Name: production of nurr-1 specific polyclonal antibodies free of cross-reactivity against its close homologs, nor1 and nur77
Uploaded: 2015-08-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Nurr-1 Specific Polyclonal Antibodies Free of Cross-reactivity Against Its Close Homologs, Nor1 and Nur77 at JoVE.com

This work was supported by NIH grants (NS070577 and NS084869).

Not: Aşağıda belirtilen tüm çözümlerin kompozisyon Malzemeleri / Ekipman Tablo bulunabilir. 1. Protein A Sütun Antikor Arıtma <ol><li> Bir protein A spin kolon ve önceki işleme başlamadan 15 dakika boyunca oda sıcaklığına kadar gerekli tüm tamponları dengelenmesi. </li><li> Bağışıklık serumu 1 seyreltin: 1 Protein A IgG Bağlama Tamponu ile. (Serum 5 mi tavsiye edilir). </li><li> Yavaşça kapağı açılmış olabilecek reçineyi çıkarmak için bir proteine ​​tezgah üstünde bir spin kolon dokunun. Üst kapağı çıkarın ve yavaşça alt kapatma koparmak. 15 ml toplama tüpüne sütun yerleştirin ve depolama çözümü süzülmesini bekleyin. </li><li> Bağlama Tamponu Protein A IgG 5 ml ilave edilir ve çözelti, kurumasına izin verin. </li><li> Sütuna seyreltilmiş bağışıklık serumu uygulayın ve flow-through toplamak. En iyi sonuçlar için, sütunun antikor-bağlanma capacit% 80 daha az bir antikor konsantrasyonunu içeren bir örnek hacim eklemeky. </li><li> Bağlama Tamponu Protein A IgG, 15 ml ya da 280 nm&#39;de absorbans aşağıdaki 0.1 kadar sütun yıkayın. </li><li> Beş etiketli toplama tüplerine Nötralizasyon Tamponu 100 ul ekleyin. </li><li> Protein A sütun IgG Elüsyon Tamponu 5 ml ilave edilir ve Nötralizasyon tampon 100 ul ihtiva eden tüplerin her biri, 1 ml&#39;lik fraksiyonların toplanması. </li><li> 0.5&#39;den daha büyük olan bir absorbans 280 nm ve havuz fraksiyonlar her fraksiyondan absorbansı ölçülür. Diyaliz için hazır olana kadar buz üzerinde Bir araya toplanan fraksiyonlar tutun. </li><li> IgG Elüsyon Tamponu 8 ml ekleyerek sütun yeniden oluşturun ve çözelti sütun üzerinden akmasına izin verir. </li><li> 7.4&#39;e yıkama sıvısı, pH dönene kadar Protein A IgG bağlanma solüsyonu ile sütun durulayın. </li><li> Depolama çözeltisi 5 ml (PBS içinde% 0.02 sodyum azid) eklenerek sütun saklayın. Yaklaşık 3 ml sütun, kapak altındaki kalır ve üst kapağı emniyete zaman. 4 ° C &#39;de sütun saklayın. </li><li> Uzunluk o belirleyinf Diyaliz tübü, üreticinin talimatlarına uygun olarak gerekli. 16 mm, düz çaplı boru çözeltinin ml&#39;si başına boru uzunluğunun 5.47 cm kullanımı kullanılarak diyaliz edilmesi. Boru kesme ve 15-30 dakika boyunca PBS pH 7.4 ile yıkayın. </li><li> Katlama ve diyaliz hortumun bir ucunu klip, PBS pH 7.4 içinde dengelenmiş diyaliz tüp içeren fraksiyonlar bir araya toplanmış IgG aktarmak ve diğer ucu kapatın. </li><li> 2 saat süre ile, PBS, pH 7.4, 200 hacmine karşı oda sıcaklığında Dialyze. </li><li> Diyaliz tamponu (taze PBS pH 7.4) değiştirin ve oda sıcaklığında başka bir 2 saat boyunca diyaliz. </li><li> Diyaliz tamponu (taze PBS pH 7.4) değiştirin ve 4 ° C&#39;de gece boyunca diyaliz. </li><li> Daha fazla saflaştırma adımları ile devam etmek için hazır olana kadar 4 ° C&#39;de diyaliz edilir antikor çözüm tutun. </li><li> 280 nm&#39;de absorbans kullanılarak antikor konsantrasyonuna ve 210,000 M-1 cm-1 12 ve 280 nm &#39;de antikor Molar soğurma katsayısı değerlendirin. </li></ol> LBD Proteinlerin 2. Bağlantı Bağlantı Reçine AminoLink için <ol><li> Iki sütun, Nor1 diğeri Nur77 diğer hazırlayın. Her iki protein için de aynı protokol takip edin. </li><li> Protein çözülme buz üzerinde reçineye bağlanmak üzere. Onun moler sönüm katsayısı ve 280 mil 12, emiciliğinin kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin. <ol><li> Alternatif olarak, bu bisinkoninik asit yöntemi 13 gibi bir protein tayini testi kullanılır. Protein bağlama tamponuna karşı bir amin-içeren tampon diyaliz ya da tampon alışverişi içinde eritildi edin. Protein, Uygun bir tampon maddesi içinde (serbest aminler) ise bu, bağlayıcı tampon içinde 4 kat seyreltilir. </li></ol></li><li> Protein 2 mg reçine 2 ml kullanın. Izleyen tüm adımlar 10 mi sütununda 2 mi reçine içindir. Protein 10 mg kadar reçine, 1 ml (1: bulamacın 1 2 ml) başına bağlanabilir. </li><li> Altına bir cam hamuru bastırıyor ve içinden PBS pH 7.4 çalıştırarak bir 10 ml sütun hazırlayın. Cap tO kolonun alt ve Kaplin Tampon 2 ml ekleyin. </li><li> , Kolona (reçine 2 ml elde etmek için 4 ml) çamurun istenen hacim ekleme alt kapağı çıkarın ve sütun drenaj sağlar. Bağlayıcı tampon içinde 6 ml (3 reçine yatak hacmi) &#39;in bir toplam sütun durulayın ve sütun boşalmasını sağlar. Kavrama tampon süzüldükten sonra, alt kapağı değiştirin. </li><li> (280 nm&#39;de emicilik ya bisinkoninik deneyi kullanarak adım 2.11 elüatın protein konsantrasyonu karşılaştırarak bağlanma verimliliğini değerlendirmek için protein çözeltisi bir kısım devam) kolonuna bağlayıcı tampon içinde süspansiyon haline getirilmiş protein, 2-4 ml ekleyin . Cap ve homojen bir çözüm var uca üzerine sonunu karıştırın. </li><li> Boş 1.8 ml&#39;lik ependorf tüp tartılır ve davlumbaz taşımak. Dikkatli bir şekilde önceden tartılmış bir tüp içinde NaCNBH3 (yaklaşık 0.05 g) aktarın. Tüp kapatılır ve NaCNBH3 içeren tüp tartın. Kaput dışında tüp açmayın. </li><li> Ağırlığına göreNaCNBH3, tüpüne aktarıldı, 1 M NaOH ilave edilerek 5 M bir solüsyon yapmak. NaCNBH3 moleküler ağırlığı 62.84 gr, bu nedenle 0.05 g (0.05 / 62.84 = 7.96 x 10 -4 mol) 7.96 x 10 -4 mol eşit olmasıdır. 