Name: ex vivo culture of chick cerebellar slices and spatially targeted electroporation of granule cell precursors
Uploaded: 2015-12-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors at JoVE.com

Bu makalede sunulan yöntem BBSRC BB / tarafından finanse edilen çalışma ortaya çıktı I021507 / 1 (TB, RJTW) ve MRC doktora öğrencilik (MH).

Not: Bütün deneyler King College London, İngiltere ve İngiltere Home Office hayvan bakımı kurallarına uygun gerçekleştirilmiştir. E14 Serebellumunda 1. Diseksiyon <ol><li> Embriyonik Gün 14-38 ° C&#39;de kahverengi döllenmiş tavukların yumurtalarını kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Kullanımı yumurta makas ovo civciv embriyo başını kesmek ve buz PBS (Şekil 1A) içeren bir Petri baş kaldırmak. </li><li> Standart forseps kullanarak, gözleri ve üst çene kaldırma, doku içinden her gözün arkasında tüm yol kesiler yapmak. Tüm yol alt çene (Şekil 1B) çıkarılması farenks yoluyla ikinci bir kesi yapmak. </li><li> Standart forseps kullanarak, (Şekil 1C) onu uzak soyulması ile kafatası yüzeyinden tüm cilt kaldırmak ve beyin açığa frontal ve parietal kemikler çıkarın. </li><li> Ventral açıdan, yutak kıkırdak ve yardımcı mezenşimi çıkarın. </li><li> Bir dorsal itibaren dikkatlily pia ve ayrı tüm beyin (Şekil 1D) zarar vermemeye Beyin alarak bakım mezenşimin dorsal çıkarın. </li><li> Tüm yol orta beyin ve arka beyin ve beyincik (Şekil 1E) da dahil olmak üzere ayrı Beyin arasındaki doku içinden kesi yapmak. </li><li> Tüm yol beyincik ve Beyin alar levhanın her iki yanal kavşaklarında doku içinden kesiler yaparak, diseksiyon boyunca pia bütünlüğünü (Şekil 1F) korumak için özen tüm beyincik çıkarın. Oluşturan koroid pleksusu (Şekil 1G) sökün. </li><li> Buz gibi soğuk HBSS içine disseke beyincik taşıyın. </li></ol> E14 Serebellumunda 2. Dilim Kültür <ol><li> Bir spatula ya da ucu ile 3 ml&#39;lik Pasteur pipeti kullanarak Doku Chopper steril platforma bütün beyincik transfer diyafram genişletmek için kesilmiş. Bir pipet kullanarak fazla sıvıyı çıkarın. </li><li> T tüm tüm beyincik CutO maksimum% 50 bir kesim hızı ayarlamak doku kıyıcı kullanarak 300 mikron kalınlığında yönünü gerekli. Doku bütünlüğü en kolay sagital bölümde korunur; Bununla birlikte, yönlendirme hücre analizi için önemli bir husustur (granül hücre aksonları enine çalıştırırken, Purkinje hücresi dendritler sagital Purkinje hücresi dendritler düzlemine dik olan, hizalanmaktadır). </li><li> 3 ml Pasteur pipet kullanarak, buz dilimlenmiş serebellum soğuk HBSS kapsamaktadır. </li><li> Kesme ucu ile 3 mi bir Pasteur pipeti kullanılarak buz gibi soğuk taze HBSS içeren bir 60 mm Petri kabı, HBSS içinde dilimleri aktarın. </li><li> Bir fiber optik ışık kaynağı ile aydınlatılan bir mikroskop altında, saatçilik forseps kullanılarak her dilim ayrılmasını sağlamak. Dilimleri belirleyin onların doku bütünlüğü ve medio-lateral pozisyonda dayalı, electroporated edilecek. Not: kültür ortamında inkübasyon dilim yoluyla embriyo Her diseksiyon yaklaşık 10-20 dk bağlı UPO alırn deneyim. Bu cerebella Dekapitasyon ve ex vivo kültür arasındaki minimum zaman miktarda harcama sağlamak için bir seferde diseksiyonlara birini gerçekleştirin. </li></ol> Dilimleri 3. elektroporasyonu <ol><li> Yalıtım bandı ile 60 mm Petri kabı tabanına bir Elektroporatör anot sabitleme tarafından bir elektroporasyon odasını oluşturun. Elektrot karşılamak için HBSS yaklaşık 1 ml ilave edilir. </li><li> HBSS kaplı elektrodun üstünde 0,4 um kültürü eki yerleştirin. Kültür insert elektrot her zaman uç ile elektrot arasında orada temasa olduğundan emin yapma dinlenmek için izin verin. Not: Bu ayarda, dilim kültür eklemek