Name: ex vivo culture of chick cerebellar slices and spatially targeted electroporation of granule cell precursors
Uploaded: 2015-12-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
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이 문서에 제시된 방법은 BBSRC BB / 재정 지원 사업에서 발생 I021507 / 1 (TB, RJTW)와 MRC 박사 재학 (MH).

참고 : 모든 실험은 킹스 칼리지 런던, 영국, 영국 홈 오피스 동물 보호 지침에 따라 수행되었다. E14 소뇌 1. 해부 <ol><li> 배아의 날 (14)에 38 ° C에서 갈색 수정 된 암탉 &#39;계란을 품어. </li><li> 사용 계란 가위 비켜에서 병아리 배아 목을 벨과 얼음 차가운 PBS (그림 1A)를 포함하는 페트리 접시에 머리를 제거합니다. </li><li> 표준 집게를 사용하여 눈과 위턱을 제거, 조직을 통해 각각의 눈 뒤에있는 모든 방법을 절개합니다. 모든 방법 아래턱 (그림 1B)를 제거 인두를 통해 두 번째 절개를합니다. </li><li> 표준 집게를 사용하여 (그림 1C을)를 벗겨하여 두개골의 표면에서 모든 피부를 제거하고 뇌를 공개, 정면 및 정수리 뼈를 제거합니다. </li><li> 복부 측면에서, 인두 연골 및 보조 중간 엽을 제거합니다. </li><li> 등의 측면에서,주의LY는 PIA, 별도의 전체 뇌 (그림 1D)를 손상하지 후뇌 돌보는에 간엽 지느러미를 제거합니다. </li><li> 모든 방법 중뇌와 후뇌와 소뇌 (그림 1E)를 포함하여 별도의 후뇌 사이의 조직을 통해 절개를합니다. </li><li> 모든 방법 소뇌와 후뇌의 ALAR 판의 양측 접합부의 조직을 통해 절개를함으로써, 절개에 걸쳐 PIA의 무결성 (그림 1 층)을 유지하기 위해주의하면서 전체 소뇌를 제거합니다. 성형 맥락총 (그림 1G)를 제거합니다. </li><li> 얼음 차가운 HBSS로 해부 소뇌를 이동합니다. </li></ol> E14 소뇌 2. 슬라이스 문화 <ol><li> 주걱이나 팁 3 ㎖ 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직 헬기의 멸균 플랫폼 전체 소뇌로 이동시켜 조리개를 확대하기 위해 절단. 피펫을 사용하여 물기를 제거합니다. </li><li> T의 전체 전체 소뇌를 잘라그는 최대 50 % 절삭 속도 설정 한 조직 헬기를 이용하여 300 μm의 두께로 방향을 요구했다. 조직의 무결성이 가장 쉽게 시상 절에 보존된다 그러나, 배향은 또한 세포 분석을위한 중요한 고려 사항이다 (과립 세포 축삭 횡 실행 동안 조롱박 세포 수지상 sagittally 조롱박 수지상 세포의 평면에 수직 정렬된다). </li><li> 3 ㎖ 파스퇴르 피펫을 사용하여, 얼음의 슬라이스 소뇌 차가운 HBSS를 다룹니다. </li><li> 컷 팁 3 ㎖ 파스퇴르 피펫을 사용하여 얼음 차가운 신선한 HBSS를 포함하는 60mm 페트리 접시에 HBSS에 조각을 전송합니다. </li><li> 광섬유 광원으로 조명 해부 현미경, 시계공 겸자를 사용하여 개별 조각의 분리를 보장한다. 슬라이스를 식별하는 것은 자신의 조직 무결성 및 메디 오 - 측면 위치에 따라, 전기 천공한다. 참고 : 배지에서 배양 슬라이스를 통해 배아에서 각각의 해부는 약 10 ~ 20 분 따라 우포늪 소요N 경험. 