저자 아무 승인 있다.

인간의 행렬 승인 그들의 기관 검토 위원회 (IRB)에서 상용 소스 로부터 구입 했다 하지만 잠재적으로 감염 치료를 해야 합니다. 사용 하는 실험실 환경 안전12의 문화를 유지 확인 합니다.
1. 분석 결과 시작 하기 전에
<ol><li>ERT 활용 streptavidin 자석 구슬 제조 업체의 지침13에 따라 준비 합니다.</li>
	<li>
품질 관리 샘플 (QCs) 준비: 종의 매트릭스 (예를 들어, 풀링된 CSF 또는 혈 청)에 긍정적인 제어 항 체 (PC) (예를 들어,는 NAb) 스파이크. 참고: FDA 및 EMA 지도 분석 결과 검증 및1,14테스트 루틴에 대 한 높은 그리고 낮은 QC 준비 권장 합니다.<ol>
<li>예를 들어 10 µ g/mL에서 QC를, 1000 µ L의 전체 볼륨에 대 한 (예를 들어, CSF) 관련 매트릭스의 990 µ L에 1 mg/mL 재고 긍정적인 통제의 10 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>Aliquot 볼륨 단일에 대 한 적합 한 QC 샘플 (예를 들어, 50 µ L) 사용 하 고 aliquots-60-80 ° C1에서 고정.</li>
		<li>약 수를 잘라 포인트-제어 (CC), 종의 매트릭스는 단일 테스트 문서 (예를 들어, 풀링된 CSF 또는 혈 청) 치료 하지 않을 (예를 들어, 50 µ L) 사용 하 고 aliquots-60-80 ° C1에서 고정.</li>
	</ol>
</li>
	<li>활용 반응에 fluorophore와 ERT 제조업체의 프로토콜15에 따라 단백질 라벨 키트를 사용 하 여 수행 합니다. Aliquot 볼륨 단일 적합에 샘플 사용 (예를 들어, 50 µ L)와 동결-60-80 ° c에 aliquots</li>
</ol>2. 주 1: 셀 도금 및 샘플 준비
<ol><li>
셀 접시 준비
	<ol>
<li>조직 문화 후드를 사용 하 고 다음 단계에 대 한 무 균 환경을 유지. 70% 에탄올과 후드에 배치 됩니다 깨끗 한 환경16,,1718를 유지 하는 각 개체를 스프레이.</li>
		<li>37 ° C19에서 물 또는 목욕에서 따뜻하게 셀 성장 매체 (예를 들어, 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 1% 페니실린-스와 RPMI-1640).</li>
		<li>수 인간 T 림프 톨 Jurkat 세포 및 플레이트 100 µ L 당 96 잘 라운드-하단에 105 셀/mL x 7.5에서 잘 문화 접시 접시 로더를 갖춘 교류 cytometer에서 사용 하기 위해 적절 한 세포.<ol>
<li>예를 들어 셀20,21을 계산 하는 hemocytometer 또는 자동화 된 셀 카운터 사용 합니다.</li>
			<li>셀 적어도 70%를 갖도록 생존 실험을 진행 하기 전에 (예를 들어, trypan 푸른 얼룩과 생존 능력 평가)17.</li>
		</ol>
</li>
		<li>14-20 h에 대 한 하룻밤 5% CO2 와 95% 습도 37 ° C 배양 기에서 세포를 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
샘플 준비 검사
	<ol>
<li>주제를 희석 또는 혈 청 자유로운 매체 (예를 들어, RPMI-1640)를 사용 하 여 컨트롤 샘플 분석 결과. 여기 예제에서는 메서드에서 RPMI-1640 년에 샘플 1:2.5 혈 청 자유로운 매체의 90 µ L을 샘플의 60 µ L을 추가 하 여 희석. (예를 들어, 8 스트립 튜브). 3.1 fluorophore 표시 된 ERT를 준비 하는 분석 결과 절차 단계로 진행 합니다. 참고: 1:2.5의 희석 실험적으로 결정 했다 고 여기 제시 하는 방법에 대 한 최적입니다. 개발 된 각 방법에 대 한 최적의 샘플 희석을 결정 되어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
확실 한 비드와 샘플 준비
	<ol>
<li>확실 한 샘플에 필요한 ERT 활용 된 구슬의 수를 계산 합니다.<ol>
<li>예를 들어, 10 샘플 사용 샘플 + 30% 추가 세척 단계 동안 손실에 대 한 보상 ERT 활용 된 구슬의 10 샘플 x 100 µ L = 1300 µ L ERT 활용 된 구슬의.</li>
		</ol>
</li>
		<li>소용돌이 구슬 철저 하 게. 세척에 대 한 15 mL 원뿔 튜브를 구슬의 계산 된 번호를 추가 합니다.</li>
		<li>ERT 활용 자석 구슬 커플링 버퍼 또는 (예를 들어, 0.1% 폴 20에 식 염 수 인산 염 버퍼와) 제조 업체에 의해 제안 된 1300 µ L을 추가 하 여 씻어13아래 단계를 수행.</li>
		<li>소용돌이 관 철저 하 게. 2 분 동안 자기 튜브 랙에서 튜브를 놓습니다. 방해 없이 구슬, 신중 하 게 발음 하 고는 상쾌한 삭제. 참고: 솔루션 구슬 자석에 때를 진한 갈색에서 돌 것 이다.</li>
		<li>버퍼를 커플링의 1300 µ L와 구슬 resuspend 총 4 개의 세척 세척 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>최종 세척 후 버퍼 (이전 단계 2.3.1.1에서에서 계산) 커플링의 1300 µ L에 비즈를 일시 중단 합니다. 96-글쎄, 흰색, 라운드-하단에 잘, (예를 들어, 하나의 샘플 또는 QC 당 잘 확인, fluorophore 표시 ERT와 알을 품을 때 중복으로 분할 샘플 지) 판 지도 따라 구속력이 폴 리 프로필 렌 플레이트 100 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>96-잘 측면 skirted 자석에 접시를 놓고 펠 릿을 형성 하기 위하여 비즈를 허용 합니다. 신중 하 게 맑은 상쾌한 발음 하 고 그것을 폐기. 참고: 솔루션이 바뀝니다 어둠에서 갈색에 측면 skirted 자석에 약 1-2 분 후 취소. 얻은 구슬 구슬 "건조" 라고 합니다.</li>
		<li>샘플 긍정적인 상영 확인 되는 경우 추가 100 µ L와 ERT 활용 된 구슬 없이 각 샘플의 적절 한/할당으로 잘 합니다. 접시는 플라스틱 필름으로 밀봉 하 고 실 온 (RT)에서 약 800 rpm에 회전 통에 적어도 60 분 동안 그것을 동요. 참고: 이전에 준비 하 고 긍정적이 고 부정적인 냉동 QCs와 CC 포함 되어야 합니다 모든 접시에.</li>
		<li>부 화 후 96 잘 측면 skirted 자석에 확실 한 접시 놓고 펠 릿을 형성 하기 위하여 비즈를 허용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Titer 희석 시리즈 준비
	<ol>
<li>Titer 시리즈를 준비 하려면 연속적으로 풀링된 매트릭스 포인트1을 잘라 미리 정해진된 titer를 시간의 충분 한 수에에서 샘플 희석.</li>
		<li>예를 들어 30 µ L의 샘플 8 희석 (예를 들어, 8 스트립 튜브)의 총에 대 한 1:3 희석 시리즈에서 풀링된 매트릭스의 60 µ L 혼합. 3.1 fluorophore 표시 된 ERT를 준비 하는 분석 결과 절차 단계로 진행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 주 1: 분석 결과 절차