devresini korumak ama katot mekansal hedefleme sağlayan, çözüm yüzey üzerine duracaktır. </li><li> Aktarım tespit dilimleri (kültür insert başına beş adede kadar) kesme ucu ile 3 ml Pasteur pipeti kullanarak kültür eklemek üzerine. Ayrı bir sagitt kültür insert üzerine yerleşmek için izinal yönelim. </li><li> Dilimler, artık çözelti içinde kalmış, böylece, bir pipet kullanarak, fazla HBSS çıkarın. </li><li> Bir dilim hedeflenen bölgenin yüzeyi üzerinde 20% hızlı yeşil ile seyreltildi (1 ug / ul bir konsantrasyonda) P10 pipet, pipet DNA kullanılarak. % 20 hızlı yeşil viskoz DNA çözümü sağlar ve prohibitively DNA&#39;nın geniş dağılma önler. Her bir dilim (Şekil 2B), yaklaşık 5 ul DNA / hızlı yeşil bir çözelti ekleyin. </li><li> İstediğiniz hedeflenen doku üzerinde katot yerleştirin ve 3 x 10 V, 10 msn süreli darbeleri ile electroporate. Doku ile katot doğrudan temastan kaçının. Bunun yerine, iletkenlik korumak (aslında doku dokunmadan mümkün olduğunca dokuya yakın katot yerleştirin) sıvının yüzey gerilimi yararlanın. </li><li> Istediğiniz gibi her serebellar dilim EGL birden bölgelerine DNA teslimat ve elektroporasyon tekrarlayın. </li><li> Elektroporasyon tamamlanması, devir kültür INSE üzerine30 mm Petri kabı rt. </li><li> Glikoz,% 1 B27 takviyesi, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penisilin - (+) - her bir kültür için, önceden ısıtılmış bir kültür ortamı (Basal Medium Eagle 1 ml% 0.5 (w / v) D ekleme Kültür uç ortamı ile temas halindedir, ancak dilimleri içinde banyo değildir, öyle ki kültür eklemek altında 100 ug / ml streptomisin). </li><li> Kadar 3 gün boyunca 37 ° C /% 6 CO2 kültürlerin inkübe edin. Kültür ortamı, taze, önceden ısıtılmış ortam ile, her 24 saat tüm değiştirin. </li><li> Kültür no kültür ortamı taze bir 30 mm çanak (4 ° C de veya O / N)% 4 paraformaldehid içinde 1 saat süre ile ekler kültürün ardından, dilimleri düzeltin. </li></ol> Serebellar Dilimleri 4. Görüntüleme <ol><li> Tespit sonra, PBS içinde 5 dakika boyunca dilimleri 3 kez yıkayın. </li><li> Bir jilet kullanarak, dilim etrafında kesme ve dilim ve yapıştırılan parçanın bölgesini kaldırarak kültür insert her Electroporated ve kültürlü serebellar dilim teşrih. Yapmakkültür insert yüzeyinden dilim çıkarmayı denemeyin. </li><li> Bir lamel alarak bakım altında (istenirse) DAPI içeren montaj orta yaklaşık 1 ml Mount dilimleri kabarcıkları tanıtmak için değil, ve görüntü lazer tarama konfokal mikroskopi kullanılarak. Not: Görüntüleme parametreler elektropore yapılara göre farklılık ve bireysel kullanıcı takdirine edilebilir. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada rapor edilen protokol kesme electroporating ve piliç embriyonik gün 14 beyincik dilimleri kültürlenmesi için bir yöntemi anlatmaktadır. Bu protokol, bireysel serebellar lob izole hedefleme dahil EGL küçük odak bölgelerinde, elektroporasyon hedefleme sağlar. Bu yüksek çözünürlük ve kolaylık genetik analiz ve görüntüleme sağlar ve düşük maliyetle kemirgenler 43-47 kurulan tekniklere göre. Böyle bir analiz sonucu değişiklikler EGL etkileyebilir demektir uzatılmış gelişim süre, fare EGL özgü genetik hedefleme olanakları yetersizdir ve eşkenar dudak ve EGL arasındaki moleküler mekanizmaların commonality, in vivo mümkün değil Onlar eşkenar dudak nörogenezi etkileyen ve EGL oluşumunu 49 abrogate beri biyoloji sık analiz edilemez. Sistemimiz böylece EGL s genetik modifikasyon hedef anlamında büyük bir ilerlemeyi temsilpecifically ve biz civciv dışındaki diğer türlere geçerli olacak tahmin belki böyle olmayan model memeliler ve sürüngenler olarak karşılaştırmalı ilgi evi. Dilim kültür elektroporasyon tekniği