この作品は、この記事の内容は、必ずしも米国国立衛生研究所の公式見解を反映するものではないPHMに国立衛生研究所の国立老化研究所からの助成金R00AG031911によって部分的にサポートされていました。

メディアアンドソリューションズの調製<ol><li>酵母エキス - ペプトン - グルコース（YPD）標準プロトコルのための富栄養培地を用いて細胞を成長させる。 2％バクトペプトン、1％酵母エキス、YPD培地、2％グルコース溶液を調製し、固形培地19、2％バクト寒天を追加する。滅菌するオートクレーブ。特定の成長条件または変異酵母株をテストするために、必要に応じて、代わりのメディアを使用してください。 </li><li>カナバニン耐性変異株を選択するために、60 mg / Lのカナバニン（SC-argが+カナバニン）とアルギニン不足している固体の合成完全培地を加えます。アルギニン（ドロップアウト·ミックス）のないアミノ酸、2％グルコース、0.2％完全なサプリメント混合せずに0.67％バクト酵母窒素ベース、2％バクト寒天19である溶液を調製する。オートクレーブの前に20 mg / mlのストック溶液（濾過滅菌し、4℃で保存）19からカナバニンを添加することに冷却する。 <ol><li> 5フルオロオロチン酸（5-FOA）を含む固体合成完全培地を加えます。 500を準備する、アミノ酸を含まない4％グルコース、0.4％完全なサプリメント混合物、及び0.2％の5-FOA 1.34％バクト酵母窒素塩基であり、19をフィルター滅菌溶液を加えた。その後、4％バクト寒天液のオートクレーブ500ミリリットル、涼しい簡潔に、そして500mlのフィルター滅菌栄養液と混合。他の突然変異試験のための適切な代替メディアを使用してください。 </li></ol></li><li>ビオチン標識のために500mlの137 mMの塩化ナトリウム、2.7mMの塩化カリウム、10.14 mMのリン酸ナトリウム二塩基、及び4℃で1.77 mMのリン酸カリウム二塩基、pH8のストアを含む1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液を作製し、上に保つ使用中に氷。 </li><li>無菌の超純水に新鮮な5 mMのビオチンのストックを作る。 </li><li>ビオチン標識をクエンチするために、1×PBS、100mMグリシンの500ミリリットルを加える。 4℃で保存し、使用中に氷上に保つ。 </li><li>使用される細胞および実験の期間の数に応じて、1×PBS、2mMのEDTA、0.5％boviを含むビーズ標識バッファー1-2 Lを作るNE血清アルブミン。フィルター滅菌し、脱ガスバッファ。 4℃で保存し、使用中に氷上に保つ。 </li><li> 1×PBS中の0.4％トリパンブルー溶液を調製し、フィルターは滅菌し、細胞生存率の測定に使用するためにRTで保存。 </li><li>コムギ胚芽凝集素（WGA）の蛍光結合体の一定分量、少量（〜100μl）を細胞齢を決定する際に使用するためにラップ箔（または不透明）マイクロチューブ内に-20℃で保存する。 </li></ol>突然変異率と周波数の2の決定<ol><li>標準的な培養条件下で増殖させた細胞について変動試験を用いて細胞世代あたりのベースライン突然変異率を確立する。成長11への7は、初期の定常期（〜10 8細胞/ ml）のに1,000〜5,000細胞/ mlの初期密度から1ミリリットルの培養物を複製する。 <ol><li>各反復文化のために、細胞を1希薄：2000およびコロニー形成単位/ mlに決定するために、非選択培地（YPD）上に1-4μLを広げた。 〜2400 xにおけるペレット残りのセル100μlの水中の微量遠心再懸濁中で1分間gが突然変異体を同定する選択培地上に広げた。 （細胞の増殖速度に基づいて、必要に応じて、インキュベーション時間を調節する）前に、コロニーを計数し、30°Cで3日間培養する。 </li><li>選択培地上で得られた変異コロニー（r）の数に基づいて裁判に発生した独立した変異（M）の数を決定します。 9以下の式におけるRの変異体コロニー数の中央値を代入してMを見つけるためにリー·コールソン中央値推定器を使用してください。式の左辺は実質的にゼロになるまで、そして、mの値を代入します。 <img alt="式（1）" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51850/51850eq1.jpg" /></li><li>突然変異率を決定するために、第一の複製培養物及び体積の平均コロニー形成単位/ mlに乗じて選択培地上に広げ、生存細胞の平均数を計算する選択培地上に加えスプレッドの文化の。セル生成あたりの突然変異率を得るために、生存細胞のこの平均数によって、ステップ2.1.2からのm値を割ります。 </li></ol></li><li>ステップ2.1.3で説明したように個別試験では各反復培養用の選択培地上に広げ、生細胞の数を計算する。変異頻度を得るために選択培地上に広げ、生存細胞数で培養について得られた突然変異体コロニー（r）の数を分割する。ベースライン変異頻度としてステップ2.1で複製培養物から個別の突然変異頻度の平均値や中央値を使用してください。 </li><li>突然変異蓄積の年齢別変化をテストする際に考慮する必要があるでしょう変異の頻度の変化での標識工程の結果かどうかを判断するためにビオチン標識細胞（3.2および3.4​​ステップ）の前と後の周波数測定を行います。 </li></ol> 3ビオチン標識<ol><li>セントreak S. cerevisiaeの YPD培地上に-80℃でグリセロールストックから1〜3日間30℃でインキュベートする。 </li><li>念頭に置いて水保管の1ミリリットル（またはそれ以上）にストリークプレートからの転送細胞はストリークの厚く成長した部分1〜1.5センチ、約10 8個の細胞を与えることを、滅菌したピペットチップを使用した。血球計数器を用いて正確な細胞密度を決定します。 </li><li>ラベル10 8変異頻度が決定されるで収集ポイントごと株（または処理条件）当たりの細胞または（工程2.2からの突然変異頻度に基づいて）選択培地上でのサンプリング当たり少なくとも5〜10の変異体コロニーを得るのに十分な集団の大きさ。歪み/条件あたりのベースライン測定のための追加の10 8細胞を含む。 </li><li>メーカーから、5 mMのビオチン試薬のストックを使用して、静かにインキュベーション中に岩を除いて、標準手順に従ってビオチン標識。すべての遠心操作は3,000×gで、4℃で5分間スピンはS4℃よりも高い温度で回転してインスは、増加した細胞の損失につながる可能性があります。最後の洗浄の後、水中10 8標識細胞/ mlの濃度に細胞を懸濁する。 </li><li>トリパンブルー染色を用いて細胞の生存率を確認してください。水23μlのおよび1×PBS中の0.4％トリパンブルーの67μlの細胞を10μlに希釈する。血球計数器を使用したライブ（未染色）と死んだ（染色）細胞を獲得する前に、室温で少なくとも40分間インキュベートします。 </li><li>ゲノム不安定性、細胞齢、およびその他の関連する特性値のベースラインを測定します（セクション5,6を参照して、図7）。 </li><li>三角フラスコ（約5×10 6細胞/ ml）に10 8個の細胞あたりYPD培地20mlにビオチン標識された細胞を移す。 10 8細胞/ ml（四から五細胞世代）のおおよその密度に培養物（複数可）、20℃で16〜18時間を育てるが、細胞が定常期に到達することはできません。 30℃で成長のためのより短いインキュベーション時間を使用してください。