Name: production of nurr-1 specific polyclonal antibodies free of cross-reactivity against its close homologs, nor1 and nur77
Uploaded: 2015-08-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
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This work was supported by NIH grants (NS070577 and NS084869).

주의 : 아래에 인용 된 모든 용액의 조성은 재료 / 장비 테이블에서 발견 될 수있다. 1. 단백질 열 항체 정제 <ol><li> 단백질을 스핀 컬럼 이전 절차를 시작하기에 15 분 동안 실온에 필요한 모든 버퍼 평형. </li><li> 면역 혈청 희석 1 : 1 단백질의 IgG는 버퍼를 바인딩. (혈청 5ml를 권장). </li><li> 조심스럽게 뚜껑에 박혀 될 수있는 수지를 꺼 내려 단백질을 벤치 위에 스핀 열을 누릅니다. 상단 캡을 제거하고 부드럽게 바닥 폐쇄을 스냅. 15 ml의 수집 튜브에 열을 놓고 스토리지 솔루션을 배출 할 수 있습니다. </li><li> 버퍼를 결합 단백질의 IgG 5 mL를 추가하고 솔루션을 배출 할 수 있습니다. </li><li> 컬럼에 희석 면역 혈청을 적용하고 흐름을 통해 수집합니다. 최상의 결과를 위해 칼럼의 항체 - 결합 capacit의 80 % 미만의 농도로 항체를 포함하는 샘플 볼륨을 추가Y. </li><li> 버퍼를 결합 단백질의 IgG의 15 ㎖로 또는 280 nm에서의 흡광도가 0.1 이하가 될 때까지 열을 씻으십시오. </li><li> 다섯 라벨 수집 튜브에 중화 버퍼의 100 μl를 추가합니다. </li><li> 단백질에 열을 IgG의 용출 버퍼 5 mL를 추가하고 중화 버퍼의 100 μl를 포함하는 튜브의 각 1 ㎖의 분수를 수집합니다. </li><li> 0.5보다 큰 흡광도를 280 nm에서 풀 분획 각 분획의 흡광도를 측정한다. 투석에 대한 준비가 될 때까지 얼음에 풀링 분수를 유지합니다. </li><li> IgG를 용출 완충액 8ml를 첨가하여 열을 재생성하고 용액을 컬럼을 통해 흐르도록 허용한다. </li><li> 7.4 용리액 pH가 돌아갈 때까지 단백질의 IgG 결합 액과 열을 씻어. </li><li> 저장 용액 5 ㎖ (PBS에 0.​​02 %의 아 지드 화 나트륨)를 첨가하여 열을 보관. 약 3 ㎖ 열, 모자 바닥에 남아 상단 캡을 고정합니다. 4 ° C에서 열을 저장합니다. </li><li> 길이 O를 결정F 투석 튜브 제조업체의 지시에 따라 필요. 16mm 평면 직경의 튜브 용액 1 ㎖ 당 튜브 길이의 5.47 CM을 사용하여 사용하는 것은 투석한다. 튜브를 잘라 15 ~ 30 분 동안 PBS 산도 7.4 씻어. </li><li> 접어 투석 튜브의 한쪽 끝을 클립, PBS pH를 7.4으로 평형화 투석 튜브에 함유 분획을 풀링 IgG를 전송하고 다른 쪽 끝을 닫는다. </li><li> 2 시간 동안 pH 7.4의 PBS를 200 볼륨에 대해, 실온에서 투석. </li><li> 투석 완충액 (pH 7.4의 신선한 PBS)를 변경하고, 실온에서 추가로 2 시간 동안 투석. </li><li> 투석 버퍼 (신선한 PBS의 pH 7.4)를 변경하고 4 ℃에서 밤새 투석. </li><li> 추가의 정제 단계를 진행 할 준비가 될 때까지 4 ℃에서 투석 항체 솔루션을 유지합니다. </li><li> 280 nm에서 흡광도를 사용하여 항체 농도 및 210,000 M -1 cm -1 (12)의 280 nm에서의 항체의 몰 흡광 계수를 평가한다. </li></ol> LBD 단백질 2. 커플 링은 커플 링 수지를 AminoLink하기 <ol><li> 두 개의 열, NOR1에 대한 하나 Nur77의 다른를 준비합니다. 두 단백질 같은 프로토콜을 따르십시오. </li><li> 단백질을 해동하는 얼음 수지에 결합한다. 그것의 몰 흡광 계수가 280 내지 12에서의 흡광도를 사용하여 단백질 농도를 결정한다. <ol><li> 대안 적으로, bicinchoninic 산 분석 13으로 단백질 결정 분석을 사용한다. 단백질을 커플 링 완충액 대 아민 - 함유 버퍼 투석 또는 버퍼 교환에 용해되는 경우. 단백질이 적절한 버퍼 (여유 아민)가없는 경우 그것을 커플 링 버퍼의 4 배 희석. </li></ol></li><li> 단백질의 2 mg을위한 수지 2 ㎖를 사용합니다. 다음의 모든 단계는 10 ml의 열에서 2 ml의 수지에 대한 것입니다. 단백질 10 ㎎까지 수지의 1 ㎖ (1 슬러리 1 2 ㎖) 당 연결될 수있다. </li><li> 바닥에 프릿을 밀고 그것을 통해 PBS 산도 7.4을 실행하여 10 ml의 컬럼을 준비합니다. 캡 T그는 칼럼의 바닥과 커플 링 버퍼 2 ㎖를 추가합니다. </li><li> 상기 컬럼 (수지 2 ㎖를 얻었다 4 mL)에 슬러리의 원하는 양을 추가 하단 캡을 제거하고 컬럼 배수하자. 커플 링 버퍼의 6 ㎖ (3 수지 침대 볼륨)의 총 열을 씻어 열을 배출 할 수 있습니다. 결합 버퍼가 고갈되면, 하단 캡을 교체한다. </li><li> (280 nm에서의 흡광도 또는 bicinchoninic 분석법을 사용하여 단계 2.11 용출액의 단백질 농도를 비교하여 결합 효율을 평가하기 위해, 단백질 용액의 분취 량을 유지) 컬럼에 결합 완충액 단백질 2-4 ml를 추가 . 모자와 균질 한 용액을 가지고 말을 통해 끝을 섞는다. </li><li> 빈 1.8 ML의 microcentrifuge 관의 무게를 측정하고 흄 후드로 이동합니다. 조심스럽게 미리 무게 튜브에 NaCNBH 3 (0.05 g)을 전송합니다. 튜브를 닫고 NaCNBH 3가 들어있는 튜브의 무게. 