uygulanırken, teknik konularla ilgili bir sayıda büyük önem taşımaktadır. İlk olarak, dilim sağlamlığı kapsamlı hücre ölümü geçiren bir yandan olmayan ya da diğer kaybetme yapısal bütünlüğü ile kültür içinde hayatta kalmak için elimizde 300 um dilimin kalınlığı sınırlar. İkinci bir önemli husus, genetik modifikasyon görebilir veya ilgili seviyelerini indüklemek için yeterince yüksek olan konsantrasyonlarda DNA elektroporasyon sağlayan DNA solüsyonu, viskozitesidir. Erken dönemde embriyo Beyin enjekte DNA çözeltilerinin ovo elektroporasyon olarak, yaklaşık% 1 hızlı yeşil boya konsantrasyonları tipiktir. Bununla birlikte, protokolde, genellikle% 20 hızlı yeşil konsantrasyonları kullanırlar. Bu yeterince vis sağlarcous DNA solüsyonu pipetleme ama elektroporasyon önce aşağıdaki DNA yayılmasını önlemek için, ama yeterince verimli elektrik iletimi arabuluculuk birini sulandırmak. Bu teknik değerlendirmeler yanında, biz ex vivo gözlemlemek proliferatif davranışı gözlendi yapar pial bütünlük doku hazırlanması tarafından kesintiye olmanın muhtemelen in vivo çalışmalar tahmin değil kesin maç. GFP ekspresyon yapısı, elektroporasyona zaman Bu koşullar altında, elektroporate edilmiş hücrelerde büyük bir kısmı PH3 boyama (Şekil 3F) ile değerlendirildiği gibi, kültür sadece bir gün sonra hücre döngüsü yazılmıştır görünmektedir. Bu fare ve civciv hem de klonlar çoğalması büyük bir zaman diliminde 27 boyunca uzanır beklenen EGL proliferatif davranışları ile ilişkili değildir. Pia çoğalmasını modüle ima gözlem tarafından desteklenen bir muhabir konstrukta electroporate zamanİn vivo koşullarında, bu yapı 36,37 post-mitotik olan iç EGL hücreleri işaretleme endojen NeuroD1 ifade aynalar GFP Bir günlük kültürden (Şekil 3D). sonuçta Elektroporasyona tabi tutulan hücreler eksprese GFP NeuroD1 düzenleyici element tahrik ifade t, tam uzunluktaki NeuroD1 hücre farklılaşmasını (Şekil 3E) çalıştırmak için yeterli olduğu görülmektedir. Bu, in vivo olarak eşdeğer bir aşamada, dış EGL olduğu gibi, belirli koşullar altında, hücrelerin çoğalma kapasitesi muhafaza edilemez olduğunu göstermektedir. PH3 boyama, ancak sık sık EGL alanına (Şekil 4D) lokalize kültürde çoğalması bir sürü olduğunu düşündürmektedir. EGL dışında Kapsamlı çoğalması muhtemelen beyaz cevher pax2 GABAerjik öncüleri gliogenesis veya çoğalmasını gelişmiş gösterir. Ima herhangi bir deneysel prosedür yorumlanması hesabına yukarıdaki proliferativ içine almak zorunda olmasıdıre davranışı, Purkinje hücreleri, normal gelişim civciv ve E18 kadar tek tabaka oluşturacak yok aslında (nedeniyle vb lifleri tırmanma ile etkileşim eksikliği, gibi) dilim hazırlandıktan sonra bozulabilir Bu kısıtlamalara rağmen, bizim protokol granül hücre biyolojisi birçok yönünü inceleyerek ilgili atılmış önemli bir adımı temsil etmektedir. Eşkenar dudak farklı olarak mekansal ve zamansal EGL özel etiketleme sağlayan en önemli avantajı, granül atalarıdır hücre biyolojisi hem de in vivo şu anda mümkün olmayan bir şekilde onu destekleyen genetik düzenlemenin birden sınavları kolaylaştıracaktır. Civciv Bizim tekniği kemirgenler 43-48 mevcut ex vivo kültür ve elektroporasyon protokolleri tamamlayacak ve maliyet ve civciv ile ilişkili kolaylık önemli avantajlar taşır olacaktır. Buna ek olarak, bu üzerinde önemli bir ilerlemeyi temsilkültürleme granül progenitörlerin 39, mevcut teknikleri. O tamamlayacak ziyade ikincisi yerini alacak olsa da, bizim protokol ilaç tedavileri çok çeşitli ve civciv mümkündür hücre özerk genetik manipülasyonlar çeşitliliği granül nöron farklılaşma kontrolünü açılacaktır. Bu eşi görülmemiş detaylı granül hücre biyolojisi incelenmesi için bir temel sağlar.