<ol><li>
혈 청 무료 매체 (예를 들어, 잘, 또는 약 6 mL/접시 당 60 µ L)에 fluorophore 표시 된 ERT를 준비 합니다.
	<ol>
<li>예를 들어, 1 µ g/mL의 10 mL를 준비 fluorophore 표시 ERT, 재고 1 mg/mL의 10 µ L을 추가 fluorophore 표시 ERT 9.99 ml 혈 청 자유로운 매체 (예를 들어, RPMI-1640)의.</li>
	</ol>
</li>
	<li>새로운 외피 격판덮개 (예를 들어, 96-잘, 백색, 라운드-하단, 구속력이 없는 폴 리 프로필 렌 플레이트), 추가 준비 샘플에서 단계 2.2, 2.3 또는 2.4 및 중복 스 (예를 들어, 각각의 전송 60 µ L 1:1 혼합물에 fluorophore 표시 ERT 샘플을 준비 하 고 잘 당 fluorophore 표시 ERT의 60 µ L 추가). 참고: 예를 들어 실험 판 지도 그림 1에 제공 됩니다.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig1.jpg"> 그림 1: 실험 접시 레이아웃의 예. 샘플 및 fluorophore 표시 ERT는 2-8 ° c.에 하룻밤 incubated 했다 높은-품질 관리 (HQC), 낮은-품질 관리 (LQC), 및 부정적인 품질 관리 (NQC) 같은 컨트롤 상영 되었고 접시 균일성을 평가 하기 위해 접시의 반대쪽 모서리에 확인. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57777/57777fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol start="3"><li>멀티 채널 피 펫을 몇 번 위아래로 pipetting으로 샘플과 fluorophore 표시 된 ERT를 믹스. 격판덮개는 호 일에 포장 하 고 품 어 그들 하룻밤 2-8 ° C에 14-20 h에 대 한.</li>
</ol>4. 주 2: 셀에 준비 된 샘플 추가
<ol><li>2-8 ° C에 외피에서 샘플 인큐베이션 plate(s)를 제거 하 고 10-15 분 동안 37 ° C에서 구슬 목욕에 그들을 배치 하 여 접시를 따뜻하게.</li>
	<li>CO2 배양 기에서 셀을 제거 합니다. 셀 표시 우물17,19에서 건강 하 고 고르게 분산을 보장 하는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 도금된 셀의 시각적 확인을 수행 합니다.</li>
	<li>실험 접시 지도 따르면 셀 플레이트에 이전 혼합된 샘플의 fluorophore 표시 ERT 100 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>추가 샘플 셀 플레이트 37 ° c.에 CO2 배양 기에 다시 배치 3 h 및 ± 격판덮개를 품 어 15 분. 참고:이 시간으로 신호 대 잡음 응답 분석 결과에 대 한 최적의 실험실에서 설립 되었다.</li>
	<li>14-18 ° c.에 탁상 원심 분리기에서 320 x g 6 분에 대 한 세포 격판덮개 원심 격판덮개 우물의 바닥에 셀 펠 릿의 존재를 확인 합니다.</li>
	<li>30-45 ° 각도에서 접시를 개최. 셀 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한 각 우물에서 조심 스럽게 제거 합니다. 각 잘 resuspend 셀을 셀 펠 릿에 1 x DPBS의 200 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>셀 세척 총 3 세척에 대 한 단계를 반복 합니다. 얼룩이 지는 세포 생존 능력에 대 한 5 단계로 바로 진행 합니다.</li>
</ol>5. 주 2: 세포 생존 얼룩
<ol><li>멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 각 잘, fluorophore 표시 ERT의 다른 방출 파장을 선택 하 고 제조 업체의 지침22에 따라 준비를 라이브/죽은 얼룩 x 1의 작업 솔루션의 100 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>어둠 속에서 RT에서 15 분 동안 접시를 품 어. 14-18 ° c.에 탁상 원심 분리기에서 320 x g 6 분에 대 한 격판덮개 원심</li>
	<li>셀 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한 각 우물에서 조심 스럽게 제거 합니다. 씻어 셀 1 x 1 x DPBS.</li>
</ol>6. 주 2: 1 %Paraformaldehyde 셀 고정
<ol><li>멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 각 잘으로 100 µ L 냉장된 (2-8 ° C)에서 1 %paraformaldehyde (PFA)의 분배.</li>
	<li>접시와 부드럽게 혼합 펄스 소용돌이 인감. 접시는 호 일에 포장 하 고 고정을 위한 수 있도록 적어도 10 분 동안 2-8 ° C에서 그것을 배치. 참고: 접시 인감에 splashing 피하기 위해 주의 해야 합니다.</li>
	<li>분석 하기 전에 여기저기 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 각 잘으로 1 x DPBS의 50 µ L를 추가 합니다.</li>
</ol>7. Cytometry
<ol><li>플레이트 로더 교류 cytometer에 접시를 놓고 그들을 실행 합니다.</li>
	<li>습득 하 고 교류 cytometry 소프트웨어를 사용 하 여 측정 된 평균 형광 강도 (MFI) 기록 ( 재료의 표참조). 참고: 로더 설정에 대 한 예를 들어 그림 2 를 참조 하십시오. 샘플 흐름 속도 샘플 볼륨, 볼륨, 혼합 속도, 및 혼합 수 혼합이 분석 결과 대 한 최적화 되어 있다. 이러한 기준 교류 cytometry 수집 소프트웨어23에 따라 각 기준에 대 한 숫자 옆 "화살표를" 또는 "아래로" 버튼을 사용 하 여 조정할 수 있다.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig2.jpg"> 그림 2: 흐름 cytometer 로더 설정의 예. 로더 설정은 개발 된 각 분석 결과 대 한 최적화 되어야 합니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57777/57777fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol start="3"><li>cytometer 분석/빌 게이츠/플롯에 그림 3과 같이 만듭니다. 참고: 게이트 생성 및 응용 프로그램 각 흐름 cytometry 소프트웨어23에 대 한 달라질 수 있습니다.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig3.jpg"> 그림 3: 전략 게이팅 cytometry 흐름. Jurkat 세포 총 이벤트에서 분리 되었고 측면 살포 (SSC) 채널 대 앞으로 분산형 (FSC) 플로팅 게이트 대상 인구 주위를 그리기에 의해 수집 된. Singlets (단일 셀) 남자에서 분리 되었다 또는 더 큰 셀 FSC 영역을 사용 하 여 집계 (FSC-A) 및 FSC 높이 (FSC-H) 채널. 라이브 세포 내의 세포 생존 얼룩에 대 한 부정적인 게이팅에 의해 선정 됐다. 메디아 형광 강도 (MFI) 단일, 라이브 Jurkat 셀에 측정 되었다 하 고 히스토그램으로 그려집니다. 약물 흡수와 셀의 MFI 값 (예를 들어, HQC) 차단 및 제어와 셀의 통풍 관의 금액 표시는 (빨강, 파랑, 각각). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57777/57777fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol start="4"><li>분석에서 죽은 세포를 제외 하 고 대략 10000 이벤트23을 기록 합니다.</li>