후드 외부 튜브를 열지 마십시오. </li><li> 중량 기준NaCNBH 3은 튜브로 옮기고 1 M NaOH를 첨가하여 5 M 용액을 만든다. NaCNBH (3)의 분자량은 62.84 g 따라서는 0.05 g (0.05 / 62.84 = 7.96 X 10-4 몰) 7.96 X 10-4 몰과 동일하다. 5 M 용액의 추가 (7.96 × 10 -4 / 5) 1 M NaOH를 159 μl를 확인하십시오. </li><li> 반응물의 총 부피가 고려 수지 부피 복용을 측정한다. 반응 1 ㎖ 당 5 M NaCNBH 3의 10 μl를 추가합니다. <ol><li> 예를 들어 : 4 ml의 반응 볼륨 (5) M NaCNBH 3의 40 μl를 추가합니다. 수지 1 ml를 첨가하여 단​​백질과 3 ㎖를 들어, 총 4 ml의 부피이다. </li></ol></li><li> 열 캡과 끝을 통해 끝을 섞는다. 튜브 회전에 열을 안전하고 반응이 4 ℃에서 하룻밤을 계속 할 수 있습니다. </li><li> 아침에, 화학 후드에 열을 가지고 조심스럽게 약간의 가스가 형성 될 수 있으므로 뚜껑을 제거합니다. 깨끗한 튜브로 열을 배출시키고 단백질 콘을 측정하는 용출액을 절약280 nm의 방법 (12)에서의 흡광도 또는 bicinchoninic 산 분석 단계 2.6에서 출발 단백질 농도와 비교를하여 자기 중심. </li><li> 커플 링 버퍼의 4 mL로 수지를 세척하고 열 배출을 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 차단 남은 사이트 <ol><li> 버퍼를 담금질의 4 mL로 수지를 씻으십시오. 배수 및 하단 캡을 교체합니다. 버퍼를 담금질 2 ㎖를 추가하고 수지를 일시 중지합니다. </li><li> 수지 량과 담금질 버퍼 볼륨 후 반응 부피 1 ㎖ 당 5 NaCNBH M (3)의 10 μL를 추가 측정하여 총 반응 부피를 평가한다. </li><li> 30 분 엔드 오버 엔드 실온에서 부드럽게 섞는다. 30 분 후, 흄 후드의 열을 가지고. 조심스럽게 상단을 제거하고 하단 캡을 제거하고 폐기물 튜브에 열 소모를 할 수 있습니다. </li><li> 세척 용액의 5 수지 볼륨에 열을 씻으십시오. 용출액의 abso을 측정하여 잔류 단백질의 존재 여부를 모니터링 세척280 nm에서 rbance. 비 결합 단백질은 높은 염분 농도에 의해 세척. </li><li> 탈기 함유 PBS pH 7.4의 0.02 % 나트륨 아 지드 6 ml의 수지를 씻는다. 필요할 때까지 4 ° C에서 열을 유지합니다. </li></ol> Nurr1 특정 항체 4. 정제 <ol><li> PBS pH 7.4의 10 mL로 Nur77 LBD 결합 열을 씻어 열 배출을 할 수 있습니다. 컬럼의 바닥을 모자와 새로운 15 ml의 수집 관에 배수 Nur77 LBD 결합 열을 배치합니다. </li><li> 단백질 5 ml의 정제 된 안티 Nurr1 항체를 추가로 1 시간 동안 4 ℃에서 회전에 열과 장소 캡. 상단 및 하단 캡을 제거하고 통한 흐름을 수집한다. NOR1 LBD 결합 열을 추가 할 준비가 될 때까지 얼음에 따로 설정합니다. </li><li> PBS pH 7.4의 10 mL로 NOR1 LBD 결합 열을 씻어 열 배출을 할 수 있습니다. 컬럼의 바닥을 모자와 15 ml의 포집 관에 NOR1 LBD를 결합 열을 배치합니다. </li><li> Nur77 LBD 쿠데타에서 흐름을 통해 추가주도 컬럼은 1 시간 동안 4 ℃에서 회전에 열과 장소 캡. 상단 및 하단 캡을 제거하고 통한 흐름을 수집한다. </li><li> 280 nm에서 흡광도를 측정함으로써 항체 농도를 측정한다. </li></ol> 정제 된 안티 Nurr1 항체 5. ELISA 기반 분석 <ol><li> 96 웰 플레이트의 웰에 100 ㎕의 단백질 (2.5 μg의 / ㎖)를 첨가. 3 가지 단백질을 테스트하는 경우, H4에 우물 A1, H8에 우물 A5에 단백질이 100 ㎕, 및 H12에 우물 A9에 단백질 3 100 ㎕에 단백질 1의 100 μl를 추가합니다. 플레이트를 커버하고 4 ℃에서 밤새 품어. </li><li> pH 7.4의 PBS의 웰 당 300 μL로 두 번 코팅 된 웰을 세척하고, 전체 항원 코팅 된 ELISA 웰에 블로킹 완충액 300 ㎕를 추가하고 실온에서 2 시간 동안 배양한다. </li><li> 플레이트 정제 항 Nurr1 항체의 원하는 시작 희석을 준비하는 동안 차단 ELISA 블로킹 버퍼 (10 내지 100 μg의 / ㎖의 범위). </li><li> 차단의 2 시간 후, 모든 우물에 신선한 ELISA 블록 버퍼 100 ㎕와 ELISA 블록 버퍼를 교체합니다. </li><li> 직렬 C는 행 행 B에서 용액 100 μl를 전사 하였다 행 B의 웰에 로우에서 용액 100 μl를 전송하여 항체를 희석 행 A. 모든 웰에 희석 된 정제 된 안티 Nurr1 항체 100 ㎕를 추가 아래 계속하는 G가 추가 100 μl를 폐기 행의 우물에 솔루션을 혼합 한 후 샷을 행합니다. 행 H에 웰스는 버퍼를 차단의 초기 100 μl를받을 수 있습니다. 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션. </li><li> PBS 산도 7.4의 판을 0.05 % 트윈 20을 잘 당 300 μL와 3 회 반복한다 과잉 세척 버퍼를 제거 판을시킨다. </li><li> 말 무 퍼 옥시 다제 (HRP) ELISA 블록 버퍼에 희석 결합 염소 항 - 토끼 IgG를 100 ㎕ 추가 (1 : 8000 희석, 일반적인 범위는 1 : 25000 : 5000 (1)). 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션. </li><li> 판 일을 씻으십시오REE (3)은 5.6 배에 기재된. 탈 이온수 300 μL로를 작성하여 모든 우물을 씻어. 종이 흡수에 반전 판에 의해 과잉의 물을시킨다. </li><li> 모든 웰에 테트라 메틸 벤지딘 (실온으로 가온) (3)의 100 μL, 3, 5 &#39;, 5&#39;를 추가하고 실온에서 15 분간 어둠 속에서 30을 배양한다. </li><li> NH 2 SO 4 (2) 50 μl를 첨가하여 반응을 정지. </li><li> 650 nm에서 배경을 뺀 450 nm에서 흡광도를 참조하십시오. </li></ol>