5 M solüsyonu (7.96 x 10 -4/5), 1 M NaOH ile 159 ul yapmak için. </li><li> Reaksiyonun toplam hacmi dikkate reçine hacmi alarak ölçün. Reaksiyonun, ml başına 5 M NaCNBH3 10 ul ekle. <ol><li> Örnek: Bir 4 ml reaksiyon hacmi için 5 M NaCNBH3 40 ul ekle. Reçine 1 ml ilave protein, 3 ml için, toplam hacim 4 ml&#39;dir. </li></ol></li><li> Sütun Cap ve sonunda üzerinde sonunu karıştırın. Bir tüp döndürücü sütun Güvenli ve reaksiyon 4 ° C&#39;de gece boyunca devam edelim. </li><li> Sabah, kimyasal kaput sütun getirmek ve dikkatli bir gaz oluşmuş olabilir gibi kapağı çıkarın. Temiz bir tüp içine sütun boşaltın ve protein con ölçmek için eluatı kaydetmek280 nm yöntemiyle 12 absorbans veya bisinkoninik asit deneyi ve adım 2.6 başlayarak protein konsantrasyonu ile karşılaştırmak kullanarak santrasyonu. </li><li> Kavrama 4 ml tampon ile reçinenin yıkanır ve sütun süzdürülür. </li></ol> 3. Engelleme Kalan Siteler <ol><li> Tampon söndürülmesi 4 ml reçine yıkanır. Drenaj ve alt kapağını kapatın. Tampon söndürülmesi 2 ml ekleyin ve reçine askıya. </li><li> Reçine hacmi ve söndürme tampon hacmi daha sonra reaksiyon hacmi ml başına 5 M NaCNBH3 10 ul ekleyin ölçerek toplam reaksiyon hacmi değerlendirin. </li><li> 30 dakika ucu-üzerinde-sonu boyunca oda sıcaklığında yavaşça karıştırın. 30 dakika sonra, davlumbaz sütun getir. Dikkatle üst kaldırmak ve daha sonra alt kapağı çıkarın ve bir atık tüp içine sütun tahliye edelim. </li><li> Yıkama çözeltisi 5 reçine hacimleri ile sütun yıkayın. Taşıma ürününden en abso ölçülmesiyle bakiye proteinlerinin varlığı için yıkama Monitör280 nm&#39;de rbance. Kuplajsız proteinler yüksek tuz konsantrasyonu ile yıkanır. </li><li> Gazı alınmış, PBS, pH 7.4,% 0.02 sodyum azid, 6 ml reçine yıkanır. Gerekli olana kadar, 4 ° C &#39;de sütun tutun. </li></ol> Nurr1 Özgü Antikorlar 4. saflaştırılması <ol><li> PBS pH 7.4 10 ml Nur77 LBD bağlanmış sütun durulayın ve sütun süzdürülür. Sütunun alt Cap ve yeni bir 15 ml toplama tüpü drene Nur77 LBD birleştiğinde sütun yerleştirin. </li><li> Protein 5 ml saflaştırılmış bir anti-Nurr1 antikor ekleyin 1 saat boyunca 4 ° C &#39;de, bir döndürücü üzerinde sütun ve yer kap. Üst ve alt kapaklarını çıkarın ve akışı toplamak. Nor1 LBD birleştiğinde sütuna eklemek için hazır olana kadar buz üzerinde bir kenara koyun. </li><li> PBS pH 7.4 10 ml Nor1 LBD bağlanmış sütun durulayın ve sütun süzdürülür. Sütunun alt kapağı ve bir 15 ml&#39;lik bir toplama tüpü içinde Nor1 LBD bağlanmış sütun yerleştirin. </li><li> Nur77 LBD darbeden akışını yoluyla Ekleyol kolon, 1 saat boyunca 4 ° C &#39;de, bir döndürücü üzerinde sütun ve yer kap. Üst ve alt kapaklarını çıkarın ve akışı toplamak. </li><li> 280 nm&#39;de absorbans ölçümü ile antikor konsantrasyonu ölçümü. </li></ol> Saf Anti-Nurr1 Antikor 5. ELISA-tabanlı Analiz <ol><li> 96 oyuklu bir plakanın oyuklarına protein, 100 ul (2.5 ug / ml) ilave et. 3 farklı protein test için, H4 Wells A1, H8 Wells A5 proteinin 2, 100 ul, ve H12 kuyu A9 proteinin 3 100 ul proteinin 1. 100 ul ilave edin. Plaka Kapak ve 4 ° C&#39;de bir gece inkübe edin. </li><li> PBS pH 7.4, oyuk başına 300 ul iki kez kaplanmış oyuklarına yıkayın ve tüm antijen kaplı oyuklara ELISA Bloke edici tamponun 300 ul ilave edildi ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe et. </li><li> Plakası saflaştırılmış anti-Nurr1 antikorun arzu edilen çıkış seyreltme hazırlanması bloke edilirken ELISA bloke tamponu içinde (10 ile 100 ug / ml arasında değişen). </li><li> Engelleme 2 saat sonra, tüm oyuklara taze ELISA blok tamponunda 100 ul ELISA blok tamponu değiştirin. </li><li> Seri olarak C satır satır B çözeltisinin 100 ul aktarma ardından satır B çukurlara satır A çözeltisi 100 ul aktarma ile antikorları seyreltik satır A&#39;da tüm oyuklara seyreltildi saflaştırılmış anti-Nurr1 antikoru 100 ul ekle aşağı doğru devam G ekstra 100 ul atmak aralıksız kuyularda çözüm karıştırıldıktan sonra G. satır. Satır H Wells, sadece tampon engelleme ilk 100 ul alırsınız. 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> PBS pH 7.4 plaka,% 0,05 Tween 20, oyuk başına 300 ul olan üç (3) defa yıkayın ve fazla yıkama tamponu çıkması için plakayı blot. </li><li> Yaban turpu peroksidazı (HRP), ELISA Blok tamponu içinde seyreltilmiş biyotinle konjuge edilmiş keçi anti-tavşan IgG, 100 ul ekle (1: 8000 seyreltme, tipik bir aralığı, 1: 25,000: 5,000 ile 1 arası). 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Plaka th yıkayınREE (3) defa 5.6 de tarif edildiği gibi. Iyonu giderilmiş su, 300 ul ile doldurarak her kuyu durulayın. Emici kağıt üzerine plakayı baş aşağı çevirerek fazla suyu kurulayın. </li><li> Tüm oyuklara tetrametilbenzidin (oda sıcaklığına kadar ılıtıldı) 3 100 ul, 3 &#39;5, 5&#39;, ilave edilir ve oda sıcaklığında 15 karanlıkta 30 dakika için inkübe edilir. </li><li> SO 4 NH2 2 50 ul ilave ederek reaksiyonu durdurun. </li><li> 650 nm &#39;de bir arka plan çıkarılması 450 nm&#39;de absorbansı okumak. </li></ol>