</ol>8. 데이터 분석
<ol><li>(원시 MFI) 데이터 분석 소프트웨어를 내보낼 ( 재료의 표참조). 참고: 필요한 분석에 따라 다음 데이터 분석 수 있습니다 수행 분석 소프트웨어를 사용 하 여.</li>
	<li>MFI (QCs 및 샘플) 중복 우물의 평균 및 평균에서 중복의 확산 가변성 평가 하 변형 (%CV)의 계수를 계산 합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq1v2.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq2v2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq3v2.jpg">
</li>
	<li>샘플 및 QCs는 분석 결과에 상영 된 계산에 대 한 비율의 의미 MFI 상대적 금지 (%SI) 신호는 QCs 풀링된 매트릭스 CC에 대 한. <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq4v2.jpg">
</li>
	<li>필요한 경우 확인 QCs 및 해당 화면 값을 기준으로 샘플에 대 한 복구 비 (Rr)를 계산 합니다. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq5v2.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>CDER. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assay Development and Validation for Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products (Draft). , (2016).</li><li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+the+design,+optimization,+and+qualification+of+cell-based+assays+used+for+the+detection+of+neutralizing+antibody+responses+elicited+to+biological+therapeutics.">Recommendations for the design, optimization, and qualification of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody responses elicited to biological therapeutics.</a> Journal of Immunological Methods. 321, 1-18 (2007).</li><li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+the+validation+of+cell-based+assays+used+for+the+detection+of+neutralizing+antibody+immune+responses+elicited+against+biological+therapeutics.">Recommendations for the validation of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody immune responses elicited against biological therapeutics.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 55, 878-888 (2011).</li><li>Pedras, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAb+me+well-+FDA+Regulatory+Perspectives+on+Neutralizing+Antibody+Assays.">NAb me well- FDA Regulatory Perspectives on Neutralizing Antibody Assays.</a> BEBPA Forum. , (2015).</li><li>Stovold, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAB+Assay+Development+and+Validation+Immunogencity+Workflow.">NAB Assay Development and Validation Immunogencity Workflow.</a> Annual BEBPA Bioassay Meeting. , (2013).</li><li>Kromminga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neutralizing anti-drug antibodies Emerging Trends and Clinical Impact. 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R. A., Plutner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+and+Degradation+of+Macrophage+Fc+Receptors+Bound+to+Polyvalent+Immune+Complexes.">Internalization and Degradation of Macrophage Fc Receptors Bound to Polyvalent Immune Complexes.</a> The Journal of Cell Biology. 98, 1170-1177 (1984).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibodies+to+the+therapeutic+enzymes:+considerations+for+testing,+prevention+and+treatment.">Neutralizing antibodies to the therapeutic enzymes: considerations for testing, prevention and treatment.</a> Nature Biotechnology. 26, 901-908 (2008).</li></ol>