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	<li>Hawk, J. D., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+NR4A+transcription+factors+in+memory+formation.">The role of NR4A transcription factors in memory formation.</a> Brain Res. Bull. 85 (1-2), 21-29 (2011).</li><li>Law, S. W., Conneely, O. M., DeMayo, F. J., O'Malley, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+new+brain-specific+transcription+factor,+NURR1.">Identification of a new brain-specific transcription factor, NURR1.</a> Mol. Endocrinol. 6 (12), 2129-2135 (1992).</li><li>Zetterstr&#246;m, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+neuron+agenesis+in+Nurr1-deficient+mice.">Dopamine neuron agenesis in Nurr1-deficient mice.</a> Science. 276 (5310), 248-250 (1997).</li><li>Kadkhodaei, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nurr1+is+required+for+maintenance+of+maturing+and+adult+midbrain+dopamine+neurons.">Nurr1 is required for maintenance of maturing and adult midbrain dopamine neurons.</a> J. Neurosci. 29 (50), 15923-15932 (2009).</li><li>Decressac, M., Volakakis, N., Bj&#246;rklund, A., Perlmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NURR1+in+Parkinson+disease--from+pathogenesis+to+therapeutic+potential.">NURR1 in Parkinson disease--from pathogenesis to therapeutic potential.</a> Nat Rev Neurol. 9 (11), 629-636 (2013).</li><li>Pe&#241;a de Ortiz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+Expression+of+the+Orphan+Nuclear+Receptor+Gene+hzf-3/nurr1+during+Spatial+Discrimination+Learning.">Hippocampal Expression of the Orphan Nuclear Receptor Gene hzf-3/nurr1 during Spatial Discrimination Learning.</a> Neurobiol Learn Mem. 74 (2), 161-175 (2000).</li><li>Vecsey, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+inhibitors+enhance+memory+and+synaptic+plasticity+via+CREB:CBP-dependent+transcriptional+activation.">Histone deacetylase inhibitors enhance memory and synaptic plasticity via CREB:CBP-dependent transcriptional activation.</a> J. Neurosci. 27 (23), 6128-6140 (2007).</li><li>Col&#243;n-Cesario, W. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+Nurr1+in+the+rat+hippocampus:+implications+to+spatial+discrimination+learning+and+memory.">Knockdown of Nurr1 in the rat hippocampus: implications to spatial discrimination learning and memory.</a> Learn Mem. 13 (6), 734-744 (2006).</li><li>McQuown, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC3+is+a+critical+negative+regulator+of+long-term+memory+formation.">HDAC3 is a critical negative regulator of long-term memory formation.</a> J. Neurosci. 31 (2), 764-774 (2011).</li><li>Hawk, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NR4A+nuclear+receptors+support+memory+enhancement+by+histone+deacetylase+inhibitors.">NR4A nuclear receptors support memory enhancement by histone deacetylase inhibitors.</a> J. Clin. Invest. 122 (10), 3593-3602 (2012).</li><li>Bridi, M. S., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NR4A+orphan+nuclear+receptors+mediate+transcription-dependent+hippocampal+synaptic+plasticity.">The NR4A orphan nuclear receptors mediate transcription-dependent hippocampal synaptic plasticity.</a> Neurobiol Learn Mem. 105, 151-158 (2013).</li><li>Gill, S. C., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+protein+extinction+coefficients+from+amino+acid+sequence+data.">Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data.</a> Anal. Biochem. 182 (2), 319-326 (1989).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Zetterstr&#246;m, R. H., Williams, R., Perlmann, T., Olson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+expression+of+the+immediate+early+transcription+factors+Nurr1+and+NGFI-B+suggests+a+gene+regulatory+role+in+several+brain+regions+including+the+nigrostriatal+dopamine+system.">Cellular expression of the immediate early transcription factors Nurr1 and NGFI-B suggests a gene regulatory role in several brain regions including the nigrostriatal dopamine system.</a> Brain Res. Mol. Brain Res. 41 (1-2), 111-120 (1996).</li><li>Xiao, Q., Castillo, S. O., Nikodem, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+messenger+RNAs+for+the+orphan+nuclear+receptors+Nurr1+and+Nur77+(NGFI-B)+in+adult+rat+brain+using+in+situ+hybridization.">Distribution of messenger RNAs for the orphan nuclear receptors Nurr1 and Nur77 (NGFI-B) in adult rat brain using in situ hybridization.</a> Neuroscience. 75 (1), 221-230 (1996).</li></ol>