Beyincik Beyin ön ucunda oturur ve olgun beyindeki duyu ve motor işleme entegrasyonu sorumlu yanı sıra yüksek bilişsel süreçleri 1 düzenleyen olduğunu. Memeliler ve kuşlar, bu yetişkin beyindeki nöronların yarıdan fazlası ürettiği gelişimi sırasında, atalarıdır geniş geçiş amplifikasyon ürünü ayrıntılı bir morfoloji sahip ve ağır foliated edilir. Beyincik yüzyıllardır Nörobiyologlar ve moleküler çağda çalışmanın konusu olmuştur aynı şekilde önemli dikkat çekmiştir. Bu, özünde ilginç biyoloji, ama aynı zamanda ağır gibi en yaygın pediatrik beyin otizm spektrum bozuklukları 2 ve en belirgin serebellar kanser, medulloblastoma 3 gibi gelişimsel genetik bozukluklar da dahil olmak üzere insanlara hastalık bulaştıran gerçeği değil sadece ilgilidir tümör. Önemlisi, bu wh içinde mükemmel bir model sistemich beyin gelişimi 4 sırasında kaderi tahsisi ve nörogenezi incelemek için. Son yıllarda, aynı zamanda omurgalı phylogeny 5-10 arasında görülen serebellar formların büyük çeşitlilik nedeniyle, beyin gelişiminin karşılaştırmalı çalışma için bir model sistem olarak kurulmuştur. Beyincik Beyin 11&#39;de rhombomere 1 dorsal yarısından itibaren gelişir ve gelişimsel iki ana progenitör popülasyonları, eşkenar dudak ve ventriküler zon oluşur. Eşkenar dudak çatı plakası sınırındaki Beyin ve neuroepithelium dorsal bölgenin çevresinde uzanır. Bu beyincik 12-14 glutamaterjik eksitatör nöronların doğduğu yerdir. Ventriküler bölge en belirgin inhibitör GABAerjik serebellar nöronların, büyük Purkinje nöronları 14,15 yol açar. Daha sonra geliştirme (fare embriyonik gün 13.5 ila yaklaşık, civciv 16 e6), glutamaterjik ProGenitors eşkenar dudaktan teğet göç ve atalarıdır bir pial bir tabaka oluşturur: ikincil progenitör bölgesi dış granül tabakası (EGL) çağırdı. Olgun beyinde bulunan granül nöronların büyük sayılara neden kapsamlı geçiş amplifikasyon uğrar bu tabakadır. EGL çoğalma uzun hücre döngüsü çıkışı ve ortasına dış EGL katmandan kendi çıkış ile bağlantılıdır progenitörlerin nöronal farklılaşma anahtarıyla, eşkenar dörtgen şeklinde dudak 17 Tanjansiyal göç kaynaklanan alt Pial konumu ile bağlantılı olmuştur EGL 18. Medial-lateral ekseninde post-mitotik granül hücrelerinin Geniş teğet göç olgun serebellar korteksin iç granül tabakası içine son radyal göç öncesi, orta ve iç EGL 19 oluşur. Serebellar yüzey üzerinde eşkenar dudak hücrelerin göç pia 20-22 den CXCL12 sinyalizasyon bağlıdır </sup&gt; Ve granül hücrelerinin CXCL12 reseptörü CXCR4 ifade eder. Onların teğet migrasyon inhibitör interneuron popülasyonları 23-25 ​​göç neokortikal teğet o böylece anımsatıyor. Şaşırtıcı, elektron mikroskobik çalışmalar 17 proliferatif morfolojiye sahip EGL hücreleri memeli korteks 26 bazal atalarıdır anımsatan tarzda çoğalma yeteneği ile hücre davranışını bağlayan, pial temas halinde olduğunu ileri sürmüşlerdir. Bu 18 imzaların granül ön farklı gen ekspresyonunu sahip farklı hücre dışı durumlar tarafından tanımlanan üç alt katmanlar halinde EGL yukarıda belirtilen tabakalaşma yansıtılır. OEGL progenitörlerin Çoğalma atalarıdır bireysel genetik fare embriyonik gelişim sonunda etiketli, onlar 250-500 postmitotic g medyan ortalama doğuran şekilde klon boyutları normal dağılım oluşurranule nöronlar 27,28. Çoğalma Purkinje nöronları 29-32, altta yatan mitojenik SHH sinyallemesinin bağlıdır. SHH&#39;nin cevap verme transkripsiyon faktörünün Atoh1 hücre bağımsız ekspresyonu üzerine tamamen bağlı olduğu gösterilmiştir, in vitro ve in vivo 33 34,35 hem de. Benzer şekilde, hücre döngüsü çıkışı ve farklılaşması olasılıkla Atoh1 37 doğrudan bir bastırıcısıdır alt transkripsiyon faktörü NeuroD1 36, ifadesine bağımlı olduğu gösterilmiştir. Hücre döngüsü çıkışına 38-42 hücre biyolojik temelini çözmekte bu ilerleme ve önemli ilerleme olmasına rağmen, karar altında yatan temel moleküler mekanizma (lar) hücre döngüsünü çıkmak için bir ayırt nöron bir progenitör geçiş için, ve İç EGL de ilişkili postmitotic teğet göç yanı sıra, daha sonra anahtarradyal göç, anlaşılan eksik kalır. Bu, EGL deneysel inatçılığı büyük ölçüde: geç gelişen ve aynı nörojenik moleküllerin pek çoğu önemli önceki granül öncülerinin hayatta eşkenar paralel dudak altındadır beri genetik hedef zordur. Bu sorunu aşmak için, sayısız yazar kemirgenler 43-48 doğum sonrası beyincik hedeflemek için bir yöntem olarak in vivo ve ex vivo elektroporasyon gelişmiştir. Burada, maliyet ve kolaylık açısından önemli avantajlar temsil EGL, incelemek için civciv ex vivo elektroporasyon kullanımını öncülük. Elektroporasyon ve civciv serebellar doku ex vivo dilim kültürü Bizim yöntemi 14 civciv EGL çoğalması zirvesinde embriyonik Gün doku disseke kullanır. Bu yöntem, eşkenar dudak bağımsız EGL genetik hedefleme izin verir ve granül geçişin genetik diseksiyon için sahne koyacaktırbeyincik postmitotic granül nöron progenitör.

