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미디어 및 솔루션의 1 준비 <ol><li> 효모 추출물 - 펩톤 - 포도당 (YPD) 표준 프로토콜에 대한 다양한 매체를 이용하여 세포를 성장. 2 % 박토 - 펩톤, 1 % 효모 추출물, YPD 배지 대 2 % 글루코스 용액을 제조하고 고체 매질 (19)에 대해 2 % 박토 - 한천을 추가한다. 살균 압력솥. 특정 성장 조건이나 돌연변이 효모를 테스트하기 위해, 필요한 경우, 다른 매체를 사용합니다. </li><li> canavanine 내성 돌연변이에 대한 선택 60 ㎎ / ℓ의 canavanine (SC-인수 + canavanine)와 아르기닌 부족 고체 합성 완전 배지를 확인합니다. 아르기닌 (강하 믹스)가없는 아미노산, 2 % 글루코스, 0.2 % 완전한 보완 혼합물없이 0.67 % 박토 효모 질소베이스, 및 2 % 박토 한천 19 인 용액을 제조 하였다. 오토 클레이브 및 20 ㎎ / ㎖ 원액에서 canavanine을 추가하는 멋진 전에 19 (4 ° C에 저장, 필터 소독). <ol><li> 5 - 플루오로 오로 산 (5-FOA)를 포함하는 고체 합성 완전 배지를 확인합니다. 500 준비아미노산없이 1.34 % 박토 효모 질소베이스, 4 % 포도당, 0.4 % 완전한 보완 혼합물 및 0.2 % 5-FOA이며 용액을 19 ㎖의 필터 - 멸균. 그 다음, 오토 클레이브 (500) 4 % 박토 한천 용액 ㎖, 차가운 짧게, 그리고 500 ㎖의 필터 - 멸균 양액과 혼합한다. 다른 돌연변이 분석에 대한 적절한 대체 용지를 사용하십시오. </li></ol></li><li> 비오틴 라벨링, 500ml의 1X 포스페이트 137 mM 염화나트륨, 2.7 mM의 염화칼륨, 10.14 mM의 인산 나트륨, 및 1.77 mM의 인산 칼륨 이염, pH가 함유 완충 식염수 (PBS) 용액 8 스토어 4 ° C를 만들고에 유지 사용하는 동안 얼음. </li><li> 멸균, 초순수에서 새로운 5 밀리미터 비오틴 재고를 확인하십시오. </li><li> , 비오틴 라벨을 해소 1X PBS의 500 ML, 100 mM의 글리신을 확인하십시오. 4 ° C에서 저장하고 사용하는 동안 얼음에 보관하십시오. </li><li> 사용 된 세포 및 실험 기간의 수에 따라, 1X PBS, 2 mM의 EDTA, 0.5 %를 함유하는 비드 BOVI 표지 버퍼 1-2 L 할NE 혈청 알부민. 필터 소독 및 탈 가스 버퍼입니다. 4 ° C에서 저장하고 사용하는 동안 얼음에 보관하십시오. </li><li> 세포 생존율 측정에 사용하기위한 RT에서 1X PBS에 0.​​4 %의 트리 판 블루 용액, 필터 소독, 저장을 준비한다. </li><li> 밀 배아 응집소 (WGA) 형광 복합체 나누어지는 작은 볼륨 (~ 100 μL)는 세포 나이를 결정하는 데 사용하기 위해 포장 호일 (또는 불투명)의 microcentrifuge 튜브에서 -20 ° C에 저장합니다. </li></ol> 돌연변이 속도 및 주파수의 2 결정 <ol><li> 표준 배양 조건에서 성장한 세포 변동 테스트를 이용하여 셀 당 생성 기준선 돌연변이율을 확립한다. 열한 초기 정지상 (~ 10 8 세포 / ㎖)에 1000 ~ 5000 세포 / ml의 초기 밀도에서 1 ㎖의 문화를 복제에 칠을 성장. <ol><li> 2000 및 집락 형성 - 단위 / ㎖를 결정하기 위해 비 선택 배지 (YPD)에 1-4 μl를 확산 각 복제 문화를 들면, 세포 하나를 희석한다. 펠렛 ~ 2400 X에서 세포를 나머지100 ㎕의 물에 마이크로 원심 및 재현 탁에서 1 분 g는 돌연변이를 식별하는 선택적 매체에 전파합니다. 식민지를 계산하기 전에 30 ° C에서 삼일 (세포의 성장 속도에 따라 필요에 따라 배양 시간을 조정)에 대한 번호판을 품어. </li><li> 선택 배지에 수득 된 돌연변이 콜로니 (R)의 수에 기초하여 상기 시험에서 발생한 독립적 돌연변이 (m)의 수를 결정한다. 9 아래의 식 연구에 대한 돌연변이 식민지의 평균 수를 대입하여 m를 찾기 위해 레아 - Coulson 평균 추정을 사용합니다. 수학 식의 좌측 거의 0이 될 때까지 그런 m의 값을 대체. <img alt="식 (1)" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51850/51850eq1.jpg" /></li><li> 돌연변이 비율을 판단하기 위해, 먼저 복제 배양과 부피 평균 콜로니 - 형성 단위 / ㎖를 곱하여 선택 배지 상에 확산 가능한 세포 수의 평균을 계산선택적 매체에 ml의 확산에 문화. 셀 당 생성 돌연변이율을 수득 가능한 세포의 평균 숫자로 본 단계 2.1.2에서 m의 값을 나눈다. </li></ol></li><li> 단계 2.1.3에서 설명 된 바와 같이 개별적으로 시험 각 복제에 선택적 배양 용 매체 상에 확산 가능한 세포의 개수를 계산한다. 돌연변이 빈도를 얻기 위해 선택 배지 상에 확산 가능한 세포의 수에 의해 얻어진 배양 돌연변이 콜로니 (R)의 수를 나눈다. 기준 돌연변이 주파수와 2.1 단계에서 복제 문화에서 개별 돌연변이 주파수의 평균 또는 중간 값을 사용합니다. </li><li> 돌연변이 축적 연령별 변화를 테스트 할 때 필요 돌연변이 빈도의 변화에​​ 라벨링 공정 결과가 고려되어야하는 경우를 결정하기 위해 비오틴 라벨링 세포 (3.2 및 3.4 단계) 전후의 주파수 측정을 수행. </li></ol> 3 비오틴 라벨링 <ol><li> 세인트reak S. cerevisiae의 YPD 매체에 -80 ° C에서 글리세롤에서 1-3 일 동안 30 ° C에서 배양한다. </li><li> 멸균 피펫 팁을 사용하여, 물 보관 1 ㎖ (또는 그 이상)의 연속 판에서 전송 세포를 염두에 행진의 두껍게 성장 부분의 1 ~ 1.5 cm 약 10 8 세포를 줄 것이다. 혈구를 사용하여 정확한 세포 밀도를 결정합니다. </li><li> 변형 (또는 처리 조건) 컬렉션 포인트 당 돌연변이 빈도가 결정되는 또는 선택 배지에 샘플링 당 적어도 5-10 돌연변이 콜로니를 수득하기에 충분한 모집단 크기 당 10 8 세포 레이블 (단계 2.2에서 돌연변이 빈도에 기초하여). 변형 / 조건 별 기준 측정을위한 추가 열 여덟 세포를 포함합니다. </li><li> 제조 업체에서, 5 mM의 비오틴 시약 스톡을 사용 부드럽게 배양 동안 바위를 제외하고 표준 절차에 따라 비오틴 레이블입니다. 모든 원심 분리 단계에 대한 3000 XG에 4 ° C에서 5 분 동안 스핀,이야4 ° C 이상의 온도에서 회전 인스 증가 세포의 손실로 이어질 수 있습니다. 최종 세척 후, 물에 10 8 표지 세포 / ml의 농도로 세포를 일시. </li><li> 트리 판 블루 염색을 이용하여 세포의 생존 능력을 확인합니다. 물 23 μL 및 1X PBS에 0.​​4 % 트리 판 블루의 67 μL와 세포의 10 μl를 희석. 혈구를 사용하여 라이브 (흠) 죽은 (염색) 세포를 득점하기 전에 실온에서 적어도 40 분 동안 품어. </li><li> 게놈 불안정성, 나이 셀 및 기타 관련 특성에 대한베이스 라인 값을 측정한다 (섹션 5, 6 참조, 및 7). </li><li> 삼각 플라스크 (약 5 × 106 세포 / ml) 10 8 세포 당 YPD 배지 20 ㎖에 비오틴 - 표지 된 세포 이동. 10 8 세포 / ml (4-5 셀 세대)의 대략적인 밀도 문화 (들) 20 ° C에서 16 ~ 18 시간 성장하지만, 세포가 정지 단계에 도달 할 수 없습니다. 30 ° C에서 성장을위한 짧은 배양 시간을 사용합니다. 