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이 프로토콜의 성공은 관심의 단백질 가족의 특정 멤버에 대해 제기 항체의 특성 분석을위한 순수한 단백질의 가용성에 의존합니다. 그것은 명확히 ELISA 및 웨스턴 블롯에 의하여 상당한 교차 반응성이 있다는 것을 확립 될 때까지의 단백질 A / G를 사용하여 항체를 정제 할 필요가 없다. 본문에 언급 된 바와 같이, 이러한 트리스 나 글리신과 같은 아민 - 함유 버퍼 열로 가교 될 단백질 (들)을 현탁 피하는 것이 중요하다. 또한 가교 결합에 사용되는 최적의 단백질 농도는 실험적으로 결정되어야한다. 너무 작은 흡착 효율을 감소시킬 수있는 동안 너무 칼럼에 많은 단백질은 입체 장애의 원인이됩니다. 따라서, 좋은 방법은 2 내지 10 ㎎ / ㎖ 범위의 단백질 농도를 테스트하도록하고, 생성 된 항체의 질을 평가하는 것이다. 여러 가지 요인이 때 일 고려되어야한다기술은 매우 특이적인 항체를 생성하는 데 실패합니다. 이들은 다음을 포함한다 : 가교 효율, 면역 도메인의 손실, 및 가교 결합 된 단백질 변성. 프로토콜에 명시된 바와 같이, 너무 많거나 너무 적은 단백질이 열에 고정되는 결정은 가교 효율을 허용 모니터링. 가교 반응은 아민을 사용하여 카르복실기를 통해 탄수화물 또는 면역 통해 도메인 (들)을 파괴 고정화 의심되는 경우 고려되어야한다. 일관되게 높은 특이 적 항체를 생성하는 과정의 효율을 모니터하는 것이 중요하다. 재생을 위해, 열은 그들이 가혹한 조건 (높은 또는 낮은 pH)를 사용하여 결합 교차 반응성 항체 박탈되어야한다. 이는 가교 된 단백질의 비율이 점점 더 높은 효과적으로 열 성능을 감소 변성되게한다. ELISA 및 Weste에 차단제를 추가RN 블로 팅은 일반적으로 성공의 공정한 수준으로 사용된다. 그러나,이 영상에 기재된 방법은 성공 가능성을 증가 시키며, 반면에 교차 반응성 단백질을 대량의 유지에 대한 필요성을 감소시킨다. 시약 및 방법은 미디어 개선을 유지 크로마토 단백질을 고정화하는 바와 같이,이 접근 방법은 형질 전환 된 세포는 특정 항체를 순환의 동정에 기여한다. 이 방법은 순수한 단백질의 가용성에 의해 제한된다. 이 프로토콜의 또 다른 제한은 적절한 폴딩에 의존 단백질 도메인을 사용하고 있습니다. 단백질 도메인이 전체 단백질로서 접하지 않을 경우, 미리 흡착 전략은 세포 또는 조직의 추출액을 분석 할 때 용이 관심 단백질 부재를 식별 할 수있는 항체를 얻을 수 없다. 이익의 대부분의 단백질은 높은 아미노산 서열 상 동성을 가진 단백질 (부) 가족에 속한다. 기능 특성화 및 아이덴단백질의 분포으로 식별 할들은 각 가정 구성원에 대해 특이적인 항체의 가용성에 의존한다. 동일 패밀리 단백질 구성원 간의 높은 아미노산 상 동성이 매우 특이적인 항체를 생성하는데 어려움에 기여한다. 이러한 교차 반응 항체를 사용하면 자주 충돌하는 결과로 이어집니다. 하나의 예는 Nur77과 NOR1과 함께 핵 수용체의 NR4A 아과에 속하는 고아 핵 수용체 Nurr1입니다. 이러한 세 가지 요인 아미노산 높은 상 동성을 공유하기 때문에, 각각의 인자에 대한 항체는 각 요소의 정확한 분석을 방해하는 유의 한 교차 반응성을 나타낸다. 예로서 이러한 NR4A 부재를 사용하면, NOR1 또는 Nur77에 반응성의 높은 특정 항체 Nurr1 자유롭게 생성 할 수 있었다. LBDs는 DNA 결합 도메인보다 동성을 공유하기 때문에, 각 단백질의 LBD는 표현과 정제하고 내가하는 데 사용되었다안티 Nurr1 항체의 특이성을 mprove. ELISA에 의해 시험 및 웨스턴 블롯 분석으로 처음 Nurr1의 LBD에 대한 항체는 다른 단백질에 교차 반응의 겸손하지만 상당한 수준을 나타냈다. 단백질 정제 Nurr1 항체는 상기 Nur77 및 NOR1의 교차 반응성 LBD 도메인에 대해 미리 흡착을 통해 정제 하였다 그러나, 얻어진 Nurr1 항체는 웨스턴 블롯에 의해 검사와 같은 임의의 교차 반응을 보이지 않았고 ELISA 띄게 검출 Nurr1 분석 중뇌 지역에서 DA 뉴런을 발현. 웨스턴 블롯 데이터와 ELISA는 밀접하게 이러한 분석은 보완하고 서로를 지원할 수 있음을 나타냅니다 서로 일치 분석. 종합적으로, 이러한 항체의 정제 전략은 상동 단백질 부재에 교차 반응성을 제거함으로써 특이 적 항체를 생성하기에 매우 유용 할 것이다.