<ol>
	<li>Hawk, J. D., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+NR4A+transcription+factors+in+memory+formation.">The role of NR4A transcription factors in memory formation.</a> Brain Res. Bull. 85 (1-2), 21-29 (2011).</li><li>Law, S. W., Conneely, O. M., DeMayo, F. J., O'Malley, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+new+brain-specific+transcription+factor,+NURR1.">Identification of a new brain-specific transcription factor, NURR1.</a> Mol. Endocrinol. 6 (12), 2129-2135 (1992).</li><li>Zetterstr&#246;m, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+neuron+agenesis+in+Nurr1-deficient+mice.">Dopamine neuron agenesis in Nurr1-deficient mice.</a> Science. 276 (5310), 248-250 (1997).</li><li>Kadkhodaei, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nurr1+is+required+for+maintenance+of+maturing+and+adult+midbrain+dopamine+neurons.">Nurr1 is required for maintenance of maturing and adult midbrain dopamine neurons.</a> J. Neurosci. 29 (50), 15923-15932 (2009).</li><li>Decressac, M., Volakakis, N., Bj&#246;rklund, A., Perlmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NURR1+in+Parkinson+disease--from+pathogenesis+to+therapeutic+potential.">NURR1 in Parkinson disease--from pathogenesis to therapeutic potential.</a> Nat Rev Neurol. 9 (11), 629-636 (2013).</li><li>Pe&#241;a de Ortiz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+Expression+of+the+Orphan+Nuclear+Receptor+Gene+hzf-3/nurr1+during+Spatial+Discrimination+Learning.">Hippocampal Expression of the Orphan Nuclear Receptor Gene hzf-3/nurr1 during Spatial Discrimination Learning.</a> Neurobiol Learn Mem. 74 (2), 161-175 (2000).</li><li>Vecsey, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+inhibitors+enhance+memory+and+synaptic+plasticity+via+CREB:CBP-dependent+transcriptional+activation.">Histone deacetylase inhibitors enhance memory and synaptic plasticity via CREB:CBP-dependent transcriptional activation.</a> J. Neurosci. 27 (23), 6128-6140 (2007).</li><li>Col&#243;n-Cesario, W. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+Nurr1+in+the+rat+hippocampus:+implications+to+spatial+discrimination+learning+and+memory.">Knockdown of Nurr1 in the rat hippocampus: implications to spatial discrimination learning and memory.</a> Learn Mem. 13 (6), 734-744 (2006).</li><li>McQuown, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC3+is+a+critical+negative+regulator+of+long-term+memory+formation.">HDAC3 is a critical negative regulator of long-term memory formation.</a> J. Neurosci. 31 (2), 764-774 (2011).</li><li>Hawk, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NR4A+nuclear+receptors+support+memory+enhancement+by+histone+deacetylase+inhibitors.">NR4A nuclear receptors support memory enhancement by histone deacetylase inhibitors.</a> J. Clin. Invest. 122 (10), 3593-3602 (2012).</li><li>Bridi, M. S., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NR4A+orphan+nuclear+receptors+mediate+transcription-dependent+hippocampal+synaptic+plasticity.">The NR4A orphan nuclear receptors mediate transcription-dependent hippocampal synaptic plasticity.</a> Neurobiol Learn Mem. 105, 151-158 (2013).</li><li>Gill, S. C., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+protein+extinction+coefficients+from+amino+acid+sequence+data.">Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data.</a> Anal. Biochem. 182 (2), 319-326 (1989).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Zetterstr&#246;m, R. H., Williams, R., Perlmann, T., Olson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+expression+of+the+immediate+early+transcription+factors+Nurr1+and+NGFI-B+suggests+a+gene+regulatory+role+in+several+brain+regions+including+the+nigrostriatal+dopamine+system.">Cellular expression of the immediate early transcription factors Nurr1 and NGFI-B suggests a gene regulatory role in several brain regions including the nigrostriatal dopamine system.</a> Brain Res. Mol. Brain Res. 41 (1-2), 111-120 (1996).</li><li>Xiao, Q., Castillo, S. O., Nikodem, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+messenger+RNAs+for+the+orphan+nuclear+receptors+Nurr1+and+Nur77+(NGFI-B)+in+adult+rat+brain+using+in+situ+hybridization.">Distribution of messenger RNAs for the orphan nuclear receptors Nurr1 and Nur77 (NGFI-B) in adult rat brain using in situ hybridization.</a> Neuroscience. 75 (1), 221-230 (1996).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu protokolün bir başarı ilgili protein ailesinin belirli bir üye karşı üretilen antikorların karakterizasyonu için, saf proteinler mevcudiyetine dayanır. Bu açık bir şekilde ELISA ve Western blot analizi ile önemli çapraz reaktivite olduğu kurulana kadar protein A / G kullanılarak antikorları saflaştırmak için bir ihtiyaç vardır. Metinde belirtildiği gibi, bu tür Tris ya da glisin gibi bir amin-ihtiva eden tampon maddesi içinde sütuna çapraz bağlanmış olduğu protein (ler) süspansiyona önlemek için önemlidir. Ayrıca çapraz bağlantısı için kullanılan uygun protein konsantrasyonu deneysel olarak tespit edilmelidir. Çok az adsorpsiyon etkinliğini azaltacaktır ise çok kolonu üzerinde daha fazla protein sterik engelleme ile sonuçlanabilir. Bu nedenle, iyi bir fikir 2 ila 10 mg / ml arasında değişen bir protein konsantrasyonunu test etmek ve elde edilen antikorlar kalitesini değerlendirmek için. Çeşitli faktörler, TH düşünülmelidirtekniği son derece spesifik antikorların verim başarısız olduğunu. Bu yöntemler şunlardır: çapraz bağlama verimliliği, immünoreaktif etki kaybı, ve çapraz bağlanmış protein denatürasyonu. Protokolde belirtildiği gibi, çok fazla ya da çok az bir protein kolonu üzerinde hareketsiz kılınmış olan belirlenmesi çapraz bağlama verimliliği sağlar izlenmesi. Çapraz bağlama reaktif aminler kullanılarak karboksilik grubu yoluyla ya da karbonhidrat ile immunoreaktif etki (ler), hareketsiz hale yok olduğundan şüpheleniliyorsa dikkate alınmalıdır. O sürekli yüksek spesifik antikorların elde etmek için prosedürün etkinliğini izlemek için önemlidir. Yenilenmesi amacıyla, sütun bunların sert koşullar (yüksek ya da düşük pH) ile bağlı olan çapraz-reaktif antikorlar olmayan olmalıdır. Bu çapraz bağlı proteinlerin giderek daha yüksek bir yüzdesi etkin kolon performansını azaltan denatüre neden olur. ELISA ve Weste bloke ajanların eklenmesirn blot yaygın bir başarı adil seviyede kullanılır. Bununla birlikte, bu video açıklanan yaklaşım, başarı olasılığını arttırır ve yandan çapraz-reaktif proteinin büyük miktarlarda muhafaza ihtiyacını azaltır. Reaktifler ve yöntemler ortam geliştirmeye devam kromatografiye proteinleri hareketsiz hale getirmek için, bu yaklaşım, transforme edilmiş hücreler, spesifik antikorların dolaşım belirlenmesine yardımcı olacaktır. Bu yaklaşım, saf proteinlerin mevcudiyeti ile sınırlıdır. Bu protokolün diğer kısıtlılığı doğru katlanması bağımlılığı protein etki kullanıyor. Protein alanları, doğal protein olarak katı yoksa, ön adsorpsiyon stratejisi hücre veya doku ekstraktları analiz edildiğinde kolayca ilgili protein elemanını belirleyebilir antikorları vermeyebilir. Çıkarlarının çoğu protein yüksek amino asit dizisi benzerliklerin proteinlerin (alt) ailelere aittir. Fonksiyonel karakterizasyonu ve kimlikleriniProteinlerin dağılımı ldirimi genellikle her bir aile üyesine karşı spesifik antikorların mevcudiyeti güveniyor. aynı aile protein üyeleri arasındaki yüksek amino asit homolojileri oldukça spesifik antikorların üretilmesi zorluğu katkıda bulunur. Bu çapraz-reaktif olan antikorları kullanılması genellikle çelişkili sonuçlar yol açar. Bu tür bir örnek, Nur77 ve Nor1 ile birlikte, nükleer reseptörlerin NR4A alt ailesine ait olan öksüz nükleer reseptör Nurr1 olup. Bu üç faktör amino asit homolojisi yüksek derecede paylaşan için, her faktörüne karşı antikorlar, her faktörün hassas analiz engelleyen önemli çapraz reaktiviteleri göstermektedir. Bir örnek olarak, bu NR4A üye kullanarak, Nor1 ya Nur77 için reaktivitelerinin oldukça spesifik Nurr1 antikorlar serbest üretmek mümkün olmuştur. LBDs DNA bağlama alanları daha az homoloji paylaştığı için, her bir proteinin LBD ifade edilir ve arıtılır ve daha sonra i için kullanılanAnti-Nurr1 antikorların spesifitesini mprove. ELISA ile incelenmiş ve Western Blot analizleri Başlangıçta, Nurr1 en LBD karşı antikorlar, diğer proteinlere çapraz reaktivite mütevazı ama önemli seviyelerde sergiledi. Protein A saflaştırılmış Nurr1 antikorlar ayrıca Nur77 ve Nor1 çapraz reaktif LBD etki karşısında önceden adsorpsiyon yoluyla saflaştınldı, ancak elde edilen Nurr1 antikor Western blot tarafından incelenmiştir gibi herhangi bir çapraz reaktivite göstermedi ELISA belirgin tespit Nurr1 analizi orta beyin alanlarında DA nöronlar -expressing. Western Blot veriler ve ELISA yakından bu analizler tamamlayıcı nitelikte ve birbirlerine destek olduğunu belirten, birbirleri ile anlaşmak analizleri. Birlikte ele alındığında, bu antikor saflaştırma stratejisi homolog protein üyelerine çapraz reaktivite ortadan kaldırarak, belirli bir antikorun üretilmesi son derece faydalı olacaktır.

