이 작품은 자연 과학 및 공학 연구 위원회 캐나다 지원 및 건강 연구의 캐나다 학회가 A로 부여

이 프로토콜에 따라 수정 된 절차의 설명 이전 18 , , 24 25 , 26 , 27.이 프로토콜 맥 길 대학에서 동물 관리 위원회에 의해 승인 됩니다.
 1. 실험 준비 참고: 다음 재고 솔루션을 준비 하 고 사용할 때까지 유지 수.
<li>해 부 솔루션 <ol><li>디졸브 3.62 g 염화 나트륨 (NaCl), 염화 칼륨 (KCl), 0.069 g의 나트륨 인산 염의 0.2 g의 <ol>(NaH 2 포 4 &#8729; H 2 O), 1.306 g D-(+)-500 mL의 포도 당 증 류 된 H 2 o. 그런 다음 솔루션에 HEPES 버퍼, 페 놀 레드 솔루션의 450 µ L 및 BSA 분수 V의 20 mL의 12.5 mL를 추가 합니다. PH 7.4 1 N 수산화 나트륨 (NaOH)를 사용 하 여 조정.</li>
		<li>Sterilize 0.22 μ m 필터와 4 ° c.에 게 이 솔루션 10 일 최대 1 주일 동안 안정적으로 유지 됩니다.</li>
	</ol></li> <li>Trypsin <ol><li>0.9% 염화 나트륨에에서 trypsin의 25 g/L의 농도에서 재고 솔루션을 준비. 저장 솔루션-20에 ° c.</li>
	</ol></li> <li>트립 신 억제 물 <ol><li>닭고기 달걀 흰 트립 신 억제 물 100 ml의 1 m m HCl. 저장소의 1 g을 용 해 하 여-20에이 솔루션 10 mg/mL의 농도와 재고를 준비 ° c.</li>
	</ol></li> <li>DNase <ol><li>100mg DNase 1의 10 mg/mL 재고를 생성 하기 위해 살 균 물 10 mL에 녹. 저장 솔루션-20에 ° c.</li>
	</ol></li> <li>MgSO 4 <ol><li>50 mL의 증류수 (H 2 O) 1 M 재고 생성 하에 6.02 g 황산 마그네슘 (MgSO 4)의 추가. 저장 솔루션 4 ° c.</li>
	</ol></li> <li>CaCl 2 <ol><li>0.735 g 염화 칼슘의 분해 (CaCl 2 &#8729; 2 H 2 O) 50 ml 증류수 H 2 O 100 m m의 재고 농도에. 저장 솔루션 4 ° c.</li>
	</ol></li> <li>KCl <ol><li>50 mL에 KCl의 분해 3.7275 g H 2 O 4에 1 M. 저장소 솔루션의 재고 농도에 증류수 ° c.</li>
	</ol></li> <li>D-(+)-포도 당 <ol><li>녹 1.802 g D-(+)-50 mL에 포도 증 류 H 2 O 100 m m의 재고 농도에. 저장 솔루션 4 ° c.</li>
	</ol></li> <li>셀 문화 미디어 <ol><li>세포 배양 기를 다음과 같이 준비: 열의 5 mL 비활성화 소 태아 혈 청을 dialyzed, 200 m m 1.0 M KCL의 L-글루타민, 50 mg/mL Gentamycin 및 1 mL의 100 µ L의 500 µ L 45 mL에 추가 되어야 한다 필터의 소독이 글 &#39; s 최소한의 필수 미디어 (전자-MEM) 1.125 g/l D 보충-소 뇌과 립 신경 문화 미디어의 50 mL를 생성 하는 포도 당. 저장 미디어 4 ° c.</li>
	</ol></li> <li>시 토 신 베타-D-Arabino Furanoside <ol><li>48 mg 10 ml 20 m m의 재고 농도에 성장 매체의 시 토 신 베타-D-arabino furanoside의 분해. 저장 솔루션-20 ° c.</li>
	</ol></li> <li>폴 리-D-리 신 <ol><li>2 mg/mL 폴 리 D-리 신 주식을 생성, 폴 D-리 리의 20 밀리 그램 살 균 H 2 O의 10 mL을 추가. 소재 폴 리 D-라이 신-80 ° c 100 µ L aliquots에서 저장 해야 합니다.</li>
	</ol></li> <li>참고: 다음 솔루션을 해 부 하기 전에 준비 하 고 사용 때까지 4 ° C에서 유지 해야 합니다.</li>
	<li>MgSO 4 Supplemented 해 부 솔루션 <ol><li>재고 MgSO 4 절 개 솔루션의 250 mL의 추가 300 µ L.</li>
	</ol></li> <li>트립 신 해 부 솔루션 <ol><li>재고 trypsin 및 재고 MgSO 4 절 개 솔루션의 10 mL의 12 µ L의 추가 100 µ L.</li>
	</ol></li> <li>트립 신 억제제 솔루션 1 <ol><li>재고 트립 신 억제 물, 재고 DNase 1 250 µ L 해 부 솔루션의 10 mL를 재고 MgSO 4의 12 µ L의 추가 164 µ L.</li>
	</ol></li> <li>트립 신 억제제 솔루션 2 <ol><li>재고 트립 신 억제 물, 재고 DNase 1 750 µ L 해 부 솔루션의 10 mL을 MgSO4 주식의 12 µ L의 추가 1040 µ L.</li>
	</ol></li> <li>CaCl 2 보충 해 부 솔루션 <ol><li>재고 CaCl 2 및 재고 MgSO 4 절 개 솔루션의 10 mL의 25 µ L의 추가 10 µ L.</li>
	</ol></li> <li>폴 리 D-리 신 코팅 문화 요리 <ol><li>코트 문화 요리, 살 균 H 2 o.의 40 mL에 재고 폴 리 D-리의 100 µ L를 희석 35 mm Nunc 문화 요리에 대 한 희석된 폴 리 D-리 솔루션의 2 개 mL를 추가 합니다. 4 잘 플레이트, 300 µ L 희석된 폴 리 D-리의 각 음을 추가할.</li>
		<li>게 발음 하 고 각각을 세척 하기 전에 폴 리 D-리 앉아 1 h 4 mL 또는 600 µ L (대 35 mm 요리 문화 또는 4 잘 플레이트, 각각) 잘 살 균 H 2 o. H 2 O 발음 그리고 요리 공기 1 헤 건조</li>
	</ol></li></ol> 2. 추출 및 격리의 소 뇌 뇌 <ol><li>Decapitate 6-7 일 오래 된 마우스 강아지 잘린이 위를 사용 하 여. 메 마른 조직 문화 후드에는 뇌의 해 부를 수행.</li>
	<li>집게의 쌍을 사용 하 여 머리를 잡고 두뇌를 제거 하 고 그림 1에서 같이 서가 위를 사용 하 여 머리의 앞쪽으로 피부를 통해 잘라. 그럼 오염 위험을 최소화 하기 위해가 위의 새로운 쌍을 사용 하 여 두개골 뼈를 통해 서 잘라. 집게를 사용 하 여 두뇌를 포함 하는 두개골을 제거 하 고 집게 또는 주걱을 사용 하 여 두뇌 애타게.
	<ol><li>전체적으로 뇌를 빼내 촉진을 시 신경을 통해 필요에 따라 잘라.</li>
	</ol></li> <li>뇌 해 부 솔루션 MgSO 4 보충 되는 장소. 솔루션 및 얼음에 두뇌</li>
	<li>다음 제거, 해 부 현미경 뇌, MgSO 4 보충 해 부 솔루션에서 뇌에서 뇌를 해 부하 고 meninges 미세 집게를 사용 하 여 제거. 그것의 복 부 측에 소 뇌 및 맥락 막 신경 총의 제거 확실히.</li>
	<li>MgSO 4 보충 해 부 솔루션의 ~ 1 mL를 포함 하는 35 mm 접시에는 cerebella 풀.</li>
	<li>조직의 작은 조각으로 잘라 고 MgSO 4 버퍼링 해 부 솔루션의 30 mL를 포함 하는 50 mL 튜브로 전송.</li>
</ol> 3. 마우스의 소 뇌과 립 신경은 고립과 Culturing <ol><li>g x 644 및 4에 5 분에 대 한 다진된 대뇌 조직을 포함 하는 50 mL 튜브 원심 ° c.</li>
	<li>제거는 상쾌한 고 트립 신 해 부 솔루션의 10 mL를 추가 합니다. 다음 37에서 15 분 동안 고속에 튜브를 흔들어 ° c.</li>
	<li>트립 신 억제제 솔루션 튜브를 2 분에 대 한 부드럽게 바위 1의 추가 10 mL</li>
	<li>G x 644 및 4에 5 분 동안 튜브 원심 ° c.</li>
	<li>는 상쾌한을 제거 하 고의 2 개 mL를 추가 트립 신 억제제 솔루션 2, 및 다음 이전 15 mL 튜브.</li>
	<li>Triturate 15 mL에 조직 관 솔루션 어두운 될 때까지. 다음 5 분에 대 한 정착 하자</li>
	<li>분명 상쾌한을 제거 하 고 새 튜브 CaCl 2 보충 해 부 솔루션의 1 mL를 포함 하는 상쾌한 전송.</li>
	<li>단계 3.6에서에서 펠 릿을 포함 하는 튜브의 하단에 트립 신 억제제 솔루션 2의 또 다른 mL를 추가 합니다. 다시 triturate 그리고 5 분은 상쾌한을 제거 하 고 상쾌한 단계 3.7 (즉, 반복 단계 3.6-3.7)에서 포함 된 튜브에 추가 대 한 합의. 조직의 대부분 기계적으로 해리 될 때까지이 과정을 반복.</li>