<table><tbody><tr><td>McIlwain tissue chopper</td><td>Mickle Laboratory Engineering Ltd</td><td></td><td>Cut at 300 &amp;mu;m for best results.</td></tr><tr><td>Basal Medium Eagle (Gibco)</td><td>Life Technologies</td><td>41010-026</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>0.4 &amp;mu;m culture insert</td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>TSS20 Ovodyne electroporator&amp;nbsp;</td><td>Intracel</td><td>01-916-02</td><td>Use 3 x 10 V, 10 msec pulses for electroporation.</td></tr></tbody></table>

ex vivo culture of chick cerebellar slices and spatially targeted electroporation of granule cell precursors

Serebellar dış granül tabakası (EGL) gelişmekte olan beyinde büyük Transit büyütme site ve nöronal çoğalmasını ve farklılaşmasını çalışmak için mükemmel bir model. Buna ek olarak, çoğalma yeteneği evrimsel değişiklikler beyinciği omurgalı beynin evo-devo çalışmaları için mükemmel bir model haline amniotları serebellar büyüklükte dramatik genişleme sorumlu olmuştur. EGL kurucu hücreleri, serebellar granül ataları da, Medulloblastoma için en yaygın pediatrik nöronal tümör kökenli önemli bir hücreyi temsil etmektedir. Transit amplifikasyon ardından, granül öncüleri olgun memeli beyninde büyük nöronal nüfusu temsil beyincik iç granüler tabaka içine radyal göç. Civciv, EGL çoğalması pik gebelik ikinci hafta sonuna doğru ortaya çıkar. Bu tabakaya genetik değişimine hedeflemek içinproliferasyonunun en yüksek, embriyonik gün 14 civciv embriyolarından serebellum dilimleri ex vivo elektroporasyon yoluyla genetik manipülasyonu için bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem, in vivo granül nöron geliştirme birkaç önemli yönlerini özetlediği ve beyincik granül hücre çoğalması ve farklılaşması tam bir anlayış oluşturmada yararlı olacaktır ve böylece beyincik geliştirme, evrim ve hastalığın.