ビオチン標識Cキープ4℃でのエルまでの数時間前に培地に添加する、成長期間及び収集のタイミングを最適化する必要がある場合。 </li></ol> 4。ビーズ標識および磁気ソート<ol><li>増殖期の後、血球計を用いて細胞密度を決定するために、培養物のアリコートを希釈する。 3000×gで4℃で5分間の遠心分離により細胞をペレット化。上清を注ぐ。 </li><li>その後、ビーズ標識バッファー30ml中でペレットを懸濁させるボルテックス遠心分離し、4.1節のように上清を注ぐことにより、細胞を洗浄。繰り返し洗濯。 </li><li>完全にボルテックスで10 8の全細胞あたり50μlのビーズ標識バッファーで細胞を懸濁します。混合する2μlの10 8の全細胞、ボルテックス簡潔当たりの磁気ビーズを追加します。オンラインプロトコルから変更された（ミックスするために定期的に反転させ、10分間氷上でインキュベート<a href="http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf">http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf &lt;</a>/ A&gt;）。 </li><li>ビーズ標識バッファー30mlで細胞を3回洗浄する。 </li><li>細胞が再懸濁するばかりまで中程度の設定で10合計8個の細胞あたり0.5ミリリットルビーズ標識バッファと簡単に渦ペレットを追加します。残りの細胞塊を除去するために50ミリリットルチューブに40μmのセルストレーナーを注ぐ。必要に応じて、カラム上にロードする前に1〜2時間氷上で細胞を残す。 </li><li>磁気カラムは、結合し洗浄し、磁気ビーズで標識された母細胞を溶出するために、製造業者の推奨プロトコルに従ってください。標識細胞の増加、回復のために、2×10 9の全細胞当たり少なくとも1つの列を使用しています。 <ol><li>彼らは流れをブロックするように、列をロードするときに発生した気泡を取り除きます。オンラインプロトコルから変更された（ビーズの間に閉じ込められたとなってから細胞を防止するための洗浄の間にセパレータの列を取り外し、交換し<a href="http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf">http://www.sysbio.org/dataresources/user</a>manual031113.pdf）。 </li><li>所望であれば、母細胞によって産生さ若い細胞を分析するための結合工程および洗浄工程のフロースルー保存する。ステップ4.7で説明したように細胞を濃縮する。 </li><li>一度に複数のサンプルを処理するための複数列の区切り文字を使用してください。処理時間削減し、細胞の損失を減少させるために同じコレクションチューブに同じサンプルの複数の列を溶出する。 </li></ol></li><li> 4°Cで5分間3000×gで遠心分離することにより溶出した母細胞を濃縮する。吸引し10 8元のビオチン標識細胞あたりすべてが、1ミリリットルのバッファ。残りのバッファーで細胞を懸濁させる簡単にボルテックスする。 </li><li>細胞のアリコートを希釈し、細胞密度および血球計数器を用いて細胞生存率を決定するためにトリパンブルーで染色し（ステップ3.5参照）。回収された細胞の総数を計算します。 <ol><li>セルの数が予想よりも実質的に高い場合には、若い細胞を汚染除去しようとする別のカラムに通し、溶出サンプルを渡す。セルの数が予想よりも実質的に低い場合には、母細胞の収率を改善しようとする別の列を介して試料を通して保存流れを通過させる。 </li></ol></li><li>せずに、（4.1-4.8.1ステップ）あるいは、セクション5および6に記載したように、さらなる分析のために細胞を使用し、その複製年齢（ステップ3.7）を増加させ、ビーズ標識によって従うことを再びYPD培養液中で細胞を増殖および並べ替えビオチン標識を繰り返す必要があります。 </li></ol>複製年齢5。決定<ol><li>このセクションのすべての手順を室温で5000×gで2分間細胞をスピン。 1.5ミリリットルの遠心管に回収された細胞（〜10 8個/ ml）を25μl入れて、1ミリリットル1×PBSで2回洗浄する。上清を吸引除去する。 <ol><li> WGA-コンジュゲートのアリコートを解凍し、ボルテックスして混合し、タンパク質凝集体を除去するために短時間スピンする。 180μlの1×PBSおよび目の表面の芽傷を標識するために蛍光分子に結合WGA20μlの中に細胞をサスペンド電子セル。ホイルで1.5ミリリットルの遠心管をカバーし、穏やかに30分間、30℃で揺らしながらインキュベートする。 </li><li> 1ミリリットルの1×PBSで3回洗浄する。 </li></ol></li><li>蛍光顕微鏡、ラベルスライドや抗フェード剤を使用して、標準的なプロトコルごとにマウントします。完全に撮像中に細胞運動を避けるために、カバースリップをシールする前に（数日まで）、暗所でスライドを治す。細胞齢の代表測定値を得るために、サンプルごとに少なくとも50個の細胞に芽傷跡を数える。必要に応じて保存、芽の傷跡を見るために1ヶ月までスライドします。 <ol><li>あるいは、ステップ5.1.2の後に1×PBS 1mlに懸濁した細胞にフローサイトメトリーを行うことにより、WGA結合体からの蛍光シグナルの強度を決定する。 WGA-アレクサ488用の505 nmのロングパスフィルターと405 nmの励起レーザーと530/30 nmの発光フィルターを使用し、各コレクションのポイントの染色していないコントロールを含めます。 </li></ol></li><li>上の顕微鏡検査により計数若い細胞と老化した細胞上のグラフ芽の傷跡x軸上の同一の細胞集団からWGA結合体の蛍光の正規化された幾何平均に対するy軸（染色された幾何平均/未染色の幾何平均）。この関係の線形傾向線の式を得る。その後の実験のために、式中のxの細胞集団のWGA-コンジュゲートの蛍光強度の正規化された幾何平均を代入し、サンプルの平均セル年齢を決定するために、yについて解く。 </li></ol> 6。変異頻度<ol><li>ステップ2.1.1で説明したようにスプレッドをYPD培地および選択培地上にステップ4.7から緩衝液中に再懸濁母細胞を選別した。 1分間5000×gで選択培地とスピン細胞について再懸濁母細胞の1ミリリットルを使用してください。 注：細胞が古い集団における非生存と老化細胞数の増加を補償するために、年齢の増加としてYPD培地上に希釈した細胞のより大きなボリュームを広げる。 <ol><li> YPD培地からの選択培地培養するそれぞれ、3および4日間30℃で6.1ステップ。非常に古い細胞や、ゆっくりと成長している菌株について1週間インキュベーション時間を増やします。ステップ2.2で説明したように突然変異頻度を計算します。 </li></ol></li></ol> 7。与えられた複製年齢に対する予測変異頻度の計算<ol><li>関連するソート用のソート母細胞の平均年齢から、初期の細胞集団の平均年齢を差し引くことにより、実験の過程でビオチン標識細胞の複製時代の平均増加を計算します。ステップ5.2ステップ5.2.2で計算されたセルの年齢を使用してください。 </li><li>ステップ7.1で算出した平均細胞齢の増加によってステップ2.1.3で得られた突然変異率を掛けます。関連する複製時代の細胞の予測変異頻度を決定するために、ステップ2.2で計算された初期集団のベースライン変異頻度にこの値を追加します。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もない。

