluable resource for studying the mechanism of tumorigenesis and metastasis of prostate cancer. Their main advantage is that they maintain the distinctive genomic and functional heterogeneity of the original tissue compared to conventional cell lines that do not. Furthermore, 3D cultures of PDO can be used to predict the effects of drug treatment on individual patients and are a step towards personalized medicine. Despite these advantages, few groups routinely use this method in part because of the extensive optimization of PDO culture conditions that may be required for different patient samples. We previously demonstrated that our prostate cancer bone metastasis PDX model, PCSD1, recapitulated the resistance of the donor patient&rsquo;s bone metastasis to anti-androgen therapy. We used PCSD1 3D organoids to characterize further the mechanisms of anti-androgen resistance. Following an overview of currently published studies of PDX and PDO models, we describe a step-by-step protocol for 3D culture of PDO using domed or floating basement membrane (e.g., Matrigel) spheres in optimized culture conditions. In vivo stitch imaging and cell processing for histology are also described. This protocol can be further optimized for other applications including western blot, co-culture, etc. and can be used to explore characteristics of 3D cultured PDO pertaining to drug resistance, tumorigenesis, metastasis and therapeutics.

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Three-dimensional cultures of patient BMPC specimens and xenografts of bone metastatic prostate cancer maintain the functional heterogeneity of their original tumors resulting in cysts, spheroids and complex, tumor-like organoids. This manuscript provides an optimization strategy and protocol for 3D culture of heterogeneous patient derived samples and their analysis using IFC.

Etablierung und Analyse von dreidimensionalen (3D) Organoiden, abgeleitet von Patienten prostatakrebs Knochenmetastasen Proben und ihre Xenografts

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Krebsforschung

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

Überwachung der Krebszellinvasion und T-Zell-Zytotoxizität in der 3D-Kultur

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is limited to cell proliferation and gene expression endpoints. However, in the organism, mammary morphogenesis occurs in a 3D environment. 3D culture systems help bridge the gap between monolayer cell culture (2D) and the complexity of the organism. Herein, we describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action. It uses the commercially available hormone-responsive human breast epithelial cell line, T47D, and rat tail collagen type 1 as a matrix. This 3D culture model responds to the main mammotropic hormones: estradiol, progestins and prolactin. The influence of these hormones on epithelial morphogenesis can be observed after 1- or 2-week treatment according to the endpoint. The 3D cultures can be harvested for analysis of epithelial morphogenesis, cell proliferation and gene expression.

We describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action.

Ein Hormon ansprechenden 3D-Kultur Modell des menschlichen Brustdrüse Epithel

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The interplay of signals between cancer cells and their microenvironment exerts a powerful influence on breast cancer growth and biological behavior1. However, most of these signals from the extracellular matrix are lost or their relevance is understudied when cells are grown in two dimensional culture (2D) as a monolayer. In recent years, three dimensional (3D) culture on a reconstituted basement membrane has emerged as a method of choice to recapitulate the tissue architecture of benign and malignant breast cells. Cells grown in 3D retain the important cues from the extracellular matrix and provide a physiologically relevant ex&#160;vivo system2,3. Of note, there is growing evidence suggesting that cells behave differently when grown in 3D as compared to 2D4. 3D culture can be effectively used as a means to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype and for underpinning the cellular and molecular signaling involved3. One of the distinguishing characteristics of benign epithelial cells is that they are polarized so that the apical cytoplasm is towards the lumen and the basal cytoplasm rests on the basement membrane. This apico-basal polarity is lost in invasive breast carcinomas, which are characterized by cellular disorganization and formation of anastomosing and branching tubules that haphazardly infiltrates the surrounding stroma. These histopathological differences between benign gland and invasive carcinoma can be reproduced in 3D6,7. Using the appropriate read-outs like the quantitation of single round acinar structures, or differential expression of validated molecular markers for cell proliferation, polarity and apoptosis in combination with other molecular and cell biology techniques, 3D culture can provide an important tool to better understand the cellular changes during malignant transformation and for delineating the responsible signaling.

Three dimensional culture of mammary epithelial cells on a reconstituted basement membrane is a useful method to recapitulate the in vivo architecture of the benign breast, and to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype. Importantly, this system can be applied to study invasive carcinomas in other tissues.