전사 인자 Nurr1 및 동족체 (Nur77 및 NOR1은) 핵 수용체 아과의 4A (NR4A 1)에 속한다. 자신의 내인성 리간드는 아직 확인되지 않기 때문에 그들은 또한 고아 수용체이다. Nurr1 먼저 1992 년에 복제되고 알려져 있지만 뇌 2로 표현되는, 개발 및 중뇌 도파민 신경 세포의 유지 보수를 위해 자사의 중요한 역할은 녹아웃 마우스 연구 (3)에 의해 밝혀졌다. 또한, 중뇌 도파민 신경 세포의 유지에 대한 중요한 역할은 최근 조건부 녹아웃 공부 (4)에 의해 입증되었다. 인해 중뇌 도파민 뉴런 Nurr1의 중요한 역할을 나타내는 이들 고급 연구에 많은 후속 연구는 주로 도파민 뉴런 및 도파민 - 관련 신경 변성 질환에 초점을 맞추고있다 중뇌 파킨슨 병 (PD) 5. 특히, Nurr1은 중뇌 도파민 (MDA) 신경 세포뿐만 아니라, 다이에서뿐만 아니라 발현강하게 Nurr1 다양한 뇌 기능에 중요한 역할을한다는 것을 보여주는 최근의 연구에 의해 지원되는 많은 비 다 분야에서 기능적인 역할을 할 수 있음을 시사 구절 뇌 영역 2. 예를 들어, 이러한 학습으로 해당 메모리 유도 활동을 보였다, 또는 다른 해마에 의존하는 작업까지 규제 해마 6,7에서 Nurr1의 발현을 초래. 또한, 다운 해마 Nurr1 발현 노크 강하게 Nurr1 많은 뇌 영역에서 다양한 역할을한다는 것을 제안하는, 장기 메모리 및 / 또는 시냅스 8-11을 저해하기에 충분했다. 따라서, 상기의 Nurr1 세포 형 특이 적 및 세포 내 발현을 이해하기 위해서는 그 동족체 Nur77 또는 NOR1 어떠한 교차 반응성을 나타내지 않는다 Nurr1 - 특이 적 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 이 논문은 그것의 특이성을 보여주는 Nurr1 특정 항체와 현재 추가 데이터를 생성하는 사전 흡착 프로토콜을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>Purified Ligand Binding Domain from Nurr1, Nor 1 and Nur77</td><td></td><td></td><td>Column Storage solution</td></tr><tr><td>AminoLink Coupling Resin and Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>44890</td><td></td></tr><tr><td>Protein A spin column</td><td>Thermo Scientific</td><td>89978</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate-Buffered Saline</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>96 well Flate-bottom plates, High Flange, 330 &amp;mu;l</td><td>Thermo Scientific</td><td>3455</td><td></td></tr><tr><td>10% Normal Goat Serum</td><td>KPL</td><td>50-675-69</td><td></td></tr><tr><td>Milk Diluent/ Blocking Concentrate&amp;nbsp;</td><td>KPL</td><td>50-82-01</td><td></td></tr><tr><td>IgG Elution Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>21004</td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Horse Radish Peroxidase conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>31460</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Resin</td><td>Thermo Scientific</td><td>88221</td><td></td></tr><tr><td>3, 3&#039;, 5, 5&#039; Tetramethylbenzydine</td><td>Thermo Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>2N H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>H381 05</td><td></td></tr><tr><td>Protein A IgG Binding Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>21001</td><td></td></tr><tr><td>IgG Elution Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>21004</td><td></td></tr><tr><td>Column Storage solution</td><td></td><td></td><td>Phosphate Buffered Saline containing 0.02% sodium azide</td></tr><tr><td>Spectra/Por 7 pre-treated dialysis tubing</td><td>Spectrum Labs</td><td>132128</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Disposable columns</td><td>Thermo Scientific</td><td>29924</td><td></td></tr><tr><td>AminoLink Coupling Buffer</td><td></td><td></td><td>0.1M sodium phosphate, 0.05% NaN3, pH 7.0</td></tr><tr><td>Quenching buffer</td><td></td><td></td><td>1M Tris. HCI, 0.05% NaN3, pH&lt;br/&gt; 7.4</td></tr><tr><td>Wash Solution</td><td></td><td></td><td>1M NaCl, 0.05% NaN3</td></tr><tr><td>ELISA Blocking buffer</td><td></td><td></td><td>1% Normal Horse serum (NHS), 1% Normal Goat Serum (NGS) in 1X KPL milk diluent</td></tr><tr><td>Storage Solution</td><td></td><td></td><td>PBS pH 7.4 containing 0.02% sodium azide</td></tr><tr><td>Micropipettes: 10 &amp;mu;l; 20 &amp;mu;l; 200 &amp;mu;l; 1000 &amp;mu;l</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

production of nurr-1 specific polyclonal antibodies free of cross-reactivity against its close homologs, nor1 and nur77