このプロトコルは、リソースを有効にするために複数の方法を組み合わせて、効率的に有糸分裂細胞老化中にゲノム不安定性の研究に適用される出芽酵母モデル系で利用可能に近づく。表現型選択を介してゲノム不安定性の異なる形態を定量化するための多種多様なアッセイは、突然変異または染色体再配列の特定の形態の蓄積を可能年齢特異的な変化を研究するために、磁気選別と組み合わせることができる。全ゲノム配列決定アプローチは年齢とともにゲノムに生じる変化の全体的な種類の詳細な情報を提供できるが、突然変異率の測定値を得るために表現型の選択系を使用すると、優先的に遺伝子変化の特定のタイプを単離する能力は、機構的研究のための重要な利点である加齢に関連するゲノム不安定性の側面。細胞齢とphysiologiの並列測定を行う可能性の決定を合理化フロースルーCALの変化は、フローサイトメトリー、特定の年齢層の間に他の細胞の変化とゲノム不安定性を相関させる効果的な手段を提供する。蓄積変異の率の潜在的な年齢依存性の変化の測定が必要です。1）慎重に若い細胞集団における金利の決定、細胞齢の2）正確な決定、及び3）確実に再現性よく測定するために母細胞の十分に大きな集団を豊かにする機能老後のゲノム不安定性。このアプローチは、酵母モデル系は速度および/または有糸分裂活性細胞におけるゲノム不安定性の周波数の年齢依存性変化の原因基礎となるメカニズムを定義することに貢献することができます。さらに、遺伝的要因と環境要因が急速に年齢依存ゲノム不安定性への寄与について評価することができる。最終的には、これらの特徴付けは、変異が複製老化の間に蓄積される方法を考慮したモデルの開発につながる可能性があります。 この方法は、そのような事象の発生率を測定するために選択可能な表現型の出現を通して突然変異またはゲノム不安定性の他のタイプを検出する能力に依存する。しかし、アッセイデザインにおける創造性を調査するゲノム不安定性の多くの側面を可能にすることができる。例えば、URA3及びCAN1遺伝子は、結果に対するゲノム位置の任意の影響をテストするために異なるゲノムの部位に配置することができる。機能的遺伝子の対立遺伝子に特異的な非機能的遺伝子の対立遺伝子の復帰は、特定の突然変異のプロセスをテストすることができます。また、遺伝子または反復配列を有する遺伝子に隣接する複数の不活性な対立遺伝子の導入は、それぞれ、修復または遺伝子機能の喪失を介して組換え事象を調べるために使用することができる。変動試験は、これらのさまざまなゲノム不安定性事象9の速度を決定するための標準的なアプローチである。プロトコルは牟田を決定するために、十分に受け入れられ、比較的単純リー·コールソン中央値推定器を使用して書かれているション率はMSS-最尤推定法は突然変異率9を決定するための最善のアプローチと考えられているにもかかわらず、多様な研究者にとってよりアクセスしやすくします。 MSS-最尤推定量は、以前に詳細9に概説されており、代替方法として使用することができるが、より高度な計算を必要とする。代替的に、この方法で突然変異率を計算するためのフリーソフトウェア22は使用可能になった。突然変異率の再現性のある措置を得ることは、10,000倍以上で人口規模が大きくなるに十分低い初期細胞密度で培養物を接種すること、十分な反復培養の使用を含む実験計画のいくつかの側面、に注意を必要とし、全体のように、適切な培養容量を選択する細胞の集団は、選択培地上に塗布することができる。後者の点については、前述の式は、培養テスト=の割合に基づいて突然変異率を調整するために使用することができD 9。培養物の増殖速度の変化が再現可能な突然変異率の決定を複雑にすることができ、そのような状況では、より再現性のある結果を生じ得る修飾された中央値に基づく推定器は、最近23に記載されている。 正確細胞齢を測定する能力は、古い細胞におけるゲノム不安定周波数による若い細胞内イベントの発生率が期待値と異なるかどうかを確立するために重要であるもう一つの要因である。私たちは、WGA染色はWGAは、異なる蛍光分子にコンジュゲート利用可能であるので、両方の背景と柔軟性の観点から、白染色をカルコフロールすることが好ましいことを見出した。この柔軟性は、蛍光試薬と他の細胞の特性の同時測定のためのより多くの機会を提供することができる。 WGA染色および細胞上の蕾瘢痕対応する数のための信号強度との関係を確立するための最初の作業は、より多くをもたらすことができるフローサイトメトリーを介して細胞齢を迅速に決定。このアプローチは、典型的には、測定の再現性改良のために顕微鏡で検査されるより大きな集団サイズの使用を可能にする。すべての年代測定は、細胞の顕微鏡検査を通じて行うことができる一方で、私たちは、フローサイトメトリーのアプローチは年齢依存ゲノム不安定性に影響を与える要因の迅速なスクリーニングを容易にすると考えています。 確実にセル年齢を測定することに加えて、考慮事項は、母細胞が細胞を増殖および並べ替えの各連続ラウンドを受けることが許可されている細胞分裂の数を与えられる必要がある。小さい初期集団の大きさ以上の培養液量を使用すると、細胞が所望の細胞密度に到達する前に、より細胞分裂を受ける可能性があります。