저자는 직원 및 BioMarin 제약 주식회사의 주주

중화 항 체 또는 CI M6PR 통해 ERT 통풍 관을 방지 기타 요인 ERT 안전 이나 효능1영향을 미칠 가능성이 있다. 따라서, 그것은 강력한 모델 관련 약물의 행동의 메커니즘을 사용 하 여 제목 샘플에서 NAbs를 평가 하는 것이 중요입니다. 우리와 다른 것으로 나타났습니다 일부 생물 검정 형식 (예:수용 체 이합체 화, luciferase 식, 등)의 성능 분석 결과 정밀도, 재현성, 고 감도 대 한 보건 기관 권장 일치 하지 29. 여기 설명 하는 검정 방법을, Jurkat 세포 생 CI M6PR 나타내는 NAbs lysosomal ERT 통풍 관에 특정 모니터링 하 고용 된다. 교류 cytometry 판독을 결합해,이 분석 결과 적합 한 분석 결과 정밀도, 감도, 재현성, 및 높은 샘플 처리량 생리 셀 모델을 사용 합니다. 탐지를 잡을 수는 흐름 cytometry 판독도에 적용 된 다른 표시. 예를 들어 메서드 간염 E과 adeno 관련 바이러스 (AAV)30,31에 대 한 기존의 항 체를 검출 하기 위하여 개발 되었습니다.
중요 한 단계는 프로토콜에 적합 한 fluorophore, 모니터에 감도, 시험 세포 생존 능력의 충분 한 수준을 보장 하 고 부 화 시간에 엄격한 준수를 유지 관리 하는 LQC 통합을 선택 포함 됩니다. 여기에 제시 된 예에 fluorophores (예를 들어, 알 렉 사 Fluor 488, 알 렉 사 Fluor 647, 및 사이 퍼 5e), lysosomal ERT, 그들의 성능에 광범위 하 게 변화를 활용. 밝은 fluorophore 테스트32는 또한, 알 렉 사 Fluor 647 추가 분석 결과 개발에 대 한 선정 됐다. 여러 fluorophores 최고의 감도 및 동적 범위를 제공 하는 분석 결과의 개발 초기에 평가 하는 것이 좋습니다. 샘플 테스트 하는 동안 분석 결과 감도 테스트 실행1의 1%에 실패 합니다 감도 제한에 근접 하는 LQC를 포함 하 여 모니터링 해야 합니다. HQC, 함께 LQC 역할도 시스템 적합성 QC 시간3분석 결과 드리프트 모니터링 한다. 최적의 세포 생존 능력 및 성능을 단일 사용 aliquots의 세포 은행을 준비 하 고 비교 QC 결과3,18에 따라 새로운 세포 은행에 한정 함으로써 이루어집니다. 약물 흡수 증가 약물 세포와 알을 품는 시간 이후 셀 및 fluorophore 활용 된 마약 보육 시간 일관성 분석 결과 성능 중심도 있습니다. 약물 흡수에 일상적인 변화를 최소화 하기 위해 샘플 데이터 (예를 들어, 위의 방법에서 컷된 포인트 제어 샘플) 각 접시에 풀링된 매트릭스 제어 샘플 정규화 수 있습니다. 일관 된 데이터를 생산 하는이 방법에 또 다른 중요 한 요소 플레이트 균일성을 모니터링 하 고 가능한 가장자리 효과 최소화 하는 것입니다. 초기 실험 수행 하는 동안 더 강력한 실험 분석 결과 유효성 검사 (예를 들면, 정밀도 정확도)1동안 수행할 수 있습니다 전체 접시에 걸쳐 단일 QC를 사용 하 여 분석 결과 포함할 수 있습니다. 이 접시 지도 레이아웃33의 중요성을 보여 줍니다. 플레이트 지도 예제 에서처럼 품질 관리 샘플 배치 접시 모니터의 양쪽에 Levey 제닝스 차트34시간이 지남에 추적할 수 있는 균일.
이 분석 결과 NAbs 및 lysosomal ERT 통풍 관 억제 수 있습니다 하는 다른 요소를 모니터링 하는 동안 추가 실험 확인 한 통풍 관 억제 항 체 때문에 실시 수 있습니다. 하나의 옵션 A/G/L, 비 특정 면역 글로불린35를 묶는 단백질으로 샘플을 치료 하는 것입니다. 샘플 단백질 A/G/L 고갈 후 긍정적인 테스트를 계속 해 서, 비 항 체 억제 요소 차단 약물 이해에 대 한 책임 수 있습니다. 여기에 설명 된 메서드는 항 체 중재 통풍 관 억제, 그리고 긍정적인 통제 및 다른 분석 결과 비 항 체 억제 요인으로 주제 샘플의 높은 비율로 발견 되 면 재검토 해야 하는 매개 변수를 측정 하도록 설계 되었습니다.
분석 결과 약물의 행동의 메커니즘에 따라 적절 한 세포질 구획에 fluorophore 라는 마약 교통 정체를 보여 주기 위해 추가 특징 수 있습니다 또한. 여기에 제시 된 예제는 ERT CI M6PR 세포 표면에 바인딩 하는 리소좀에 교통으로 예상 된다. 우리 이전 보고 있음을 나타내는 여러 가지 실험의 결과 거의 모든 리소좀8ERT fluorophore 표시에서 메서드 결과에서 관찰 하는 형광 신호. 우리는 ERT fluorophore 표시 신호 cytochalasin 방해 말라 개편의 억제를 통해 국제화 B에 포함 된 셀의 치료를 다음과 탈락 했다 발견. 또한, 4 ° C에서 셀을 배치 하 여 외부 fluorophore trypan 파랑, 또는 둔화 국제화와 침묵 실험 나타냅니다 fluorophore 표시 ERT 빠르게 내 면 아주 작은 형광은 세포 표면에 바운스되는 ERT. Lysosomal 타겟팅 fluorophore 활용 된 마약 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 pH에 민감한 lysotracker 염료의 공동 지역화를 머릿속으로 확인 됐다. CI-M6PR 통해 통풍 관에 대 한 특이성 수 있습니다 또한 수용 체 바인딩에 대 한 레이블이 약물과 경쟁 하기 위해 exogenous M6P를 사용 하 여 확인할 수 있습니다. 비슷한 실험 이해 속도 론 및 다른 분석 실험에 fluorophore 활용 된 약물의 세포 지역화 확인 수행 되어야 한다.
이 세포 기반 분석 플랫폼 NAbs CI M6PR 수용 체 중재 된 endocytosis를 활용 하는 치료 약물에 대 한 연구에 사용 되었습니다. 우리는 최근 elosulfase 알파36,37NAb 및 약물 효능의 개발 사이의 상관 관계가 입증이 분석 결과 플랫폼을 사용 하 여 결과 보고 했다. 임상 샘플 테스트, 매개 변수, 분석 결과 감도, 정밀도, 선택도, 특이성, 약물 내성, 견고성를 포함 하 여 분석 결과 유효성을 검사 하 여 포인트를 잘라 설립된 guidances3, 평가 되어야 한다 4. 또한 주목 해야 한다, lysosomal ERTs 대 NAbs 효소 촉매 사이트 근처 바인딩을 통해 마약 활동을 방해 하는 잠재력을 개발할 수 있습니다. 일반적으로, 우리는이 유형의 NAb는 리소좀의 가혹한 산 성 및 분해 환경 ERT 항 체 상호 작용2,,3940에 유리한 있기 때문에 우선 순위가 낮은의 수를 모니터링을 고려 합니다. 그러나, 그것은 분해 방지 NAbs 존재 및 약40의 촉매 부분을 억제 수 있습니다. 이 분석 결과 모니터 fluorophore 표시 ERT 글귀는 리소좀 및 분석 결과의 제한에 분해 방지 NAbs 모니터링 하는 무 능력 이다. NAb의이 종류는 안전 또는 효 험 데이터에 따라 의심 되, ERT 활동을 모니터링 하는 분석 결과 개발 하 고 샘플을 테스트 하는 데 사용 해야 합니다.
Immunogenicity의 평가 마약 안전 및 효 험에 NAbs의 효과 이해에서 중요 하다. 생체 외에서 마약 통풍 관을 통해 CI M6PR 억제 능력이 NAbs의 식별 NAb 활동 비보를 이해 하기 위한 기회를 제공 합니다. 여기에 제시 된 방법 CI-M6PR fluorophore 활용 lysosomal ERT 세포질 통풍 관의 간섭 측정을 표현 하는 인간 세포 선을 활용 합니다. 이 방법은 이미 NAbs lysosomal 저장 질병을 치료 하기 위한 여러 ERTs에 대 한 모니터링 하는 데 사용 되었습니다. 이 분석 결과 플랫폼 그들의 적절 한 기능에 대 한 셀룰러 국제화를 필요로 하는 생물 학적 치료제에 NAbs의 효과 연구를 위한 다른 방법을 적용할 수 있습니다.