	<li>추가 CaCl 2의 0.3 mL 보충 상쾌한의 모든 mL에 대 한 표면에 뜨는 컬렉션에 해 부 솔루션.</li>
	<li>튜브의 내용을 믹스 하 고 644 x g.에서 5 분 동안 원심</li>
	<li>제거는 상쾌한 10 mL 신선한 매체의 펠 릿을 추가 하 고 혼합.</li>
	<li>셀 다음 계산 하 고 1.5 x 10 6 셀/mL의 농도를 희석 수 있습니다. 일반적으로 10 백만 셀 trypsinization 시간 및 해 부의 효율성에 따라 각 해 부 두뇌에서 예상 된다 note 하시기 바랍니다. 이전 만든된 폴 리 D-리 신 판에 셀 플레이트. 4-잘 접시, 접시 0.5 mL, 잘 당 10 5 셀 x 7.5를 주는. 35 mm 요리 접시 4 mL 접시 당 6 x 10 6 세포 주는.</li>
	<li>후 24 h, glial 오염 줄이기 위해 접시를 시 토 신-β-arabino furanoside (아크)를 추가 합니다. 미디어의 각 mL 20 m m 아크의 0.5 µ L가 필요 합니다. 아크의 추가 미디어의 변화를 필요 하지 않습니다. 셀 하는 경우 7-8 일에 대 한 유지, 3 일에이 치료를 반복.</li>
	<li>37 ° C에서 5% CO 2 배양 기에서 문화를 유지 하 고 100 m m 포도 당 매 2 일 지난 5 일 미디어의 모든 2 mL에 대 한 문화에 추가의 100 µ L를 피드. 완전 한 미디어 변경 필요 하지 않습니다.</li>
</ol> 4. Lentivirus 포장, 정화와 적정 참고: 포장, 농도, 정화 및 lentivirus의 적정에 대 한 프로토콜 이전 키트의 사용 없이 자세히 기술 되었다 28, 교류 cytometry 29 등 적정에 대 한 대체 메서드를 포함 하 여. 여기에 우리가 짧게 제시 신경 부상 빠른 바이러스 정화 솔루션 및 정량 lentiviral 적정 키트를 사용 하 여 공부 하기 lentivirus의 생산에 대 한 우리의 실험실에서 사용 하는 프로토콜.
<li>Dulbecco와 10 cm 문화 요리에서 접시 Hek293T 셀 <ol>&#39; s 수정이 글 &#39; s 최소 필수 매체 (DMEM) 10% 보충 FBS. 높은 바이러스 titer를 얻기 위해 각 transfection에 대 한 Hek293T 셀의 적어도 5 접시를 성장. Transfection 셀 당일 확인은 70% 합칠. 변경 미디어 transfection 전에 3 시간.</li>
	<li>각 transfection에 대 한 두 개의 튜브를 준비. 튜브에 1 1.5 mL 혈 청 MEM 감소 미디어와 transfection 시 약의 41 µ L 섞어 잘 추가 합니다. 튜브 2, MEM 감소 혈 청 미디어의 1.5 mL 및 전송 플라스 미드의 6 µ g, pCMV-dR8.2 벡터 (포장 플라스 미드)의 6 µ g, 3 µ g pCMV VSV G 벡터 (봉투 플라스 미드), 그리고 p3000 증강 시 약 (lipofectamine 함께 제공 됨)의 35 µ L를 추가 합니다. 잘, 그리고 결합 튜브 1과 2, 소용돌이 혼합 하 고 15 분에 대 한 품 어</li>
	<li>는 Hek293T 격판덮개에서 미디어의 50%를 제거 하 고 세포에 DNA 지질 단지를 추가. 37 ° C, 5% CO 2에서 6 h에 품 어. 미디어를 제거 하 고 신선한 DMEM의 5 mL을 바꿉니다, 밤새 품 어.</li>
	<li>에서 24 h 후 transfection, 각 접시에서 바이러스 상쾌한의 첫 번째 일괄 처리를 수집 합니다. 4 ° C에서 바이러스 성 미디어를 유지 하 고 Hek293T 세포의 각 격판덮개에 신선한 미디어의 5 mL을 추가. 밤새 품 어.</li>
	<li>48 h 후 transfection 바이러스 상쾌한의 두 번째 배치를 수집 하 고 첫 번째 일괄 처리와 결합 하 고, 결합 된 바이러스 상쾌한 600 x g.에서 10 분 원심</li>
	<li>는 상쾌한 45 µ m 기 공 크기와 필터를 통해 필터링.</li>
	<li>빠른 바이러스 정화 솔루션을 사용 하 여 바이러스를 정화. 바이러스 성 상쾌한의 모든 45 ml lentiviral 바인딩 솔루션, 믹스, 그리고 분리기에서 10 분의 5 mL을 추가 &#62; g 및 4 x 5000 ° c.</li>
	<li>상쾌한을 신중 하 게 제거는 펠 렛을 방해를 하지.</li>
	<li>매체의 20-40 µ L을 추가 하 고 다시는 펠 릿을 일시 중단. 약 수와 스토어-80 ° c.</li>
	<li>Lentiviral titer, 정량 lentiviral 적정 키트를 얻기 위해 사용 됩니다. PBS의 500 µ L에서 순화 된 바이러스의 2 µ L를 희석. 바이러스 세포의 용 해 버퍼 (키트에 제공 되는)의 18 µ L를 희석된 바이러스의 2 µ L을 추가.</li>
	<li>다른 3을 설정 RT-q-PCR 반응에 triplicates 그리고 그들, 바이러스 lysate, 긍정적인 컨트롤 1 (STD1), 및 긍정적인 컨트롤 2 (STD2). 각 반응에 대 한 추가, 2 x 정량 MasterMix의 2.5 µ L의 12.5 µ L 바이러스 성 lysate 또는 STD1 (키트에 제공) 또는 STD2 (키트에 제공), 그리고 시 약-믹스 (키트에 제공 되는) 0.2 mL PCR 튜브에 10 µ L.</li>
	<li>PCR 프로그램을 다음과 같이 설정: 반전 녹음 방송, 효소 활성화, 15의 40 주기를 위한 95 ° C에서 10 분에 대 한 42 ° C에서 20 분 변성 및 어 닐 링/확장을 위한 60 ° C에서 1 분 95 ° C에서 s.</li>
	<li>계산이 수식을 사용 하 여 바이러스 titer: 
	Lysate의 바이러스 titer = 5 × 10 7 / 2 3(Ctx-Ct1)/(Ct2-Ct1). 
	Ctx = 알 수 없는 샘플, Ct1의 평균 Ct 값 = STD1, Ct2의 평균 값 = STD2의 평균 값. 
	참고: CGNs는 lentiviruses로 불리고 또는 공부 되 고 상해의 모드 adenoviruses 감염 최고의 될 수 있습니다. 도금 시에 2-3 셀 문화 솔루션의 나는 lentiviruses의 추가 NMDA 유도 신호 문화 제 7 일에 공부 하는 데 사용 됩니다. 80% 이상에서이 결과 변환 ( 그림 2) 이러한 뉴런의 생 화 확 적인 분석을 추구 하 고. (나 50)에서 문화와 NMDA 유도 하루 7-8에서 신호를 공부 하 고 5 일에 adenoviruses의 추가 영상 같은 다른 기술을 사용 됩니다. 10%가 하에이 치료 결과 신경 세포 이미징 및 단백질의 공동 지역화에 이상적의 감염. Adenoviruses 도금 시 DNA 손상 유도 된 세포 죽음을 공부를 과산화 수소의 추가 의해 하루 2-3 또는 산화 긴장에서 camptothecin의 추가 의해 사용할 수 있습니다. 관심사의 유전자에 형광 단백질 (GFP, RFP, CFP 또는 YFP)의 존재는 백분율 변환 및 잠재적인 독성 예측에 사용할 수 있습니다. 권장된 나 우리 볼 최소한의 독성과 최대 변환 ( 그림 3).</li>
</ol> 5. 신경 상해 모델링 <ol>NMDA 유도 <li>유도 신경 excitotoxicity, 체 외에 7 일, 1 헤 없이 병렬 문화에서 바른된 매체 바꿉니다 모든 매체에 대 한 100 μ M NMDA와 10 µ M 글리신 CGNs 치료 치료입니다. 이 농도 24 h 게시물 치료 ( 그림 3C)에서 50% 세포 죽음에서 발생합니다. 미토 콘 드 리아 조각화는 분명 6-8 h 게시물 치료 (참조 Jahani Asl 외. 26 , 27).</li> <li>신경 치료 선생님-유도 된 세포 죽음 (산화 스트레스)을 유도 하는 것75-100 µ M 과산화 수소 (H 2 O 2)와 스위치를 ns H 2 O 2에 5 분 노출 다음 병렬 문화에서 미디어 조절. 참고, H 2 O 2의 불안정으로 인해 문화 치료의 24 h 다음에 50-70% 세포 죽음을 유도 하는 수준으로 농도 최적화.</li>
	<li>유도 DNA를 손상 유도 된 세포 죽음, 10 µ M camptothecin와 CGNs를 치료. 이 농도 24 h. 미토 콘 드 리아 조각화의 50% 세포 죽음 보다 더 유도 및이 농도 (참조 Jahani Asl 외에 camptothecin의 추가 후 2-3 h 발생 초기 apoptotic 신호 18)</li> <li>낮은 K + 유도 신경 apoptosis CGNs에서 유도, 25 m m K + + 5 m K m 낮은 칼륨 미디어 7 일에서 체 외에 다음을 포함 하는 미디어 변경.</li></ol>