Transkripsiyon faktörü Nurr1 ve homologları (Nur77 ve Nor1), nükleer reseptör alt ailesi 4A (NR4A) 1 aittir. Onların endojen ligandlar henüz tespit edilmemiş çünkü onlar da yetim reseptörler vardır. Nurr1 ilk olarak 1992 klonlandı ve bilinen, ancak beyin 2&#39;de belirtildiği üzere, geliştirme ve orta beyin dopamin nöronlarının bakımı için de önemli bir rolü nakavt fare çalışmaları 3 konuldu. Buna ek olarak, orta beyin dopamin nöronlarının bakım için çok önemli bir rol son şartlı bir nakavt çalışma 4 ile gösterilmiştir. Nedeniyle orta beyin dopamin nöronları için Nurr1 en kritik roller gösteren bu zarif çalışmalara, birçok sonraki çalışmalarda büyük ölçüde dopamin nöronları ve dopamin ile ilişkili nörodejeneratif bozukluk orta beyin odaklanmıştır, Parkinson hastalığı (PH) 5. Özellikle, Nurr1 orta beyin dopamin (MDA) nöronlarda, aynı zamanda di sadece ifade edilirşiddetle Nurr1 çeşitli beyin fonksiyonlarında önemli rol oynadığını gösteren daha yeni çalışmalar tarafından desteklenmektedir olmayan birçok DA alanlarda işlevsel rollere sahip olabileceğini düşündüren ayet beyin bölgelerinin 2. Örnekler için, bu gibi öğrenme gibi bellek indükleyici aktiviteleri gösterilir, ya da diğer hipokampus bağımlı görevler yukarı regülasyonu hipokampus 6,7 Nurr1 ifade ile sonuçlanır. Buna ek olarak, aşağı hipokampus Nurr1 ifade vurmak şiddetle Nurr1 birçok beyin bölgelerindeki çeşitli roller oynadığını düşündüren, uzun süreli hafızayı ve / veya sinaptik plastisite 8-11 zarar için yeterli oldu. Bu nedenle, daha Nurr1 hücre-tipi-spesifik ve hücre içi ifade anlamak için, onun homologları ya da Nur77 Nor1 herhangi bir çapraz reaktivite sergilemez Nurr1 özgü antikorları kullanmak için tercih edilir. Bu kağıt özgüllüğü gösteren Nurr1 özgü antikorlar ve bu ek verileri oluşturmak için bir ön-adsorpsiyonu protokolü tarif eder.