Immunogenicity 평가 안전 성과 효능 모니터링 ERTs 포함 모든 생물 학적 치료 제품에 대 한 프로그램의 중요 한 부분입니다. 환자는 약물 안전, 효능, 그리고 pharmacokinetic pharmacodynamic 프로필 직접 영향을 수 있는 면역 반응을 개발할 수 있습니다. NAbs, 라는이 ADA의 하위 집합 두 가지 방법으로 ERT 효능을 억제 수 있습니다: 대상된 셀 또는 ERT 촉매 활동을 억제 함으로써 ERT 통풍 관의 억제를 통해. 여기에 제시 된 방법 측정 NAbs ERT 통풍 관 세포로 방해 하는 설계 되었습니다. 안전과 치료 ERT의 효능을 완벽 하 게 모니터링 하려면 NAbs의 지속적인 모니터링 elucidating 임상 결과 또는 pharmacodynamic 효과1어떤 잠재적인 상관 관계에서 결정적 이다.
NAbs 단백질 치료제에 대 한 평가 대 한 플랫폼 포함 셀 기반, 효소 활동 및 ligand 바인딩 분석1. 다양 한 기준에 따라 최적의 분석 결과 플랫폼 선택: vivo에서 치료 제품, 분석 결과 플랫폼 감도, 선택도, 정밀도, 및 중요 한 것은,의 금지 행동을 모방 하는 능력의 행동의 메커니즘 NAbs . Ligand 바인딩 분석 실험은 특정 경우에 있을 수 있습니다 (예를 들어, 관련 셀 라인을 식별할 수 없는 경우 또는 세포 기반 분석 결과에 적절 한 감도 얻을 수 없는 경우). 그러나, 산업 문서 및 다른 업계에서 수용 된 백서에 대 한 2016 초안 FDA 지침, 셀 기반 NAb 분석 실험 때문에 그들은 더 나은 있습니다 것이 좋습니다 반영1,2 생체 내에서약물의 생물 학적 메커니즘 , 3.
교류 cytometry 셀 기반 NAb 분석 결과 개발 하기 위한 중요 한 구성 요소는 적합 한 셀 하 포함 약 자극, 대리 긍정적인 제어 응답 중화는 ERT, fluorophore 활용 ERT 및 생물학적 테스트 종 NAb 매트릭스4,,56. 셀 라인 선택 행동의 ERT 메커니즘에 의존 하 고 여러 셀 라인 분석 결과 개발3중 평가 한다. 여기 설명 하는 방법을 인간의 Jurkat T 세포 세포 표면에 항 체 단편 수용 체 (FcRs)을 무차별 대부분 항 체7,8의 Fc 지역의 부족 그들의 생 CI M6PR 식 선정 됐다 . 분석 결과 개발 하는 동안 유효성 검사 연구와 테스트, 테스트 문서1치료 하지 개인에서 풀링된 혈 청 등 환자 샘플에 대 한 부정적인 통제 설정 중요 하다. 셀 라인 또한 약물 개발1의 nonclinical, 임상, 및 사후 마케팅 단계에 걸쳐 연속성에 대 한 다른 종에서 관련 행렬을 용납 한다. 다른 구성 요소 분석 결과 긍정적인 통제의 선택 이다. ERT 셀 이해 분석 결과 대 한 긍정적인 컨트롤 바인딩 치료과 CI M6PR9,1를 통해 이해를 무력화 하는 기능에 따라 선택 되었다. 희귀 질환 환자 인구2에서 특히 분석 결과 컨트롤로 사용 하기 위해 인체에서 유용한 또는 지속 가능한 양의 중화 antisera 얻기 위해 자주 어렵습니다. 대안 하이퍼 예방 접종 동물, 또는 선호도 정화 polyclonal 또는 단일 클로 널 항 체 분석 결과 관련 매트릭스1에 아군에서 antisera를 포함 합니다. 종의 매트릭스를 사용 하 여, 매트릭스에 존재 하는 항 체 이외의 금지 요인 ERT 통풍 관 억제 수 있습니다 가능 하다. 분석 결과의 또 다른 중요 한 구성 요소가 이다 fluorophore 활용 ERT. ERT 활용에 대 한 fluorophore의 선택은 밝기, pH 안정성, 그리고 교류 cytometer에 다른 채널에 잠재적인 스펙트럼 중첩에 대 한 분석 결과 필요에 따라 각 ERT에 대 한 평가 되어야 한다.
여기서 설명 하는 분석 결과 ERT는 셀 통해 CI M6PR 들어가는 등 치료 단백질, NAb 측정에 대 한 예입니다. 여러 ERTs, lysosomal 저장 장애 (LSDs) 치료, elosulfase 알파 A Morquio 증후군, CLN2 고정 편 질병에 대 한 cerliponase 알파, Fabry 질병에 대 한 agalsidase 알파를 포함 하 여 세포 통풍 관 및 lysosomal 타겟팅이 통로 활용 하기 위한 고 Pompe 질병10,11alglucosidase 알파. 이 방법의 목적은 마약 바인딩 및 국제화를 통해 CI M6PR 방해 NAbs의 상대적 수준을 측정 하는 것입니다. 이 계층 검사, 확인, 및 titer에서 수행 단계3. 샘플 먼저 NAb 양성 위한 상영 되며 다음 확인 단계에서 긍정적인 확인. 마지막으로, 샘플 화면 하 고 긍정적인 확인을 항 체 titer1생성 하 순차적으로 희석 수 있습니다. 이 셀 기반 흐름 cytometry 약물 이해 분석 결과는 측정 하는 약물의 약리 프로 파일에 영향을 미칠 수 있는 약물 관련 NAbs의 민감하고 mechanistically 관련 생체 외에서 방법을 제공 합니다. 우리는 이전 메서드를 유효성을 검사 하 고 약 elosulfase 알파8이 플랫폼을 사용 하 여 임상 샘플 테스트. 여기는 다른 치료 단백질 또는 ERTs에 적용할 수 있습니다 상세한 단계별 프로토콜에 설명 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter unit, 500 mL vacuum filter flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Bottom 96-well culture plates</td>
			<td>Thermo-Nunclon</td>
			<td>163320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile reagent reservoirs</td>
			<td>VistaLab</td>
			<td>3054-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well white round bottom polystyrene microplate plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Polypropylene Tubes, 8-Tube Strips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bead separator tube rack</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc</td>
			<td>VP 772F2M-1, VP 772F2R-2, VP 772F2R-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag -2 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag -96 Side Skirted Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD High Throughput Sampler (HTS)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1450103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12620-928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galaxy MiniStar Microcentrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>C1413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue culture CO2 incubator</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Labcono</td>
			<td>Purifier Cell Logic +</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jurkat Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB152&#8482;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A20173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M270 Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 1X Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10491-01-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep (100X) liquid formulation</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X DPBS without calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Para-formaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>15735-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pooled human matrix (e.g. human serum or cerebrospinal fluid)</td>
			<td>Bioreclamation IVT</td>
			<td>request a quote from website</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Polyester Plate Film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seal &#38; Sample Aluminum Foil</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>538619</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of antibodies that neutralize the cellular uptake of enzyme replacement therapies with a cell-based assay