Bu bölüm, embriyonik gün 14 hatundan kesit elektroporasyon ve beyincik kültürü kullanılarak elde edilebilir sonuçlarının örneklerini göstermektedir. Beyincik diseksiyon Şekil 1 içinde tasvir edilmektedir ve ayarlamak elektroporasyon haznesi, Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. Bu başarılı in vitro (Şekil 3A), yapı ve hücresel morfolojik korumak kültür serebellar dilimleri, elektroporasyona ve mümkün olduğunu göstermektedir. Bireysel Folia Hedefli elektroporasyon kolayca (Şekil 3B) elde edilir. Biz başarıyla, ii) beyincik hücrelerde işlevselliği için olası genomik bölgeleri test) EGL hücrelerine farklı plazmid bir dizi electroporate ve muhabir davranışlarını (Şekil 3C gözlemlemek yapıları ile hücreleri etiketlemek için) mümkün i olduğunu göstermek (Şekil 3D ) ve iii) genetik olarak manipüleÇevrede (Şekil 3E) proteinlerini misexpressing ile EGL hücreler. Buna ek olarak, elektroporasyona dilim farmakolojik manipülasyonlar (sonuçlar gösterilmemiştir) da mümkündür. Kültürlendikten sonra bu tür immünohistokimya veya proliferasyon deneyleri (Şekil 3F) gibi ek doku analizini gerçekleştirmek mümkündür. Biz Kalbindin ve PH3 immün doku sağlık analizi gerçekleştirmek ve doku bütünlüğü kültürden sonra en az 3 div (Şekil 4) muhafaza olduğunu göstermektedir. Bu sonuçlar, EGL tamamen incelenmiş ve genetik olarak civciv model sistemde değiştirilebilir erişilebilir ve kolay elde edilebilir yapısı şimdi olduğunu göstermektedir. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53421/53421fig1.jpg" /> E14 civciv embriyolarının beyincik Şekil 1. Diseksiyon. (A) yumurta civciv başını kesmek ve kafa int kaldırmakbuz PBS ile oa petri. Alt çene ve gözleri ve farenks (kesikli çizgi) arkasında kesi yaparak gözleri çıkarın. (B) kafatasının yüzeyine deri çıkarın. (C) onu çevreleyen mezenşimin ve kıkırdaktan beyin kaldırmak frontal ve parietal kemik ve (D) sökün. Bir mikroskop altında (E), beyin arka sonunda beyincik konumunu belirlemek. Orta beyin ve arka beyin (kesik çizgiler) arasında kesin beyincik ve ventral Beyin sol edilecek. (F) Beyin (kesikli çizgi) beyincik ayırmak için beyincik yanal kavşaklar (pedinküller) de kesiler olun. Ekli pia ile bir bütün dokunulmamış beyincik sol kadar (G) beyincik ventral tarafında koroid pleksusu (yıldız) sökün. Bir doku Chopp ile dilimleri hazırlamadan önce buz HBSS içine beyincik aktarıner. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53421/53421fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53421/53421fig2.jpg" /> Elektroporasyon odasının 2. Şekil kurdu. (A) ısmarlama elektroporasyon odasının bir resmi. Odası 60 mm Petri kabı tabanı üzerine güvenli bir şekilde yerleştirilmiş bir elektro-bir anot içerir. Bulaşık elektrot karşılamak için HBSS yaklaşık 1 ml içerir. Kültür insert devresi koruyarak ama elle manipüle katot, mekansal hedefleme sağlayan, insert ve elektrot arasındaki sürekli temas ile elektrot üzerinde durmalıdır. Dilim (B) Bir resim electroporated edilir. Dilimler, DNA / hızlı yeşil bir çözelti ile kaplanmıştır. Dilimler arzu olarak electroporated edilird: elektroporasyon, bir veya birden fazla folium&#39;dan konumlara hedeflenebilecektir. Elektroporasyondan sonra uç inkübatör önceden ısıtılmış kültür ortamı ve kültürlenmiş bir 30 mm Petri tabağına yerleştirilir. 1. anot 2. 1 ml HBSS 5. Diseksiyon mikroskobu doku kıyıcı 6. Bireysel dilim hızlı yeşil boya ile 7. DNA solüsyonu ile katot 3. Kültür insert 4. Petri. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53421/53421fig2large.jpg" target="_blank">Tıklayınız Bu büyük bir versiyonunu görmek için rakam.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53421/53421fig3.jpg" /> Şekil 3. Temsilcisi sonuçları. (A) birden fazla yerde EGL içine RFP kodlama plazmid kontrol elektroporasyon düşük büyütme resim. Doku yapısını muhafaza eden ve Elektroporasyona tabi tutulan hücreler açık beyincik kalın subpial tabakada görebilir. (B) birBir kontrol GFP plazmidi ile hedeflenen bir elektroporasyon, örneğin. Hedeflenen folium bir yıldızla gösterilir. Ölçek çubuğu AB 500 mikron =. (C) Atoh1 arttırıcı tarafından tahrik edilen bir konstrukt kodlayan GFP EGL elektropore edilmiş bir örnek. Atoh1 ekspresyonu EGL olan granül hücre öncülerinin tanımlar. Çeşitli hücre morfolojisi açık 3 div de görebilir ve hücre davranışı izlenebilir. (D) sürüş GFP NeuroD1 geninin varsayılan bir korunmuş kodlayıcı olmayan elemanı (CNE) ihtiva eden bir yapının aşağıdaki elektroporasyon etiketleme bir örnek. CNE gelişiminin bu cne aktif bir rolü olduğunu düşündürmektedir endojen NeuroD1 ifade göre beklenen hücrelerde aktivitesi rapor eder. NeuroD1 sentezleme granül hücre farklılaşmasının başlatılması ile ilişkilidir. (E) ya da doku genetik NeuroD1 proteininin misexpression ve granül hücre Behav bir değişiklik ile manipüle edilebilir bir örnekgelmeleri gözlenebilir. (F) içinde elektroporasyona tabi dokusu (GFP plazmidi kontrol), sabit ve phosphohistone H3 (PH3) halinde çoğalan hücrelere belirteçleri için renklendirilebilirliğinin bulunması, bir örnek. Ölçek çubuğu CF = 50 um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53421/53421fig3large.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53421/53421fig4.jpg" /> Kültürde 4. Doku bütünlüğü ve çoğalmasını Şekil. (A - C) in vitro (div) 1-3 gün kontrol GFP plazmid ile elektropore E14 serebellar doku Calbindin boyama. Kalbindin boyama doku bütünlüğü en az 3 div kültür içinde muhafaza edildiğini göstermektedir. Purkinje hücresi tabakası civciv gelişme, bu aşamada, bir tek tabaka oluşturmayan ancak açık bir şekilde altında bir tabaka oluşturucu görülürGranül hücreleri (yeşil) yer almaktadır EGL. 2 div kültüre serebellar doku üzerinde (D) Phosphohistone H3 (PH3) boyama. PH3 boyama EGL (oklar) görünür ama aynı zamanda diğer beyincik bölgelerinin (ok başları) bulunmaktadır. Bu boyama incelenen kültür içinde her aşamada (1-3 div) temsilcisidir. Ölçek çubuğu AD = 50um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53421/53421fig4large.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors at JoVE.com

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Serebellar dış granül tabakası gelişmekte olan beyinde büyük Transit amplifikasyon sitedir. Burada, embriyonik Gün 14 civciv embriyolardan ex vivo elektroporasyon ve serebellar dilim kültürü kullanarak çoğalması zirvesinde bu tabakaya genetik modifikasyon hedeflemek için bir protokol mevcut.