바이오틴 표지 다 유지4 ° C에서 ELL 학생까지 몇 시간 전에 매체에 첨가, 성장기 및 수집의 타이밍을 최적화하기 위해 필요한 경우. </li></ol> 4 구슬 라벨링 및 자기 정렬 <ol><li> 성장기 후, 혈구를 이용하여 세포 밀도를 결정하는 문화의 분취 액을 희석한다. 3,000 X g에서 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리하여 펠렛 세포. 상층 액을 붓고. </li><li> 다음, 비드 라벨 ​​버퍼의 30 ㎖에 펠렛을 일시 중단 텍싱 원심 분리 및 4.1 절에서와 같이 상층 액을 주입하여 세포를 씻으십시오. 씻어 반복합니다. </li><li> 완전 소용돌이로 교반하여 10 총 8 개 세포 당 50 ㎕의 비드 라벨 버퍼에 세포를 재현 탁. 혼합하기 위해 잠시 열 여덟 총 세포와 소용돌이 당 2 μL에게 자석 구슬을 추가합니다. 에서 온라인 프로토콜에서 수정 (혼합 주기적으로 반전, 10 분 동안 얼음에 품어 <a href="http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf">http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf &lt;</a>/&gt;). </li><li> 비드 라벨 ​​버퍼의 30 ㎖의 세포를 세 번 씻으십시오. </li><li> 세포를 재현 탁 아르 단지 때까지 중간 설정에 10 총 8 개 세포 당 0.5 ㎖의 비드 라벨 버퍼와 잠시 소용돌이 펠렛을 추가합니다. 남아있는 세포 덩어리를 제거하기 위해 50 ML 튜브로 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 부어. 필요한 경우, 이전 컬럼에로드 1-2 시간 동안 얼음에 세포를 둡니다. </li><li> 자기 열이 바인딩 세척, 자기 비드 표지 어머니 세포를 용출 제조업체의 권장 프로토콜을 따르십시오. 표지 세포의 증가 복구의 경우, 2 × 10 9 총 세포 당 하나 이상의 열을 사용합니다. <ol><li> 그들은 흐름을 차단하므로, 열을로드 할 때 발생하는 거품을 제거합니다. 제거에 온라인 프로토콜에서 수정 구슬 (사이에 갇혀되는 것을 세포를 방지하기 위해 세척 사이의 구분에 열을 대체 <a href="http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf">http://www.sysbio.org/dataresources/user</a>manual031113.pdf). </li><li> 원하는 경우, 머더 세포에 의해 생성 젊은 세포를 분석하는 바인딩 및 세정 단계에서 흐를 저장한다. 단계 4.7에 설명 된대로 세포를 집중. </li><li> 한 번에 여러 개의 샘플을 처리하기 위해 다중 열 구분 기호를 사용합니다. 같은 포집 관에 동일한 샘플의 용출 여러 열은 처리 시간 감소 및 세포의 손실을 감소시킵니다. </li></ol></li><li> 4 ° C에서 5 분 동안 3,000 XG에서 원심 분리하여 용출 어머니 세포를 집중. 대기음은 1 만 모두 10 8 원래 바이오틴 표지 세포 당 버퍼 ML. 소용돌이가 잠시 버퍼를 남아있는 세포를 일시 중단합니다. </li><li> 세포의 분취 액을 희석하고 셀 밀도 및 혈구를 사용하여 세포 생존율을 결정 트리 판 블루로 염색하고 (단계 3.5 참조). 회수 된 세포의 총 수를 계산한다. <ol><li> 세포의 수는 예상보다 실질적으로 높은 경우, 젊은 세포 오염을 제거하려고하는 다른 칼럼을 통해 용출 샘플을 통과한다.세포의 수는 예상보다 실질적으로 낮은 경우, 머더 세포의 수율을 개선하기 위해 시도하는 또 다른 칼럼을 통해 샘플을 통해 저장된 유동을 전달한다. </li></ol></li><li> 섹션 5 또는 6에 설명 된대로하지 않고, 다시 자신의 증식 및 연령 (단계 3.7)을 증가시키고 비드 표시하고 (단계를 4.1-4.8.1) 정렬하여 수행하는 YPD 배지에서 세포를 성장, 추가 분석을 위해 세포를 사용하여 비오틴 라벨을 반복해야합니다. </li></ol> 증식 및 연령 (5) 결정 <ol><li> 이 섹션의 모든 단계에 대한 RT에서 5,000 XG에서 2 분 동안 세포를 스핀. 1.5 ㎖의 원심 분리 관에 복구 세포 (~ 10 8 세포 / ml) 25 μl를 넣고 PBS 1X 1 ㎖로 두 번 씻는다. 상층 액을 기음. <ol><li> WGA 공역의 나누어지는 해동, 와류 믹스, 단백질 응집체를 제거하기 위해 잠시 회전합니다. 차의 표면에 꽃 봉오리 흉터에 라벨을 PBS 1 배 180 ㎕의 형광 분자에 결합 WGA의 20 μL에서 세포를 일시 중단전자 셀. 호일로 1.5 ㎖의 원심 분리 관을 덮고 부드러운 30 분 동안 30 ° C에서 락을 함께 품어. </li><li> 1 ㎖의 1X PBS로 3 회 세척 할 것. </li></ol></li><li> 형광 현미경, 라벨 슬라이드 들어 안티 퇴색 방지제를 이용 표준 프로토콜 당 마운트. 완전 이미징 동안 세포의 움직임을 방지하기 위해 커버 슬립을 밀봉하기 전에 어둠 속에서 (몇 일까지) 슬라이드를 치료. 셀 시대의 대표적인 측정을 얻기 위해 샘플 당 적어도 50 세포에 꽃 봉오리 흉터를 계산합니다. 최대 필요한 경우, 새싹 흉터를 볼 1개월에 대한 저장 슬라이드. <ol><li> 대안 적으로, 단계 5.1.2 후 PBS 1X 1 ㎖에 현탁 세포를 유세포 분석기를 수행하여 WGA-공액로부터 형광 신호의 강도를 결정. WGA - 알렉사 488에 대한 505 nm의 긴 패스 필터와 405 nm의 여기 레이저와 30분의 530 nm의 방출 필터를 사용하여 각 수거 장소에 대한 흠없는 컨트롤을 포함합니다. </li></ol></li><li> 에 현미경으로 계산 젊은 세포와 세 세포에 대한 그래프 봉오리 흉터x 축에 동일한 세포 집단에서 WGA-공액 형광 정규화 기하 평균에 대하여 y 축 (염색 등비 / 흠 기하 평균). 이 관계에 대한 선형 추세선의 방정식을 구하십시오. 후속 실험에서, 식 X 용 세포 집단의 WGA-공액 형광 강도의 정규화 기하 평균을 대체하여 시료의 평균 기포 나이를 결정하기 위해 Y 해결. </li></ol> 6 돌연변이 주파수 <ol><li> 단계 2.1.1에 설명 된대로 확산은 YPD 매체와 선택적 매체에 단계 4.7에서 완충액 어머니 세포를 분류. 1 분 동안 5,000 XG에서 선택 배지와 스핀 셀에 대한 재현 탁 어머니 세포 1 ㎖를 사용합니다. 참고 : 세포가 나이가 인구에 비 실행 가능하고 노화 세포의 수를 증가를 보상하기 위해 연령 증가로 YPD 매체에 희석 세포의 큰 볼륨을 확산. <ol><li> YPD 배지로부터 선택 배지 플레이트 부화각각 3, 4 일 동안 30 ° C에서 6.1 단계. 아주 오래된 세포 또는 느리게 성장하는 균주 일주에 배양 시간을 위로 늘립니다. 단계 2.2에 설명 된대로 돌연변이 주파수를 계산합니다. </li></ol></li></ol> 7 감안할 때 증식 및 연령에 대한 예측 돌연변이 주파수를 계산 <ol><li> 중요한 정렬을위한 정렬 머더 세포의 평균 연령에서 초기 셀 모집단의 평균 연령을 감산함으로써 실험 과정 위에 비오틴 표지 된 세포의 증식 및 연령의 평균 증가를 계산한다. 단계 5.2에서 계산 된 세포 나이를 사용하거나 5.2.2 단계. </li><li> 단계 7.1에서 계산 된 평균 세포 연령의 증가에 의해 단계 2.1.3에서 얻어진 돌연변이 속도를 곱하십시오. 관련된 세포 증식 및 연령에 대한 예측값 돌연변이 빈도를 결정하는 단계 2.2에서 계산 된 초기 모집단의 기준 변이 주파수에이 값을 추가한다. </li></ol>