그 소뇌가 잘린 및 생체 문화 사이의 최소 시간을 보낼 수 있도록 한 번에 해부 하나를 수행합니다. </li></ol> 조각의 3 Electroporation에 <ol><li> 절연 테이프로 60mm 페트리 접시의 바닥에 electroporator의 양극을 고정하여 전기 챔버를 구축합니다. 전극을 커버하는 HBSS의 약 1 ML을 추가합니다. </li><li> HBSS에 덮여 전극의 상단에 0.4 μm의 문화 삽입을 놓습니다. 문화 삽입 전극이 항상 삽입과 전극 사이가 접촉되어 있는지 확인하기에 휴식을 허용합니다. 주 :이 설정에서는 슬라이스 배양 인서트 서킷을 유지하지만, 음극의 표적화를 허용 공간, 용액의 표면에 나머지 것이다. </li><li> 전송 확인 조각 (문화 삽입 당 최대 5) 절단 팁 3 ㎖ 파스퇴르 피펫을 사용하여 문화 삽입 상. 분리 및 sagitt 문화 삽입에 정착 할 수 있도록알 방향입니다. </li><li> 슬라이스가 더 이상 용액에 목욕을하지 않도록 피펫을 사용하여, 초과 HBSS 제거합니다. </li><li> 조각의 대상 영역의 표면에 20 % 빠른 그린으로 희석 (1 μg의 / μL의 농도) P10 피펫 팁, 피펫 DNA를 사용. 20 % 빠른 그린은 점성 DNA 용액을 보장하고 엄청나게 DNA의 넓은 분산을 방지 할 수 있습니다. 각각의 조각 (그림 2B)에 약 5 μL DNA / 빠른 그린 솔루션을 추가합니다. </li><li> 원하는 대상 조직을 통해 음극를 놓고 3 × 10 V, 10 밀리 초 지속 펄스 electroporate. 조직과 음극의 직접적인 접촉을 피하십시오. 대신 컨덕턴스를 유지 (실제로 조직에 닿지 않으면 서 가능한 한 조직에 가까운 음극 배치)하는 액체의 표면 장력을 이용한다. </li><li> 원하는대로 각각의 소뇌 조각에 EGL의 여러 지역에 DNA 전달 및 전기를 반복합니다. </li><li> 일렉트로 완료, 전송 배양시 INSE30mm 페트리 접시에 체류. </li><li> 글루코오스 1 % B27 보충제, 2 mM의 글루타민, 100 U가 / ㎖ 페니실린 - (+) - 각각의 배양, 미리 예열 배지 (기초 배지 이글 1 ㎖, 0.5 % (w / v)의 D를 추가 배양 인서트 매체와 접촉하지만, 슬라이스가 목욕하지되도록 배양 인서트 아래 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신). </li><li> 최대 3 일 동안 37 ° C / 6 % CO 2의 문화를 품어. 배지 신선한 사전 예열 매체 매 24 시간을 모두 교체합니다. </li><li> 문화가없는 문화 미디어와 신선한 30mm 접시에 (4 ° C에서 또는 O / N) 4 % 파라 포름 알데히드에서 1 시간 동안 삽입에 문화에 따라, 슬라이스를 수정합니다. </li></ol> 소뇌 조각 4. 영상 <ol><li> 고정 후, PBS에서 5 분 동안 조각을 3 회 반복한다. </li><li> 면도날을 사용하여, 주위 슬라이스 절단하고 조각에 부착되는 인서트의 영역을 제거하여 배양 인서트에서 각 일렉트로 배양 소뇌 슬라이스 해부. 해야 할 것문화 삽입 표면에서 슬라이스를 제거하려고하지. </li><li> 커버 슬립 돌보는에서 원하는 경우 DAPI를 포함하는 설치 매체의 약 1 ml의 마운트 슬라이스 거품을 소개하지, 이미지는 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여. 주 : 이미징 파라미터들이 전기 천공 구조에 따라 다양하고, 개별 사용자의 재량에 따라 할 수있다. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