Ex Vivo Chick Serebellar Dilimleri Kültür ve Mekansal Elektroporasyon granül hücre öncülerinin Hedefli

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

ex-vivo-culture-chick-cerebellar-slices-spatially-targeted

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

9.2K Görüntüleme.  King's College London.  Serebellar dış granül tabakası gelişmekte olan beyinde büyük Transit amplifikasyon sitedir. Burada, embriyonik Gün 14 civciv embriyolardan ex vivo elektroporasyon ve serebellar dilim kültürü kullanarak çoğalması zirvesinde bu tabakaya genetik modifikasyon hedeflemek için bir protokol mevcut. 

Video: Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons 

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the cerebellar neuronal types (granule cells, Purkinje cells and inhibitory interneurons), granule neurons are by far the most numerous and are the most abundant type of neurons in the mammalian brain. In rodents, cerebellar granule neurons are generated during the first two post-natal weeks from progenitor cells in the outermost layer of the cerebellar cortex, the external granule layer (EGL). The protocol presented here describes techniques to enrich and culture granule neurons and their progenitor cells from post-natal mouse cerebellum. We will describe procedures to obtain cultures of increasing purity3,4, which can be used to study the differentiation of proliferating progenitor cells into granule neurons5,6. Once the progenitor cells differentiate, the cultures also provide a homogenous population of granule neurons for experimental manipulation and characterization of phenomena such as synaptogenesis, glutamate receptor function7, interaction with other purified cerebellar cells8,9 or cell death7.

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons

Here we present a method to isolate and culture cerebellar granule neuron progenitor cells and cerebellar granule neurons from postnatal mouse.

Post-Natal Mouse Serebellar Granül Nöron Progenitör Hücreler ve Nöronlar İzolasyon ve Kültür

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the ...

Biyoloji

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors of the diseases. To validate the contribution of a dysfunction of the mutated genes to disease development, the generation of animal models carrying the mutations is one obvious approach. While germline genetically engineered mouse models (GEMMs) are popular biological tools and exhibit reproducible results, it is restricted by time and costs. Meanwhile, non-germline GEMMs often enable exploring gene function in a more feasible manner. Since some brain diseases (e.g., brain tumors) appear to result from somatic but not germline mutations, non-germline chimeric mouse models, in which normal and abnormal cells coexist, could be helpful for disease-relevant analysis. In this study, we report a method for the induction of CRISPR-mediated somatic mutations in the cerebellum. Specifically, we utilized conditional knock-in mice, in which Cas9 and GFP are chronically activated by the CAG (CMV enhancer/chicken &#223;-actin) promoter after Cre-mediated recombination of the genome. The self-designed single-guide RNAs (sgRNAs) and the Cre recombinase sequence, both encoded in a single plasmid construct, were delivered into cerebellar stem/progenitor cells at an embryonic stage using in utero electroporation. Consequently, transfected cells and their daughter cells were labeled with green fluorescent protein (GFP), thus facilitating further phenotypic analyses. Hence, this method is not only showing electroporation-based gene delivery into embryonic cerebellar cells but also proposing a novel quantitative approach to assess CRISPR-mediated loss-of-function phenotypes.

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Conventional loss-of-function studies of genes using knockout animals have often been costly and time-consuming. Electroporation-based CRISPR-mediated somatic mutagenesis is a powerful tool to understand gene functions in vivo. Here, we report a method to analyze knockout phenotypes in proliferating cells of the cerebellum.

CRISPR-aracılı kaybı serebellar granül işlev analizinin gen transferi Elektroporasyon tabanlı rahim içinde kullanarak hücreleri

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Gelişim Biyolojisi

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon<em&gt; In Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Nöronal morfoloji ve Göç Eğitim için

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Nörobilim

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

Modelleme nöronal ölüm ve fare birincil serebellar granül nöronlar dejenerasyon

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Organotypic slice culture is a powerful in vitro model that mimicks in vivo conditions more closely than dissociated primary cell cultures. In early postnatal development, cerebellar Purkinje cells are known to go through a vulnerable period, during which they undergo programmed cell death. Here, we provide a detailed protocol to perform mouse organotypic cerebellar slice culture during this critical time. The slices are further labeled to assess Purkinje cell survival and the efficacy of neuroprotective treatments. This method can be extremely valuable to screen for new neuroactive molecules.