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저자가 공개하는 게 없다.

이 프로토콜은 자원을 사용하기 위해 여러 가지 방법을 조합하고 효율적으로 유사 분열 세포 노화 동안 게놈 불안정성의 연구에 적용 할 cerevisiae의 모델 시스템에서 사용할 수있는 사카로 접근한다. 분석의 다양한 표현형이 선택을 통해 게놈 불안정성의 다른 형태를 정량화하는 돌연변이 또는 염색체 재 배열의 특정 형태의 축적이 가능 연령별 변화를 연구하기 위해 자기 정렬과 결합 될 수있다. 전체 게놈 시퀀싱 방법은 나이와 게놈에 발생하는 변화의 전체 유형에 대한 자세한 정보를 제공 할 수 있지만, 돌연변이 레이트 측정을 얻기 위해 표현형 선택 시스템을 사용하기 위해 우선적으로 유전 적 변화의 특정 유형을 분리하는 능력은 역학적 연구를위한 중요한 장점은 노화 관련 유전자 불안정성의 측면. 나이 세포의 결정 및 전위 합리화 physiologi 병렬 측정을 수행 할흐름을 통해 학적 변화는 세포 계측법 특정 연령대 동안 다른 세포 변화와 게놈 불안정성의 상관 관계를하는 효율적인 수단을 제공합니다. 축적 돌연변이의 비율의 잠재적 연령에 의존하는 변화의 결정이 필요합니다 1)주의 젊은 세포 인구의 비율의 결정, 세포 연령이) 정확한 결정, 3) 안정적으로 재현성있게 측정 할 수있는 어머니 세포의 충분히 큰 개체군을 풍부하게 할 수있는 능력 노년 게놈 불안정성. 이 접근법은 효​​모 모델 시스템은 요금 및 / 또는 mitotically 활성 세포 게놈 불안정성의 주파수에 의존 연령 변화에 책임 기전을 형성에 기여할 수있다. 또한, 유전 적, 환경 적 요인이 빠르게 연령에 의존 게놈의 불안정성에 공헌 평가 될 수있다. 궁극적으로, 이러한 특성화는 돌연변이가 증식 및 노화 과정에 누적되는 방식을 설명 모델의 개발로 이어질 수 있습니다. 이 방법은 이러한 사건의 속도를 측정하기 위해 선택 가능 표현형의 모양을 통해 돌연변이 또는 게놈 불안정성의 다른 유형을 검출 할 수있는 능력에 달려있다. 그러나, 분석 설계의 창의성은 게놈 불안정성의 여러 측면을 조사 할 수 있도록 할 수 있습니다. 예를 들어 URA3 및 CAN1 유전자는 게놈 위치 결과에 어떠한 영향을 테스트하기 위해 다른 게놈 위치에 배치 될 수있다. 기능 유전자의 대립 유전자에 특정 비 기능 유전자 대립 형질의 복귀는 특정 돌연변이 프로세스를 테스트 할 수 있습니다. 또한, 유전자 또는 반복 서열을 가진 유전자를 플 랭킹 여러 비활성 대립 유전자의 도입은 각각 복원 또는 유전자 기능의 손실을 통해 재조합 사건을 조사하는데 사용될 수있다. 변동 시험이 다양한 게놈 불안정성 이벤트 (9)의 속도를 결정하기위한 표준 접근법이다. 프로토콜은 무타을 결정하기 위해 잘 받아 들여 비교적 간단 레아 - Coulson 중간 추를 사용하여 작성기 속도는 MSS-최우 추정기 방법 돌연변이율 구를 결정 최상의 접근 간주 되더라도, 다양한 연구에 더 접근 할 수 있도록한다. MSS-최우 추정기는 이전에 상세히 9에서 검토되었으며, 다른 방법으로 사용될 수 있지만,보다 복잡한 계산을 필요로한다. 또한,이 방법으로 돌연변이 비율을 계산하는 무료 소프트웨어는 22 사용할 수있게되었습니다. 돌연변이 비율의 재현 조치를 구하기 충분한 복제 문화를 사용하여 충분히 낮은 초기 세포 밀도에서 문화 접종을 포함하여 실험 설계의 몇 가지 측면에주의를 요구하는 만 배 이상, 선택 적절한 문화 볼륨 인구의 크기가 증가하여 전체 있도록 세포의 인구는 선택 배지에 확산 될 수 있습니다. 후자의 지점에 대해, 앞서 설명한 공식 배양 teste의 분율에 기초한 돌연변이 빈도를 조정하기 위해 사용될 수있다D 구. 배양의 성장 속도의 변동이 재현 돌연변이율의 판정, 및 최근 23를 설명 하였지만 이러한 상황에서 더욱 재현 가능한 결과를 산출 할 수 개질 중앙값 기반 추정기를 복잡하게 할 수있다. 정확하게 셀 나이를 측정 할 수있는 능력은 오래 세포 게놈 불안정성 주파수 인한 젊은 세포의 이벤트 레이트에 기대 값과 다른 여부를 설정하기위한 또 다른 중요한 인자이다. WGA는 서로 다른 형광 분자 접합 사용할 수 있기 때문에 우리는 배경과 유연성의 측면에서 모두 흰색 염색을 calcofluor하는 것이 바람직 할 WGA 염색을 발견했다. 이러한 유연성은 형광 시약과 다른 세포의 특성을 동시에 측정을 위해 더 많은 기회를 제공 할 수 있습니다. 초기 작업은 더 이어질 수 신호 WGA 염색에 대한 강도 및 세포 봉오리 흉터의 수 사이의 대응 관계를 설정하는유동 세포 계측법을 통해 세포 연령의 신속한 결정. 이 방법은 또한 전형적으로 측정의 재현성 향상을위한 현미경으로 관찰되는 것보다 큰 크기 개체군의 사용을 허용한다. 모든 연령의 결정이 세포의 현미경 검사를 통해 할 수 있지만, 우리는 접근 유동 세포 계측법 연령에 의존 게놈의 불안정성에 영향을 미치는 요인의 신속한 선별을 용이하게 느낀다. 안정적으로 세포 나이를 측정하는 것 외에도, 고려 머더 세포 성장 및 세포의 정렬 각 연속 라운드로 받도록 허용하는 세포의 분할 수에 부여 될 필요가있다. 세포가 원하는 세포 밀도에 도달하기 전에 더 많은 세포 분열을 겪게 할 수있는 작은 초기 인구 크기 또는 더 큰 문화의 볼륨을 사용합니다. 