<ol>
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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+depolarization+in+the+survival+and+differentiation+of+cerebellar+granule+cells+in+culture.">The role of depolarization in the survival and differentiation of cerebellar granule cells in culture.</a> J Neurosci. 7 (7), 2203-2213 (1987).</li><li>Miller, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bax+deletion+further+orders+the+cell+death+pathway+in+cerebellar+granule+cells+and+suggests+a+caspase-independent+pathway+to+cell+death.">Bax deletion further orders the cell death pathway in cerebellar granule cells and suggests a caspase-independent pathway to cell death.</a> J Cell Biol. 139 (1), 205-217 (1997).</li><li>Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+cerebellar+granule+neurons+undergoing+apoptosis+by+potassium/serum+deprivation.">Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation.</a> Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).</li><li>Piccioli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+nuclear+factor-kappaB+activation+induces+apoptosis+in+cerebellar+granule+cells.">Inhibition of nuclear factor-kappaB activation induces apoptosis in cerebellar granule cells.</a> J Neurosci Res. 66 (6), 1064-1073 (2001).</li><li>D'Mello, S. R., Galli, C., Ciotti, T., Calissano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+apoptosis+in+cerebellar+granule+neurons+by+low+potassium:+inhibition+of+death+by+insulin-like+growth+factor+I+and+cAMP.">Induction of apoptosis in cerebellar granule neurons by low potassium: inhibition of death by insulin-like growth factor I and cAMP.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (23), 10989-10993 (1993).</li><li>Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+release+of+glutamate+from+cerebellar+granule+cells+differentiating+in+culture.">Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7919-7923 (1982).</li><li>Messer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maintenance+and+identification+of+mouse+cerebellar+granule+cells+in+monolayer+culture.">The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture.</a> Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).</li><li>Jahani-Asl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CDK5+phosphorylates+DRP1+and+drives+mitochondrial+defects+in+NMDA-induced+neuronal+death.">CDK5 phosphorylates DRP1 and drives mitochondrial defects in NMDA-induced neuronal death.</a> Hum Mol Genet. 24 (16), 4573-4583 (2015).</li><li>Jahani-Asl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+inner+membrane+GTPase,+optic+atrophy+1+(Opa1),+restores+mitochondrial+morphology+and+promotes+neuronal+survival+following+excitotoxicity.">The mitochondrial inner membrane GTPase, optic atrophy 1 (Opa1), restores mitochondrial morphology and promotes neuronal survival following excitotoxicity.</a> J Biol Chem. 286 (6), 4772-4782 (2011).</li><li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system.">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J Vis Exp. (63), e4031 (2012).</li><li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+production.">Lentivirus production.</a> J Vis Exp. (32), (2009).</li><li>Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+post-natal+mouse+cerebellar+granule+neuron+progenitor+cells+and+neurons.">Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons.</a> J Vis Exp. (23), (2009).</li><li>Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+cerebellar+granule+neurons+in+vitro+and+in+vivo+to+study+neuronal+morphology+and+migration.">Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li></ol>