The nuclear receptor subfamily 4 (NR4A) is composed of 3 related proteins sharing a DNA binding domain (DBD) and a ligand-binding domain (LBD). The nuclear receptor related 1 protein (Nurr1 or NR4A2) plays a key role in the maintenance of the dopaminergic system. Dopamine dysfunctions associated with the Nurr1 gene include Parkinson&#8217;s disease, schizophrenia and manic depression among others. Furthermore, recent evidence indicates that Nurr1 is also expressed in other brain areas such as the hippocampus and plays critical roles for learning and memory. The other members of the family are nerve growth factor IB (Nur77 or NR4A1) and neuron-derived orphan receptor 1 (NOR1 or NR4A3). To help investigate the precise functional roles of Nurr1 in dopaminergic and other brain region-related neuronal dysfunctions antibodies devoid of cross-reactivities against Nur77 and NOR1 were needed. Since the proteins are more divergent in their LBDs than in their DNA binding domains immunization with purified LBDs should yield antibodies specific for Nurr1 with minimal reactivities against Nur77 and/or NOR1. Although anti-Nurr1 antibodies were successfully generated these showed significant immunoreactivity against the other members of the family. Affinity chromatography over immobilized Protein A followed by pre-adsorption against immobilized Nur77 and NOR1 LBDs yielded Nurr1 specific antibodies free of cross-reactivity. Here, we selectively target antibodies against a specific member of a highly conserved family of proteins by immunizing animals with their most divergent regions followed by removing cross reactive antibodies by pre-adsorption. The goal of the protocol is to increase polyclonal antibodies specificity through pre-adsorption against cross-reactive antigens.

단백질의 비교 Nur77 LBD 및 NOR1 LBD 컬럼을 통과 한 다음 정제 된 안티 Nurr1 항체가 알 수있는도 1.로 도시되어 단백질과 컬럼 정제 Nurr1 특이 항체, 단백질 A-정제 Nurr1 항체는 강한 결합을 나타내 Nurr1 LBD에. 그러나, 그것은 또한 Nur77 LBD와 NOR1 LBD에 결합 중요한 보였다. 단백질 정제 Nurr1 항체 더 Nur77 LBD와 NOR1 LBD, Nurr1 항체가 Nur77과 NOR1과의 교차 반응 이었다는 것을 보여주는, Nur77 LBD 또는 NOR1 LBD에 결합 탐지와 Nurr1 LBD에 특이 적으로 결합을 전시 정제 최종 친화력에 대해 정제 할 때 완전히 제거. 이 특이성은 더 전체 길이 Nurr1, NOR1, 또는 Nur77 단백질을 (그림 2) 태그 MYC 융합 운반하는 발현 벡터로 형질 전환 된 CHO 세포 추출물의 웨스턴 블롯 분석에 의해 입증되었다. 예상 항 myc의 antib로서odies 각 전체 길이 단백질의 예상 분자량이 발현 된 것으로 나타났습니다. ELISA 결과와 일치, 단백질 정제 Nurr1 특정 항체는 견고 전체 길이 Nurr1를 감지뿐만 아니라, 덜 효율적이지만 NOR1 및 Nur77가 감지되었습니다. 반대로, 충분히 정제 Nurr1 항체 및 ELISA에 의해 NOR1 Nur77 어떤 검출 가능한 교차 반응성을 나타내지 않았다 또는 웨스턴 블롯 분석. 마지막으로, 완전 정제 된 항체 Nurr1 MDA 뉴런의 면역 분석에 사용 하였다. 그것은 잘 그 Nurr1 설명되어 있지만 가까운 동족체 NOR1 및 Nur77은 눈에 띄게 설치류와 mRNA의 모두에서 인간의 MDA 신경 세포와 단백질 수준 14, 15로 표현하지. 완전 정제 Nurr1 항체의 사용은 거의 독점적 Nurr1 흑질 영역 MDA 뉴런 (도 3)의 핵에서 발현되는 것을 확인했다. <img alt="그림 1"SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 52963 / 52963fig1.jpg&quot;/&gt; 그림 1 :. 전 Nur77 및 NOR1 LBDs를 통과하여 정화 결합 열 단백질 정제 항 Nurr1 항체 (0.156 μg의 / ㎖) 후 () 또는 단백질이 다음에 정제 된 항 Nurr1 항체의 교차 반응성의 ELISA 비교 NOR1 및 Nur77 LBD 결합 컬럼 상 크로마토 안티 Nurr1 항체 (0.156 μg의 / ㎖) (b) Nurr1 LBD, NOR1 LBD 또는 Nur77 LBD 중 2.5 ㎍ / mL의 100 ㎕로 코팅 된 96 웰 플레이트의 웰에 첨가 하였다. 방법 섹션에서 설명 된 바와 같이 ELISA를 수행 하였다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52963/52963fig2.jpg" /> 그림 2. 전장 Nurr1의 특정 검출은 충분히 정제 Nurr1 특정 항체를 이용하여 CHO 세포에서 발현 myc의 태그 된 바와 같이 전체 길이가 Nurr1, NOR1 및 Nur77 단백질이 발현되었다융합 단백질이 CHO 세포에서 특이 적 항체 나 Myc 및 (a), 단백질 A-Nurr1 정제 항체 (b), 및 완전 정제 된 항체 Nurr1 (c)에 의해 검출. 단백질 부하 제어 (D)에 사용되는 안티 굴지 항체. 각 나 Myc 태그가 전체 길이 DNA (65, 66의 분자량 및 Nurr1 각각 Nur77, NOR1, 69 kDa의 분자량) 일시적 CHO 세포 내로 형질 감염시키고, 세포 추출물의 동일한 양이 각 레인에서 적재 하였다. 레인 1 : 빈 벡터로 형질 전환 된 CHO 세포 추출물로 구성된 음성 대조군; 레인 2 : Myc와-Nurr1; 레인 3 : Myc와 - Nur77; 레인 4 : Myc와 - NOR1. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52963/52963fig3.jpg" /> 그림 3 :. 흑질에서 완전히 정제 Nurr1 특정 항체가 특별히 티로신 수산화 양성 도파민 신경 세포를 감지 중간 뇌 도파민 신경 세포는 전자로, Nurr1에 대한 긍정적완전 정제 Nurr1 특정 항체를 사용하여 면역 조직 화학에 의해 xamined. 특히, Nurr1은 MDA 신경 세포의 핵 지역화했다. TH (티로신 수산화). 스케일 바 = 100 μm의. 흰색 상자 병합의 스케일 바는 10 μm의입니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52963/52963fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Production of Nurr-1 Specific Polyclonal Antibodies Free of Cross-reactivity Against Its Close Homologs, Nor1 and Nur77

Here, we selectively target antibodies against a specific member of a highly conserved family of proteins by immunizing animals with their most divergent regions followed by removing cross reactive antibodies by pre-adsorption.

그 닫기 동족체, NOR1 및 Nur77에 대하여 교차 반응의 Nurr-1 특정 클론 항체 무료 제작

The nuclear receptor subfamily 4 (NR4A) is composed of 3 related proteins sharing a DNA binding domain (DBD) and a ligand-binding domain (LBD). The ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

7.4K 조회수.  McLean Hospital. Here, we selectively target antibodies against a specific member of a highly conserved family of proteins by immunizing animals with their most divergent regions followed by removing cross reactive antibodies by pre-adsorption.

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High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

인간 혈청에있는 N-메틸-D-아스파 라진 산염 수용체 또는 도파민 2 수용체에 대한 항체를 검출하는 높은 처리량 유동 세포 계측법 세포 기반 분석

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

연구

의학

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that may facilitate the development of vaccines and peptide drugs. Peptide scanning is a simple and efficient method that straightforwardly maps the linear epitope recognized by a monoclonal antibody (mAb). Here, the authors present an epitope determination methodology involving serially truncated recombinant proteins, synthetic peptide design, and dot-blot hybridization for the antigenic recognition of nervous necrosis virus coat protein using a neutralizing mAb. This technique relies on the dot-blot hybridization of synthetic peptides and mAbs on a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane. The minimum antigenic region of a viral coat protein recognized by the RG-M56 mAb can be narrowed down by step-by-step trimmed peptide mapping onto a 6-mer peptide epitope. In addition, alanine scanning mutagenesis and residue substitution can be performed to characterize the binding significance of each amino acid residue making up the epitope. The residues flanking the epitope site were found to play critical roles in peptide conformation regulation. The identified epitope peptide may be used to form crystals of epitope peptide-antibody complexes for an x-ray diffraction study and functional competition, or for therapeutics.

Here, the authors present a simple and efficient protocol to define a linear antigenic epitope using a purified monoclonal antibody and peptide scanning through dot-blot hybridization. The identified epitope can then be used in therapeutic and diagnostic applications.

펩타이드 모노클로 날 항체 인식 선형 B 세포 에피토프의 확인을 스캔 보조

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

면역학 및 감염병학

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

희귀 한 항 원 특정 B 세포 혈액 순환에서 구별 인간 단일 클론 항 체의 생성

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

천연 제품에 대 한 단일 클론 항 체의 생성

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Detection of Antibodies That Neutralize the Cellular Uptake of Enzyme Replacement Therapies with a Cell-based Assay

The administration of enzyme replacement therapies (ERTs) and other biologic therapies to patients may elicit an anti-drug immune response. The characterization of these anti-drug antibodies (ADA), especially those that may neutralize the biological activity of the drug, termed neutralizing antibodies (NAbs), is crucial in understanding the effects of these antibodies on the drug&#39;s pharmacological profile. This protocol describes a cell-based flow cytometry method to detect factors that neutralize the cellular uptake of a representative lysosomal ERT in human matrix. The protocol consists of three procedures: screening, a confirmatory step, and titer assays to detect, identify, and establish the relative level of neutralizing antibody titer in subject samples.
In this method, samples are first mixed with the fluorophore-conjugated ERT product, then incubated with cells [e.g., human T lymphocytes (Jurkat cells)] that express a cell-surface cation-independent mannose 6-phosphate receptor (CI-M6PR), and finally, analyzed with a flow cytometer. A sample without NAbs will result in the uptake of the fluorophore-conjugated ERT product via CI-M6PR, whereas, the presence of NAbs will bind to the drug and interfere with the CI-M6PR binding and uptake. The amount of the fluorophore-conjugated ERT internalized by the Jurkat cells is measured by flow cytometry and evaluated as the percentage (%) signal inhibition compared to the response obtained in the presence of a representative drug-na&#239;ve matrix. In the confirmatory step, the samples are pre-incubated with ERT-conjugated magnetic beads to deplete drug-specific factors that bind to the drug (such as NAbs) prior to an incubation with cells. Samples that screen and confirm positive for drug-specific NAbs in the assay are then serially diluted to generate an antibody titer. Semi-quantitative antibody titers may be correlated with measurements of drug safety and efficacy.

Here we present a cell-based flow cytometry method to detect neutralizing antibodies or other factors that interfere with the cellular uptake of enzyme replacement therapies in a human matrix, such as cerebral spinal fluid (CSF) or human serum.

세포 기반 분석 결과와 효소 대체 요법의 세포질 통풍 관을 중화 하는 항 체의 검출

The administration of enzyme replacement therapies (ERTs) and other biologic therapies to patients may elicit an anti-drug immune response. The ...

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) Receptor in Blood

The presence of anti-NMDA receptor autoantibody can cause various neuropsychiatric symptoms in the affected patients, termed anti-NMDA receptor autoimmune encephalitis. Detection of the specific autoantibody against the NMDA receptor in the blood or cerebrospinal fluid (CSF) is essential for the accurate diagnosis of this condition. The NMDA receptor is an ion channel protein complex that contains four subunits, including two mandatory NMDA receptor subunit 1 (NR1) and one or two NMDA receptor subunit 2A (NR2A), NMDA receptor subunit 2B (NR2B), NMDA receptor subunit 2C (NR2C), or NMDA receptor subunit 2D (NR2D). The epitope of anti-NMDA receptor autoantibody was reported to be present at the extracellular N-terminal domain of the NR1 subunit of the NMDA receptor. The goal of this study is to develop a simple cell-based immunofluorescence assay that can be used as a screening test to detect the presence of autoantibodies against NR1 subunit of the NMDA receptor in the blood to facilitate the clinical and basic research of anti-NMDA receptor autoimmune encephalitis.