<table><tbody><tr><td>Purified Ligand Binding Domain from Nurr1, Nor 1 and Nur77</td><td></td><td></td><td>Column Storage solution</td></tr><tr><td>AminoLink Coupling Resin and Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>44890</td><td></td></tr><tr><td>Protein A spin column</td><td>Thermo Scientific</td><td>89978</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate-Buffered Saline</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>96 well Flate-bottom plates, High Flange, 330 &amp;mu;l</td><td>Thermo Scientific</td><td>3455</td><td></td></tr><tr><td>10% Normal Goat Serum</td><td>KPL</td><td>50-675-69</td><td></td></tr><tr><td>Milk Diluent/ Blocking Concentrate&amp;nbsp;</td><td>KPL</td><td>50-82-01</td><td></td></tr><tr><td>IgG Elution Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>21004</td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Horse Radish Peroxidase conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>31460</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Resin</td><td>Thermo Scientific</td><td>88221</td><td></td></tr><tr><td>3, 3&#039;, 5, 5&#039; Tetramethylbenzydine</td><td>Thermo Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>2N H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>H381 05</td><td></td></tr><tr><td>Protein A IgG Binding Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>21001</td><td></td></tr><tr><td>IgG Elution Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>21004</td><td></td></tr><tr><td>Column Storage solution</td><td></td><td></td><td>Phosphate Buffered Saline containing 0.02% sodium azide</td></tr><tr><td>Spectra/Por 7 pre-treated dialysis tubing</td><td>Spectrum Labs</td><td>132128</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Disposable columns</td><td>Thermo Scientific</td><td>29924</td><td></td></tr><tr><td>AminoLink Coupling Buffer</td><td></td><td></td><td>0.1M sodium phosphate, 0.05% NaN3, pH 7.0</td></tr><tr><td>Quenching buffer</td><td></td><td></td><td>1M Tris. HCI, 0.05% NaN3, pH&lt;br/&gt; 7.4</td></tr><tr><td>Wash Solution</td><td></td><td></td><td>1M NaCl, 0.05% NaN3</td></tr><tr><td>ELISA Blocking buffer</td><td></td><td></td><td>1% Normal Horse serum (NHS), 1% Normal Goat Serum (NGS) in 1X KPL milk diluent</td></tr><tr><td>Storage Solution</td><td></td><td></td><td>PBS pH 7.4 containing 0.02% sodium azide</td></tr><tr><td>Micropipettes: 10 &amp;mu;l; 20 &amp;mu;l; 200 &amp;mu;l; 1000 &amp;mu;l</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

production of nurr-1 specific polyclonal antibodies free of cross-reactivity against its close homologs, nor1 and nur77

The nuclear receptor subfamily 4 (NR4A) is composed of 3 related proteins sharing a DNA binding domain (DBD) and a ligand-binding domain (LBD). The nuclear receptor related 1 protein (Nurr1 or NR4A2) plays a key role in the maintenance of the dopaminergic system. Dopamine dysfunctions associated with the Nurr1 gene include Parkinson&#8217;s disease, schizophrenia and manic depression among others. Furthermore, recent evidence indicates that Nurr1 is also expressed in other brain areas such as the hippocampus and plays critical roles for learning and memory. The other members of the family are nerve growth factor IB (Nur77 or NR4A1) and neuron-derived orphan receptor 1 (NOR1 or NR4A3). To help investigate the precise functional roles of Nurr1 in dopaminergic and other brain region-related neuronal dysfunctions antibodies devoid of cross-reactivities against Nur77 and NOR1 were needed. Since the proteins are more divergent in their LBDs than in their DNA binding domains immunization with purified LBDs should yield antibodies specific for Nurr1 with minimal reactivities against Nur77 and/or NOR1. Although anti-Nurr1 antibodies were successfully generated these showed significant immunoreactivity against the other members of the family. Affinity chromatography over immobilized Protein A followed by pre-adsorption against immobilized Nur77 and NOR1 LBDs yielded Nurr1 specific antibodies free of cross-reactivity. Here, we selectively target antibodies against a specific member of a highly conserved family of proteins by immunizing animals with their most divergent regions followed by removing cross reactive antibodies by pre-adsorption. The goal of the protocol is to increase polyclonal antibodies specificity through pre-adsorption against cross-reactive antigens.