저자는 공개 없다.

여기 우리는 기본 마우스 소 뇌과 립 신경 (CGNs), 손실 및 기능 연구의 이득의 경작 그리고 세포 죽음의 다른 메커니즘을 모델링에 대 한 간단한 방법을 제공 합니다. 여러 가지 요인을 가까운 모니터링을 요구 하는이 절차를 사용 하 여 결과의 재현성을 영향을 줍니다. 문화 문화, 문화의 합류에에서 glial 세포의 제거를 포함 하 고 건강 한 세포를 유지의 순도 포함 됩니다. 이러한 요인에 변화를 도입 결과 바이어스 하 고 재현성을 도전 수 있습니다. 아래는 부정적인 결과 영향을 주는 요소를 최소화 하는 방법에 설명 합니다.
CGNs 문화에서 glial 세포를 제거 하 고 순수한 신경 모집단 확립, 시 토 신-β-arabino furanoside (아크), DNA 합성을 억제 함으로써 증식 세포를 죽이고 pyrimidine antimetabolite의 10 µ M을 사용 합니다. 여전히 인구 glial 세포 존재의 경우에, 아크의 농도 15 µ M를 늘릴 수 있습니다. 이것은 또한 많은 종속입니다. 또한, 최대 7-8 일 동안 유지 되는 문화에 대 한 두 번째 아크 치료 3 일에 수행할 수 있습니다. 하는 순수한 신경 인구 세포 죽음을 방지, 조직 trypsinization 다음 조각으로 절단 전에 소 뇌에서 모든 meninges 껍질 중요 하다. 이 시간 (안 이상 소 뇌 당 7-10 분)의 비교적 짧은 기간에 행해져야 한다. 건강에 해로운 문화 및 최후 세포 죽음에 신경 문화 결과에서 meninges의 존재. 치료 전에 뉴런의 죽음에 발생할 수 있는 또 다른 요인은 trypsinization 시간 이다. 셀-trypsinized는 중요 하다.입니다. 다른 한편으로, 아래 trypsinization 그들을 손상 하거나 낮은 수율 결과 세포의 기계적 분리를 더 필요 합니다. 따라서, trypsinization 시간 최적화를 필요로 하 고 많은 종속.
고려해 야 할 다음 요소 사용 시 셀의 합류입니다. 다른 confluency는 결과에 변화를 생성할 수 있습니다. 이 실험에서 판독에 따라 특히 중요 하다. 낮은 합류 상태와 신경 2-3 일 후 덩어리를 시작 합니다. 너무 낮거나 너무 높은 합류 상태는 뉴런의 신호를 손상 한다. 그것은 정확한 도금에 대 한 라이브 셀의 수를 계산 하는 것이 중요입니다.
CGN 문화의 다른 방법 설명, 특히 기본적인 자란 절차 보고 Papain 분리 시스템을 사용 하 여 키트 30 도 후 자란으로 절차와 CGN의 조작으로 신경 마이그레이션을 공부 하기 위하여 고 형태 31 이 외 에 의해 제시 하는 프로토콜 Papain 분리 시스템 키트의 사용을 설명합니다. 그들은 고립 된 CGNs의 순도 높이기 위해 두 가지 방법을 추천: Percoll 그라데이션 분리를 통해 셀을 실행으로 미리 20 분 폴 리-D-리 접시에 도금. 두 방법 모두 glial 오염 물질에서 CGNs의 분리에서 원조 하는. 이 아크 혼자 치료 되지 않을 경우 순수한 신경 문화에 대 한 풍부 하 것이 좋습니다. 또한,이 사용 하 여 4-6 일 오래 된 마우스 새끼,이 신경 감 별 법;을 조사 하기 위한 효과적인 모델을 제공 하는 동안 우리는 신경 상해의 연구에 더 적합은 6-7 일 오래 된 마우스 새끼에서 CGNs를 사용 하 여 찾을. Holubowska 외는 게 칼슘 인산 염 방법을 생체 외에서 그리고 electroporation 비보를 사용 하 여 포스트 mitotic 소 뇌 신경 세포의 transfection에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. 이들은 하나의 신경 추적 될 수 있다 신경의 유전 조작 위한 우수한 방법 이다입니다. 칼슘 인산 염 방법을 사용 하 여 transfection 효율 0.1-5에서 다를 수 있습니다 %. 따라서, 우리 생 화 확 적인 분석 등 칩 Seq 분석, 공동-immunoprecipitation, immunoblotting, lentiviruses의 사용입니다 찾을 80% 이상에 더 적절 한 변환 때 도금 시간에 불리고.