여기에보고 된 프로토콜은 해부 electroporating 및 병아리 배아로부터 14 일째 소뇌의 슬라이스를 배양하기위한 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 개별 소뇌 로브의 고립 된 타겟팅을 포함하여 EGL의 작은 초점 지역에 전기의 대상으로 할 수 있습니다. 그것은 높은 해상도와 편의에 따라 유전자 분석 및 이미징을 가능하게하고, 저렴한 비용으로 설치류 43-47 년에 설립 된 기술에 비해. 이러한 분석으로 인해 변경이 EGL에 영향을 미칠 수 있음을 의미 확장 ​​개발 기간, 마우스의 EGL 특정 유전자 타겟팅 가능성의 소수와 마름모꼴 입술과 EGL 사이의 분자 메커니즘의 공통성에 생체 내에서하실 수 없습니다 그들은 마름모꼴 립 신경에 영향을 형성 EGL 49 폐지 이후 생물학 자주 분석 될 수 없다. 우리의 시스템은 이에 EGL의 유전 적 변형을 추가로 타겟팅면에서 중요한 진보를 나타낸다pecifically, 그리고 우리가 병아리를 넘어 다른 종에 적용 할 것으로 예상 어쩌면 같은 비 모델 포유류와 파충류 등의 비교 관심의. 슬라이스 배양 전기 천공 법을 수행함에있어서, 기술적 사항의 개수는 매우 중요하다. 첫째, 조각의 견고성은 광범위한 세포 사멸을 진행 한 손에없이 또는 다른 잃고 구조적 무결성에 문화에서 살아 남기 위해 우리의 손에 300 μm의 슬라이스의 두께를 제한한다. 두번째 중요한 고려 사항은 유전 적 변형의 표시 또는 중요한 레벨을 유도하기에 충분히 높은 농도에서 DNA의 전기 천공을 보장 DNA 용액의 점도이다. 초기 배아 후뇌에 주입 된 DNA 솔루션을 비켜 전기에에서 약 1 %의 빠른 녹색 염료의 농도는 일반적이다. 그러나, 우리의 프로토콜에서, 우리는 일반적으로 20 %의 빠른 그린의 농도를 사용합니다. 이 힘은 충분히 보장사촌 DNA 용액은 피펫하지만 전기하기 전에 다음과 같은 DNA의 분산을 방지하기 위해,하지만 충분히 효율적으로 전기 전도를 중재하는 하나를 희석. 이러한 기술적 고려 사항에 더하여, 우리는 우리가 생체 관찰 그 증식 행동을 관찰하지 PIAL 무결성이 조직 준비에 의해 파괴되기 아마도 생체 내 연구에서 예측하지 정확하게 일치합니다. GFP 발현 구조가 일렉트로 때와 같은 조건에서, 일렉트로 세포의 큰 비율은 PH3 염색 (그림 3 층)에 의해 판단으로 문화의 한 하루를 보낸 후 세포주기를 떠난 것으로 보인다. 이 마우스와 여자 모두에서 클론의 확산이 큰 기간 (27)에 걸쳐 연장 예상 EGL 증식 행동과 상관 관계가 없습니다. PIA 증식을 조절 의미는 관찰에 의해 지원되는 우리는 기자 CONSTRUC을 electroporate 때생체는,이 구조는 (36, 37) 이후 유사 분열되어 내부 EGL의 세포를 표시에서 내생 NeuroD1 표현을 반영 GFP 문화의 일일 (그림 3D). 후 모든 전기 천공 세포 표현 GFP의 NeuroD1 규제 소자 구동 식 T, 전체 길이 NeuroD1는 세포 분화 (그림 3E)를 구동하기에 충분한다. 이는 생체 내에서 상응하는 단계에서 외부 EGL에서와 같이 특정 조건 하에서, 세포의 증식 능력이 유지되지 않을 수 있음을 시사한다. PH3 염색 그러나 종종 EGL 영역 (그림 4D)에 지역화 된 문화의 확산을 많이,이 제안 않습니다. EGL 외부의 광범위한 확산 가능성이 흰색 만에 Pax2 GABA 성 전구체의 gliogenesis 또는 증식을 강화 나타냅니다. 의미는 어떤 실험 절차의 해석이 계정 위 proliferativ에을해야한다는 것입니다전자 행동, 조롱박 세포가 정상적인 발달 병아리 그 E18까지 단층을 형성하지 않는다는 사실 (등에 의해 섬유 등반과의 상호 작용의 부족, 예), 슬라이스 조제 후에 노출 될 수있다 이러한 한계에도 불구하고, 우리의 프로토콜은 과립 세포 생물학의 여러 측면을 연구와 관련하여 앞으로 중요한 단계를 나타냅니다. 마름모꼴 립 별개로 공간적으로 시간적으로 EGL의 특정 표시를 가능하게하는 중요한 장점은 과립 전구 세포의 세포 생물학 모두와 생체 내에서 현재 수없는 방식으로 그것을 뒷받침하는 유전자 조절의 여러 검사를 촉진 할 것이다. 병아리에서 우리의 기술은 설치류 43-48에서 기존의 체외 배양 및 전기 프로토콜을 보완하고 비용과 병아리와 관련된 편의성에 상당한 이점을 수행합니다. 또한, 그 위에 상당한 진보를 나타낸다배양 과립 전구 세포 (39)의 기존 기술. 그것을 보완하기보다는 후자를 대체 할 동안, 우리의 프로토콜은 제약 치료의 다양한와 병아리 가능하다 세포 자율 유전자 조작의 다양성에 과립 신경 세포 분화 제어를 엽니 다. 그것은 전례가없는 세부 사항에 과립 세포 생물학을 조사하기위한 기반을 제공합니다.