Organotypic slice cultures are a powerful tool to study neurodevelopmental or degenerative/regenerative processes. Here, we describe a protocol that models the neurodevelopmental death of Purkinje cells in mouse cerebellar slice cultures. This method may benefit research in neuroprotective drug discovery.

Organotipik Serebellar Dilim Kültürlerde Purkinje Hücre Sağkalım

Organotypic slice culture is a powerful in vitro model that mimicks in vivo conditions more closely than dissociated primary cell cultures. In early ...

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent cerebellum is an ideal system to track the development and morphogenesis of a single cell type, the cerebellar granule neuron (CGN), across time. Here, in vivo electroporation of granule neuron progenitors in the developing mouse cerebellum was employed to sparsely label cells for subsequent morphological analyses. The efficacy of this technique is demonstrated in its ability to showcase key developmental stages of CGN maturation, with a specific focus on the formation of dendritic claws, which are specialized structures where these cells receive the majority of their synaptic inputs. In addition to providing snapshots of CGN synaptic structures&#160;throughout cerebellar development, this technique can be adapted to genetically manipulate granule neurons in a cell-autonomous manner to study the role of any gene of interest and its effect on CGN morphology, claw development, and synaptogenesis.

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Here we describe a method to visualize synaptogenesis of granule neurons in the mouse cerebellum over the time course of postnatal brain development when these cells refine their synaptic structures and form synapses to integrate themselves into the overall brain circuit.

Serebellar Granül Nöron Morfolojisi ve Sinaps Gelişimini Incelemek için In Vivo Postnatal Elektroporasyonun Kullanılması

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent ...

Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In the granule cell precursor (GCP), the primary cilium acts as a pivotal signaling center that orchestrates precursor cell proliferation by modulating the Hh signaling pathway. The investigation of primary cilium-dependent Hh signaling machinery is facilitated by in vitro genetic manipulation of the pathway components to visualize their dynamic localization to the primary cilium. However, transfection of transgenes in the primary cultures of GCPs using the currently known electroporation methods is generally costly and often results in low cell viability and undesirable transfection efficiency. This paper introduces an efficient, cost-effective, and simple electroporation protocol that demonstrates a high transfection efficiency of ~80-90% and optimal cell viability. This is a simple, reproducible, and efficient genetic modification method that is applicable to the study of the primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathway in primary GCP cultures.

Here, we present a reproducible in vitro electroporation protocol for genetic manipulation of primary cerebellar granule cell precursors (GCPs) that is cost-effective, efficient, and viable. Moreover, this protocol also demonstrates a straightforward method for the molecular study of primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathways in primary GCP cells.

Granül Hücre Öncüsünde Birincil Seyuma Bağımlı Sinyal Yollarını İncelemek için Verimli ve Uygun Maliyetli Elektroporasyon Yöntemi

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In ...

Isolating and Culturing Murine Cerebellar Granular Neuron Progenitors

Source: Bovio, P., et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/56631">Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates the isolation and cultivation of cerebellar neural progenitor cells from a mouse pup&#39;s cerebellum. Cerebellar granule neuron progenitors are isolated and purified through differential adhesion, effectively removing astrocytes. These cultured progenitors subsequently differentiate into cerebellar granule neurons.

Murin serebellar granüler nöron progenitörlerinin izole edilmesi ve kültürlenmesi

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1.&#160;Preparations

	Preparations ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Nöronal Kültür Teknikleri

Birincil Nöronal Kültür

Ex Vivo Electroporation of Chick Embryo Cerebellar Slices: A Method to Introduce Plasmid DNA Encoding Green Fluorescent Protein to Visualize Granular Cell Development

Source: Hanzel, M. et al.&#160;<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/53421" target="_blank">Ex Vivo&#160;Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2015)
In this video, we perform electroporation of chick embryo cerebellum slices with reporter gene plasmids. The technique facilitates visualization of the development and migration of granule cell precursors to form granular layer.

Civciv Embriyo Serebellar Dilimlerinin Ex Vivo Elektroporasyonu: Granüler Hücre Gelişimini Görselleştirmek için Yeşil Floresan Proteini Kodlayan Plazmid DNA'yı Tanıtma Yöntemi

Source: Hanzel, M. et al.&#160;Ex Vivo&#160;Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors.&#160;J. ...

Kanser Araştırmaları

Sinir Sistemi Kanserleri

İn vitro çalışmalar

Obtaining Cerebellum Slices from an Embryonic Chick Brain

Source: Hanzel, M., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/53421">Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors.</a> J. Vis. Exp. (2015).
The video demonstrates the preparation of cerebellum slices. It shows a detailed procedure for isolating the cerebellum from a chick embryo. The slices are then prepared from the dissected cerebellum using a tissue chopper for further experimental analysis.

Embriyonik Civciv Beyninden Beyincik Dilimleri Elde Edilmesi

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...