효소 대체 요법 (ERTs)의 관리 및 다른 생물 학적 치료 환자에 게 마약 방지 면역 반응을 유도 수 있습니다. 특히 그 마약, 중화 항 체 (NAbs)를 나의 생물 학적 활동을 무력화 수 있습니다 이러한 마약 방지 항 체 (ADA)의 특성은 약물의에이 항 체의 효과 이해 하는 중요 한 약리 프로 파일입니다. 이 프로토콜에서는 인간의 매트릭스에 대표 lysosomal ERT의 세포질 통풍 관을 중화 하는 요소를 검색 하는 셀 기반 흐름 cytometry 방법을 설명 합니다. 3 절차의 프로토콜 구성: 심사, 확정 단계를 감지, 분석 실험 titer 식별, 그리고 중화 주제 샘플에 항 체 titer의 상대적 수준을 확립.
이 방법에서는, 샘플 먼저 fluorophore 활용 ERT 제품 혼합 다음 셀 [예를 들면, 인간 T 림프 톨 (Jurkat 세포)] 세포-표면 양이온 독립만 노 오 스 6 인산 염 수용 체 (CI-M6PR), 표현 하는 인 큐베이 팅 하 고 마지막으로, 교류 cytometer와 분석. 반면, NAbs의 존재는 마약을 바인딩할 하 고 CI M6PR 바인딩 및 통풍 관을 방해 NAbs 없이 샘플은 fluorophore 활용 ERT 제품 통해 CI M6PR의 통풍 관에 발생 합니다. Fluorophore 활용 ERT Jurkat 세포에 의해 내 면의 양은 cytometry에 의해 측정 하 고 대표적인 약물 순진한 매트릭스 존재 얻은 응답에 비해 백분율 (%) 신호 억제로 평가. 확정 단계 샘플 미리 incubated 구슬과 ERT 활용 된 자기 세포로 부 화 하기 전에 (예: NAbs) 마약에 바인딩되는 마약 관련 요소를 고갈 하는. 샘플 화면 하 고 마약 관련 NAbs 분석 결과에 대 한 긍정적인 확인을 순차적으로 생성 한 항 체 titer를 희석 됩니다. 반 정량적 항 체 titers 약물 안전 및 효 험의 측정 상관 될 수 있습니다.

방법의 첫 날, Jurkat 세포의 냉동된 약 수는 해 동 도금, 그리고 테스트 샘플을 준비 했다. 그림 1 예제 판 지도를 보여준다. 두 번째 날, 샘플 Jurkat 세포와 혼합 하 고 약 3 시간 15 분 동안 37 ° C에서 incubated 했다. 셀 다음 세척, PFA, 고정 되었고 교류 cytometer에서 분석. 그림 2 예제 교류 cytometer 설정을 보여 줍니다.
전략 게이팅 cytometry 라이브 단일 Jurkat 세포24 (그림 3)에 fluorophore 활용 된 약물의 양을 측정 하도록 설계 되었습니다. 셀 게이트 세포질 파편을 제외 하 여 파편에서 분리 되었다 [일반적으로, 낮은 앞으로 분산형 (FSC)] 및 죽은 세포 [일반적으로, 높은 쪽 (SSC) 분산형], 분석25라이브 셀만을 떠나. 단일 셀 다음 게이트 높은 FSC 지역과 낮은 FSC 높이26제외 하 여 셀 클러스터에서 분리 되었다. 세포 생존 능력 얼룩 없이 그대로 막 죽 었 거 나 건강에 해로운 셀 표시로 치료 했다 고 추가 게이트 죽은 세포22제외를 만들었습니다. 라이브 단일 셀의 MFI fluorophore 활용 ERT 통풍 관의 분석을 위해 사용 되었다. 시험 결과 심사 하는 잠재력의 예를 들어, 대리 항 약물 항 체 긍정적인 컨트롤 [예를 들어, 높은-품질 관리 (HQC)]의 높은 금액으로 아군 매트릭스 fluorophore 활용 ERT 글귀, 결과의 낮은 MFI에 저해 약 300 (그림 3)입니다. 반면, 긍정적인 제어 항 체의 부재에서 매트릭스와 incubated 셀 높은 MFI 있어야 (MFI 그림3에서 37,830 =), fluorophore 활용 ERT의 통풍 관을 보여주는.
예를 들어 여기에 대 한 긍정적인 제어 항 체 선정 되었다 중화 (즉, CI M6PR 통해 ERT 글귀) 약물의 행동의 메커니즘에 따라. Fluorophores의 패널은 또한 테스트 하 고 최적의 분석 결과 감도 및 동적 범위1에 대 한 비교. 사이 퍼 5e는 약27의 lysosomal 대상의 추가 조치로 일부 ERTs에 관련성이 있을 수도 있습니다 산 성 pH에서의 증가 형광으로 시험 되었다. 녹색 형광 성 염료 (예를 들어, 알 렉 사 Fluor 488), 그리고 빨강 형광 염료 (예를 들어, 알 렉 사 Fluor 647) 또한 시험 되었다. 어떻게 다른 fluorophores의 예로 수행할 수 그림 4a 와 4b에 제시. 예제에서는 알 렉 사 Fluor 647 ERT (예를 들어, 낮은 PC 농도에서 높은 %SI) 우수한 감도와 넓은 동적 범위 (~ 3 크기 순서) 최상의 성능을 했다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig4v2.jpg"> 그림 4: 다른 fluorophore-ERT 어원이 같은 말에서 결과 예. (A) 분석 결과 개발 하는 동안 긍정적인 제어 (PC) 희석 곡선 평가 되어야 한다 다른 fluorophore 활용 ERTs를 사용 하 여. 예, 여기 두 fluorophore 활용 ERTs (알 렉 사 Fluor 488와 사이 퍼 5e) 6.25 µ g/mL에서와 밝은 fluorophore 활용 ERT (알 렉 사 Fluor 647) 1.56 µ g/mL에서 긍정적인 제어 NAbs의 농도 증가 하는 면 전에 서 시험 되었다. (B)이이 패널 표시 패널 A 에서 곡선 그래프로, MFI를 사용 하 여 알 렉 사 Fluor 647 활용 된 ERT를 사용 하 여 동적 범위에 상당한 증가 보여. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57777/57777fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
설명 하는 방법을 검색, 확인, 및 보간 NAb titer3의 준 양적 수준에 대 한 계층형된 접근 이다. 분석 결과 분석 결과 감도, 정밀도, 선택도, 특이성, 약물 내성, 견고성를 포함 하는 매개 변수 유효성 검사에 대 한 준비 이며 컷된 포인트에 따라 평가 되어야 한다 설정 설립 guidances1,3 .
샘플 심사 삭감 포인트 (SCP) 보다 큰 %SI 값 가져온 때 잠재적으로이 분석 결과에서 긍정적인 간주 됐다. SCP는 대표적인 인구에서 마약 순진한 샘플 테스트 신호 강도 (SI)3의 상대적 감소를 측정 하 여 통계적으로 결정 했다. 지도 (FDA)의 예를 들어 권장 SCP는 일반적으로 분산 된 데이터 세트의 95번째 백분위 수에 설정 되 고 SCP 계산 방법 되었습니다 다른 곳에서 상세히 설명1. 모든 샘플 분석 결과 신호 (측정 시 % 증가) SCP 이상 감소 하는 잠재적으로 긍정적인 결정 했다 및 SCP 보다 높은 결과 (없이 변경 또는 SI % 감소) 부정적인 것으로 간주 됩니다.
긍정적인 (SCP 위의 %SI) 상영 샘플은 ERT NAbs의 특이성을 결정 하는 확실 한 분석 결과에서 테스트 되었습니다. 확실 한 분석 결과 ERT 활용 자석 구슬 약물 특정 항 체 또는 억제 요인 제거와 미리 배양 하 여 수행 되었다. RR (MFI 상영을 확정 MFI의 비율) NAbs의 수 샘플에서 제거 결정을 평가 했다. RR 양성 [즉, 확실 한 컷된 포인트 (CCP)]의 계산 된 임계값 보다 높은 anti-drug NAbs의 존재를 표시. 심사 분석 결과에서 확실 한 분석 결과에서 대표적인 인구에서 치료 순진한 샘플을 평가 하 여 먼저 CCP은 설립 해야한다. CCP는 통계적으로 결정된 1% 긍정 비율에 근거 했다 고 했다 임계값 지정 긍정적으로 확인된 샘플 (그림 5)3.
샘플을 상영 하 고 긍정적인 확인 순차적으로 희석 되었고 상대적 수준 또는 각 샘플에서 NAbs의 titer 결정 titer 분석 결과에서 테스트. 샘플 테스트 긍정적인 그것 [예를 들어, 포인트 (TCP)를 잘라 titer]에 지정 된 임계값을 넘어 가장 높은 희석은 샘플 titer (그림 5)1,3.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig5.jpg"> 그림 5: 예제 샘플 테스트 결과. 이러한 패널 예를 보여 테스트 샘플의 포지티브 또는 네거티브 심사 위 또는 아래 17.51%의 SCP로 시. 긍정적인 샘플 다음 약물 활용 자석 구슬 고갈 분석 결과에서 테스트 이전 샘플에서 약물 특정 항 체를 사용 하 여 확실 한 분석 결과에서 테스트 되었습니다. 복구 비율 (RR) 확실 한 컷된 포인트 보다 큰 샘플 (즉, RR = 1.315) 긍정적인 확인할 수로 간주 됐다. 샘플 확인 긍정적인 신호 건너 titer 포인트 titer (희석 비율) 샘플 결과 titer를 같게 잘라 포인트 설정 (TCP)를 잘라 때까지 희석 했다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57777/57777fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
분석 결과 반복성 및 다양성 더 이상의 애 널 리스트와 몇 일 동안 시험 되었다. QCs는 처음 하나의 일괄 처리에서 준비 하 고 서브-aliquoted 1 x 사용 했다. 3 d 과정 두 애 널 리스트 분석 결과의 전체 자릿수를 보여 QCs의 여러 분석 결과 수행 합니다. 남북 및 내부 분석 정밀도 QCs의 CV % 표시 되는 예제 데이터에서 % 이력서 < 20% (그림 6)1의 FDA 지침의 권고는 있습니다.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig6.jpg"> 그림 6: QC 정밀 데이터 두 애 널 리스트와 함께 3 일 동안 생성의 예. 정밀 데이터는 분산 분석 (ANOVA) DeSilva 외 에 표시 하는 수식을 사용 하 여 계산 된 28. (실행) 내 내부 배치 및 (실행) 사이 간 배치 통계 %cv.로 보고 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57777/57777fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Detection of Antibodies That Neutralize the Cellular Uptake of Enzyme Replacement Therapies with a Cell-based Assay

여기 우리는 중화 항 체 또는 인간 매트릭스, 뇌 척추 액체 (CSF) 등 인간의 혈 청에에서 효소 대체 요법의 세포질 통풍 관을 방해 하는 다른 요소를 감지 하는 셀 기반 흐름 cytometry 방법을 제시.

세포 기반 분석 결과와 효소 대체 요법의 세포질 통풍 관을 중화 하는 항 체의 검출

The administration of enzyme replacement therapies (ERTs) and other biologic therapies to patients may elicit an anti-drug immune response. The ...

detection-antibodies-that-neutralize-cellular-uptake-enzyme

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.7K 조회수.  BioMarin Pharmaceutical Inc. 여기 우리는 중화 항 체 또는 인간 매트릭스, 뇌 척추 액체 (CSF) 등 인간의 혈 청에에서 효소 대체 요법의 세포질 통풍 관을 방해 하는 다른 요소를 감지 하는 셀 기반 흐름 cytometry 방법을 제시.

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Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens. The ability to detect and quantify these responses in humans is an important diagnostic tool. The enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT) is gaining popularity for its ability to identify cellular immune responses against microbial antigens, including immunosuppressed populations such as those with HIV infection, transplantation, and steroid use. This assay has the capacity to quantify the immune responses against specific microbial antigens, as well as distinguish if these responses are Th1 or Th2 in character. ELISPOT is not limited to the site of inflammation. It is versatile in its ability to assess for immune responses within peripheral blood, as well as sites of active involvement such as bronchoalveolar lavage, cerebral spinal fluid, and ascites. Detection of immune responses against a single or multiple antigens is possible, as well as specific epitopes within microbial proteins. This assay facilitates detection of immune responses over time, as well as distinctions in antigens recognized by host T cells. Dual color ELISPOT assays are available for detection of simultaneous expression of two cytokines. Recent applications for this technique include diagnosis of extrapulmonary tuberculosis, as well as investigation of the contribution of infectious antigens to autoimmune diseases.

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Identification of microbial targets of adaptive immunity in idiopathic diseases can be accomplished by the use of the enzyme-linked immunospot assay.

효소 링크된 Immunospot 분석 (ELISPOT) : 미생물 항원 반대 예뻐 - 1 세포 면역 반응의 부량

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

연구

면역학 및 감염병학

In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) Enzyme

Protozoan parasites are among the most devastating infectious agents of humans responsible for a variety of diseases including amebiasis, which is one of the three most common causes of death from parasitic disease. The agent of amebiasis is the amoeba parasite Entamoeba histolytica that exists under two stages: the infective cyst found in food or water and the invasive trophozoite living in the intestine. The clinical manifestations of amebiasis range from being asymptomatic to colitis, dysentery or liver abscesses. E. histolytica is one of the rare unicellular parasite with 5-methylcytosine (5mC) in its genome. 1, 2 It contains a single DNA methyltransferase, Ehmeth, that belongs to the Dnmt2 family. 2 A role for Dnmt2 in the control of repetitive elements has been established in E. histolytica, 3 Dictyostelium discoideum 4,5 and Drosophila. 6 Our recent work has shown that Ehmeth methylates tRNAAsp, and this finding indicates that this enzyme has a dual DNA/tRNAAsp methyltransferase activity. 7 This observation is in agreement with the dual activity that has been reported for D. discoideum and D. melanogaster. 8 The functional significance of the DNA/tRNA specificity of Dnmt2 enzymes is still unknown. To address this question, a method to determine the tRNA methyltransferase activity of Dnmt2 proteins was established. In this video, we describe a straightforward approach to prepare an adequate tRNA substrate for Dnmt2 and a method to measure its tRNA methyltransferase activity.

In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 Ehmeth Enzyme

This protocol describes the preparation of a synthetic tRNA substrate for the Entamoeba histolytica DNA/tRNA methyltransferase 2 (Dnmt2) homolog Ehmeth and the measure of its methyltransferase activity. This experimental approach can be used for investigating the activity of other Dnmt2 proteins.

Entamoeba histolytica DNA와 tRNA Methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) 효소를 체외 tRNA의 Methylation 분석에서

Protozoan parasites are among the most devastating infectious agents of humans responsible for a variety of diseases including amebiasis, which is one of ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

모든 독감의 양적 분석 간단한 슬롯 얼룩 Assays에서 유니버설 항체를 사용하는 바이러스성 Hemagglutinins 및 Neuraminidases를 입력하십시오

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or localization of a target molecule in cells and tissues. Immunofluorescence relies on the specificity of fluorescent-labelled antibodies against their corresponding antigens within a cell. Both direct and indirect immunofluorescence approaches can be used which rely on the use of antibodies linked with a fluorochrome. Direct immunofluorescence is less frequently used because it provides lower signal, involves higher cost and less flexibility. In contrast, indirect immunofluorescence is more commonly used because of its high sensitivity and provides an amplified signal since more than one secondary antibody can attach to each primary antibody. In this manuscript, both epifluorescence microscopy and confocal microscopy were used to monitor the internalization of human lactoferrin, an important component of the immune system, into hepatic cells. Moreover, we monitored the inhibitory potential of hLF on the intracellular replication of the Hepatitis C virus using immunofluorescence. Both the advantages and disadvantages associated with these approaches are discussed.

The human lactoferrin (hLF) is a component of the immune system. In this study, immunofluorescence assays are used to demonstrate both the hepatocellular uptake of hLF and a qualitative reduction in the hepatitis C virus replication upon treatment with hLF.

C 형 간염 바이러스에 대한 인간 락토페린의 세포 흡수 및 관련 바이러스 활동을 모니터링하는 면역 형광

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

기자 효소 형광와 쥐에서 이미징 결핵균

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a formidable defense against invading pathogens via diverse mechanisms. One major goal of vaccination is to induce protective antigen-specific antibodies to prevent life-threatening infections. Both thymus-dependent (TD) and thymus-independent (TI) antigens can elicit robust antigen-specific IgM responses and can also induce the production of isotype-switched antibodies (IgG, IgA and IgE) as well as the generation of memory B cells with the help provided by antigen presenting cells (APCs). Here, we describe a protocol to characterize TD and TI Ig isotype responses in mice using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this protocol, TD and TI Ig responses are elicited in mice by intraperitoneal (i.p.) immunization with hapten-conjugated model antigens TNP-KLH (in alum) and TNP-polysaccharide (in PBS), respectively. To induce TD memory response, a booster immunization of TNP-KLH in alum is given at 3 weeks after the first immunization with the same antigen/adjuvant. Mouse sera are harvested at different time points before and after immunization. Total serum Ig levels and TNP-specific antibodies are subsequently quantified using Ig isotype-specific Sandwich and indirect ELISA, respectively. In order to correctly quantify the serum concentration of each Ig isotype, the samples need to be appropriately diluted to fit within the linear range of the standard curves. Using this protocol, we have consistently obtained reliable results with high specificity and sensitivity. When used in combination with other complementary methods such as flow cytometry, in vitro culture of splenic B cells and immunohistochemical staining (IHC), this protocol will allow researchers to gain a comprehensive understanding of antibody responses in a given experimental setting.

In this paper, we describe a protocol to characterize T-dependent and T-independent immunoglobulin (Ig) isotype responses in mice using ELISA. This method used alone or in combination with flow cytometry will allow researchers to identify differences in B cell-mediated Ig isotype responses in mice following T-dependent and T-independent antigen immunization.

Thymus 종속 및 독립 Thymus 면역 글로불린 Isotype 반응 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 사용 하 여 마우스의 특성

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

살 모 넬 라 종의 심사에 대 한 높은 처리 플랫폼 /Shigella 종

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection

Merkel cell polyomavirus (MCPyV) infection can lead to Merkel cell carcinoma (MCC), a highly aggressive form of skin cancer. Mechanistic studies to fully investigate MCPyV molecular biology and oncogenic mechanisms have been hampered by a lack of adequate cell culture models. Here, we describe a set of protocols for performing and detecting MCPyV infection of primary human skin cells. The protocols describe the isolation of human dermal fibroblasts, preparation of recombinant MCPyV virions, and detection of virus infection by both immunofluorescent (IF) staining and in situ DNA-hybridization chain reaction (HCR), which is a highly sensitive fluorescence in situ hybridization (FISH) approach. The protocols herein can be adapted by interested researchers to identify other cell types or cell lines that support MCPyV infection. The described FISH approach could also be adapted for detecting low levels of viral DNAs present in the infected human skin.

Here, we present a protocol to infect primary human dermal fibroblast with MCPyV. The protocol includes isolation of dermal fibroblasts, preparation of MCPyV virions, virus infection, immunofluorescence staining, and fluorescence in situ hybridization. This protocol can be extended for characterizing MCPyV-host interactions and discovering other cell types infectable by MCPyV.

메르켈 세포 폴리오 감염 및 탐지

Merkel cell polyomavirus (MCPyV) infection can lead to Merkel cell carcinoma (MCC), a highly aggressive form of skin cancer. Mechanistic studies to fully ...