Protein bir karşılaştırması Nur77 LBD ve Nor1 LBD sütunları boyunca geçirilerek ve ardından bir saflaştırılmış anti-Nurr1 antikorları görülebilir Şekil 1. As gösterilmiştir, Protein A sütun saf hale Nurr1-spesifik antikorlar, protein-A saf hale Nurr1 antikor güçlü bir bağlanma sergilemiştir Nurr1 LBD&#39;sine. Bununla birlikte, aynı zamanda Nur77 LBD ve Nor1 LBD bağlanmasını belirgin göstermiştir. Protein A saflaştırılmış Nurr1 antikorlar ayrıca Nur77 LBD ve Nor1 LBD, Nurr1 antikorları Nur77 ve Nor1 olan çapraz reaktivite olduğu gösteren, Nur77 LBD veya Nor1 LBD bağlanma saptanamaz ile Nurr1 LBD bağlanabilen spesifik sergilenen saflaştırılmış nihai afinite karşı saflaştırılmıştır zaman tamamen kaldırıldı. Bu özgüllüğü, bundan başka, tam uzunlukta Nurr1, Nor1 veya Nur77 Protein (Şekil 2) etiketleme myc erimiş taşıyan ekspresyon vektörleri ile transfekte edilmiş CHO hücre ekstrelerinin Western blot analizi ile gösterilmiştir. Beklenen, anti myc antib olarakkuruluşları da her bir tam boyda bir protein beklenen molekül ağırlığı ile ifade edildiğini ortaya çıkarmıştır. ELISA sonuçları ile uyumlu olarak, Protein A saflaştırılmış Nurr1 özgü antikor sağlam tam uzunlukta Nurr1 tespit değil, aynı zamanda daha az etkin olsa da Nor1 ve Nur77 tespit edildi. Buna karşılık, tamamen saflaştırılmış Nurr1 ELISA ile, Nor1 ve Nur77 herhangi bir tespit edilebilir çapraz reaktivite göstermemiştir veya Western blot analizleri. Son olarak, tamamen saflaştırılmış Nurr1 antikor MDA nöronların immünohistokimyasal analizi için kullanılmıştır. O iyi ki Nurr1 belgelenmiştir, ancak yakın homologlan Nor1 ve Nur77, belirgin kemirgen ve mRNA hem de insan MDA nöronlar ve protein düzeylerinde 14,15 olarak ifade edilir değil. Tam saflaştınldı Nurr1 antikorun kullanımı Nurr1 hemen hemen tamamen, substantia nigra alanında MDA nöronlar (Şekil 3) çekirdeğinde ifade olduğunu doğruladı. <img alt="Şekil 1"src = &quot;/ files / ftp_upload / 52963 / 52963fig1.jpg&quot; /&gt; Şekil 1:. Önce ve Nur77 ve Nor1 LBDs geçirilerek saflaştırma bağlanmış kolonlar protein A saflaştırılmış anti-Nurr1 antikorları (0.156 ug / ml) sonra, (a) ya da protein A takip saflaştırılmış anti-Nurr1 antikorların çapraz reaktivite ELISA karşılaştırması Nor1 ve Nur77 LBD-bağlanmış sütunlara kromatografisi, anti-Nurr1 antikorları (0.156 ug / ml), (b) Nurr1 LBD, Nor1 LBD veya Nur77 LBD da 2.5 ug / ml 100 ul ile kaplanmış 96 kuyulu plakanın kuyularına eklendi. Yöntemi bölümünde tarif edildiği gibi ELISA gerçekleştirilmiştir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52963/52963fig2.jpg" /> Şekil 2:., Tam uzunlukta Nurr1 spesifik saptama tamamen saflaştırılmış Nurr1 özel bir antikor kullanılarak CHO hücrelerinde ifade edilen myc etiketli gibi tam uzunlukta Nurr1, Nor1 ve Nur77 proteinleri olarak ifade edildifüzyon proteinleri, CHO hücrelerinde ve myc spesifik antikorlar (a) protein-A saf hale Nurr1 antikor, (b), ve tam saflaştırılmış Nurr1 antikor (C) ile tespit edildi. Protein yükleme kontrolü (d) için kullanılan anti-aktin antikor. Her bir Myc-etiketli tam uzunlukta DNA (65, 66 arasında bir moleküler ağırlığı ve Nurr1 sırasıyla Nur77, Nor1, 69 kDa) CHO hücreleri içine geçici olarak transfekte edilmiş hücre ekstrelerinin, aynı miktarda, her bir şeride yüklendi. Şerit 1: Boş vektör ile transfekte edilmiş CHO hücreleri ekstreleri oluşan negatif kontrol; şerit 2: Myc-Nurr1; kuşak 3: Myc-Nur77; şerit 4: Myc-Nor1. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52963/52963fig3.jpg" /> Şekil 3:. Substantia nigra tamamen saflaştırılmış Nurr1 özgü antikor spesifik tirosin-hidroksilaz-pozitif dopamin nöronları tespit Orta beyin dopamin nöronları e kadar, Nurr1 için pozitiftamamen saflaştırılmış Nurr1-spesifik antikorlar kullanılarak immünohistokimya ile haller işlendi. Özellikle, Nurr1 MDA nöronların çekirdeğinde lokalize idi. TH (tirosin hidroksilaz). Ölçek çubuğu = 100 mikron. Beyaz kutu birleştirme Ölçek çubuğu 10 mikron olduğunu. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52963/52963fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Production of Nurr-1 Specific Polyclonal Antibodies Free of Cross-reactivity Against Its Close Homologs, Nor1 and Nur77 at JoVE.com

Production of Nurr-1 Specific Polyclonal Antibodies Free of Cross-reactivity Against Its Close Homologs, Nor1 and Nur77

Here, we selectively target antibodies against a specific member of a highly conserved family of proteins by immunizing animals with their most divergent regions followed by removing cross reactive antibodies by pre-adsorption.