例えば、他の研究者は、より少ないexperime古い細胞を得る明白な利点を有する非常に古い酵母細胞16を得るために選別つだけのラウンドを使用しているNTALステップ。細胞がソーティングの前にそれ以上の細胞分裂を完了できるように培養液量を増やすかどうかを検討する際、念頭に置いて、単一の列で処理することができる細胞の総数に制限を続ける。より大きな培養容量の使用は、一つの細胞集団をソートする複数の列の使用を必要とすることができる。細胞は、ソート/収集ポイント間の細胞分裂の少ないラウンドを受ける場合も、その後寿命の間に異なる時点で予想される突然変異頻度からの偏差を観察するより多くの機会がある。例えば、製品寿命中のみで、早期のサンプリング及び後期の時点は、データの変異頻度が着実に増加を示したが、すぐに、その後プラトーその突然変異頻度が増加を示す可能性が寿命の間に追加の中間の時間でサンプリングを生成することができる。このプロトコルは古い母細胞を分離するので、年齢とともに突然変異率の変化のより直接的な測定値を得るための機会がある。変動試験は、bの可能性eは、突然変異率は、若い細胞を用いて得られた速度と異なるかどうかを決定するために、異なる年齢の母細胞を用いて行った。彼らが成長するにつれて、これらの変動試験のための培養は古く、若い細胞の混合物となりますが、若い細胞で出発して得率からの逸脱は、古い出発集団の使用に起因する可能性がある。 再現性よく正確にゲノム不安定性を測定するために、高齢者の母細胞の十分な大きさの集団を得る能力は、このアプローチの成功に不可欠です。プロトコルがこの目的のための特定の磁気ソーティングシステムの使用を説明しているが、他のグループは、代替システム14,18（ 材料の表を参照）、酵母母細胞を選別している。製造業者のプロトコルのいくつかの最適化が必要になることができたにもかかわらずこのような代替システムはまた、この方法で動作するはずです。関係なく、使用される特定のシステムの、人口規模が必要ですdは研究のために選択突然変異またはゲノム再編成の種類の周波数によって異なる。最低でも、変異頻度を計算するために、人口あたり少なくとも1つの変異体コロニーを得るために十分な母細胞が存在しなければならない。唯一のゼロ5に対する変異コロニーは人口規模、人口規模の小さな増加から期待されている場合は、五から十突然変異体コロニーが期待されていることを、大幅に再現性を向上させることができますので、実際には、結果は、非常に可変することができます。ビオチン出発集団を標識する場合、各ソートのための回収効率は、古い母細胞における変異頻度を測定するために必要な適切な集団の大きさを特定するために考慮に入れる必要がある。各ソート後の母細胞の90％の回収率では、元の人口のわずか59％の成長と選別の5ラウンド後に回収されることになる。これは〜33％の成長率の5ラウンド後、元の人口の回復とラベルされた母細胞のわずか80％が回復している場合は、ソートに低下各ソート中に編。母集団の大きさの二から三倍の減少が簡単に人口あたりの突然変異体コロニーの信頼性の低い数字につながる可能性があるため、低周波イベントを測定する際の測定と回復を最大化することは非常に重要です。 上の拡張または有糸分裂細胞老化中にゲノム不安定性のより広い理解を得るために、このプロトコルを変更するための多数のオプションがあります。簡単な例としては、遺伝子機能、メディアの変更、またはその他の環境条件の変化の変化は年齢とともに変異の蓄積を変える方法を分析することを含む。改変された遺伝子機能又は適切な条件で若い細胞のための突然変異率を測定し、対照細胞集団に比べて異なった速度値により予測と比べて変異が異なって蓄積するかどうかを決定するために使用される。複製老化中の異なる点での細胞集団は、そのような活性酸素種またはDNA損傷剤のような特定のストレス要因にさらされる可能性があります。 A酸化ストレスに対する一過性の軽度の曝露は、実質的に細胞選別（ 図3）を実行する機能には変わりはありませんでしたが、厳しいストレスは、細胞の回復を複雑にするかもしれない。予備実験は、母細胞はまだ特定のストレスの後に効率的に回収できることを確認することが必要であろう。さらに、単離された母細胞の細胞特性は、活性酸素種、ミトコンドリアおよび液胞形 ​​態、及び3を老化と関連している他の生理学的特性のレベルを含む、詳細に分析することができた。また、母細胞は、さらなる処理または操作のための出発集団であってもよい。母と娘細胞が物理的手順の間に分離されているので、娘細胞は、依然として、分析のために用意されています。例えば、娘細胞または酵母母と娘細胞との間の損傷を受けた巨大分子の非対称継承の生理学的特性の変化<sアップ&gt;図24は、変異頻度/レートのいずれかの興味深い変更のタイミングと比較することができた。娘細胞集団のための突然変異頻度はまた、複製老化の間の変異の非対称の継承があるかどうかをモデル化しようとするために得ることができた。要約すると、変動試験と磁気細胞ソーティングを通して母細胞の濃縮を組み合わせてSの利点を可能にする·セレビシエモデル系は、効率的に、有糸分裂細胞老化中の遺伝的変化の蓄積に関与するメカニズムを調査に適用される。

酵母サッカロマイセス·セレビシエなどの微生物は、突然変異率を調査するための優れたモデルであるが、これらのモデルは、完全に細胞の有糸分裂熟成中変異の蓄積を調査するために利用されていない。核ゲノムにおける突然変異の蓄積は、遺伝子機能の1（または変動）進行性の喪失をもたらすことによって老化に寄与することが仮定されている。エージング中に突然変異の蓄積のメカニズムと影響を研究するために微生物系を使用する能力が大幅ため容易遺伝子系および微生物における稀な表現型の変化を定量化が容易で、このプロセスに影響を与える遺伝的および環境的因子の同定を加速する可能性がある。 DNA修復因子およびDNA損傷応答タンパク質は、十分に多様な種2を超えて保存され、そして生物の老化の根本的な類似性は、S.限り多様な生物のために同定されているセレビシエ ANそれは可能性が高いことを作るD哺乳類3は 、酵母における研究から得られた結果は、多くの生物の老化に関係するであろう。 Sに高齢化に関する研究サッカロミセス·セレビシエは加齢による老化や細胞の複製老化を測定する2高齢化のモデルを利用する。加齢による老化に起因栄養枯渇3に非分裂状態（定常期）にある酵母細胞集団における生存能力の進行性の喪失によって特徴付けられる。加齢による老化モデルでは、大きな細胞集団を容易に変異細胞のための表現型選択を行うために、このモデルで得られるので突然変異が、加齢4に蓄積することを実証するために使用されている。この場合には、突然変異の蓄積は、増殖シグナル伝達経路および酸化ストレス5によって影響されるようであり、これらの各要因は、多細胞真核生物3の老化の理解に関連する。複製老化モデルは、非対称ディビジのを悪用S.の間での連続した細胞世代3で発生する老化を調査するためのサッカロミセス·セレビシエ母と娘細胞。酵母複製老化は、多くの場合、マイクロ流体デバイス6,7酵母細胞の小集団のビデオ顕微鏡を通して母と娘細胞、またはより最近では、小集団のマイクロマニピュレーションにより測定された。リミテッド人口のサイズは、全ゲノム情報が単一細胞から得られた、または非常に高い周波数の遺伝的変化は8で測定されていない限り、分裂熟成中の突然変異の蓄積を調査するためのこれらのアプローチはあまり適しています。単一細胞の全ゲノム配列決定は、変異の蓄積を調査するため、実質的なデータセットを提供するが、表現型選択システムは、突然変異の蓄積のメカニズムを研究するために突然変異率を測定する手段を提供するという重要な利点を有する。 haploiにおける表現型の選択を介して突然変異頻度や料金を検討する研究複製老化の間のd個の酵母菌株は、まだ報告されていない。 突然変異率は、一般的に変動試験9を用いて測定される。変異頻度の値は、集団における遺伝子配列における変異を有する細胞の総数を反映する。これは独立した突然変異が発生した細胞単に既存の突然変異を継承するそれらの細胞の任意の子孫を含む。対照的に、変動試験により測定された突然変異率は、新たに、各セルの生成を生じる独立した突然変異の数を表す。これらのテストは、典型的には、標的配列内の既存の変異を有する細胞を添加ほぼ飽和した培養物を増殖し、選択培地上での増殖によって突然変異細胞を同定する可能性を低減するために低細胞密度で、多くの複製培養物を接種することを含む。レプリケート集団で同定された変異体細胞の数は、その後、iの数を推定するために、いくつかの数学的モデルのいずれかで使用されている成長の9時に生まれたndependentの突然変異。平均集団サイズに独立した変異の数を比較して突然変異率の尺度を提供する。 S.でこれらの遺伝子における機能喪失変異は、選択可能な表現型を生成するので、 サッカロミセス·セレビシエ 、突然変異頻度や料金は頻繁に、URA3及びCAN1遺伝子を用いて測定される。 URA3によりコードされたタンパク質は、毒性分子10内に5-FOAに変換するので、URA3機能の喪失は、5 -フルオロオロチン酸（5-FOA）に耐性の細胞をレンダリングします。 CAN1によってコードされるタンパク質が細胞11内にアルギニン及びカナバニンを搬送するので、CAN1の機能の喪失は、細胞がカナバニンに耐性になることができ、有毒なアルギニン類似体。 遺伝的および物理的な両方のソーティング戦略は成功しS.のより大きな集団を得るために使用されている複製老化の調査を容易にするために、 サッカロミセス·セレビシエ母細胞。遺伝的戦略は、集団の中の娘細胞の生存に対して選択する巧妙な手法を含む。母濃縮計画（MEP）loxP部位 12を含むように操作された2つの必須遺伝子の娘特有の混乱につながる唯一の娘細胞におけるCreリコンビナーゼの発現のベータ-エストラジオール誘導を伴う。 MEP株は誘導物質の非存在下では正常に成長させることができますが、母細胞が娘細胞が細胞周期から12彼らの最初の進行の間に、一般的なM期で逮捕する一方、誘導後に分裂していきます。このシステムは広く熟成中の変異の蓄積を研究するために使用されていないが、それは老化母細胞13,14におけるヘテロ接合性の消失、二倍体酵母株におけるゲノム不安定性の比較的頻繁な形態、ならびに生化学的変化を研究するために使用されている。同様に、娘避雷器システムは、Sの娘特異的発現を伴うcereviSIAE URA3遺伝子15。 5-FOAがれるURA3を発現しているポイントの娘細胞が死んでしまう、培地に添加されるまで、母細胞が15を成長させ続けている娘、アレスタ株は、正常に成長。これらは、母細胞を濃縮するための有用なシステムであるが、それらは選択システムを構成する遺伝子機能の維持に依存している。選択システムの1つまたは複数の構成要素におけるランダム変異は、選択を脱出し、指数関数的に増殖する娘細胞を生じる可能性がある。 MEP株の開発中に、適切な集団サイズは選択12を逃れる可能性突然変異娘細胞の出現を回避するために決定した。しかし、人口規模で、この制限は、複製老化の間にゲノム不安定性のまれな形態の検出を損なう。集団サイズに対するこの制限は、部分的にほとんどは、選択システムに貢献する各遺伝子の2つのコピーを二倍体酵母株を用いることによって克服することができ変異はおそらく12劣性となる。しかし、二倍体株の使用を容易に簡単に一倍体酵母細胞中で検出可能なものと比較して検出することができる突然変異事象の種類を制限する。 物理選別戦略は母細胞の大集団を濃縮するために、非標識の娘細胞からの標識細胞表面と母細胞の単離を含む。観察S.の細胞表面タンパク質（細胞壁タンパク質）が出芽は、彼らが16を産生する娘細胞を標識することなく母細胞を標識するために利用されてきた時にセレビシエ娘細胞が新たに合成される。例えば、ビオチンでその表面上に標識した酵母細胞の初期集団を成長させることができ、次いで、初期集団によって生成された娘細胞がその表面にビオチンを含有しないので、抗ビオチンマイクロビーズ、磁気選別16を使用して娘細胞から単離さ。シリアル成長とソートは、母細胞の漸進古い集団が得られ、分析されることを可能にする。この手順は、酵母13,14,17,18の複製老化の間の細胞生理学および遺伝子発現の変化を調べるために首尾よく使用されてきた。現在の方法は、潜在的にまれな変異または表現型の選択を介してアッセイしたゲノム不安定性の他の形態の蓄積を測定する目的で母細胞を濃縮するために、このビオチン標識および磁気選別技術を適応させる。シリアル成長および物理的ソートが漸進的により古い母細胞において、ならびにそれらの娘細胞集団における突然変異の蓄積の分析を可能にする。世代当たりの突然変異率の決定は、予測された変異頻度は、細胞分裂の特定の数を受けた母細胞のために計算されることを可能にする。予測された周波数値に起因観察mutatiにおける細胞分裂のさらなるラウンド、実質的な偏差に増加が予想に基づいていますので予測された値と比較した周波数での変異を蓄積率の年齢別の変更のための証拠を提供しています。このプロトコルを使用して、フローサイトメトリーによって分析と結合した母細胞における細胞分裂の部位に対応芽瘢痕の蛍光染色を迅速にソートされたおよび未選別集団の年齢分布を決定するために用いることができる。このような反応性酸素種を検出するために使用されるもののような付加的な蛍光試薬もまた、このプロトコルの間に使用することができる。全体的に、このプロトコルは、老化関連ゲノム不安定性に影響を与える遺伝的要因と環境要因を研究に非常に適したモデル生物において加齢に伴う細胞生理学的変化との相関の可能性を持つゲノム不安定性における年齢依存性変化の効率的な解析を可能にします。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="802">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:108px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:359px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td style="width:108px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21335</td>
			<td style="width:359px;">100mg</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-Biotin Microbeads</td>
			<td style="width:108px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-485</td>
			<td style="width:359px;">2ml MicroBeads conjugated to monoclonal mouse anti-biotin antibodies (isotype: mouse IgG1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MACS LS columns</td>
			<td style="width:108px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td style="width:359px;">25 columns suitable for QuadroMACS separator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QuadroMACS separator</td>
			<td style="width:108px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-976</td>
			<td style="width:359px;">Separator Only</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">QuadroMACS Starting Kit</td>
			<td style="width:108px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-091-051</td>
			<td style="width:359px;">Includes:&#160; QuadroMACS Separator (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), LS Columns (130-042-401), MACS 15ml Tube Rack (130-091-052), One 2ml unit of MACS MicroBeads. Note: Alternative systems include Dynabeads Biotin Binder and MagnaBind Magnetic Beads</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BD Falcon Cell Strainer, 40 &#181;m</td>
			<td style="width:108px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td style="width:359px;">40 &#181;m for use with BD Falcon 50 ml Conical Tubes.&#160; 50 per pack</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6146</td>
			<td style="width:359px;">Powder, filtering after dissolving important to remove particulates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wheat germ agglutinin Alexa Fluor488</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">W11261</td>
			<td style="width:359px;">Conjugates with different excitation/emission spectra could also be used</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">P36930</td>
			<td>10 ml, other antifade reagents could also be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining magnetic sorting of mother cells and fluctuation tests to analyze genome instability during mitotic cell aging in saccharomyces cerevisiae

出芽酵母は、ゲノム不安定性のメカニズムと影響を調べるための優れたモデル系となっている。 DNA修復およびDNA損傷応答因子が十分に多様な種を超えて保存されているので、この酵母モデルから得られた情報は、ヒトを含む多くの生物に関連しています。しかし、S.サッカロミセス·セレビシエは、まだ完全には技術的な制約のために複製（有糸分裂）、年齢の増加と共に突然変異変化を蓄積する速度かどうかに対処するために使用されていない。例えば、マイクロマニピュレーションを通して酵母複製寿命の測定は、稀な変異の検出を禁止する細胞の非常に小さな集団を伴う。娘細胞の死を誘導することにより、集団における母細胞を濃縮するための遺伝的方法が開発されているが、集団サイズは依然として選択システムを危険にさらすランダム突然変異が発生する頻度によって制限される。現在のプロトコルは、磁気sortiを利用しています表現型の選択を介して稀な突然変異を定量化するために高齢の母親細胞の十分な大きさの集団を得るために表面標識酵母母細胞ngの。変動試験により測定された突然変異率、および突然変異頻度は、最初の若い細胞に対して確立や各種複製年齢の母細胞における突然変異の頻度を予測するために使用される。突然変異頻度は、次に、ソート母細胞のために決定され、母細胞の年齢は、細胞分裂中にそれらの細胞表面上に形成された芽の傷を検出する蛍光試薬で染色してフローサイトメトリーを用いて決定される。実験的に与えられた複製年齢の母細胞について観察された頻度に細胞分裂の数に基づいて予測された突然変異頻度の比較はその後の突然変異の蓄積率の加齢変化があるかどうかを識別することができる。この基本的なプロトコルのバリエーションは、特定の遺伝子機能の変化の影響を調査するための手段を提供するか、または複製老化中にゲノム不安定性のメカニズムに対処するために、突然変異の蓄積上の特定の環境条件。