소뇌는 후뇌의 앞쪽 끝 부분에 앉아 성숙한 뇌의 감각 및 모터 처리의 통합에 대한 책임뿐만 아니라 더 높은인지 과정 (1)을 조절하는 것입니다. 포유류와 조류, 그것은 성인의 뇌에서 신경 세포의 절반 이상을 생산하고 개발하는 동안, 조상의 광범위한 대중 교통 증폭의 제품을 정교한 형태를 보유하고 무겁게 잎 모양입니다. 소뇌는 수세기 동안 신경 생물 학자과 분자 시대 연구의 대상이되어왔다 마찬가지로 상당한 관심을 받고있다. 이는 본질적으로 흥미로운 생물학뿐만 아니라이 많이와 같은 가장 일반적인 소아 두뇌 자폐증 스펙트럼 장애 (2) 가장 눈에 띄게 소뇌 암, 수 모세포종 3, 등의 발달 유전 질환을 포함하여 인간의 질병에 연루되어 있다는 사실뿐만 아니라 관련 종양. 중요한 것은 WH 내의 우수한 모델 시스템이며무형 문화 유산은 두뇌 발달 4시에 운명 할당 및 신경을 연구한다. 최근에는 또한, 척추 동물 계통 5-10 걸쳐 본 소뇌 형태의 다양성으로 인하여 큰, 뇌 발달의 비교 연구를위한 모델 시스템으로 구축되었다. 소뇌는 후뇌 11 rhombomere 1의 등 반에서 개발하고 발달 두 가지 기본 전구 인구, 마름모꼴 입술과 심실 영역으로 구성되어 있습니다. 마름모꼴의 입술은 지붕 판과의 국경에있는 후뇌의 neuroepithelium의 등 주변 지역 확장합니다. 그것은 소뇌 12-14의 글루타메이트 흥분성 신경 세포의 발상지입니다. 심실 영역은 가장 눈에 띄게 억제 GABA 성 소뇌 신경 세포, 큰 조롱박 신경 세포 (14, 15)을 발생시킨다. 나중에 개발 (마우스의 배아 일 13.5 약에서, 병아리 16 E6), 글루타메이트의 progen마름모꼴적인 억제제는 립으로부터 접선 마이그레이션의 선조 PIAL 층을 형성 : 보조 선조 존 외부 과립 층 (EGL)라고. 이는 성숙한 뇌에서 발견되는 과립 뉴런의 거대한 수 리드 광범위한 중계 증폭을 겪는다이 층이다. EGL의 확산은 긴 세포주기 종료하고 중앙으로 외부 EGL 층에서 자신의 종료와 관련되는 전구 세포의 신경 세포 분화에 스위치, 마름모꼴 립 (17)에서 접선 마이그레이션의 결과 하위 PIAL 위치에 연결되었습니다 EGL (18). 중간 - 가로축에 후 유사 분열 과립 세포의 광범위한 접선 마이그레이션 성숙한 소뇌 피질의 내부 과립 층에 최종 반경 마이그레이션하기 전에, 중간 및 내부 EGL (19)에서 발생합니다. 소뇌 표면 마름모꼴 입술에서 세포의 마이그레이션 피아 20-22에서 CXCL12 신호에 따라 달라집니다 </sup&gt; 및 과립 세포 CXCL12 수용체 CXCR4를 발현. 그들의 접선 마이그레이션 억제 interneuron 인구 23-25 ​​마이그레이션 신피질 접선 방향으로의 그 때문에 연상시킨다. 흥미롭게도, 전자 현미경 연구 (17)는 증식 형태와 EGL 세포는 포유류의 피질 (26)의 기초 선조를 연상시키는 방식으로 증식 능력과 세포의 동작을 연결, PIAL 접촉을 유지한다고 제안했다. 이것은 18 시그니처 과립 전구체 별개의 유전자 발현이 뚜렷한 세포 외 환경에 의해 정의되는 세 개의 부 계층으로 EGL의 전술 한 층화에 반영된다. oEGL에서 증식 전구 세포의 전구 세포가 개별적 유전자 생쥐 배아 발달의 마지막에 표시 될 때, 그들은 postmitotic 250-500 g의 중앙값의 평균을 야기하도록 클론 크기의 정규 분포로 발생ranule 뉴런 (27, 28). 확산은 조롱박 뉴런 29-32의 기초에서 분열 쉬이 잇 신호에 따라 달라집니다. SHH에 응답하는 능력이 전사 인자 Atoh1의 세포 발현에 따라 자율적 전적으로 의존하는 것으로 밝혀졌다, 시험 관내 및 생체 내 (33) (34, 35)의 양쪽 모두. 이와 마찬가지로 세포주기 출구와 분화 가능성 Atoh1 37의 직접 리프레이다 하류 전사 인자 NeuroD1 36의 발현에 의존하는 것으로 밝혀졌다. 세포주기 출구 38-42의 세포 생물학적 근거를 해독이 진행하고, 상당한 발전에도 불구하고, 결정을 기초 근본적인 분자 메커니즘 (들)은 세포주기를 종료 및 분화 신경 세포에 선조에서 전환하고, 내부 EGL에서 관련 postmitotic 접선 마이그레이션뿐만 아니라 나중에 스위치방사형 마이그레이션 이해 불완전하게 남아있다. 이는 EGL의 실험 다루기 힘듦의 큰 정도이다 늦은 개발과 같은 신경성 분자의 많은 중요한 앞서 과립 전구체의 삶에서 마름모꼴 립에서 또한 때문에 유전자 타겟팅하기 어렵다. 이 문제를 극복하기 위해, 다수의 저자는 설치류 43-48에서 출생 후 소뇌를 대상으로하는 방법으로 생체와 생체 전기에서 개발했습니다. 여기에, 우리는 비용과 편의성면에서 상당한 이점을 나타내는 EGL을 공부 병아리에 생체 전기의 사용을 개척. 전기와 병아리 소뇌 조직의 생체 슬라이스 문화의 우리의 방법은 14 병아리 EGL 증식의 절정에 배아 날로부터 조직 해부 사용합니다. 이 방법은 마름모꼴 립의 독립적 EGL 유전자의 표적화를 허용하고 과립으로부터의 전이 유전자 해부 스테이지를 설정한다소뇌에 postmitotic 과립 신경 세포에 전구.

<table><tbody><tr><td>McIlwain tissue chopper</td><td>Mickle Laboratory Engineering Ltd</td><td></td><td>Cut at 300 &amp;mu;m for best results.</td></tr><tr><td>Basal Medium Eagle (Gibco)</td><td>Life Technologies</td><td>41010-026</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>0.4 &amp;mu;m culture insert</td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>TSS20 Ovodyne electroporator&amp;nbsp;</td><td>Intracel</td><td>01-916-02</td><td>Use 3 x 10 V, 10 msec pulses for electroporation.</td></tr></tbody></table>

ex vivo culture of chick cerebellar slices and spatially targeted electroporation of granule cell precursors

소뇌 외부 과립 층 (EGL)이 개발 뇌에서 가장 큰 교통 증폭의 사이트 및 신경 세포의 증식 및 분화 연구를위한 훌륭한 모델입니다. 또한, 자사의 증식 능력의 진화 적 수정은 소뇌 척추 동물의 뇌의 EVO-DEVO 연구를위한 훌륭한 모델을 만들고, 양막 류 (amniotes)에서 소뇌 크기의 극적인 확장을위한 책임이있다. EGL의 구성 세포, 소뇌 과립 전구 세포는 또한, 수 모세포종에 대한 가장 일반적인 소아 종​​양 신경 기원의 상당한 셀을 나타낸다. 교통 증폭 다음, 과립 전구체은 성숙한 포유류의 뇌에서 가장 큰 신경 인구를 대표하는 소뇌의 내부 세분화 된 계층에 반경 방향으로 이동한다. 병아리, EGL 증식의 피크는 임신의 두 번째 주 끝으로 발생합니다. 이 층에서 유전 적 변형을 타겟팅하기 위해서확산의 피크, 우리는 배아의 날 (14) 병아리 배아에서 소뇌 조각의 생체 전기를 통해 유전자 조작하는 방법을 개발했다. 이 방법은 생체 내 과립 신경 발달의 여러 중요한 양상을 되풀이되었습니다 소뇌 과립 세포 증식 및 분화에 대한 철저한 이해를 생성하기에 유용 할 것이며, 따라서 소뇌 개발, 질병의 진화.

이 섹션에서는 배아의 날 (14) 병아리에서 슬라이스 전기 및 소뇌의 문화를 사용하여 얻을 수있다 결과의 예를 보여줍니다. 소뇌의 박리는도 1에 도시되어 설정 일렉트로 포 레이션 챔버는도 2에 도시되어있다. 우리가 성공적으로 시험 관내에서 (도 3a)을 그 구조 및 셀룰러 모폴로지를 유지 배양 소뇌 슬라이스, electroporate 및하는 것이 가능하다는 것을 보여준다. 개인 folia을 대상으로 전기 쉽게 (그림 3B) 달성된다. 우리는 성공적으로, II) 소뇌 세포의 기능에 대한 가능한 게놈 영역을 테스트) EGL 세포로 다른 플라스미드의 수를 electroporate와 기자가 자신의 행동 (그림 3C를 관찰하기 위해 구축과 세포 레이블을)이 가능 내가 있음을 보여준다 (그림 3D ) 및 ⅲ) 유전자 조작하는관심 (그림 3E)의 단백질을 misexpressing하여 EGL 세포. 또한, 전기 천공 조각에 대한 약리학 적 조작은 (결과 미도시)이 가능하다. 배양 후에는 면역 분석법 또는 증식 (도 3f)에 따라 추가 조직 분석을 수행 할 수있다. 우리는 calbindin 및 PH3의 면역 염색에 의해 조직 건강 분석을 수행하고 조직의 무결성 문화 후 최소 3 사업부 (그림 4)에 대해 유지되는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 충분히 검토 EGL 유전 병아리 모델 시스템에서 변경 될 수있는 접근 가능하고 쉽게 조작 구조가 이제 있음을 입증한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53421/53421fig1.jpg" /> E14 병아리 배아에서 소뇌의 그림 1. 해부. (A) 달걀에서 병아리 목을 벨과 헤드 INT를 제거얼음 차가운 PBS와 OA 페트리 접시. 아래턱과 눈과 인두 (점선) 뒤에 절개를함으로써 눈을 제거합니다. (B)의 두개골 표면으로부터 피부를 제거한다. (C)를 둘러싸고있는 중간 엽과 연골에서 뇌를 제거 정면과 정수리 뼈와 (D)를 제거합니다. 해부 현미경 (E)는 뇌의 후방 단부에 소뇌의 위치를 식별한다. 중뇌와 후뇌 (점선) 사이에 컷은 소뇌와 복부 후뇌 왼쪽합니다. (F) 후뇌 (점선)에서 소뇌를 분리하는 소뇌의 측면 접합 (꽃자루)에 절개를합니다. 당신이 부착 된 PIA와 전체 그대로 소뇌로 남을 때까지 (G) 소뇌의 복부 측면에서 맥락막 신경총 (별표)를 제거합니다. 조직 chopp와 조각을 준비하기 전에 얼음처럼 차가운 HBSS로 소뇌로 이동어. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53421/53421fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53421/53421fig2.jpg" /> 전기 챔버 (2) 그림 설정합니다. (A) 주문 제작 전기 챔버의 그림. 챔버는 60mm 페트리 접시의 기초에 안전하게 배치 electroporator의 양극으로 구성되어 있습니다. 요리는 전극을 커버하는 HBSS의 약 1 ml에 포함되어 있습니다. 배양 인서트 서킷을 유지하지만, 손에 의해 조작되어, 캐소드의 공간적 타겟팅 있도록 삽입과 전극 사이의 일정한 접촉 전극 쉬어야. 조각 (B) 화상은 전기 천공된다. 조각은 D​​NA / 빠른 그린 솔루션으로 덮여있다. 슬라이스는 욕망으로 일렉트로된다D : 전기 하나 folium 또는 여러 지역을 대상으로 할 수 있습니다. 전기 천공 후 인서트 인큐베이터에서 예열 된 배지와 함께 배양 30mm 페트리 접시에 배치된다. 1. 양극 2. 1 ml의 HBSS 5. 해부 현미경 조직 헬기 6. 개별 조각 빠른 녹색 염료 7. DNA 용액과 음극 (3) 문화 삽입 4. 페트리 접시는. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53421/53421fig2large.jpg" target="_blank">여기를 클릭하십시오이의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다 그림.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53421/53421fig3.jpg" /> 도 3 대표 결과. (A)에서의 여러 위치에 EGL RFP 인코딩 플라스미드의 전기 제어의 저배율 사진. 조직 구조를 유지하고 전기 천공 세포는 분명히 소뇌의 두꺼운 subpial 층에서 볼 수 있습니다. (B)제어 GFP 플라스미드와 타겟의 전기 예. 대상 folium는 별표 (*)로 표시됩니다. 스케일 바 AB 500 μm의 =. (C) Atoh1 인핸서에 의해 구동되는 구조가 GFP 코딩 EGL에 전기 천공 한 예. Atoh1의 발현은 EGL 내에 과립 세포 전구체를 정의한다. 다양한 세포 모폴로지 명확 DIV 3에서 볼 수있는 세포의 행동을 모니터링 할 수있다. (D) GFP 구동 NeuroD1 유전자의 추정 비 보존 된 부호화 요소 (CNE)를 포함하는 구조의 전기 천공 다음 라벨의 예. CNE는 개발이 CNE의 적극적인 역할을 제안 내생 NeuroD1 식을 기준으로 예상되는 세포의 활동을보고합니다. NeuroD1 식 과립 세포 분화의 개시와 상관 관계. (E) 조직이 유전자 NeuroD1 단백질 misexpression 및 과립 세포 behav의 변화에 의해 조작 될 수있는 예iour는 관찰 할 수있다. (F) 일렉트릭 조직이 (GFP 플라스미드를 제어) 고정 및 포스 포의 H3 (PH3)으로 증식하는 세포의 마커 염색 할 수 있습니다 예. 스케일 바 CF = 50 μm의 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53421/53421fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53421/53421fig4.jpg" /> 문화 4. 조직의 무결성 및 확산을 그림. (A - C) 시험 관내 (DIV) 1-3 일째 제어 GFP 플라스미드와 일렉트로 E14 소뇌 조직의 Calbindin 염색. Calbindin 염색은 조직의 무결성은 최소 3 사업부에 대한 문화에서 유지되는 것을 알 수있다. 조롱박 세포층은 병아리 개발 단계에서 단분자막을 형성하지 않고 명확 아래 층을 형성하는 볼과립 세포 (녹색)가있는 EGL. 2 DIV 배양 소뇌 조직에 (D) 포스 포 H3 (PH3) 염색. PH3 염색은 EGL (화살표)에서 볼 수 있지만, 다른 소뇌 지역 (화살촉)에 있습니다. 이 염색 검사 문화의 모든 단계 (1-3 DIV)의 대표입니다. 스케일 바 AD = 50 ㎛는 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53421/53421fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

소뇌 외부 과립 층은 개발 뇌에서 가장 큰 교통 증폭의 사이트입니다. 여기, 우리는 배아의 날 (14) 병아리 배아에서 생체 전기와 소뇌 조각의 문화를 사용하여 확산의 절정에이 계층에 유전자 변형을 대상으로하는 프로토콜을 제시한다.

예 생체 병아리 소뇌 조각의 문화가 공간적으로 Electroporation에 과립 세포 전구체의 표적

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

ex-vivo-culture-chick-cerebellar-slices-spatially-targeted

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

9.2K 조회수.  King's College London.  소뇌 외부 과립 층은 개발 뇌에서 가장 큰 교통 증폭의 사이트입니다. 여기, 우리는 배아의 날 (14) 병아리 배아에서 생체 전기와 소뇌 조각의 문화를 사용하여 확산의 절정에이 계층에 유전자 변형을 대상으로하는 프로토콜을 제시한다. 

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Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons 

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the cerebellar neuronal types (granule cells, Purkinje cells and inhibitory interneurons), granule neurons are by far the most numerous and are the most abundant type of neurons in the mammalian brain. In rodents, cerebellar granule neurons are generated during the first two post-natal weeks from progenitor cells in the outermost layer of the cerebellar cortex, the external granule layer (EGL). The protocol presented here describes techniques to enrich and culture granule neurons and their progenitor cells from post-natal mouse cerebellum. We will describe procedures to obtain cultures of increasing purity3,4, which can be used to study the differentiation of proliferating progenitor cells into granule neurons5,6. Once the progenitor cells differentiate, the cultures also provide a homogenous population of granule neurons for experimental manipulation and characterization of phenomena such as synaptogenesis, glutamate receptor function7, interaction with other purified cerebellar cells8,9 or cell death7.

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons

Here we present a method to isolate and culture cerebellar granule neuron progenitor cells and cerebellar granule neurons from postnatal mouse.

포스트 - 나탈 마우스 소뇌 과립 신경 세포의 전구 세포 뉴런의 분리 및 문화

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the ...

연구

생물학

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors of the diseases. To validate the contribution of a dysfunction of the mutated genes to disease development, the generation of animal models carrying the mutations is one obvious approach. While germline genetically engineered mouse models (GEMMs) are popular biological tools and exhibit reproducible results, it is restricted by time and costs. Meanwhile, non-germline GEMMs often enable exploring gene function in a more feasible manner. Since some brain diseases (e.g., brain tumors) appear to result from somatic but not germline mutations, non-germline chimeric mouse models, in which normal and abnormal cells coexist, could be helpful for disease-relevant analysis. In this study, we report a method for the induction of CRISPR-mediated somatic mutations in the cerebellum. Specifically, we utilized conditional knock-in mice, in which Cas9 and GFP are chronically activated by the CAG (CMV enhancer/chicken &#223;-actin) promoter after Cre-mediated recombination of the genome. The self-designed single-guide RNAs (sgRNAs) and the Cre recombinase sequence, both encoded in a single plasmid construct, were delivered into cerebellar stem/progenitor cells at an embryonic stage using in utero electroporation. Consequently, transfected cells and their daughter cells were labeled with green fluorescent protein (GFP), thus facilitating further phenotypic analyses. Hence, this method is not only showing electroporation-based gene delivery into embryonic cerebellar cells but also proposing a novel quantitative approach to assess CRISPR-mediated loss-of-function phenotypes.

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Conventional loss-of-function studies of genes using knockout animals have often been costly and time-consuming. Electroporation-based CRISPR-mediated somatic mutagenesis is a powerful tool to understand gene functions in vivo. Here, we report a method to analyze knockout phenotypes in proliferating cells of the cerebellum.

CRISPR 중재 손실 함수 분석 소 뇌과 립 세포를 사용 하 여 Utero에서 Electroporation 기반 유전자 이동

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

발생학

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

소뇌 과립 신경 세포의 유전자 조작<em&gt; 체외</em&gt;와<em&gt; 생체</em&gt; 신경 세포의 형태와 마이그레이션을 연구하는

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

신경과학

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

신경 죽음 및 마우스 기본 소 뇌과 립 신경에 변성을 모델링

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Organotypic slice culture is a powerful in vitro model that mimicks in vivo conditions more closely than dissociated primary cell cultures. In early postnatal development, cerebellar Purkinje cells are known to go through a vulnerable period, during which they undergo programmed cell death. Here, we provide a detailed protocol to perform mouse organotypic cerebellar slice culture during this critical time. The slices are further labeled to assess Purkinje cell survival and the efficacy of neuroprotective treatments. This method can be extremely valuable to screen for new neuroactive molecules.

Organotypic slice cultures are a powerful tool to study neurodevelopmental or degenerative/regenerative processes. Here, we describe a protocol that models the neurodevelopmental death of Purkinje cells in mouse cerebellar slice cultures. This method may benefit research in neuroprotective drug discovery.

오르가노티픽 소뇌 슬라이스 배양에서 푸르킨제 세포 생존

Organotypic slice culture is a powerful in vitro model that mimicks in vivo conditions more closely than dissociated primary cell cultures. In early ...

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent cerebellum is an ideal system to track the development and morphogenesis of a single cell type, the cerebellar granule neuron (CGN), across time. Here, in vivo electroporation of granule neuron progenitors in the developing mouse cerebellum was employed to sparsely label cells for subsequent morphological analyses. The efficacy of this technique is demonstrated in its ability to showcase key developmental stages of CGN maturation, with a specific focus on the formation of dendritic claws, which are specialized structures where these cells receive the majority of their synaptic inputs. In addition to providing snapshots of CGN synaptic structures&#160;throughout cerebellar development, this technique can be adapted to genetically manipulate granule neurons in a cell-autonomous manner to study the role of any gene of interest and its effect on CGN morphology, claw development, and synaptogenesis.

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Here we describe a method to visualize synaptogenesis of granule neurons in the mouse cerebellum over the time course of postnatal brain development when these cells refine their synaptic structures and form synapses to integrate themselves into the overall brain circuit.

소뇌 과립 뉴런 형태 및 시냅스 발달을 연구하기 위해 생체 내 출생 후 전기천공법 활용

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent ...

Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In the granule cell precursor (GCP), the primary cilium acts as a pivotal signaling center that orchestrates precursor cell proliferation by modulating the Hh signaling pathway. The investigation of primary cilium-dependent Hh signaling machinery is facilitated by in vitro genetic manipulation of the pathway components to visualize their dynamic localization to the primary cilium. However, transfection of transgenes in the primary cultures of GCPs using the currently known electroporation methods is generally costly and often results in low cell viability and undesirable transfection efficiency. This paper introduces an efficient, cost-effective, and simple electroporation protocol that demonstrates a high transfection efficiency of ~80-90% and optimal cell viability. This is a simple, reproducible, and efficient genetic modification method that is applicable to the study of the primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathway in primary GCP cultures.

Here, we present a reproducible in vitro electroporation protocol for genetic manipulation of primary cerebellar granule cell precursors (GCPs) that is cost-effective, efficient, and viable. Moreover, this protocol also demonstrates a straightforward method for the molecular study of primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathways in primary GCP cells.

과립 세포 전구체에서 1 차적인 실륨 의존적 신호 경로를 연구하는 효율적이고 비용 효율적인 전기 포기법

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In ...

Isolating and Culturing Murine Cerebellar Granular Neuron Progenitors

Source: Bovio, P., et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/56631">Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates the isolation and cultivation of cerebellar neural progenitor cells from a mouse pup&#39;s cerebellum. Cerebellar granule neuron progenitors are isolated and purified through differential adhesion, effectively removing astrocytes. These cultured progenitors subsequently differentiate into cerebellar granule neurons.

Isolating and culturing murine Cerebellar Granular Neuron Progenitors(쥐 소뇌 과립 뉴런 전구 세포)

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1.&#160;Preparations

	Preparations ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

Neuronal Culture Techniques

Primary Neuronal Culture

Ex Vivo Electroporation of Chick Embryo Cerebellar Slices: A Method to Introduce Plasmid DNA Encoding Green Fluorescent Protein to Visualize Granular Cell Development

Source: Hanzel, M. et al.&#160;<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/53421" target="_blank">Ex Vivo&#160;Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2015)
In this video, we perform electroporation of chick embryo cerebellum slices with reporter gene plasmids. The technique facilitates visualization of the development and migration of granule cell precursors to form granular layer.

병아리 배아 소뇌 절편의 생체 외 전기천공법: 과립 세포 발달을 시각화하기 위해 녹색 형광 단백질을 인코딩하는 플라스미드 DNA를 도입하는 방법

Source: Hanzel, M. et al.&#160;Ex Vivo&#160;Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors.&#160;J. ...

암 연구학

Cancers of the Nervous System

In vitro studies

Obtaining Cerebellum Slices from an Embryonic Chick Brain

Source: Hanzel, M., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/53421">Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors.</a> J. Vis. Exp. (2015).
The video demonstrates the preparation of cerebellum slices. It shows a detailed procedure for isolating the cerebellum from a chick embryo. The slices are then prepared from the dissected cerebellum using a tissue chopper for further experimental analysis.

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
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