소 뇌과 립 신경 (CGNs) 문화에서 잘 성격을 나타낸다 고 신경 죽음 및 개발 1,2,3,,45, 연구는 효과적인 모델 역임 6. CGN 문화에서 체 외에 있는 N-메 틸-D-aspartate (NMDA) 수용 체의 초기 식 게 NMDA 유도 신호를 공부 하는 매력적인 모델. 함께 막 도발은 NMDA와 함께 이러한 수용 체의 활성화 생리 적 신경 활동 자극, 모델링 하는 데 사용 되 고 시 냅 스가 소성 7,8의 메커니즘으로 연구에 대 한 허용 했다. 그와 반대로, NMDA ligand에 의해 이러한 수용 체의 과잉 자극 excitotoxicity, 급성 뇌 손상 및 신경 퇴행 성 질환 9신경 손실의 주요 메커니즘을 모델링 하는 데 사용할 수 있습니다. 급성 신경 상해 본 excitotoxicity의 유도 대 한 메커니즘 중 하나 감소 산소와 ATP 기아 통해 이다. 그러면 막 도발은 고 조미료의 높은 수준의 시 냅 스에서 출시. 과도 한 Ca2 + 유입이 수용이 체를 통해 여러 경로 포함 하 여 캘리포니아2 +차례 차례로 활성화에 높은 조미료 결과 NMDA 수용 체의 후속 overstimulation-phospholipases, 프로 테아 제 활성화 및 endonucleases, 중요 한 세포 구성 요소와 세포 죽음의 통제 저하 발생 또한, 높은 세포내 캘리포니아2 + 리드 생성 산소 자유 래 디 칼 및 미토 콘 드리 아 손상 10,11.
NMDA 유발 신경 excitotoxicity 다음 신경 손실의 대부분은 칼슘 유입 때문 이며 Bax/박 독립,이 모델에서 세포 죽음의 다른 메커니즘을 제외할 수 없습니다. 회 저 성 둘 다의 외관 그리고 apoptotic 세포 죽음 excitotoxicity 때문 반응성 산소 종 (선생님)와 높은 세포내 캘리포니아2 + 레벨 12로 인 한 DNA 손상의 발생으로 인해 부분적으로 같은. DNA 손상 신경 죽음 apoptotic 세포 죽음, chromatin 대중과 apoptotic 시체의 모습 등의 연관 되는 apoptotic 메커니즘을 통해 결과. Apoptosis의 감 응 작용은 미토 콘 드리 아에서 시 토 크롬 c의 출시를 통해 중재 그리고 Bax/박 oligomerization 13에 종속 되도록 표시 되었습니다. Bax/박 oligomerization 시 토 크롬 c 출시 및 프로 apoptotic 레 귤 레이 터로 가벼운 허 혈 성 부상 14본의 활성화의 결과로 외부 미토 콘 드리 아 막의 기 공 형성을 촉진 합니다.
선생님의 세대 신경 기능 15큰 산소 요구와 결합 하는 항 산화 물질의 낮은 생 수준 때문에 뇌에서 중요 한 문제입니다. 허 혈 성 이벤트에 노출 되 면 산화 질소 synthase upregulated, 질소 산화물을 생성 하 고 반응성 산소 종 14증가입니다. 산소 래 디 칼의 농도 증가 DNA 손상 하 고 간접적으로 에너지 부족을 일으킬 수 있습니다. 높은 수준의 DNA 이중 가닥 나누기의 폴 리 ADP ribose 중 합 효소-1 (PARP-1), 진 핵 chromatin-바인딩 단백질 catalyzing 나드+, 통합 하는 과정에서에서 ADP ribose 단위 전송에 대 한 책임의 활성화에 의해 조치를 취했고합니다 DNA 수리 16. 그러나, 산화 스트레스로 인해 과도 한 손상, PARP 1 활성화 하면 증가 드레인으로 인해 에너지 기아 나드+, 산화 인 산화를 통해 ATP 생산을 위한 필요한 기판에. 궁극적으로, 산화 스트레스는 미토 콘 드리 아 시 토 크롬 c 출시로 이어지는 Bax/박 종속 방식으로 apoptosis를 일으킬 것 이다 그리고 유도 미토 콘 드 리아 CGNs 17개장을 보여줘 왔다.
마지막으로, 염화 칼륨 (KCl) CGN 문화에서의 농도에 변화 낮은 칼륨/도발은 중재 apoptosis 18,,1920를 사용할 수 있습니다. K+의 낮은 수준에 드러낼 때, CGNs 받아야 뚜렷한 생리 적 변화, 미토 콘 드리 아 호흡의 분해, 세포질 수요 감소 21에 감소 레벨의 감소에 있는 결과 핵 요인-κB (NFκB) 염증, 시 냅 스 전송 22등의 활동을 조절. 이 모형은 신경 발달 동안에 세포 죽음의 연구에 대 한 특정 관심의 이다. 낮은 K+ 환경 더 밀접 하 게 유사한 생리 적 조건, 고 신경 개발 23중 세포 죽음의.
요약 하자면, CGNs 신경 죽음 및 변성의 기본 분자 메커니즘을 조사 하는 오랜 모델을 제공 합니다. 다음 프로토콜 고립과 CGNs, 식 또는 바이러스 및 신경 상해 및 변성을 대표 하는 다른 메커니즘을 통해 신경 죽음의 유도 사용 하 여 특정 유전 통로의 억압의 경작을 허용할 것 이다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="934">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">qPCR lentivitral titration kit&#160;</td>
			<td style="width:215px;">ABM</td>
			<td style="width:219px;">#LV900</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">speedy virus purification solution&#160;</td>
			<td style="width:215px;">ABM</td>
			<td>#LV999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pCMV-dR8.2</td>
			<td style="width:215px;">Addgene</td>
			<td>#8455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pCMV-VS.VG</td>
			<td style="width:215px;">Addgene</td>
			<td>#8454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Distilled water&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Gibco</td>
			<td style="width:219px;">#15230162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 mM L-Glutamine&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Gibco</td>
			<td style="width:219px;">#25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 mm Nunc culture dishes</td>
			<td style="width:215px;">Gibco</td>
			<td style="width:219px;">#174913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PowerUP SYBR green master mix</td>
			<td>life technologies</td>
			<td style="width:219px;">#A25742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">BSA V Solution</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#A-8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">CaCl2 &#8226; 2H2O</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#C-7902&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Camptothecin</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#C-9911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Chicken Egg White Trypsin Inhibitor&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#10109878001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Cytosine beta-D-Arabino Furanoside</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#C-1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">D-(+)-Glucose&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#G-7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DNase1&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Eagle-minimal essential medium</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#M-2279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glycine</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#G-5417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Heat inactivated dialyzed Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#F-0392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Hepes Buffer&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#H-0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#216763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">50 mg/mL Gentamycin&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#G-1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">MgSO4&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#M-2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">N-Methyl-D-aspartic acid</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#M-3262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Phenol Red Solution&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#P-0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Trypsin&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#T-4549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 3000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3000-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">p3000 enhancer reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3000-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl&#160;</td>
			<td style="width:215px;">VWR</td>
			<td style="width:219px;">#CABDH9258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl&#160;</td>
			<td style="width:215px;">VWR</td>
			<td style="width:219px;">#CABDH9286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NaH2PO4H2O&#160;</td>
			<td style="width:215px;">VWR</td>
			<td style="width:219px;">#CABDH9298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly D-lysine&#160;</td>
			<td style="width:215px;">VWR</td>
			<td style="width:219px;">#89134-858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">DMEM</td>
			<td style="width:215px;">Wisent</td>
			<td style="width:219px;">#319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">FBS</td>
			<td style="width:215px;">Wisent</td>
			<td style="width:219px;">#080-450</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling neuronal death and degeneration in mouse primary cerebellar granule neurons