Dreidimensional Kulturen: Ein Werkzeug, um Architektur zu studieren Normale acinar gegen maligne Transformation von Brustzellen

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Medizin

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal cells. The tumor microenvironment is comprised of a variety of cell types, such as fibroblasts, immune cells, vascular endothelial cells, pericytes and bone-marrow-derived cells, embedded in the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs) have a pro-tumorigenic role through the secretion of soluble factors, angiogenesis and ECM remodeling. The experimental models for cancer cell survival, proliferation, migration, and invasion have mostly relied on two-dimensional monocellular and monolayer tissue cultures or Boyden chamber assays. However, these experiments do not precisely reflect the physiological or pathological conditions in a diseased organ. To gain a better understanding of tumor stromal or tumor matrix interactions, multicellular and three-dimensional cultures provide more powerful tools for investigating intercellular communication and ECM-dependent modulation of cancer cell behavior. As a platform for this type of study, we present an experimental model in which cancer cells are cultured on collagen gels embedded with primary cultures of CAFs.

Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.

Dreidimensionale Co-Kultur-Modell für Tumor-Stroma-Interaktion

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular matrix (ECM) of the unique brain environment, such as hyaluronic acid (HA), facilitates GBM progression and invasion. However, most in vitro culture models include GBM cells outside of the context of an ECM. Murine xenografts of GBM cells are used commonly as well. However, in vivo models make it difficult to isolate the contributions of individual features of the complex tumor microenvironment to tumor behavior. Here, we describe an HA hydrogel-based, three-dimensional (3D) culture platform that allows researchers to independently alter HA concentration and stiffness. High molecular weight HA and polyethylene glycol (PEG) comprise hydrogels, which are crosslinked via Michael-type addition in the presence of live cells. 3D hydrogel cultures of patient-derived GBM cells exhibit viability and proliferation rates as good as, or better than, when cultured as standard gliomaspheres. The hydrogel system also enables incorporation of ECM-mimetic peptides to isolate effects of specific cell-ECM interactions. Hydrogels are optically transparent so that live cells can be imaged in 3D culture. Finally, HA hydrogel cultures are compatible with standard techniques for molecular and cellular analyses, including PCR, Western blotting and cryosectioning followed by immunofluorescence staining.

Here, we present a protocol for three-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells within orthogonally tunable biomaterials designed to mimic the brain matrix. This approach provides an in vitro, experimental platform that maintains many characteristics of in vivo glioblastoma cells typically lost in culture.

Hyaluronsäure basierte Hydrogele für 3-dimensionale Kultur des Patienten abgeleitet Glioblastom-Zellen

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells often generates unwanted artifacts. Therefore, cell culture in a three-dimensional (3D) environment, often using extracellular matrix components, emerged as an interesting alternative due to its close similarity to the native in vivo tissue or organ. We developed a 3D cell culture system using two compartments, namely (i) a central compartment containing cancer cells embedded in a collagen gel acting as a pseudo-primary macrospherical tumor and (ii) a peripheral cell-free compartment made of a fibrin gel, i.e. an extracellular matrix component different from that used in the center, in which cancer cells can migrate (invasion front) and/or form microspherical tumors representing secondary or satellite tumors. The formation of satellite tumors in the peripheral compartment is remarkably correlated to the known aggressiveness or metastatic origin of the native tumor cells, which makes this 3D culture system unique. This cell culture approach might be considered to assess cancer cell invasiveness and motility, cell-extracellular matrix interactions and as a method to evaluate anti-cancer drug properties.

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

Dreidimensionale Kulturtest auf Krebszelle Invasivität und Satelliten Tumorbildung erkunden

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Establishing a Three-Dimensional Culture of Rat Brain-Derived Glial Cells

Source: Koss, K. M, et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/56615">Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a technique to establish a three-dimensional culture of glial cells. Rat-brain-derived glial cells are encapsulated within a photocrosslinkable polymer matrix containing extracellular matrix components. Upon incubating in a growth medium, the glial cells proliferate within the supporting matrix to create a three-dimensional culture.

Etablierung einer dreidimensionalen Kultur von Gliazellen aus dem Rattengehirn

The protocol for the brain tissue extraction from day 1 Sprague Dawley rat pups, euthanized by decapitation, was approved by the Animal Care and Use ...