Bu yakın homologları, Nor1 ve Nur77 karşı çapraz-reaktivite Nurr-1 spesifik olan poliklonal antikorlar Free üretimi

The nuclear receptor subfamily 4 (NR4A) is composed of 3 related proteins sharing a DNA binding domain (DBD) and a ligand-binding domain (LBD). The ...

production-nurr-1-specific-polyclonal-antibodies-free-cross

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

7.4K Görüntüleme.  McLean Hospital. Here, we selectively target antibodies against a specific member of a highly conserved family of proteins by immunizing animals with their most divergent regions followed by removing cross reactive antibodies by pre-adsorption.

Video: Production of Nurr-1 Specific Polyclonal Antibodies Free of Cross-reactivity Against Its Close Homologs, Nor1 and Nur77

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

İnsan Serum içinde N-metil-D-aspartat reseptör ya da dopamin-2 reseptör antikorları algılamak üzere yüksek verimli Flow Cytometry hücre bazlı bir deneyde

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Tıp

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that may facilitate the development of vaccines and peptide drugs. Peptide scanning is a simple and efficient method that straightforwardly maps the linear epitope recognized by a monoclonal antibody (mAb). Here, the authors present an epitope determination methodology involving serially truncated recombinant proteins, synthetic peptide design, and dot-blot hybridization for the antigenic recognition of nervous necrosis virus coat protein using a neutralizing mAb. This technique relies on the dot-blot hybridization of synthetic peptides and mAbs on a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane. The minimum antigenic region of a viral coat protein recognized by the RG-M56 mAb can be narrowed down by step-by-step trimmed peptide mapping onto a 6-mer peptide epitope. In addition, alanine scanning mutagenesis and residue substitution can be performed to characterize the binding significance of each amino acid residue making up the epitope. The residues flanking the epitope site were found to play critical roles in peptide conformation regulation. The identified epitope peptide may be used to form crystals of epitope peptide-antibody complexes for an x-ray diffraction study and functional competition, or for therapeutics.

Here, the authors present a simple and efficient protocol to define a linear antigenic epitope using a purified monoclonal antibody and peptide scanning through dot-blot hybridization. The identified epitope can then be used in therapeutic and diagnostic applications.

Peptid, bir monoklonal antikor tarafından tanınan lineer B-hücresi epitopunun belirlenmesi: Tarama destekli

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

Kanda dolaşan nadir antijen spesifik B hücreleri Discriminative insan monoklonal antikorların üretimi

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

Doğal ürünler karşı monoklonal antikorların üretimi

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Detection of Antibodies That Neutralize the Cellular Uptake of Enzyme Replacement Therapies with a Cell-based Assay

The administration of enzyme replacement therapies (ERTs) and other biologic therapies to patients may elicit an anti-drug immune response. The characterization of these anti-drug antibodies (ADA), especially those that may neutralize the biological activity of the drug, termed neutralizing antibodies (NAbs), is crucial in understanding the effects of these antibodies on the drug&#39;s pharmacological profile. This protocol describes a cell-based flow cytometry method to detect factors that neutralize the cellular uptake of a representative lysosomal ERT in human matrix. The protocol consists of three procedures: screening, a confirmatory step, and titer assays to detect, identify, and establish the relative level of neutralizing antibody titer in subject samples.
In this method, samples are first mixed with the fluorophore-conjugated ERT product, then incubated with cells [e.g., human T lymphocytes (Jurkat cells)] that express a cell-surface cation-independent mannose 6-phosphate receptor (CI-M6PR), and finally, analyzed with a flow cytometer. A sample without NAbs will result in the uptake of the fluorophore-conjugated ERT product via CI-M6PR, whereas, the presence of NAbs will bind to the drug and interfere with the CI-M6PR binding and uptake. The amount of the fluorophore-conjugated ERT internalized by the Jurkat cells is measured by flow cytometry and evaluated as the percentage (%) signal inhibition compared to the response obtained in the presence of a representative drug-na&#239;ve matrix. In the confirmatory step, the samples are pre-incubated with ERT-conjugated magnetic beads to deplete drug-specific factors that bind to the drug (such as NAbs) prior to an incubation with cells. Samples that screen and confirm positive for drug-specific NAbs in the assay are then serially diluted to generate an antibody titer. Semi-quantitative antibody titers may be correlated with measurements of drug safety and efficacy.

Here we present a cell-based flow cytometry method to detect neutralizing antibodies or other factors that interfere with the cellular uptake of enzyme replacement therapies in a human matrix, such as cerebral spinal fluid (CSF) or human serum.

Enzim replasman terapileri ile hücre tabanlı tahlil hücresel alımını nötralize antikorların tespiti

The administration of enzyme replacement therapies (ERTs) and other biologic therapies to patients may elicit an anti-drug immune response. The ...

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) Receptor in Blood

The presence of anti-NMDA receptor autoantibody can cause various neuropsychiatric symptoms in the affected patients, termed anti-NMDA receptor autoimmune encephalitis. Detection of the specific autoantibody against the NMDA receptor in the blood or cerebrospinal fluid (CSF) is essential for the accurate diagnosis of this condition. The NMDA receptor is an ion channel protein complex that contains four subunits, including two mandatory NMDA receptor subunit 1 (NR1) and one or two NMDA receptor subunit 2A (NR2A), NMDA receptor subunit 2B (NR2B), NMDA receptor subunit 2C (NR2C), or NMDA receptor subunit 2D (NR2D). The epitope of anti-NMDA receptor autoantibody was reported to be present at the extracellular N-terminal domain of the NR1 subunit of the NMDA receptor. The goal of this study is to develop a simple cell-based immunofluorescence assay that can be used as a screening test to detect the presence of autoantibodies against NR1 subunit of the NMDA receptor in the blood to facilitate the clinical and basic research of anti-NMDA receptor autoimmune encephalitis.