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate NMDA Receptor in Blood

We ectopically expressed NR1 subunit of NMDA receptor tagged with green fluorescent protein in human embryonic cells (HEK293) as antigen to detect autoantibodies against NMDA receptor in the blood of patients suspected with autoimmune encephalitis. This simple method may be suitable for screening purposes in clinical settings.

Autoantibody N-메 틸-D-Aspartate (NMDA) 수용 체에 대 한 혈액에서 검출 하는 간단한 세포 기반 면역 형광 분석 결과

The presence of anti-NMDA receptor autoantibody can cause various neuropsychiatric symptoms in the affected patients, termed anti-NMDA receptor autoimmune ...

신경과학

Profiling of the Human Natural Killer Cell Receptor-Ligand Repertoire

Natural killer (NK) cells are among the first responders to viral infections. The ability of NK cells to rapidly recognize and kill virally infected cells is regulated by their expression of germline-encoded inhibitory and activating receptors. The engagement of these receptors by their cognate ligands on target cells determines whether the intercellular interaction will result in NK cell killing. This protocol details the design and optimization of two complementary mass cytometry (CyTOF) panels. One panel was designed to phenotype NK cells based on receptor expression. The other panel was designed to interrogate expression of known ligands for NK cell receptors on several immune cell subsets. Together, these two panels allow for the profiling of the human NK cell receptor-ligand repertoire. Furthermore, this protocol also details the process by which we stain samples for CyTOF. This process has been optimized for improved reproducibility and standardization. An advantage of CyTOF is its ability to measure over 40 markers in each panel, with minimal signal overlap, allowing researchers to capture the breadth of the NK cell receptor-ligand repertoire. Palladium barcoding also reduces inter-sample variation, as well as consumption of reagents, making it easier to stain samples with each panel in parallel. Limitations of this protocol include the relatively low throughput of CyTOF and the inability to recover cells after analysis. These panels were designed for the analysis of clinical samples from patients suffering from acute and chronic viral infections, including dengue virus, human immunodeficiency virus (HIV), and influenza. However, they can be utilized in any setting to investigate the human NK cell receptor-ligand repertoire. Importantly, these methods can be applied broadly to the design and execution of future CyTOF panels.

Here we design two complementary mass cytometry (CyTOF) panels and optimize a CyTOF staining protocol with the aim of profiling the natural killer cell receptor and ligand repertoire in the setting of viral infections.

Natural killer (NK) cells are among the first responders to viral infections. The ability of NK cells to rapidly recognize and kill virally infected cells ...

Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response without any interference such as low protein expression, enzyme inactivity, or structural changes. This makes APN an attractive candidate in the development of vaccines that selectively target the mucosal epithelium. Previous studies have shown that APN is a receptor protein for both enterotoxigenic Escherichia coli (E. coli) F4 and transmissible gastroenteritis virus. Thus, APN shows promise in the development of antibody-drug conjugates or novel vaccines based on APN-specific antibodies. In this study, we compared production of APN-specific monoclonal antibodies (mAbs) using traditional hybridoma technology and recombinant antibody expression method. We also established a stably transfected Chinese hamster ovary (CHO) cell line using pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN and an E. coli expression BL21(DE3) strain harboring the pET28a (+)-rAbs-APN vector. The results show that antibodies expressed in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO cells and mAbs produced using hybridomas could recognize and bind to the APN protein. This provides the basis for further elucidation of the APN receptor function for the development of therapeutics targeting different APN-specific epitopes.

The recombinant antibody protein expressed in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO cells and monoclonal antibodies produced using traditional hybridoma technology can recognize and bind to the porcine aminopeptidase N (APN) protein.

돼지 장 점막 상피에서 아미노펩티다아제 N을 표적으로 하는 단클론 항체 생산

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response ...

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. The S domain forms a contiguous scaffold around the viral RNA, whereas the P domain forms viral spikes on the S domain and contains determinants for antigenicity and host-cell interactions. The P domain binds carbohydrate structures, i.e., histo-blood group antigens, which are thought to be important for norovirus infections. In this protocol, we describe a method for producing high quality norovirus P domains in high yields. These proteins can then be used for X-ray crystallography and ELISA in order to study antigenicity and host-cell interactions.
The P domain is firstly cloned into an expression vector and then expressed in bacteria. The protein is purified using three steps that involve immobilized metal-ion affinity chromatography and size exclusion chromatography. In principle, it is possible to clone, express, purify, and crystallize proteins in less than four weeks, which makes this protocol a rapid system for analyzing newly emerging norovirus strains.

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Here, we describe a method to express and purify high quality norovirus protruding (P) domains in E. coli for use in X-ray crystallography studies. This method can be applied to other calicivirus P domains, as well as non-structural proteins, i.e., viral protein genome-linked (VPg), protease, and RNA dependent RNA polymerase (RdRp).

인간의 노로 바이러스 돌출 도메인의 생산에<em&gt; E. 대장균</em&gt; X 선 결정학에 대한

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

생물학

A Hybridoma Technology for Producing Monoclonal Antibodies against a Metallopeptidase

Source: Xia, P., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/62437">Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video demonstrates an assay to produce monoclonal antibodies against porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase, using a traditional hybridoma technology. Upon immunizing a mouse with APN, the spleen cells are harvested and fused with immortal myeloma cells to produce hybridomas. The hybridomas are then selected and proliferated using the HAT (hypoxanthine-aminopterin-thymidine) medium to produce monoclonal antibodies specific to different APN epitopes.

그 닫기 동족체, NOR1 및 Nur77에 대하여 교차 반응의 Nurr-1 특정 클론 항체 무료 제작

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