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Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

変動試験により測定された若いサッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞における突然変異率が異なる複製年齢の母細胞のための突然変異頻度を予測するために使用される。磁気ソーティングフローサイトメトリー予測さ突然変異周波数からの逸脱を識別するために、実際の突然変異頻度及び母細胞の年齢を測定するために使用される。

母細胞と変動試験の磁気ソーティングを組み合わせることでの有糸分裂細胞老化中に、ゲノム不安定性を分析するために<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

combining-magnetic-sorting-mother-cells-fluctuation-tests-to-analyze

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

12.5K ビュー.  Rensselaer Polytechnic Institute. 変動試験により測定された若いサッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞における突然変異率が異なる複製年齢の母細胞のための突然変異頻度を予測するために使用される。磁気ソーティングフローサイトメトリー予測さ突然変異周波数からの逸脱を識別するために、実際の突然変異頻度及び母細胞の年齢を測定するために使用される...

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Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

の解剖サッカロマイセスセレビシエ ASCI

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

生物学

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

脂肪酸の定量的なPhosphoproteomicsは刺激を受けてサッカロマイセスセレビシエ</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

マイクロアレイ解析のためのサッカロマイセスセレビシエ</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

磁気活性化細胞選別（LIMACS）を使用して、脂質小胞を介したアフィニティクロマトグラフィー：タンパク質脂質相互作用を解析する新手法

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

酵母でMitophagyを監視するための蛍光顕微鏡アッセイサッカロマイセスセレビシエ

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

で嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子タンパク質の発現および精製サッカロマイセスセレビシエ

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析<em&gt;その場で</emで&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

のリフォールディング監視タンパク質を結合アッセイ<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging

Aging tissue is characterized by a continuous decline in functional ability. Adult stem cells are crucial in maintaining tissue homeostasis particularly in tissues that have a high turnover rate such as the intestinal epithelium. However, adult stem cells are also subject to aging processes and the concomitant decline in function. The Drosophila midgut has emerged as an ideal model system to study molecular mechanisms that interfere with the intestinal stem cells&#8217; (ISCs) ability to function in tissue homeostasis. Although adult ISCs can be easily identified and isolated from midguts of young flies, it has been a major challenge to study endogenous molecular changes of ISCs during aging. This is due to the lack of a combination of molecular markers suitable to isolate ISCs from aged intestines. Here we propose a method that allows for successful dissociation of midgut tissue into living cells that can subsequently be separated into distinct populations by FACS. By using dissociated cells from the esg-Gal4, UAS-GFP fly line, in which both ISCs and the enteroblast (EB) progenitor cells express GFP, two populations of cells are distinguished based on different GFP intensities. These differences in GFP expression correlate with differences in cell size and granularity and represent enriched populations of ISCs and EBs. Intriguingly, the two GFP-positive cell populations remain distinctly separated during aging, presenting a novel technique for identifying and isolating cell populations enriched for either ISCs or EBs at any time point during aging. The further analysis, for example transcriptome analysis, of these particular cell populations at various time points during aging is now possible and this will facilitate the examination of endogenous molecular changes that occur in these cells during aging.

Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging

Understanding the endogenous molecular changes in adult stem cells during aging requires isolating the cells of interest. The method described here presents a simple and robust approach to enrich for and isolate Drosophila intestinal stem cells and the enteroblast progenitor cells by FACS at any time point during aging.

大人から腸管幹細胞を単離<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt; FACSによる中腸は老化中の幹細胞の挙動を研究するために

Aging tissue is characterized by a continuous decline in functional ability. Adult stem cells are crucial in maintaining tissue homeostasis particularly ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.