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate NMDA Receptor in Blood

We ectopically expressed NR1 subunit of NMDA receptor tagged with green fluorescent protein in human embryonic cells (HEK293) as antigen to detect autoantibodies against NMDA receptor in the blood of patients suspected with autoimmune encephalitis. This simple method may be suitable for screening purposes in clinical settings.

N-metil-D-Aspartat (NMDA) reseptör karşı antikor kanında tespit etmek için basit hücre tabanlı ayirt tahlil

The presence of anti-NMDA receptor autoantibody can cause various neuropsychiatric symptoms in the affected patients, termed anti-NMDA receptor autoimmune ...

Nörobilim

Profiling of the Human Natural Killer Cell Receptor-Ligand Repertoire

Natural killer (NK) cells are among the first responders to viral infections. The ability of NK cells to rapidly recognize and kill virally infected cells is regulated by their expression of germline-encoded inhibitory and activating receptors. The engagement of these receptors by their cognate ligands on target cells determines whether the intercellular interaction will result in NK cell killing. This protocol details the design and optimization of two complementary mass cytometry (CyTOF) panels. One panel was designed to phenotype NK cells based on receptor expression. The other panel was designed to interrogate expression of known ligands for NK cell receptors on several immune cell subsets. Together, these two panels allow for the profiling of the human NK cell receptor-ligand repertoire. Furthermore, this protocol also details the process by which we stain samples for CyTOF. This process has been optimized for improved reproducibility and standardization. An advantage of CyTOF is its ability to measure over 40 markers in each panel, with minimal signal overlap, allowing researchers to capture the breadth of the NK cell receptor-ligand repertoire. Palladium barcoding also reduces inter-sample variation, as well as consumption of reagents, making it easier to stain samples with each panel in parallel. Limitations of this protocol include the relatively low throughput of CyTOF and the inability to recover cells after analysis. These panels were designed for the analysis of clinical samples from patients suffering from acute and chronic viral infections, including dengue virus, human immunodeficiency virus (HIV), and influenza. However, they can be utilized in any setting to investigate the human NK cell receptor-ligand repertoire. Importantly, these methods can be applied broadly to the design and execution of future CyTOF panels.

Here we design two complementary mass cytometry (CyTOF) panels and optimize a CyTOF staining protocol with the aim of profiling the natural killer cell receptor and ligand repertoire in the setting of viral infections.

Natural killer (NK) cells are among the first responders to viral infections. The ability of NK cells to rapidly recognize and kill virally infected cells ...

Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response without any interference such as low protein expression, enzyme inactivity, or structural changes. This makes APN an attractive candidate in the development of vaccines that selectively target the mucosal epithelium. Previous studies have shown that APN is a receptor protein for both enterotoxigenic Escherichia coli (E. coli) F4 and transmissible gastroenteritis virus. Thus, APN shows promise in the development of antibody-drug conjugates or novel vaccines based on APN-specific antibodies. In this study, we compared production of APN-specific monoclonal antibodies (mAbs) using traditional hybridoma technology and recombinant antibody expression method. We also established a stably transfected Chinese hamster ovary (CHO) cell line using pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN and an E. coli expression BL21(DE3) strain harboring the pET28a (+)-rAbs-APN vector. The results show that antibodies expressed in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO cells and mAbs produced using hybridomas could recognize and bind to the APN protein. This provides the basis for further elucidation of the APN receptor function for the development of therapeutics targeting different APN-specific epitopes.

The recombinant antibody protein expressed in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO cells and monoclonal antibodies produced using traditional hybridoma technology can recognize and bind to the porcine aminopeptidase N (APN) protein.

Domuz Bağırsak Mukozal Epitelinde Aminopeptidaz N'yi Hedef Alan Monoklonal Antikorların Üretimi

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response ...

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. The S domain forms a contiguous scaffold around the viral RNA, whereas the P domain forms viral spikes on the S domain and contains determinants for antigenicity and host-cell interactions. The P domain binds carbohydrate structures, i.e., histo-blood group antigens, which are thought to be important for norovirus infections. In this protocol, we describe a method for producing high quality norovirus P domains in high yields. These proteins can then be used for X-ray crystallography and ELISA in order to study antigenicity and host-cell interactions.
The P domain is firstly cloned into an expression vector and then expressed in bacteria. The protein is purified using three steps that involve immobilized metal-ion affinity chromatography and size exclusion chromatography. In principle, it is possible to clone, express, purify, and crystallize proteins in less than four weeks, which makes this protocol a rapid system for analyzing newly emerging norovirus strains.

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Here, we describe a method to express and purify high quality norovirus protruding (P) domains in E. coli for use in X-ray crystallography studies. This method can be applied to other calicivirus P domains, as well as non-structural proteins, i.e., viral protein genome-linked (VPg), protease, and RNA dependent RNA polymerase (RdRp).

İnsan Norovirüs çıkıntılı Domains üretimi içinde<em&gt; E. E. coli</em&gt;, X ışını Kristallografi için

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

Biyoloji

A Hybridoma Technology for Producing Monoclonal Antibodies against a Metallopeptidase

Source: Xia, P., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/62437">Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video demonstrates an assay to produce monoclonal antibodies against porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase, using a traditional hybridoma technology. Upon immunizing a mouse with APN, the spleen cells are harvested and fused with immortal myeloma cells to produce hybridomas. The hybridomas are then selected and proliferated using the HAT (hypoxanthine-aminopterin-thymidine) medium to produce monoclonal antibodies specific to different APN epitopes.

Bu yakın homologları, Nor1 ve Nur77 karşı çapraz-reaktivite Nurr-1 spesifik olan poliklonal antikorlar Free üretimi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler