Name: production of nurr-1 specific polyclonal antibodies free of cross-reactivity against its close homologs, nor1 and nur77
Uploaded: 2015-08-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
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This work was supported by NIH grants (NS070577 and NS084869).

注：以下の引用された全ての溶液の組成は、材料/機器の表に記載されています。 1.プロテインAカラム抗体精製<ol><li>手順を開始する前に15分間室温にプロテインAスピンカラムと、必要なすべてのバッファーを平衡化します。 </li><li>結合緩衝液プロテインAのIgGと1：免疫血清1を希釈します。 （血清5mlをお勧めします）。 </li><li>静かにキャップ内に提出することができる任意の樹脂を除去するために、ベンチトップ上のタンパク質スピンカラムをタップします。トップキャップを外し、ゆっくりと底部の閉鎖をスナップオフ。 15ミリリットルのコレクションチューブにカラムを置き、ストレージソリューションを排出することができます。 </li><li>結合緩衝液プロテインAのIgGの5ミリリットルを加え、溶液を排出させます。 </li><li>カラムに希釈した免疫血清を適用し、フロースルーを収集します。最良の結果を得るために、カラムの抗体結合capacitの80％未満の抗体の濃度が含まれているサンプル容量を追加Y。 </li><li> 280 nmでの吸光度が0.1以下になるまで、プロテインAのIgG 15mlの結合緩衝液またはでカラムを洗浄します。 </li><li> 5標識されたコレクションチューブに中和緩衝液100μlを追加します。 </li><li>プロテインAカラムへのIgG溶出緩衝液5mlを加え、中和緩衝液100μlを含むチューブのそれぞれに1mlの画分を収集します。 </li><li> 0.5より大きい吸光度280 nmおよびプールの画分で各画分の吸光度を測定します。透析の準備ができるまで氷上でプールした画分を保管してください。 </li><li> IgGを溶出緩衝液8mlのを追加することで、列を再生成し、溶液がカラムを通って流れることを可能にします。 </li><li>溶離液のpHは7.4に戻るまで、プロテインAのIgG結合液でカラムを洗浄します。 </li><li>貯蔵溶液5ml（PBS中0.02％アジ化ナトリウム）を添加することにより、カラムを保存。約3mlの列、キャップ底部に残り、トップキャップを固定した場合。 4℃で列を保管してください。 </li><li>長さOを決定製造業者の指示に従って必要なF透析チューブ。 16ミリメートルに平らな直径のチューブを使用すると、透析される溶液1ml当たり、チューブの長さの5.47センチメートルを使用しています。チューブをカットし、15〜30分間のPBS（pH7.4）ですすいでください。 </li><li>倍と透析チューブの一端をクリップ、PBSのpHは7.4で平衡化した透析チューブに含有画分をプールしたIgGを転送し、もう一方の端を閉じます。 </li><li> 2時間pH7.4のPBSの200ボリュームに対して室温で透析します。 </li><li>透析緩衝液（新鮮なPBS pH7.4）に変更し、室温でさらに2時間透析。 </li><li>透析緩衝液（新鮮なPBS pH7.4）に変更し、4℃で一晩透析します。 </li><li>さらなる精製工程を続行する準備ができるまで4℃で透析した抗体溶液を保管してください。 </li><li> 280 nmでの吸光度を用いて抗体濃度と21万M -1 cm -1で12の280nmにおける抗体のモル吸光係数を評価します。 </li></ol>アミノリンクカップリング樹脂にLBDタンパク質の2カップリング<ol><li> 2列、Nur77ためNor1のための1つおよび他を準備します。両方のタンパク質のための同じプロトコルに従ってください。 </li><li>氷上で樹脂に結合するタンパク質を解凍します。 280 nmの12で、そのモル吸光係数とその吸光度を用いてタンパク質濃度を決定します。 <ol><li>あるいは、そのようなビシンコニン酸アッセイ13のようなタンパク質の決意アッセイを使用しています。タンパク質は、アミン含有緩衝透析またはカップリングバッファーに対してバッファー交換中に溶解されている場合。タンパク質は、適当な緩衝液（無遊離アミン）である場合のカップリング緩衝液で4倍に希釈します。 </li></ol></li><li>タンパク質2mgのための樹脂の2ミリリットルを使用してください。以降のすべての手順は、10ミリリットルの列に2ミリリットルの樹脂のためのものです。タンパク質の最大10 mgの（1：1スラリー1を2ml）樹脂を1mlあたり連結することができます。 </li><li>底部にフリットを押し、それを介してPBS pHが7.4を実行して、10ミリリットルのカラムを準備します。キャップT彼は塔の底部とのカップリング緩衝液2ミリリットルを追加します。 </li><li> 、カラムへのスラリーの所望の体積（樹脂の2ミリリットルを得るために4ミリリットル）を追加底部キャップを除去し、カラムの流出をしてみましょう。カップリング緩衝液の6ミリリットル（3樹脂床容積）の合計でカラムを洗浄し、カラムを排水することができます。カップリング緩衝液を排出した後、ボトムキャップを交換してください。 </li><li> （280nmでの吸光度またはビシンコニンアッセイのいずれかを使用してステップ2.11で溶出液のタンパク質濃度を比較することにより、結合効率を評価するために、タンパク質溶液のアリコートを保持）カラムへの結合緩衝液に懸濁し、タンパク質2-4 mlを加え。キャップと均一な溶液を持つように転倒混和します。 </li><li>空の1.8ミリリットルマイクロチューブを秤量し、ドラフトに移動します。慎重に予め秤量したチューブ中のNaCNBH 3（約0.05g）を転送します。チューブを閉じ、のNaCNBH 3を含むチューブの重量を量ります。フードの外管を開けないでください。 </li><li>の重量を基準にしてチューブに移しのNaCNBH 3は 、1 M NaOHを添加することによって5 M溶液を作成します。のNaCNBH 3の分子量は、62.84グラム、従って0.05グラムは、（0.05 / 62.84 = 7.96×10 -4モル）を7.96×10 -4モルに等しいです。 5 M溶液を作製するには、（7.96×10 -4 / 5）1 M NaOHを159μlを添加します。 </li><li>考慮に樹脂容量を取る反応の総容量を測定します。反応の1ml当たり5 MのNaCNBH 3の10μLを加えます。 <ol><li>たとえば、次の4ミリリットルの反応ボリュームの5 MのNaCNBH 3の40μlを添加します。樹脂1mlのコメントを追加しましたタンパク質の3ミリリットルのために、総容量を4 mlです。 </li></ol></li><li>カラムに蓋をし、転倒混和します。チューブ回転で列を固定し、反応物を4℃で一晩続けましょう。 </li><li>午前中は、化学フードに列を持参し、いくつかのガスが形成されている可能性がありますように慎重にキャップを取り外します。きれいなチューブにカラムを排水し、タンパク質コンを測定するために、溶出液を保存セント280nmの方法12またはビシンコニン酸アッセイでの吸光度を用いて、ステップ2.6で出発タンパク質濃度と比較します。 </li><li>カップリング緩衝液4mlで樹脂を洗浄し、カラムの流出をしてみましょう。 </li></ol> 3.残りのサイトをブロック<ol><li>クエンチング緩衝液4mlで樹脂を洗浄。ドレインと底部キャップを交換してください。急冷2mlの緩衝液を添加し、樹脂を中断。 </li><li>樹脂容量と消光バッファ量を測定することにより、総反応容量は、その後、反応容量1mlあたり5 MのNaCNBH 3の10μlを添加する評価します。 </li><li> 30分転倒、室温で穏やかに混合します。 30分後、ドラフト内で列をもたらします。慎重にトップを削除してから、底部キャップを除去し、廃棄物の管に、カラムの流出をしてみましょう。 </li><li>洗浄溶液の5樹脂ボリュームでカラムを洗浄します。溶出液のabsoを測定することにより、残留タンパク質の存在のための洗浄を監視280nmでrbance。非結合タンパク質を、高塩濃度によって洗い流されます。 </li><li> 0.02％アジ化ナトリウムを含有する脱気したPBSのpHが7.4の6ミリリットルで樹脂を洗浄。必要になるまで4℃で列を保管してください。 </li></ol> Nurr1を特異的抗体の4精製<ol><li>すすぎNur77 LBDは、pH7.4のPBS 10mlでカラムに結合し、カラムの流出をしてみましょう。カラムの底部に蓋をして、新しい15ミリリットルのコレクションチューブに排出さNur77 LBD結合列を配置します。 </li><li> 、タンパク質5mlの精製抗のNurr1抗体を追加し、1時間4℃で回転体の列と場所をキャップ。上部と下部のキャップを外し、フロースルーを収集します。 Nor1のLBD結合列に追加する直前まで、氷上に置いておきます。 </li><li>すすぎNor1のLBDは、pH7.4のPBS 10mlでカラムに結合し、カラムの流出をしてみましょう。カラムの底部に蓋をし、15 mlコレクションチューブNor1のLBD結合列を配置します。 </li><li> Nur77 LBDのクーデターからの流れを介して追加4℃で1時間回転器でのカラムと場所をキャップ、列を主導しました。上部と下部のキャップを外し、フロースルーを収集します。 </li><li> 280nmでの吸光度を測定することにより抗体濃度を測定します。 </li></ol>精製抗のNurr1抗体の5 ELISAに基づく分析<ol><li> 96ウェルプレートのウェルにタンパク質を100μl（2.5μgの/ ml）を追加します。 3種類のタンパク質をテストする場合は、H4のウェルA1、H8にウェルA5へのタンパク質2を100μl、およびH12のウェルA9へのタンパク質3の100μlにタンパク質1の100μlを添加します。プレートをカバーし、4℃で一晩インキュベートします。 </li><li> pH7.4のPBSのウェル当たり300μlの二回コーティングしたウェルを洗浄し、抗原全体コーティングされたウェルにELISAブロッキング緩衝液の300μlを添加し、室温で2時間インキュベートします。 </li><li>プレートは、精製された抗のNurr1抗体の所望の出発希釈を準備ブロックしているときにELISAブロッキング緩衝液中（10〜100μg/ mlの範囲）。 </li><li>ブロッキングの2時間後、全てのウェルに新鮮なELISAブロック緩衝液100μlを用いたELISAブロックバッファを交換します。 </li><li>行Aの全てのウェルに希釈した精製された抗のNurr1抗体の100μlを添加する逐次Cを行ごとにBから溶液100μlを転送することにより、続いてB列にA列からウェルに100μlの溶液を転送することにより、抗体を希釈余分な100μLを捨てる行Gのウェル中の溶液を混合した後G.行ダウン続けます。行Hのウェルは、緩衝液のみをブロックの最初の100μLを受けます。 1時間室温でインキュベートします。 </li><li> pH7.4のPBSでプレートを0.05％のTween 20のウェル当たり300μlので3回洗浄し、過剰な洗浄緩衝液を除去するためにプレートをブロット。 </li><li>ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）ELISAブロック緩衝液で希釈したコンジュゲートヤギ抗ウサギIgGの100μlを加える（1：8,000希釈し、典型的な範囲は、1：25,000：5,000 1）。 1時間室温でインキュベートします。 </li><li>プレート番目を洗いますREE（3）5.6倍に記載の方法。脱イオン水300μlのとそれらを充填することにより、全てのウェルを洗浄します。紙を吸収する上でプレートを反転させて余分な水分を吸い取ります。 </li><li> &#39;、5,5&#39; 3,3の100μlを添加しテトラメチルベンジジン（室温に温め）を全てのウェルに、室温で暗所で15〜30分間インキュベートします。 </li><li> SO 4を 2 NH 2の50μLを加えて反応を停止します。 </li><li> 650 nmでのバックグラウンドを差し引い450 nmの吸光度を読みます。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

このプロトコルの成功は、目的のタンパク質ファミリーの特定のメンバーに対して産生された抗体の特徴付けのための純粋なタンパク質の利用可能性に依存しています。それは明らかにELISAおよびウェスタンブロッティングによる有意な交差反応性があることが確立されるまで、プロテインA / Gを使用して抗体を精製する必要はありません。 本文で述べたように、このようなトリスまたはグリシンなどのアミン含有緩衝液でカラムに架橋するためにタンパク質を懸濁避けることが重要です。さらに、架橋に使用される最適なタンパク質濃度は、経験的に決定されなければなりません。少なすぎる吸着の効率を低下させるだろうが、あまりにも列に多くのタンパク質は、立体障害につながる可能性があります。したがって、それは良い考えでは2からの10mg / mlの範囲のタンパク質濃度を試験するために、得られた抗体の質を評価することです。 いくつかの要因が時に目を考慮しなければなりません技術が高度に特異的な抗体を得るために失敗しています。これらには、架橋効率、免疫反応性ドメインの喪失、および架橋タンパク質の変性を。プロトコールに記載されているように、架橋効率を監視する過不足タンパク質がカラム上に固定化されていることを決意することができます。反応性アミンを用いた架橋が免疫反応性ドメインを破壊することが疑われる場合は、カルボキシル基を介して、または炭水化物を介して固定化を考慮すべきです。 それは一貫して高度に特異的な抗体を生成する手順の効率を監視することが重要です。再生のために、カラムは、過酷な条件（高または低pH）を使用して、それらに結合された交差反応性抗体を剥奪されなければなりません。これは、架橋されたタンパク質のますます高い割合は、カラムの性能を低下させる、効果的に変性させます。 ELISAおよびWesteにおけるブロッキング剤の添加RNブロッティングは、一般的に、成功の公正なレベルで使用されます。しかし、このビデオに記載されたアプローチは、成功の確率が増加し、逆に交差反応性タンパク質を大量に維持するための必要性を減少させます。メディアのクロマトグラフィーにタンパク質を固定化するための試薬および方法を改善し続けるように、このアプローチは、形質転換された細胞に特異的な抗体の循環識別に貢献します。 このアプローチは、純粋なタンパク質の利用可能性によって制限されます。このプロトコルの他の制限は、適切な折り畳みに依存するタンパク質ドメインを使用しています。タンパク質ドメインは、全タンパク質のように折り畳まれない場合は、事前に吸着戦略は、細胞または組織抽出物を分析する際に容易に目的のタンパク質のメンバーを同定することができる抗体を生じないかもしれません。 利益の多くのタンパク質は、高いアミノ酸配列の相同性を有するタンパク質の（サブ）ファミリーに属します。機能的特徴とのiDENタンパク質の分布のtificationは、多くの場合、それぞれの家族のメンバーに対する特異的抗体の利用可能性に依存しています。同じファミリーのタンパク質メンバー間の高いアミノ酸相同性が高度に特異的な抗体を生成する際に困難に貢献しています。これらの交差反応性抗体を使用すると、しばしば矛盾する結果につながります。 その一例は、Nur77とNor1のとともに、核内受容体NR4Aサブファミリーに属するオーファン核内受容体のNurr1あります。これら三つの因子は、アミノ酸相同性の高い程度を共有するので、各因子に対する抗体は、各要因の正確な分析を妨げる有意な交差反応性を示します。 一例として、これらのNR4Aメンバーを使用すると、Nor1のかNur77に対する反応性のない非常に特異的なのNurr1抗体を生成することが可能でした。のLBDは、DNA結合ドメイン未満の相同性を共有するので、各タンパク質のLBDは、発現させ、精製した後、私に使用されました抗Nurr1を抗体の特異性をmprove。 ELISAおよびウエスタンブロット分析によって調べ、最初に、Nurr1をのLBDに対する抗体は、他のタンパク質と交差反応性のささやかではあるが有意なレベルを示しました。プロテインA精製のNurr1抗体はさらにNur77およびNor1のの交差反応性LBDドメインに対して事前に吸着により精製したときただし、結果として得られるのNurr1抗体は、ウエスタンブロットにより調べたように、任意の交差反応性を示さなかったし、ELISAが顕著に検出されたのNurr1の分析します中脳領域におけるDAニューロンを発現性。ウェスタンブロットおよびELISAデータは、密接に分析し、これらの分析は相補的でかつ相互にサポートできることを示す一致します。 まとめると、この抗体の精製戦略は、相同なタンパク質メンバーに対する交差反応性を排除することによって、特異的な抗体を生成するのに非常に有用であろう。

転写因子のNurr1およびその同族体（Nur77およびNor1のは）核内受容体サブファミリー4A（NR4A）1に属します。それらの内因性リガンドはまだ同定されていないので、彼らはまた、オーファン受容体です。 Nurr1を最初は1992年にクローン化され、2脳内で発現することが知られているが、中脳ドーパミンニューロンの発達および維持のための重要な役割は、ノックアウトマウスの研究により明らかになった3。また、中脳ドーパミンニューロンの維持のための重要な役割は、最近、条件付きノックアウト研究4によって実証されました。による中脳ドーパミンニューロンのためのNurr1の重要な役割を示すこれらのエレガントな研究に、多くのその後の研究は、主に中脳ドーパミンニューロンおよびドーパミン関連の神経変性疾患、パーキンソン病（PD）に焦点を当ててきた5。 注目すべきは、Nurr1をは中脳ドーパミン（MDA）ニューロンにおいてだけでなく、ディだけでなく表現されていますそれは強くNurr1を、様々な脳機能に重要な役割を果たしていることを示す最近の研究によって支持されている多くの非DAの分野で機能的な役割を有し得ることを示唆している詩の脳領域2、。例については、このような学習として、メモリ誘導活性を示された、またはその他の海馬依存タスクがアップレギュレーション海馬6,7中のNurr1の発現をもたらします。また、海馬でのNurr1発現のノックダウンが強くのNurr1は、多くの脳領域で多様な役割を果たしていることを示唆し、長期記憶および/ ​​またはシナプス可塑性8-11を損なうのに十分でした。したがって、さらにNurr1をの細胞型特異的および細胞内発現を理解するためには、そのホモログNur77またはNor1のに任意の交差反応性を示さないのNurr1特異的抗体を使用することが望ましいです。本稿では、Nurr1を特異的抗体を生成し、その特異性を示す追加データを提示するために事前に吸着プロトコルについて説明します。

<table><tbody><tr><td>Purified Ligand Binding Domain from Nurr1, Nor 1 and Nur77</td><td></td><td></td><td>Column Storage solution</td></tr><tr><td>AminoLink Coupling Resin and Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>44890</td><td></td></tr><tr><td>Protein A spin column</td><td>Thermo Scientific</td><td>89978</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate-Buffered Saline</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>96 well Flate-bottom plates, High Flange, 330 &amp;mu;l</td><td>Thermo Scientific</td><td>3455</td><td></td></tr><tr><td>10% Normal Goat Serum</td><td>KPL</td><td>50-675-69</td><td></td></tr><tr><td>Milk Diluent/ Blocking Concentrate&amp;nbsp;</td><td>KPL</td><td>50-82-01</td><td></td></tr><tr><td>IgG Elution Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>21004</td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Horse Radish Peroxidase conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>31460</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Resin</td><td>Thermo Scientific</td><td>88221</td><td></td></tr><tr><td>3, 3&#039;, 5, 5&#039; Tetramethylbenzydine</td><td>Thermo Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>2N H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>H381 05</td><td></td></tr><tr><td>Protein A IgG Binding Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>21001</td><td></td></tr><tr><td>IgG Elution Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>21004</td><td></td></tr><tr><td>Column Storage solution</td><td></td><td></td><td>Phosphate Buffered Saline containing 0.02% sodium azide</td></tr><tr><td>Spectra/Por 7 pre-treated dialysis tubing</td><td>Spectrum Labs</td><td>132128</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Disposable columns</td><td>Thermo Scientific</td><td>29924</td><td></td></tr><tr><td>AminoLink Coupling Buffer</td><td></td><td></td><td>0.1M sodium phosphate, 0.05% NaN3, pH 7.0</td></tr><tr><td>Quenching buffer</td><td></td><td></td><td>1M Tris. HCI, 0.05% NaN3, pH&lt;br/&gt; 7.4</td></tr><tr><td>Wash Solution</td><td></td><td></td><td>1M NaCl, 0.05% NaN3</td></tr><tr><td>ELISA Blocking buffer</td><td></td><td></td><td>1% Normal Horse serum (NHS), 1% Normal Goat Serum (NGS) in 1X KPL milk diluent</td></tr><tr><td>Storage Solution</td><td></td><td></td><td>PBS pH 7.4 containing 0.02% sodium azide</td></tr><tr><td>Micropipettes: 10 &amp;mu;l; 20 &amp;mu;l; 200 &amp;mu;l; 1000 &amp;mu;l</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

production of nurr-1 specific polyclonal antibodies free of cross-reactivity against its close homologs, nor1 and nur77

The nuclear receptor subfamily 4 (NR4A) is composed of 3 related proteins sharing a DNA binding domain (DBD) and a ligand-binding domain (LBD). The nuclear receptor related 1 protein (Nurr1 or NR4A2) plays a key role in the maintenance of the dopaminergic system. Dopamine dysfunctions associated with the Nurr1 gene include Parkinson&#8217;s disease, schizophrenia and manic depression among others. Furthermore, recent evidence indicates that Nurr1 is also expressed in other brain areas such as the hippocampus and plays critical roles for learning and memory. The other members of the family are nerve growth factor IB (Nur77 or NR4A1) and neuron-derived orphan receptor 1 (NOR1 or NR4A3). To help investigate the precise functional roles of Nurr1 in dopaminergic and other brain region-related neuronal dysfunctions antibodies devoid of cross-reactivities against Nur77 and NOR1 were needed. Since the proteins are more divergent in their LBDs than in their DNA binding domains immunization with purified LBDs should yield antibodies specific for Nurr1 with minimal reactivities against Nur77 and/or NOR1. Although anti-Nurr1 antibodies were successfully generated these showed significant immunoreactivity against the other members of the family. Affinity chromatography over immobilized Protein A followed by pre-adsorption against immobilized Nur77 and NOR1 LBDs yielded Nurr1 specific antibodies free of cross-reactivity. Here, we selectively target antibodies against a specific member of a highly conserved family of proteins by immunizing animals with their most divergent regions followed by removing cross reactive antibodies by pre-adsorption. The goal of the protocol is to increase polyclonal antibodies specificity through pre-adsorption against cross-reactive antigens.

Nur77 LBDとNor1のLBDのカラムに通すことによって、その後のタンパク質の比較タンパク質とカラム精製の​​Nurr1に特異的な抗体精製抗Nurr1を抗体は、図1に示されている。図から分かるように、プロテインA精製の​​Nurr1抗体は強い結合を示しましたNurr1をLBDに。しかし、それはまた、Nur77 LBDへとNor1のLBDへの有意な結合を示しました。プロテインA精製のNurr1抗体はさらにNur77 LBDおよびNor1のLBDに対して精製したところ、最終的なアフィニティー精製のNurr1抗体はNur77とNor1のとの交差反応性があったことを実証し、Nur77 LBDまたはNor1のLBDに検出不可能な結合でNurr1をLBDへの特異的結合を示しました完全に除去します。 この特異性は、さらに、Nurr1を、Nor1の、またはNur77タンパク質（ 図2）をタグ付けするためにMYC融合全長を担持する発現ベクターでトランスフェクトされたCHO細胞からの抽出物のウェスタンブロット分析によって実証されました。予想、抗myc antibなどodies各完全長タンパク質は、その予想された分子量で発現されたことが明らかになりました。 ELISAの結果と一致して、プロテインA精製Nurr1を特異的抗体は、確実に、完全長のNurr1を検出だけでなく、低い効率が、Nor1のとNur77を検出しました。これとは対照的に、完全に精製されたNurr1抗体をELISAによりNor1のとNur77に任意の検出可能な交差反応性を示さなかったか、ウエスタンブロット分析します。 最後に、完全に精製されたのNurr1抗体は、MDAニューロンの免疫組織化学的分析のために使用しました。これはよくのNurr1ではなく、その近くのホモログNor1のとNur77は、顕著にmRNAおよびタンパク質レベル14,15の両方で、げっ歯類およびヒトMDAニューロンに発現していることが記載されています。完全に精製されたのNurr1抗体の使用は、Nurr1ををほぼ独占的に黒質の領域（ 図3）におけるMDAニューロンの核に発現していることを確認しました。 <img alt="図1"SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 52963 / 52963fig1.jpg&quot; /&gt; 図1：前とNur77とNor1ののLBDを通過させることによって精製結合列タンパク質精製抗Nurr1を抗体（0.156 / mlの） の後に（a）またはプロテインAは、続いて精製された抗のNurr1抗体の交差反応性のELISA比較 Nor1のとNur77 LBD結合カラム上のクロマトグラフィーは、抗Nurr1を抗体（0.156 / mlの）（B）のNurr1 LBD、Nor1のLBDまたはNur77 LBDのいずれかを2.5μg/ mlの100μlでコーティングした96ウェルプレートのウェルに加えました。方法の項に記載したようにELISAを行いました。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52963/52963fig2.jpg" /> 図2：完全長のNurr1の特異的検出は、完全に精製されたNurr1を特異的抗体を用いてCHO細胞内で発現 MYCがタグ付けされた完全長のNurr1、Nor1の、およびNur77タンパク質を発現させました。CHO細胞における融合タンパク質およびMyc特異的抗体（A）、プロテインA精製の​​Nurr1抗体（B）、および完全に精製された抗体のNurr1（c）で検出されました。タンパク質負荷対照（d）のために使用される抗アクチン抗体。各mycタグ全長DNA（65の分子量、66、及びそれぞれのNurr1、Nur77、Nor1の、69キロダルトン）を一過性CHO細胞にトランスフェクトし、細胞抽出物の同じ量が各レーンにロードしました。レーン1：空のベクターでトランスフェクトしたCHO細胞の抽出物からなる陰性対照。レーン2：Mycの-のNurr1。レーン3：Mycの-Nur77。レーン4：Mycの-Nor1の。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52963/52963fig3.jpg" /> 図3：完全に精製されたNurr1を特異的抗体は、チロシンヒドロキシラーゼ陽性ドーパミンニューロンを検出する黒質における中脳ドーパミンニューロンは、Nurr1を陽性である、eと。完全に精製されたNurr1を特異的抗体を用いて免疫組織化学によってxamined。注目すべきは、Nurr1をは、MDAニューロンの核内に局在していました。 TH（チロシンヒドロキシラーゼ）。スケールバー=100μmです。ホワイトボックスマージ中のスケールバーは10μmである。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52963/52963fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>

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Production of Nurr-1 Specific Polyclonal Antibodies Free of Cross-reactivity Against Its Close Homologs, Nor1 and Nur77

Here, we selectively target antibodies against a specific member of a highly conserved family of proteins by immunizing animals with their most divergent regions followed by removing cross reactive antibodies by pre-adsorption.

NURR-1特異的ポリクローナル抗体の密接な相同体に対する交差反応性の自由、Nor1のとNur77の生産

The nuclear receptor subfamily 4 (NR4A) is composed of 3 related proteins sharing a DNA binding domain (DBD) and a ligand-binding domain (LBD). The ...

production-nurr-1-specific-polyclonal-antibodies-free-cross

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

7.4K ビュー.  McLean Hospital. Here, we selectively target antibodies against a specific member of a highly conserved family of proteins by immunizing animals with their most divergent regions followed by removing cross reactive antibodies by pre-adsorption.

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High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

ハイスループットフローサイトメトリー細胞ベースのアッセイN-メチル-D-アスパラギン酸受容体またはヒト血清中のドーパ​​ミン-2受容体に対する抗体を検出する

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

医学

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that may facilitate the development of vaccines and peptide drugs. Peptide scanning is a simple and efficient method that straightforwardly maps the linear epitope recognized by a monoclonal antibody (mAb). Here, the authors present an epitope determination methodology involving serially truncated recombinant proteins, synthetic peptide design, and dot-blot hybridization for the antigenic recognition of nervous necrosis virus coat protein using a neutralizing mAb. This technique relies on the dot-blot hybridization of synthetic peptides and mAbs on a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane. The minimum antigenic region of a viral coat protein recognized by the RG-M56 mAb can be narrowed down by step-by-step trimmed peptide mapping onto a 6-mer peptide epitope. In addition, alanine scanning mutagenesis and residue substitution can be performed to characterize the binding significance of each amino acid residue making up the epitope. The residues flanking the epitope site were found to play critical roles in peptide conformation regulation. The identified epitope peptide may be used to form crystals of epitope peptide-antibody complexes for an x-ray diffraction study and functional competition, or for therapeutics.

Here, the authors present a simple and efficient protocol to define a linear antigenic epitope using a purified monoclonal antibody and peptide scanning through dot-blot hybridization. The identified epitope can then be used in therapeutic and diagnostic applications.

モノクローナル抗体認識リニアB細胞エピトープのペプチドスキャンアシスト識別

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

免疫・感染学

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

まれな抗原特異的 B 細胞血液の循環から弁別に対するモノクローナル抗体の生成

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

天然物に対するモノクローナル抗体の作製

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Detection of Antibodies That Neutralize the Cellular Uptake of Enzyme Replacement Therapies with a Cell-based Assay

The administration of enzyme replacement therapies (ERTs) and other biologic therapies to patients may elicit an anti-drug immune response. The characterization of these anti-drug antibodies (ADA), especially those that may neutralize the biological activity of the drug, termed neutralizing antibodies (NAbs), is crucial in understanding the effects of these antibodies on the drug&#39;s pharmacological profile. This protocol describes a cell-based flow cytometry method to detect factors that neutralize the cellular uptake of a representative lysosomal ERT in human matrix. The protocol consists of three procedures: screening, a confirmatory step, and titer assays to detect, identify, and establish the relative level of neutralizing antibody titer in subject samples.
In this method, samples are first mixed with the fluorophore-conjugated ERT product, then incubated with cells [e.g., human T lymphocytes (Jurkat cells)] that express a cell-surface cation-independent mannose 6-phosphate receptor (CI-M6PR), and finally, analyzed with a flow cytometer. A sample without NAbs will result in the uptake of the fluorophore-conjugated ERT product via CI-M6PR, whereas, the presence of NAbs will bind to the drug and interfere with the CI-M6PR binding and uptake. The amount of the fluorophore-conjugated ERT internalized by the Jurkat cells is measured by flow cytometry and evaluated as the percentage (%) signal inhibition compared to the response obtained in the presence of a representative drug-na&#239;ve matrix. In the confirmatory step, the samples are pre-incubated with ERT-conjugated magnetic beads to deplete drug-specific factors that bind to the drug (such as NAbs) prior to an incubation with cells. Samples that screen and confirm positive for drug-specific NAbs in the assay are then serially diluted to generate an antibody titer. Semi-quantitative antibody titers may be correlated with measurements of drug safety and efficacy.

Here we present a cell-based flow cytometry method to detect neutralizing antibodies or other factors that interfere with the cellular uptake of enzyme replacement therapies in a human matrix, such as cerebral spinal fluid (CSF) or human serum.

細胞に基づく試金の酵素補充療法の細胞内取り込みを中和する抗体の検出

The administration of enzyme replacement therapies (ERTs) and other biologic therapies to patients may elicit an anti-drug immune response. The ...

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) Receptor in Blood

The presence of anti-NMDA receptor autoantibody can cause various neuropsychiatric symptoms in the affected patients, termed anti-NMDA receptor autoimmune encephalitis. Detection of the specific autoantibody against the NMDA receptor in the blood or cerebrospinal fluid (CSF) is essential for the accurate diagnosis of this condition. The NMDA receptor is an ion channel protein complex that contains four subunits, including two mandatory NMDA receptor subunit 1 (NR1) and one or two NMDA receptor subunit 2A (NR2A), NMDA receptor subunit 2B (NR2B), NMDA receptor subunit 2C (NR2C), or NMDA receptor subunit 2D (NR2D). The epitope of anti-NMDA receptor autoantibody was reported to be present at the extracellular N-terminal domain of the NR1 subunit of the NMDA receptor. The goal of this study is to develop a simple cell-based immunofluorescence assay that can be used as a screening test to detect the presence of autoantibodies against NR1 subunit of the NMDA receptor in the blood to facilitate the clinical and basic research of anti-NMDA receptor autoimmune encephalitis.

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate NMDA Receptor in Blood

We ectopically expressed NR1 subunit of NMDA receptor tagged with green fluorescent protein in human embryonic cells (HEK293) as antigen to detect autoantibodies against NMDA receptor in the blood of patients suspected with autoimmune encephalitis. This simple method may be suitable for screening purposes in clinical settings.

血の N-メチル-D-アスパラギン酸 (NMDA) 受容体に対する自己抗体を検出する単純な細胞ベースの蛍光抗体法

The presence of anti-NMDA receptor autoantibody can cause various neuropsychiatric symptoms in the affected patients, termed anti-NMDA receptor autoimmune ...

神経科学

Profiling of the Human Natural Killer Cell Receptor-Ligand Repertoire

Natural killer (NK) cells are among the first responders to viral infections. The ability of NK cells to rapidly recognize and kill virally infected cells is regulated by their expression of germline-encoded inhibitory and activating receptors. The engagement of these receptors by their cognate ligands on target cells determines whether the intercellular interaction will result in NK cell killing. This protocol details the design and optimization of two complementary mass cytometry (CyTOF) panels. One panel was designed to phenotype NK cells based on receptor expression. The other panel was designed to interrogate expression of known ligands for NK cell receptors on several immune cell subsets. Together, these two panels allow for the profiling of the human NK cell receptor-ligand repertoire. Furthermore, this protocol also details the process by which we stain samples for CyTOF. This process has been optimized for improved reproducibility and standardization. An advantage of CyTOF is its ability to measure over 40 markers in each panel, with minimal signal overlap, allowing researchers to capture the breadth of the NK cell receptor-ligand repertoire. Palladium barcoding also reduces inter-sample variation, as well as consumption of reagents, making it easier to stain samples with each panel in parallel. Limitations of this protocol include the relatively low throughput of CyTOF and the inability to recover cells after analysis. These panels were designed for the analysis of clinical samples from patients suffering from acute and chronic viral infections, including dengue virus, human immunodeficiency virus (HIV), and influenza. However, they can be utilized in any setting to investigate the human NK cell receptor-ligand repertoire. Importantly, these methods can be applied broadly to the design and execution of future CyTOF panels.

Here we design two complementary mass cytometry (CyTOF) panels and optimize a CyTOF staining protocol with the aim of profiling the natural killer cell receptor and ligand repertoire in the setting of viral infections.

Natural killer (NK) cells are among the first responders to viral infections. The ability of NK cells to rapidly recognize and kill virally infected cells ...

Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response without any interference such as low protein expression, enzyme inactivity, or structural changes. This makes APN an attractive candidate in the development of vaccines that selectively target the mucosal epithelium. Previous studies have shown that APN is a receptor protein for both enterotoxigenic Escherichia coli (E. coli) F4 and transmissible gastroenteritis virus. Thus, APN shows promise in the development of antibody-drug conjugates or novel vaccines based on APN-specific antibodies. In this study, we compared production of APN-specific monoclonal antibodies (mAbs) using traditional hybridoma technology and recombinant antibody expression method. We also established a stably transfected Chinese hamster ovary (CHO) cell line using pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN and an E. coli expression BL21(DE3) strain harboring the pET28a (+)-rAbs-APN vector. The results show that antibodies expressed in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO cells and mAbs produced using hybridomas could recognize and bind to the APN protein. This provides the basis for further elucidation of the APN receptor function for the development of therapeutics targeting different APN-specific epitopes.

The recombinant antibody protein expressed in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO cells and monoclonal antibodies produced using traditional hybridoma technology can recognize and bind to the porcine aminopeptidase N (APN) protein.

ブタ腸粘膜上皮におけるアミノペプチダーゼNを標的とするモノクローナル抗体の作製

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response ...

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. The S domain forms a contiguous scaffold around the viral RNA, whereas the P domain forms viral spikes on the S domain and contains determinants for antigenicity and host-cell interactions. The P domain binds carbohydrate structures, i.e., histo-blood group antigens, which are thought to be important for norovirus infections. In this protocol, we describe a method for producing high quality norovirus P domains in high yields. These proteins can then be used for X-ray crystallography and ELISA in order to study antigenicity and host-cell interactions.
The P domain is firstly cloned into an expression vector and then expressed in bacteria. The protein is purified using three steps that involve immobilized metal-ion affinity chromatography and size exclusion chromatography. In principle, it is possible to clone, express, purify, and crystallize proteins in less than four weeks, which makes this protocol a rapid system for analyzing newly emerging norovirus strains.

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Here, we describe a method to express and purify high quality norovirus protruding (P) domains in E. coli for use in X-ray crystallography studies. This method can be applied to other calicivirus P domains, as well as non-structural proteins, i.e., viral protein genome-linked (VPg), protease, and RNA dependent RNA polymerase (RdRp).

ヒトノロウイルス突出ドメインの生産で<em&gt; E。大腸菌</em&gt; X線結晶用

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

生物学

A Hybridoma Technology for Producing Monoclonal Antibodies against a Metallopeptidase

Source: Xia, P., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/62437">Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video demonstrates an assay to produce monoclonal antibodies against porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase, using a traditional hybridoma technology. Upon immunizing a mouse with APN, the spleen cells are harvested and fused with immortal myeloma cells to produce hybridomas. The hybridomas are then selected and proliferated using the HAT (hypoxanthine-aminopterin-thymidine) medium to produce monoclonal antibodies specific to different APN epitopes.

NURR-1特異的ポリクローナル抗体の密接な相同体に対する交差反応性の自由、Nor1のとNur77の生産

要約

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ハイスループットフローサイトメトリー細胞ベースのアッセイN-メチル-D-アスパラギン酸受容体またはヒト血清中のドーパミン-2受容体に対する抗体を検出する

モノクローナル抗体認識リニアB細胞エピトープのペプチドスキャンアシスト識別

まれな抗原特異的 B 細胞血液の循環から弁別に対するモノクローナル抗体の生成

天然物に対するモノクローナル抗体の作製

細胞に基づく試金の酵素補充療法の細胞内取り込みを中和する抗体の検出

血の N-メチル-D-アスパラギン酸 (NMDA) 受容体に対する自己抗体を検出する単純な細胞ベースの蛍光抗体法

Profiling of the Human Natural Killer Cell Receptor-Ligand Repertoire

ブタ腸粘膜上皮におけるアミノペプチダーゼNを標的とするモノクローナル抗体の作製

ヒトノロウイルス突出ドメインの生産で

メタロペプチダーゼに対するモノクローナル抗体作製ハイブリドーマ技術

NURR-1特異的ポリクローナル抗体の密接な相同体に対する交差反応性の自由、Nor1のとNur77の生産

要約

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ハイスループットフローサイトメトリー細胞ベースのアッセイN-メチル-D-アスパラギン酸受容体またはヒト血清中のドーパ​​ミン-2受容体に対する抗体を検出する

モノクローナル抗体認識リニアB細胞エピトープのペプチドスキャンアシスト識別

まれな抗原特異的 B 細胞血液の循環から弁別に対するモノクローナル抗体の生成

天然物に対するモノクローナル抗体の作製

細胞に基づく試金の酵素補充療法の細胞内取り込みを中和する抗体の検出

血の N-メチル-D-アスパラギン酸 (NMDA) 受容体に対する自己抗体を検出する単純な細胞ベースの蛍光抗体法

Profiling of the Human Natural Killer Cell Receptor-Ligand Repertoire

ブタ腸粘膜上皮におけるアミノペプチダーゼNを標的とするモノクローナル抗体の作製

ヒトノロウイルス突出ドメインの生産で

メタロペプチダーゼに対するモノクローナル抗体作製ハイブリドーマ技術

ハイスループットフローサイトメトリー細胞ベースのアッセイN-メチル-D-アスパラギン酸受容体またはヒト血清中のドーパミン-2受容体に対する抗体を検出する