예를 들어, 다른 연구자들은 적은 experime 오래 된 세포를 얻는 명백한 장점을 가지고 아주 오래된 효모 세포 (16)을 얻기 위해 정렬의 두 라운드를 사용했다ntal 단계. 세포를 선별하기 전에 더 많은 세포 분열을 완료 할 수 있도록 배양 부피를 증가 여부를 고려할 때 염두에 단일 열에서 처리 될 수있는 셀들의 총 개수에 대한 제한을 유지한다. 하나의 세포 집단을 정렬하기 위해 여러 컬럼의 사용을 필요로 할 수있는 더 큰 문화의 볼륨을 사용합니다. 세포 종류 / 수집 지점 사이의 세포 분열의 적은 라운드를 받아야하는 경우 또한, 다음의 수명 동안 별개의 시점에서 예상 돌연변이 주파수의 편차를 관찰 할 더 많은 기회가있다. 예를 들어, 수명 동안에 만에 초기 샘플링 늦은 시점은 데이터 돌연변이 빈도가 꾸준히 증가를 나타내는, 그러나 신속하고 고원이 돌연변이 주파수가 증가를 표시 할 수 있습니다 수명 동안 추가 중간 시간에 샘플링을 생성 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 이전 머더 세포를 분리하기 때문에, 연령 돌연변이율 변화의 더 직접적인 측정치를 얻을 수있는 기회가있다. 변동 시험은 ㄱ 수E는 돌연변이율이 젊은 세포를 사용하여 얻은 속도 다를 여부를 결정하기 위해 서로 다른 연령의 어머니 세포를 사용하여 수행. 그들이 성장이 변동 시험에 대한 문화가 오래되고 젊은 세포의 혼합물이 될 것입니다 동안, 젊은 세포로 시작 획득 속도에서 어떤 편차는 이전 시작 인구의 사용에 기인 할 수있다. 정확하게 재현 게놈 불안정성을 측정하기 위해 세 머더 셀 충분히 큰 집단을 수득하는 능력은 이러한 접근법의 성공에 매우 중요하다. 프로토콜은 이러한 목적을 위해 특히 자기 정렬 시스템의 사용을 설명하지만, 다른 그룹은 다른 시스템 (14, 18) (자재 도표 참조) 어머니 효모 세포를 분류 하였다. 제조 업체의 일부 프로토콜 최적화가 요구 될 수 있지만 이러한 대안이 시스템은 또한,이 방법으로 작동합니다. 에 관계없이 사용 된 특정 시스템의 인구 크기는 필요연구를 위해 선택된 돌연변이 또는 게놈 재 배열 된 형태의 주파수에 따라 D 다르다. 최소한 충분히 머더 세포 돌연변이 빈도를 계산하는 인구 당 적어도 하나의 돌연변이 콜로니를 얻을​​ 수있을한다. 만 0-5 돌연변이 식민지가 인구 크기 및 인구 규모도 작은 증가를 기대하는 경우 5-10 돌연변이 식민지가 예상되어, 크게 재현성을 향상시킬 수 있도록 실제로, 결과는 매우 변수가 될 수 있습니다. 비오틴 라벨링 인구 시작되면, 각각의 정렬을위한 회수 효율 구 모 세포의 돌연변이 빈도를 측정하기 위해 필요한 적절한 모집단 크기를 식별하기 위해 고려 될 필요가있다. 각 정렬 후 어머니 세포의 90 % 회복, 원래 인구의 59 %는 성장과 정렬의 5 라운드 이후에 복구 할 수있다. 이것은 ~ 33 % 성장의 5 라운드 후 원래 인구의 복구 및 표시 어머니 세포의 80 %를 복구하는 경우 정렬에 떨어각 종류의시 에드. 인구의 크기가 2-3 배 감소가 쉽게 인구 당 돌연변이 식민지의 신뢰할 수없는 번호로 이어질 수 있기 때문에, 저주파 이벤트를 측정 할 때 측정 및 복구를 극대화하는 것이 중요합니다. 에 확대 또는 유사 분열 세포 노화 동안 게놈 불안정성의 폭 넓은 이해를 얻기 위해이 프로토콜을 수정하기위한 수많은 옵션이 있습니다. 간단한 예는 유전자 기능, 미디어 변경, 또는 다른 환경 조건 변화의 변화는 나이와 돌연변이의 축적을 분석하는 방법을 변경하는 등. 변형 된 유전자의 기능 또는 적절한 조건에서 젊은 세포 돌연변이 비율을 측정 및 제어 세포 집단에서 다르게 속도 값에 의해 예측 된 것보다 돌연변이와 다르게 축적 여부를 결정하기 위해 사용될 것이다. 증식 및 노화 동안 다른 지점에서 세포 집단은 반응성 산소 종 또는 DNA 손상 에이전트와 같은 특정 스트레스에 노출 될 수있다.산화 적 스트레스에 노출 과도 중성 실질적 정렬 셀 (도 3)를 수행하는 능력을 변화시키지 않았지만, 가혹한 응력은 세포의 회복을 복잡있다. 예비 실험은 어머니 세포가 여전히 특정 스트레스 후 효율적으로 복구 할 수 있는지 확인하기 위해 필요하다. 또한, 절연 어머니 세포의 세포질 특성 3 노화와 연관되는 활성 산소 종, 미토콘드리아와 액포 형태 및 기타 생리 학적 특성의 수준을 포함하여 상세하게 분석 될 수있다. 또한, 머더 세포 또는 추가 처리 조작 개시 인구 수 있었다. 엄마와 딸 세포가 물리적으로 절차를 수행하는 동안 분리되어 있기 때문에, 딸 세포는 여전히도 분석을 위해 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 딸 세포 또는 효모 어머니와 딸 세포 사이 손상 거대 분자의 비대칭 상속의 생리 학적 특성의 변화 <s&gt; (24)는 돌연변이 주파수 / 속도의 흥미로운 변화의 타이밍에 비교 될 수까지. 딸 세포 집단에 대한 돌연변이 빈도도 증식 및 노화 동안 돌연변이 비대칭 상속이 있는지 모델링하려고하기 위해 얻어 질 수있다. 요약하면, 변동 테스트를 정렬 자기 셀을 통해 머더 세포의 농축을 조합하면 S.의 이점을 가능하게 cerevisiae의 모델 시스템은 효율적으로 세포 유사 분열 동안 노화 유전자 변화의 축적에 대한 책임을 조사기구에 적용될 수있다.

이러한 효모 사카로 미세스 세 레비 시아와 같은 미생물, 돌연변이율을 조사하는 우수한 모델이지만,이 모델은 완전히 유사 분열 세포의 노화 동안 돌연변이의 축적을 조사하는 데에 이용되지 않았다. 핵 게놈에서 돌연변이의 축적은 유전자의 기능을 하나 (또는 변형) 진보의 손실이 발생하여 노화에 기여하는 가설이있다. 크게 때문에 손쉬운 유전 시스템이 프로세스에 영향을 미치는 유전 적 및 환경 적 요인들의 식별 및 미생물 희귀 표현형 변화를 정량화의 용이성을 촉진 할 수 노화 동안에 메커니즘과 돌연변이 축적의 영향을 연구하기 위해 미생물 시스템을 사용할 수있는 능력. DNA 수리 인자 및 DNA 손상 반응 단백질이 아니라 다양한 종에 걸쳐 보존되고, 유기체 노화 기본적인 유사성 S. 등 다양한 미생물에 대해 식별 된 cerevisiae의의그것은 가능성이 있음을 만드는 D 포유류 3, 효모의 연구에서 얻은 결과는 많은 생물의 노화와 관련됩니다. S. 노화에 관한 연구 cerevisiae의 연대기 노화 또는 세포의 증식 및 노화를 측정하는이 노화 모델을 사용한다. 연대 기적 노화 영양분 고갈 3 비 분할 상태 (정지상)에 효모 세포 집단의 생존 능력의 점진적인 손실을 특징으로한다. 연대 기적 노화 모델은 큰 세포 집단 쉽게 돌연변이 세포 표현형 선택을 수행하기 위해이 모델에서 획득되기 때문에 돌연변이는, 4 세를 축적 증가 함을 입증하기 위해 사용되었다. 이 경우에, 변이 축적이 성장 신호 전달 경로 및 산화 적 스트레스 (5)에 의해 영향을받을 것처럼, 이들 각 요소는 다세포 진핵 3에서 에이징 이해에 중요한 것이다. 증식 및 노화 모델은 비대칭을 divisi 악용S. 사이에 연속 셀 세대 세 발생 노화를 조사하는 cerevisiae의 어머니와 딸 세포. 효모 증식 및 노화는 종종 마이크로 유체 장치 6,7에서 효모 세포의 작은 인구의 비디오 현미경을 통해 어머니와 딸 세포, 또는 최근의 작은 인구의 미세 조작을 통해 측정되었다. 제한된 인구 크기는 전체 게놈 정보가 하나의 세포로부터 얻을 수있다 또는 매우 높은 주파수 유전자 변화가 팔을 측정하지 않는 한 유사 분열 노화 동안 돌연변이의 축적을 조사하는 이러한 접근 방식은 잘못 적합하다. 단일 셀의 전체 게놈 서열은 돌연변이의 축적을 조사위한 실질적인 데이터 세트를 제공하지만 표현형 선택 시스템 메커니즘보기 기본 돌연변이 축적 공부 돌연변이 비율을 측정하는 수단을 제공하는 중요한 이점을 가지고있다. 연구는 haploi의 표현형의 선택을 통해 돌연변이 주파수와 속도를 검사합니다증식 및 노화 동안 D 효모 균주는 아직보고되지 않았다. 돌연변이율 일반적 변동 시험 구를 사용하여 측정된다. 돌연변이 빈도 값은 인구 유전자 서열의 변이를 형질 세포의 총 수를 반영한​​다. 이것은 독립적 인 돌연변이가 발생하는 세포와 단순히 기존의 돌연변이를 상속 그 세포의 자손이 포함되어 있습니다. 반대로, 변동 테스트를 통해 측정 돌연변이율 새롭게 각 전지 발전 발생할 독립적 돌연변이의 수를 나타낸다. 이러한 시험은 일반적으로, 표적 서열에서 기존의 돌연변이 세포를 첨가 가까운 포화 배양 성장하고, 선택 배지에서의 성장에 의해 돌연변이 세포를 식별 할 가능성을 감소시키기 위해 낮은 세포 밀도에 많은 복제 배양 물을 접종 포함한다. 복제 개체군에서 식별 돌연변이 세포의 숫자는 난의 수를 추정하기 위해 여러 수학적 모델 중 하나를 사용성장 9시 발생 ndependent 돌연변이. 평균 모집단 크기에 독립적 돌연변이의 수를 비교하는 것은 돌연변이율의 측정 값을 제공한다. S.에서 이 유전자의 기능 상실 돌연변이가 선택 표현형을 생산 이후로 미세스 세 레비 시아는 돌연변이 주파수 및 요금 자주 URA3 및 CAN1 유전자를 사용하여 측정한다. URA3에 의해 코드되는 단백질은 독성 분자 (10)에 5-FOA 변환 이후 URA3 기능의 손실, 5 - 플루오로 오로 산 (5-FOA)에 내성 세포를 렌더링합니다. CAN1에 의해 코드되는 단백질은 세포 11에 아르기닌 canavanine를 전송하기 때문에 CAN1의 기능의 손실, 세포 canavanine, 독성 아르기닌 아날로그에 내성이 될 수 있습니다. 모두 유전 적, 물리적 정렬 전략이 성공적으로 S.의 큰 인구를 얻기 위해 사용되었다 cerevisiae의 어머니 세포 증식 및 노화의 조사를 용이하게하기 위해. 유전 전략은 인구의 딸 세포 생존에 선택 영리한 방법을 포함한다. 어머니 농축 프로그램 (MEP)는에 loxP 사이트 (12)를 포함하도록 설계되었습니다 두 가지 중요한 유전자의 딸 고유의 중단으로 이어지는, 외동 딸 세포에 Cre 호텔의 재조합 효소의 발현 베타 - 에스트라 디올 유도를 포함한다. MEP 균주 유도제의 부재 하에서 통상적으로 성장 될 수 있지만, 머더 세포 딸 세포는 세포주기 (12)를 통해 처음으로 진행 중에 통상 M-단계에서 체포 반면, 유도 다음 분할 할 것이다. 이 시스템은 크게 노화 중에 돌연변이 축적을 연구하는 데 사용되지는 않았지만, 이는 노화 머더 셀 13,14에서 이형의 손실 배체 효모 균주의 게놈 불안정성 비교적 빈번한 형태뿐만 아니라 생화학 적 변화를 연구하는 데 사용되어왔다. 마찬가지로, 도터 피뢰기 시스템 S. 딸의 특정 식을 포함 cerevisiae URA3 유전자 15. 5-FOA가되는 URA3을 표현하는 점 딸 세포가 죽을 것이다, 배지에 첨가 될 때까지 어머니 세포가 15 성장을 계속하는 동안 딸 - 피뢰기 균주는 일반적으로 성장한다. 이러한 머더 세포 농축 시스템에 유용하지만, 이들은 선택 시스템을 구성하는 유전자 기능의 유지에 의존한다. 선택 시스템의 하나 이상의 구성 요소의 임의의 돌연변이가 선택 벗어나 지수 딸 세포 증식 될 수있다. MEP 균주의 개발 과정에서, 적절한 크기의 인구가 선택 (12)을 벗어날 수있는 돌연변이 딸 세포의 모양을 회피하기로 결정했다. 그러나, 인구 규모에서이 제한 증식 및 노화 동안 게놈 불안정성의 드문 형태의 탐지를 타협. 인구의 크기에 제한이 부분적으로 각 유전자의 두 카피가 가장 때문에, 선택 시스템에 공헌하여 배체 효모 균주를 사용함으로써 극복 될 수있다돌연변이 가능성이 12 열성이 될 것이다. 그러나 이배체 균주의 사용은 쉽게 쉽게 반수체 효모 세포에서 검출 될 수있는 것에 비해 돌연변이를 검출 할 수 이벤트의 유형을 제한한다. 물리적 정렬 전략 어머니 세포의 큰 인구에 풍부하게 레이블이없는 딸 세포에서 레이블이 세포 표면 어머니 세포의 분리를 포함한다. S.의 세포 표면 단백질이 관찰 (세포벽 단백질) cerevisiae의 딸 세포는 새로 그들은 16을 생산 딸 세포 레이블없이 어머니 세포에 라벨을 악용 한 신진 동안 합성된다. 예를 들어, 비오틴과의 표면에 표지 된 효모 세포의 초기 집단을 성장시킬 수 있고, 그 다음 초기 모집단 생성 딸 세포는 그들의 표면 상에 비오틴을 함유하지 않기 때문에 16 정렬 안티 비오틴 마이크로 비드 및 자석을 사용하여 자신의 딸 세포로부터 분리 . 직렬 성장과정렬 어머니 세포의 점진적 이전 인구가 획득하고 분석 할 수 있습니다. 이 절차는 효모 13,14,17,18의 증식 및 세포 노화시 생리 및 유전자 발현의 변화를 조사하기 위해 성공적으로 사용되어왔다. 현재의 방법은 잠재적으로 희귀 한 형질 변이 또는 선택 사항을 정량 게놈 불안정성의 다른 형태의 축적을 측정 할 목적으로 머더 셀이 풍부 비오틴 라벨링 및 자기 정렬 기술을 적응시킨다. 직렬 성장 및 물리적 정렬 점진적 이전 머더 세포에서 돌연변이 축적 분석뿐만 아니라 자신의 딸 세포 집단을 허용한다. 생성 당 돌연변이 비율의 결정은 예측 된 돌연변이 빈도가 세포 분열의 특정한 번호를받은 머더 셀에 대해 계산 될 수있다. 예측 주파수 값으로 인해 관찰 mutati에서 세포 분열의 추가 라운드, 상당한 편차로 예상 증가를 기반으로하고 있기 때문에예측 값과 비교 주파수에 축적 돌연변이의 비율 연령별 변화에 대한 증거를 제공합니다. 이 프로토콜을 이용하여, 유동 세포 계측법에 의해 분석하여 결합 머더 세포 세포 분열 부위에 대응 봉오리 흉터의 형광 염색을 신속하게 정렬 및 정렬되지 않은 집단의 연령 분포를 결정하는데 사용될 수있다. 이러한 반응성 산소 종을 검출하기 위해 사용되는 것과 같은 추가의 형광 시약은 또한이 프로토콜 동안 이용 될 수있다. 전반적으로,이 프로토콜은 노화 관련 유전자의 불안정성에 영향을 미치는 유전 적, 환경 적 요인을 연구에 적합 모델 생물의 노화와 관련된 세포의 생리적 변화에 대한 상관 관계에 대한 가능성이있는 게놈 불안정성 연령에 따라 변화를 효율적으로 분석 할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="802">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:108px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:359px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td style="width:108px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21335</td>
			<td style="width:359px;">100mg</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-Biotin Microbeads</td>
			<td style="width:108px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-485</td>
			<td style="width:359px;">2ml MicroBeads conjugated to monoclonal mouse anti-biotin antibodies (isotype: mouse IgG1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MACS LS columns</td>
			<td style="width:108px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td style="width:359px;">25 columns suitable for QuadroMACS separator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QuadroMACS separator</td>
			<td style="width:108px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-976</td>
			<td style="width:359px;">Separator Only</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">QuadroMACS Starting Kit</td>
			<td style="width:108px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-091-051</td>
			<td style="width:359px;">Includes:&#160; QuadroMACS Separator (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), LS Columns (130-042-401), MACS 15ml Tube Rack (130-091-052), One 2ml unit of MACS MicroBeads. Note: Alternative systems include Dynabeads Biotin Binder and MagnaBind Magnetic Beads</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BD Falcon Cell Strainer, 40 &#181;m</td>
			<td style="width:108px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td style="width:359px;">40 &#181;m for use with BD Falcon 50 ml Conical Tubes.&#160; 50 per pack</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6146</td>
			<td style="width:359px;">Powder, filtering after dissolving important to remove particulates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wheat germ agglutinin Alexa Fluor488</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">W11261</td>
			<td style="width:359px;">Conjugates with different excitation/emission spectra could also be used</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">P36930</td>
			<td>10 ml, other antifade reagents could also be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining magnetic sorting of mother cells and fluctuation tests to analyze genome instability during mitotic cell aging in saccharomyces cerevisiae

사카로 미세스 세 레비 시아는 메커니즘과 게놈 불안정성의 결과를 검사하는 훌륭한 모델 시스템이었다. DNA 수리 및 DNA 손상 반응 인자가 아니라 다양한 종에 걸쳐 보존되어 있기 때문에이 효모 모델에서 얻은 정보는, 인간을 포함한 많은 미생물에 적합하다. 그러나, S. 미세스 세 레비 시아는 아직 완전히 여부 연령 증가 증식 및 (유사 분열)와 돌연변이 변화를 축적의 속도 기술적 제약으로 해결하는 데 사용되지 않았습니다. 예를 들어, 미세 조작을 통한 효모 증식 및 수명의 측정은 드문 돌연변이 검출을 금지하는 세포의 매우 작은 집단을 포함한다. 딸 세포 사멸을 유도함으로써 인구 머더 세포 농축 유전 방법이 개발되어 왔지만, 인구 크기는 여전히 선택 시스템을 손상 무작위 돌연변이가 발생하는 빈도에 의​​해 제한된다. 현재의 프로토콜은 자기 sorti을 활용표면 표지 효모 어머니 세포의 NG는 표현형 선택을 통해 희귀 돌연변이를 계량하는 어머니 세포 노화의 충분한 인구를 얻었다. 변동 테스트를 통해 측정 돌연변이율, 돌연변이 주파수는 제 젊은 세포 확립과 증식 및 다양한 연령대의 어머니 세포에서 돌연변이의 빈도를 예측하는데 사용된다. 돌연변이 빈도는 정렬 된 머더 셀에 대해 결정되며, 셀의 어머니는 나이 세포 분열 동안 그들의 세포 표면에 형성된 봉오리 흉터를 검출하는 형광 시약으로 염색하여 유세포 사용하여 결정된다. 실험적으로 소정의 증식 및 나이 머더 세포 관찰 주파수로 세포 분열의 수에 기초하여 예측 된 돌연변이 주파수의 비교는 축적 돌연변이 비율에 나이 - 관련 변화가 있는지 여부를 식별 할 수있다. 이 기본 프로토콜의 변형이 특정 유전자 기능의 변화의 영향을 조사하는 수단을 제공하거나돌연변이의 축적에 대한 특정 환경 조건 증식 및 노화 동안 메커니즘에게 기본 게놈 불안정성을 해결합니다.

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Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

변동 테스트를 통해 측정 된 사카로 미세스 세 레비 시아 젊은 세포에서 돌연변이 비율이 상이한 연령의 증식 및 모 세포의 돌연변이 빈도를 예측하는데 사용된다. 자기 정렬 및 유동 세포 계측법은 다음 예측 돌연변이 주파수에서 모든 편차를 식별하기 위해 실제 돌연변이 주파수와 어머니 세포의 나이를 측정하는 데 사용됩니다.

어머니 세포 및 변동 시험의 자기 정렬을 결합에서 유사 분열 세포 노화 동안 게놈 불안정성을 분석합니다<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

12.5K 조회수.  Rensselaer Polytechnic Institute.  변동 테스트를 통해 측정 된 사카로 미세스 세 레비 시아 젊은 세포에서 돌연변이 비율이 상이한 연령의 증식 및 모 세포의 돌연변이 빈도를 예측하는데 사용된다. 자기 정렬 및 유동 세포 계측법은 다음 예측 돌연변이 주파수에서 모든 편차를 식별하기 위해 실제 돌연변이 주파수와 어머니 세포의 나이를 측정하는 데 사용됩니다. 

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Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

의 해부 Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

연구

생물학

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

지방산의 정량 Phosphoproteomics은 자극 Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray 분석을위한 Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

자기 활성 셀 정렬 (LIMACS)를 사용하여 지질 소포 - 중재 동질 크로마 토그래피 : 단백질 지질 상호 작용을 분석하는 소설 방법

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

효모에서 모니터링 Mitophagy을위한 형광 현미경 분석 Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

의 낭성 섬유증의 Transmembrane의 전도성 조절 단백질의 표현과 정제 Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

의 모니터링 단백질 접힘에 대한 결합 분석 실험<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging

Aging tissue is characterized by a continuous decline in functional ability. Adult stem cells are crucial in maintaining tissue homeostasis particularly in tissues that have a high turnover rate such as the intestinal epithelium. However, adult stem cells are also subject to aging processes and the concomitant decline in function. The Drosophila midgut has emerged as an ideal model system to study molecular mechanisms that interfere with the intestinal stem cells&#8217; (ISCs) ability to function in tissue homeostasis. Although adult ISCs can be easily identified and isolated from midguts of young flies, it has been a major challenge to study endogenous molecular changes of ISCs during aging. This is due to the lack of a combination of molecular markers suitable to isolate ISCs from aged intestines. Here we propose a method that allows for successful dissociation of midgut tissue into living cells that can subsequently be separated into distinct populations by FACS. By using dissociated cells from the esg-Gal4, UAS-GFP fly line, in which both ISCs and the enteroblast (EB) progenitor cells express GFP, two populations of cells are distinguished based on different GFP intensities. These differences in GFP expression correlate with differences in cell size and granularity and represent enriched populations of ISCs and EBs. Intriguingly, the two GFP-positive cell populations remain distinctly separated during aging, presenting a novel technique for identifying and isolating cell populations enriched for either ISCs or EBs at any time point during aging. The further analysis, for example transcriptome analysis, of these particular cell populations at various time points during aging is now possible and this will facilitate the examination of endogenous molecular changes that occur in these cells during aging.

Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging

Understanding the endogenous molecular changes in adult stem cells during aging requires isolating the cells of interest. The method described here presents a simple and robust approach to enrich for and isolate Drosophila intestinal stem cells and the enteroblast progenitor cells by FACS at any time point during aging.

성인에서 장내 줄기 세포를 분리<em&gt; 초파리</em&gt; FACS로 Mi​​dguts는 노화 동안 줄기 세포 동작을 연구하기 위해

Aging tissue is characterized by a continuous decline in functional ability. Adult stem cells are crucial in maintaining tissue homeostasis particularly ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.