소 뇌과 립 신경 (CGNs)는 소 뇌에 풍부한 균질 인구를 형성 일반적으로 사용 되 신경 모델입니다. 그들의 출생 개발, 풍부, 및 접근에 비추어 CGNs는 신경 프로세스, 신경 개발, 생리 적 신경 활동 자극, 신경 마이그레이션 등을 공부 하는 이상적인 모델입니다. 또한, CGN 문화 excitotoxicity 등 apoptosis는 세포 죽음의 다른 모드를 공부에 대 한 훌륭한 모델을 제공 합니다. 문화에 주, CGNs N-메 틸-D-aspartate (NMDA) 수용 체, 신경 건강 및 질병에 많은 중요 한 기능을 가진 특정 ionotropic 글루타민 산 염 수용 체를 표현 한다. 함께 설치류 기본 CGN 문화에 막 도발은 NMDA의 낮은 농도의 추가 동안 NMDA의 높은 농도의 추가 모델을 채택 될 수 있다 생리 적 신경 활동 자극을 모델링 하는 데 사용 되었습니다. excitotoxic 신경 부상입니다. 여기, 격리의 방법 및 6 주 오래 된 강아지 adenoviruses와 lentiviruses CGNs의 유전자 조작에서 CGNs의 배양 설명 되어 있습니다. 우리는 또한 NMDA 유도 excitotoxicity, 낮은 칼륨-유도 된 apoptosis, 산화 스트레스와 DNA 손상 이러한 뉴런의 변환에 따라 자극 하는 방법에 현재 최적화 된 프로토콜.

그림 1A-B에서 보듯이 조심 해 부와 그대로 뇌 최소한의 손상으로 제거 한다. 노력 제거 하는 동안 두뇌에 손상을 최소화, 특히 소 뇌 손상에 취해야 한다. 더 어려운 식별 하 고 meninges의 완전 한 제거에 대 한 소 뇌 손상 그리고 신경 문화의 오염의 가능성을 증가. Meninges 제거 되었습니다 일단 소 뇌 그림 1C 에서 보듯이 나머지 조직에서 해 부 고 분리에 대 한 준비.
도금, 이전 CGNs lentivirus로 불리고 하거나 그림 2에 설명 된 대로 아 데 노 바이러스에 감염 될 수 있습니다. 우리 lentivirus (그림 3)에 대 한 도금의 하루에 최대의 효율성과 나 50 아 데 노 바이러스, 감염에 대 한 최소한의 독성과 2-3의 나를 찾아.
건강 한 CGN 문화 7 DIV에 불리고 그림 3A에서 제공 됩니다. 명과의 다 수 문화에 남아 있으면 아크의 농도 순수한 신경 인구를 위해 늘릴 수 있습니다. 또한 glial 세포는 바이러스에 신경 보다는 더 쉽게 차지 하 고 5 일에는 transductions을 수행 하는 중요 한 되는. 신경 세포의 죽음을 겪고의 존재 그림 3C에서 보듯이 pyknotic 핵의 형성에 의해 평가 될 수 있다. 모든 농도 NMDA의 H2O2, Camptothecin 최적화 됩니다 24 h 후 50% 세포 죽음을 유도 하. 미토 콘 드 리아 조각화 같은 신경 손실 앞 다른 초기 이벤트를 공부에 대 한 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55871/55871fig1.jpg"> 
그림 1: 쥐의 뇌와 소 뇌의 해 부의 제거. (A) 집게의 쌍을 사용 하 여 6-7 일 오래 된 마우스의 두뇌를 추출 하 고 머리를 잡고 서가 위를 사용 하 여 점선 따라 anteriorly 피부를 잘라. 피부 및 결합 조직만 잘라 조심, 너무 깊은 절 개는 두개골 펑크 두뇌를 손상 수 있습니다. 이 세 절, 중간 선, 두 측면, 커브를 따라 똑바로 푸시된 피부에 대 한 허용 두개골을 드러내는 다시. 일단 노출, 두개골은가 위, 끝으로 관통 고 anteriorly 잘라 수 있습니다. 큰 해야 합니다 주의 하지를 식별 및 제거 meninges의 소 뇌 손상. 컷 한 번, 집게 한 쌍의 집게 또는 주걱을 사용 하 여 멋진 해 부 솔루션으로 다음 밖으로 조롱 수 있습니다 뇌를 노출 두개골을 다시 껍질을 사용할 수 있습니다. 뇌를 제거 하기 위해 시 신경 절단 될 필요가 있습니다. (B) 두개골에서 분리, meninges 잘 밀고 집게의 쌍을 사용 하 여 소 뇌에서 제거 되어야 합니다. 잘 밀고 집게, 소 뇌의 쌍 나머지 조직에서 해 부하 고 meninges의 완전 한 제거를 보장 하기 위해 검사에 사용을 (C) <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55871/55871fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55871/55871fig2.jpg"> 
그림 2: 소 뇌과 립 신경에 있는 신경 상해 모델링. 하루 6-7 마우스 절차에 따라 단일 셀에 해리는에서 분리 된 cerebella 파트 3에에서 제시. 분리, 다음 셀 계산 됩니다 및 35 m m 요리 문화 미디어 1.5 x 106 cells/mL.For 생성 하는 볼륨에 resuspended, 4 mL는 도금 접시 당 6 x 106 세포 주는. 슬라이드 이미징에 대 한 0.5 mL 도금, 7.5 105 셀/잘 x 주는. CGNs 다음 lentivirus로 불리고 또는 아 데 노 바이러스에 감염 수 있습니다. 아 데 노 바이러스를 사용 하 여 90% 이상의 transfection 효율 제공 (0 일에서 생체 외에서 (DIV)) 도금의 날 및 산화 스트레스와 DNA 손상을 통해 신경 상해의 연구에 대 한 수 있습니다. 10 µ M camptothecin (CPT)의 추가 75-100 µ M (H2O2) 과산화 수소 산화 스트레스를 유발 한다 하는 동안 DNA 손상을 유발 한다. H2O2 의 농도 24 시간 후 50% 세포 죽음을 유도 하기 위해 낙관 되어야 한다. 5 DIV에서 adenoviruses 감염 10% 미만의 낮은 변환 효율을 제공 합니다. 7 DIV에 NMDA 수용 체, 문화에 풍성 하 게 하는 경우 100 μ M NMDA와 10 µ M 글리신 excitotoxicity 유도 신경 치료 수 있습니다. 이것은 후속 이미징 분석 또는 추적 하나의 신경에 대 하 이상적 이다. 마지막으로, 충분히 높은 변환 효율을 제공 0 DIV, 100 μ M NMDA와 7 DIV에 10 µ M 글리신 치료 뒤에 lentivirus와 시험 (&#62; 80%) 문화, 시퀀싱, 칩 등의 생 화 확 적인 분석에 대 한 허용 단백질 표정, 그리고 라이브/죽은 분석 실험을 수행. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55871/55871fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55871/55871fig3v2.jpg"> 
그림 3: 소 뇌과 립 신경. (A) 뉴런 도금의 때에 3의 나에서 RFP에 대 한 lentiviruses로 불리고 고정 그리고 7 일에 생체 외에서 얼룩이. RFP 신호를 MAP2, Hoechst의 colocalization는 lentiviruses로 불리고 완전히 건강 한 뉴런을 보여 주기 위해 표시 됩니다. (B)는 이미지 신경 독성을 측정 하기 위해 다른 나 감염의 라이브 죽은 분석 결과 분석을 나타냅니다. CGNs 25와 50 사이 나에서 LacZ 표현 하는 아 데 노 바이러스 감염 최소한의 독성을 유지 하면서 최대한의 효율성에 대 한 수 있습니다. 제어에 비해 세포 생존에 1% 차이 볼 때이 나가에 감염 보다는 더 적은. (C) Hoechst NMDA 세포 죽음을 유도 하 치료 제어 CGNs와 CGNs의 얼룩. NMDA 치료 pyknotic 핵의 형성 note 이 세포의 죽음, 그리고 문화 24 100 μ M NMDA와 함께 치료 후 h 및 10 µ M의 약 50%에서 볼 수 있습니다 글리신. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55871/55871fig3v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

이 프로토콜 분리 하 고 기본 마우스 뇌과 립 신경 (CGNs) 6-7 주 오래 된 강아지, 손실에 대 한 CGNs의 효율적인 변환 및 기능 연구의 이득에서에서 경작 하 고 NMDA 유발 신경 excitotoxicity, 모델링에 대 한 간단한 방법을 설명 합니다. 낮은 칼륨-유도 된 세포 죽음, DNA 손상 및 산화 스트레스 같은 문화 모델을 사용 하 여

신경 죽음 및 마우스 기본 소 뇌과 립 신경에 변성을 모델링

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.0K 조회수.  Jewish General Hospital. 이 프로토콜 분리 하 고 기본 마우스 뇌과 립 신경 (CGNs) 6-7 주 오래 된 강아지, 손실에 대 한 CGNs의 효율적인 변환 및 기능 연구의 이득에서에서 경작 하 고 NMDA 유발 신경 excitotoxicity, 모델링에 대 한 간단한 방법을 설명 합니다. 낮은 칼륨-유도 된 세포 죽음, DNA 손상 및 산화 스트레스 같은 문화 모델을 사용 하 여

비디오: Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

utero에서 Electroporation은 두피 뉴런의 하위 집합의 유전자 기능을 학습에 대한 기본의 연결을 문화 뒤에

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

연구

신경과학

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection 및 배아 마우스 Hippocampal과 두피 뉴런의 주요 문화

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

FM 염료를 사용하여 양식 소뇌 과립 뉴런에서 시냅틱 소포 풀 보충의 정량 분석

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

소뇌 과립 신경 세포의 유전자 조작<em&gt; 체외</em&gt;와<em&gt; 생체</em&gt; 신경 세포의 형태와 마이그레이션을 연구하는

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

마우스 도파민 뉴런의 차 문화

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

공 초점 Macroscopy을 사용하여 출생 후의 소뇌 과립 세포 이동의 생체 이미징

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the co-existence of glial cells and neurons in CGN culture might lead to biases in the accurate assessment of neuronal viability. Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining has been used to measure cell viability by simultaneously evaluating the viable and dead cells. We used FDA-PI double staining to improve the sensitivities of the colorimetric assays and to evaluate neuronal viability in CGNs. Furthermore, we added blue fluorescent DNA stains (e.g., Hoechst) to improve the accuracy. This protocol describes how to improve the accuracy of assessment of neuronal viability by using these methods in CGN culture. Using this protocol, the number of glial cells can be excluded by using fluorescence microscopy. A similar strategy can be applied to distinguish the unwanted glial cells from neurons in various mixed cell cultures, such as primary cortical culture and hippocampal culture.

This protocol describes how to accurately measure neuronal viability using Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining in cultured cerebellar granule neurons, a primary neuronal culture used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research.

소뇌 과립 신경 세포 배양에서 Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide 이중 염색을 이용한 신경 생존력의 평가

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, Charcot-Marie-Tooth disease, and spinal muscular atrophy, which are all associated with muscular atrophy. Primary cultures of spinal MNs have been used widely to demonstrate the involvement of specific genes in such diseases and characterize the cellular consequences of their mutations. This protocol models a primary MN culture derived from the seminal work of Henderson and colleagues more than twenty years ago. First, we detail a method of dissecting the anterior horns of the spinal cord from a mouse embryo and isolating the MNs from neighboring cells using a density gradient. Then, we present a new way of efficiently transfecting MNs with expression plasmids using magnetofection. Finally, we illustrate how to fix and immunostain primary MNs. Using neurofilament mutations that cause Charcot-Marie-Tooth disease type 2, this protocol demonstrates a qualitative approach to expressing proteins of interest and studying their involvement in MN growth, maintenance, and survival.

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

The goal of this technique is to prepare a highly enriched culture of primary motoneurons (MNs) from murine spinal cord. To evaluate the consequences of mutations causing MN diseases, we describe here the isolation of these isolated MNs and their transfection by magnetofection.

마우스 기본 Motoneurons Transfecting으로 Charcot Marie이 질병에서 체 외에서 모델링

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of pyramidal neurons and dendritic spines, a ballistic labeling technique can be utilized. In the present protocol, pyramidal neurons are labeled with DilC18(3) dye and analyzed using neuronal reconstruction software to assess neuronal morphology and dendritic spines. To investigate neuronal structure, dendritic branching analysis and Sholl analysis are performed, allowing researchers to draw inferences about dendritic branching complexity and neuronal arbor complexity, respectively. The evaluation of dendritic spines is conducted using an automatic assisted classification algorithm integral to the reconstruction software, which classifies spines into four categories (i.e., thin, mushroom, stubby, filopodia). Furthermore, an additional three parameters (i.e., length, head diameter, and volume) are also chosen to assess alterations in dendritic spine morphology. To validate the potential of wide application of the ballistic labeling technique, pyramidal neurons from in vitro cell culture were successfully labeled. Overall, the ballistic labeling method is unique and useful for visualizing neurons in different brain regions in rats, which in combination with sophisticated reconstruction software, allows researchers to elucidate the possible mechanisms underlying neurocognitive dysfunction.

We present a protocol to label and analyze pyramidal neurons, which is critical for evaluating potential morphological alterations in neurons and dendritic spines that may underlie neurochemical and behavioral abnormalities.

뇌 슬라이스와 기본 세포 배양에서 피라미드 뉴런의 탄도 라벨링

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx due to the abnormal activation of glutamate receptors results in DA excitotoxicity and has been identified as an important mechanism for DA neuron loss. In this study, we isolate, dissociate, and culture midbrain neurons from the mouse ventral mesencephalon (VM) of ED14 mouse embryos. We then infect the long-term primary mouse midbrain cultures with an adeno-associated virus (AAV) expressing a genetically encoded calcium indicator, GCaMP6f under control of the human neuron-specific synapsin promoter, hSyn. Using live confocal imaging, we show that cultured mouse midbrain neurons display spontaneous Ca2+ fluxes detected by AAV-hSyn-GCaMP6f. Bath application of glutamate to midbrain cultures causes abnormal elevations in intracellular Ca2+ within neurons and this is accompanied by caspase-3 activation in DA neurons, as demonstrated by immunostaining. The techniques to identify glutamate-mediated apoptosis in primary mouse DA neurons have important applications for the high content screening of drugs that preserve DA neuron health.

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Here we present a protocol to measure in vitro Ca2+ fluxes in midbrain neurons and their downstream effects on caspase-3 using primary mouse midbrain cultures. This model can be employed to study pathophysiologic changes related to abnormal Ca2+ activity in midbrain neurons, and to screen novel therapeutics for anti-apoptotic properties.

기본 마우스 중뇌 뉴런에서 자발적인 Ca2+ 플럭스와 다운스트림 효과를 정량화

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx ...