CJN 실험실에서 연구 NSERC, 캐나다 암 협회 연구소 (CCSRI)와 캐나다 유방암 재단 (BC-유콘 지점)에서 운영 보조금 지원됩니다.

참고 :이 절차의 일반적인 작업은 그림 2에 설명되어 있습니다. 성장 억제 용량 1. 결정 <ol><li> 효모 하룻밤 문화의 준비 참고 :이 프로토콜에 사용되는 효모 추출물 - 펩톤 - 덱스 트로 오스 성장 미디어 (YEPD)는 표준 조리법 (13)이다. <ol><li> BY4741 (마타 HIS3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) YEPD 한천 접시에 세포 밖으로 행진 30 ° C 또는 볼 식민지 형성 할 때까지 48 시간 동안 배양한다. </li><li> 하나의 식민지로 무균 배양 용기에 YEPD 액체 매체의 5 mL를 접종하여 하룻밤 문화를 준비합니다. 연속 회전이나 진탕 30 ° C에서 밤새 품어. 문화는 일반적으로 아침 (~ 2 × 10 8 세포 / ㎖)에 의해 포화에 도달 할 것입니다. </li></ol></li><li> 고체 한천 매체 준비 다양한 화학 용량을 포함 <ol><li> 여러 주식을 준비화학 물질은 적당한 용매 100X 원하는 최종 농도에서 시험한다. 참고 : 유효 농도는 화학 물질에 따라 달라집니다, 그리고 경험적으로 결정해야합니다. 높은 mM의 낮은 μM에서, 즉, 그것은 처음에 폭 넓은 최종 농도 범위를 테스트하는 것이 좋습니다. </li><li> 화학 물질의 농도에서 각각 여러 멸균 배양 관에 분취 용융 YEPD 한천 3 ㎖를 시험한다. 55 ° C의 물을 욕조에 장소 응고에서 유지합니다. </li><li> 테스트 할 화학 물질의 농도를 각각 들어 12 웰 플레이트에 중복 우물의 각 쌍에 용융 미디어, 소용돌이에 섞어 2 ~ 3 초, 피펫 1 ml에 100 배 화합물의 30 μl를 추가합니다. 만 제어 차량을 포함해야합니다. 플레이트는 실온에서 하룻밤 설정할 수 있습니다. 여분의 미디어를 폐기하십시오. </li></ol></li><li> 확산 도금 세포 <ol><li> 1 단계로 하룻밤 성장 포화 효모 문화의 2 μL와 YEPD 액체 매체 10 ㎖를 접종.1.2. </li><li> 잘 희석 주당 효모 문화의 25 μL는, 멸균 유리 구슬 또는 막대를 사용하여 균일하게 확산하고 판은 불꽃에서 건조 할 수 있도록 접시입니다. 48 시간 동안 30 ° C에서 접시를 품어. </li><li> 접시에 효모의 성장 (식민지 모두 총 개수 및 크기)을 평가합니다. 화면을 수행하는보다 10 % -15 %의 성장을 저해하지 않는 화합물의 치사량 농도를 선택한다. </li></ol></li></ol> 2. 체계적인 화학 유전자 화면 <ol><li> 소스 플레이트의 삭제 돌연변이 배열의 유지 보수 (DMA) 및 준비 <ol><li> 글리세롤 주식에서 삭제 돌연변이 어레이를 구성에 대한 자세한 설명은 Baryshnikova 등. (14)을 참조하십시오. 삭제 돌연변이가 판 당 384 식민지의 밀도로 배열되고 나면, DMA는 4 ° C에서 몇 달 동안 저장할 수 있습니다. 각각의 콜로니로 성장하는 것을 방지하기 위해 필요한만큼의 G418 200 ㎍ / ml를 함유 YEPD 한천 복제다른. 주 : 복수 직렬 복제가 느린 성장 균주의 손실을 방지하고 억제 돌연변이 출현을 최소화하기 위해 피해야한다. 이 haploids으로 컬렉션을 유지하는 경우에 특히 관련이있다. </li><li> 로봇 시스템의 배열 미생물을 사용하여 모든 복제 도금 단계를 수행합니다. 또한, 수동 피닝 도구를 사용하여 식민지를 배열 조작 할 수 있습니다. 참고 : 효모 삭제 컬렉션 여러 상용 소스에서 haploids 및 diploids로 사용할 수 있으며 일반적으로 96 웰 플레이트에 글리세롤 주식으로 제공됩니다. </li></ol></li><li> 삭제 돌연변이의 배열을 응축 <ol><li> G418 200 ㎍ / ㎖의를 포함 YEPD 한천 미디어 250 ml의를 준비합니다. G418의 유효 농도는 다를 수 있으며, 각각의 많은 경험적으로 테스트해야합니다. </li><li> 접시 당 G418 200 ㎍ / ㎖의를 포함 YEPD 한천의 50 ㎖를 주입하여 다섯 YEPD 한천 플레이트를 준비합니다. 배열을 응축하기 전에이 일일를 수행하고 판을 실온에서 냉각 할 수 있도록erature 하룻밤 다음 평평한 표면에. 참고 : 4 판은 1536 - 변형 밀도에서 수집해야합니다, 다섯 번째 판은 추가로 부어있다. </li><li> 접시 당 384 식민지의 밀도로 돌연변이 삭제 컬렉션을 포함하는 16 개의 배양 접시를 제거하고 실온 (1 ~의 시간)에 올 수 있습니다. </li><li> 섬세한 작업을 닦아 사용하여 각 판의 덮개를 형성하고 응축을 닦으십시오. 물방울이 발생할 수 있습니다 그렇게하지 ​​않으면 배열과 배열 된 돌연변이 체의 교차 오염에 증착된다. </li><li> 미생물 배열 달아 로봇을 사용하여, 판 당 1,536 식민지 (4 페트리 접시)에 접시 당 384 콜로니 (16 페트리 접시)의 밀도에서 DMA를 응축. 플레이트 (1) 핀에서 1 차 식민지가 응축 된 배열의 1 열 1 행하기 때문에이 작업을 수행 판 (2)의 1 차 식민지는 1 열 2, 2, 1 열을 행하기 판 (3)의 1 차 식민지를 행 및합니다 판 (4)의 1 차 식민지는 2 행합니다2 열. </li><li> 하룻밤 30 ° C에서 통합 된 배열을 품어. </li><li> 소스 판에서 식민지의 균일 한 전송을 보장하기 위해 배열을 검사합니다. DMA가 제대로 (그림 4A)를 응축 된 보장하기 위해 가이드 역할을 의도적으로 배열에 포함 여러 빈 위치,있을 것이다. 주 :이 시험 화합물을 함유하는 매체 상 복제본 도금 소스 판 것이다. 단일 소스 복수 pinnings 판에 사용될 수있다. 또한 많은 로봇마다 전송되는 효모의 비슷한 번호를 확인합니다 상쇄 기능을해야합니다. </li></ol></li><li> 복제 플레이트 삭제 돌연변이 어레이 <ol><li> 제어 700 ㎖ (차량 만 해당) 및 실험 매체 (화학 물질 함유) 700 ml의를 준비합니다. 이 세중 분석 (조건 당 12 판, 플러스 두 엑스트라)을 수행하기위한 충분하다. </li><li> 시험 물질 또는 플레이트 당 컨트롤을 포함 YEPD 한천의 50 ㎖를 붓고. 플레이트 t 허용오 다음 평평한 표면에 하룻밤 실온에서 냉각. </li><li> 레플리카 플레이트에 로봇을 사용하여, 실험적으로 결정된 농도로 화학 물질을 함유하는 접시의 3 세트뿐만 아니라, 차량 제어를 함유하는 플레이트 상에 세 세트 DMA 접종. 24 ~ 48 시간 동안 실온에서 접시를 품어. </li></ol></li></ol> 3. 이미징 플레이트 및 데이터 분석 <ol><li> 인큐베이터에서 접시를 제거하고 실온 (1 ~의 시간) 이전 영상에 올 수 있습니다. 이 판을 이미징하는 동안 결로 현상을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 뚜껑을 제거하고 플랫 베드 스캐너에 얼굴을 아래로 배치하여 24 및 48 시간에서 이미지 플레이트. 적어도 300 dpi의 해상도로 이미지를 캡처합니다. 다르게는, 이미지를 캡처하는 디지털 카메라를 사용한다. 이렇게하면, 장소 플레이트는 어두운 배경에 닫 얼굴과 이미지에 뚜껑을 제거합니다. 주 : 판의 파일 형식 및 위치가 사용 정량 프로그램에 의존 할 것이다. </li&gt; <li> 정량 Balony 15 SGAtools (16), 및 ScreenMill (17) 등 여러 오픈 소스 프로그램 중 하나를 사용하여 배열을 식민지 크기 비교를 수행합니다. </li></ol> 화면의 4. 검증 참고 :이 단계에서 몇 가지 효모 삭제 돌연변이 관심있는 화학 물질 등의 과민 점수 것입니다. 이러한 화학 물질이 유전 적 상호 작용은 다음 두 가지 방법으로 확인해야합니다. 먼저 민감한 균주의 신원은 PCR에 의해 확인되어야한다. 둘째, 화학 감도는 독립적으로 득점해야합니다. 아래에 설명하는 변형 과민, 효모 생물학에서 일반적인 기술을 검증하기 위해 안보 분석을 수행하기위한 간단한 프로토콜입니다. <ol><li> 킬 밖으로 G418 200 ㎍ / ㎖의를 포함 YEPD 한천에 효모 삭제 컬렉션 (과민) 돌연변이를 원했다. 콜로니를 형성 할 때까지 30 ° C에서 품어. 프라이머에 따라 함께 진단 PCR에 의해 변형의 유전자형 확인제조업체의 프로토콜입니다. </li><li> 각 변형에 대한 YEPD 액 5 mL를 접종하고 회전이나 진탕 30 ° C에서 밤새 품어. </li><li> OD 600을 측정하고 멸균 dH보다 2 O 600 = 1 중독 각 균주를 희석 이들은 지금 정규화 된 효모 문화입니다. </li><li> 96- 웰 플레이트의 웰 A1로 정규화 야생형 효모 (BY4741) 100 ㎕ 배양 디스펜스. 우물 B1-H1에 최대 7 개의 추가 균주의 100 μl를 분배. </li><li> A6-H6를 통해 우물 A2-H2 멸균 dH보다 2 O의 90 μl를 분배하는 멀티 채널 피펫을 사용합니다. 마지막으로, 표준화 된 효모 배양 1:10 희석 시리즈를 준비합니다. 직렬 멀티 채널 피펫으로 열 2 열 1의 10 μl를 피펫 팅에 의해 시작, 6 희석이 이루어질 때까지 96 웰 플레이트에 걸쳐 계속 (즉, 10 0-10 -5). </li><li> 멀티 채널을 사용하여 그리드에 희석 효모 문화의 2-5 μl를 전송화학 및 차량 컨트롤을 포함 YEPD 고체 매체에 피펫. 24 ~ 48 시간 동안 적절한 온도에서 접시를 품어. </li><li> 판을 검사하고 (BY4741 컨트롤을 기준으로) 화학 물질을 선택 돌연변이의 감도를 비교합니다. 이미지 (24) 접시와 단계 3.2에서와 같이 48 시간. 참고 : 관련 유전자 온톨로지 또는 함수 여러 민감한 균주의 동정은 스크린의 유효성을 확신 적합하지만, 유전자의 야생형 카피를 함유하는 플라스미드 과민 결실 균주의 변환은 공식적 유전자 것을 설정하는 데 필요한 관심의 삭제 (그리고 숨겨진 두 번째 사이트 돌연변이) 약물 감도가 발생합니다. </li></ol>

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	<li>Giaever, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome.">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li><li>Winzeler, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+S.+cerevisiae+genome+by+gene+deletion+and+parallel+analysis.">Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis.</a> Science. 285, 901-906 (1999).</li><li>Breslow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+strategy+enabling+high-resolution+functional+analysis+of+the+yeast+genome.">A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome.</a> Nat Methods. 5, 711-718 (2008).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+exploration+of+essential+yeast+gene+function+with+temperature-sensitive+mutants.">Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants.</a> Nat Biotechnol. 29, 361-367 (2011).</li><li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+landscape+of+a+cell.">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li><li>Parsons, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+chemical-genetic+and+genetic+interaction+data+links+bioactive+compounds+to+cellular+target+pathways.">Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways.</a> Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).</li><li>Parsons, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+mode-of-action+of+bioactive+compounds+by+chemical-genetic+profiling+in+yeast.">Exploring the mode-of-action of bioactive compounds by chemical-genetic profiling in yeast.</a> Cell. 126, 611-625 (2006).</li><li>Hillenmeyer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+genomic+portrait+of+yeast:+uncovering+a+phenotype+for+all+genes.">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li><li>Hillenmeyer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+genome-wide+fitness+data+in+yeast+reveals+novel+gene+function+and+drug+action.">Systematic analysis of genome-wide fitness data in yeast reveals novel gene function and drug action.</a> Genome Biol. 11, R30 (2010).</li><li>Smith, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+genomic+screens+of+barcoded+yeast+libraries.">Competitive genomic screens of barcoded yeast libraries.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li><li>Bowie, D., Parvizi, P., Duncan, D., Nelson, C. J., Fyles, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical-genetic+identification+of+the+biochemical+targets+of+polyalkyl+guanidinium+biocides.">Chemical-genetic identification of the biochemical targets of polyalkyl guanidinium biocides.</a> Organic &amp; Biomolecular Chemistry. 11, 4359-4366 (2013).</li><li>Alamgir, M., Erukova, V., Jessulat, M., Azizi, A., Golshani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical-genetic+profile+analysis+of+five+inhibitory+compounds+in+yeast.">Chemical-genetic profile analysis of five inhibitory compounds in yeast.</a> BMC Chem Biol. 10 (6), (2010).</li><li>Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cold Spring Harbor Laboratory. Methods In Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).</li><li>Baryshnikova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+genetic+array+(SGA)+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae+and+Schizosaccharomyces+pombe.">Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods Enzymol. 470, 145-179 (2010).</li><li>Young, B. P., Loewen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balony:+a+software+package+for+analysis+of+data+generated+by+synthetic+genetic+array+experiments.">Balony: a software package for analysis of data generated by synthetic genetic array experiments.</a> BMC Bioinformatics. 14, 354 (2013).</li><li>Wagih, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SGAtools:+one-stop+analysis+and+visualization+of+array-based+genetic+interaction+screens.">SGAtools: one-stop analysis and visualization of array-based genetic interaction screens.</a> Nucleic Acids Res. 41, W591-W596 (2013).</li><li>Dittmar, J. C., Reid, R. J., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScreenMill:+a+freely+available+software+suite+for+growth+measurement,+analysis+and+visualization+of+high-throughput+screen+data.">ScreenMill: a freely available software suite for growth measurement, analysis and visualization of high-throughput screen data.</a> BMC Bioinformatics. 11, 353 (2010).</li><li>Longley, D. B., Harkin, D. P., Johnston, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-fluorouracil:+mechanisms+of+action+and+clinical+strategies.">5-fluorouracil: mechanisms of action and clinical strategies.</a> Nat Rev Cancer. 3, 330-338 (2003).</li><li>Lum, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+modes+of+action+for+therapeutic+compounds+using+a+genome-wide+screen+of+yeast+heterozygotes.">Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes.</a> Cell. 116, 121-137 (2004).</li><li>Toussaint, M., Conconi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+sensitive+assay+to+measure+yeast+cell+growth:+a+bench+protocol+for+testing+genotoxic+agents.">High-throughput and sensitive assay to measure yeast cell growth: a bench protocol for testing genotoxic agents.</a> Nat Protoc. 1, 1922-1928 (2006).</li><li>Robinson, M. D., Grigull, J., Mohammad, N., Hughes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FunSpec:+a+web-based+cluster+interpreter+for+yeast.">FunSpec: a web-based cluster interpreter for yeast.</a> BMC Bioinformatics. 3, 35 (2002).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources.">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4, 44-57 (2009).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatics+enrichment+tools:+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists.">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37, 1-13 (2009).</li><li>Hong, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Ontology+annotations+at+SGD:+new+data+sources+and+annotation+methods.">Gene Ontology annotations at SGD: new data sources and annotation methods.</a> Nucleic Acids Res. 36, D577-D581 (2008).</li><li>Fang, F., Hoskins, J., Butler, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-fluorouracil+enhances+exosome-dependent+accumulation+of+polyadenylated+rRNAs.">5-fluorouracil enhances exosome-dependent accumulation of polyadenylated rRNAs.</a> Mol Cell Biol. 24, 10766-10776 (2004).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+the+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol Syst Biol. 2, 0008 (2006).</li><li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+landscape+of+a+bacterial+cell.">Phenotypic landscape of a bacterial cell.</a> Cell. 144, 143-156 (2011).</li><li>Dai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+nucleosome+function:+a+highly+versatile+library+of+synthetic+histone+H3+and+H4+mutants.">Probing nucleosome function: a highly versatile library of synthetic histone H3 and H4 mutants.</a> Cell. 134, 1066-1078 (2008).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

화학적 상호 작용 유전자 프로파일을 생성하기위한 방법이 여기에 설명했다. 방법은 간단하다 화학의 유무에 광범위한 유전자 결실 컬렉션 각 균주의 콜로니 크기를 비교하여, 화학적 내성 모독에 필요한 모든 유전자들은 식별된다. 민감한 균주의 결과 목록의 주석 농축 분석은 화학 물질의 작용 모드에 대한 통찰력을 제공하기 위해 사용될 수있다. 이 프로토콜은 효모 신진 위해 최적화되어 있지만, 이는 또한 다른 배열 된 E. 미생물 삭제 모음과 함께 사용하도록 적응 될 수있다 휴대 교란의 (26, 27)의 수백을 조사하기 위해 성공적으로 사용 된 대장균 게이오 컬렉션입니다. 효모 및 기타 생물 화학 - 유전 적 프로파일 링은 잘 확립되어있다. 이러한 연구의 대부분은 마이크로 어레이 분석 또는 높은 처리량 sequ 통해 결실 돌연변이 체를 풀링 재배 적 경쟁 분석법에 의존고유 한 유전자 바코드의 encing. 이 방법은 큰 화학 라이브러리의 강력한 화학 물질이 유전자 프로파일을 생산에 성공 증명했다. 여기에 설명 된 방법은 시험 화합물의 작은 숫자의 화학 분석을위한 유전자 유용한 대안을 제공한다. 분석은 높은 처리량 시퀀싱 또는 마이크로 어레이 분석을보다 적은 비용으로 금지하고 순서 바이어스 고통없는 간단한 판독을 제공합니다. 명시된 프로토콜 콜로니 조작 로봇 장비를 필요로하지만, 이러한 시스템은 교대 프로토콜 물질의 목록에 포함 된 예들이 수동 피닝 도구와 함께 사용 조정될 수, 더 저렴 해지고있다. 이것은 일반적으로이 방법 및 화학 유전자 프로파일의 제한을 인식하는 것이 중요하다. 먼저, 화합물 출아 효모의 생존에 영향을해야하거나 특정 유기체들이 이용된다. 많은 기본적인 생물학적 과정 동안과 기능은 물론 세포에 화학 물질의 흡수 것 같은 진핵 생물은 생물 특정 화학 유전자 상호 작용이 매우 다양 할 수있다 사이에 보존되어있다. 또한 여러 결실 균주 여러 약물 치료 8에 민감한 것으로 밝혀졌다 주목해야한다. 이러한 약물 유출, 액포 기능, 막 무결성에 관여하는 유전자를 포함한다. 이 지시하는 존경과 행동의 간접적 인 방식으로 결론을 내릴 때 고려 다중 약물 내성을 고려하는 것이 중요하다. 여기에 설명 된 화면 반수체 삭제 컬렉션, 효모에서의 유전 분석 화학에 대한 일반적인 방법을 사용하여 수행 하였다. 행동의 화학 물질 화합물의 모드의 결정에 더 도움을 사용할 수 효모 돌연변이 체의 여러 컬렉션은 지금이 있습니다. 이것은 완전한 동형 접합 및 이형 이배체 삭제 컬렉션뿐만 아니라 조건부 온도에 민감한 필수 유전자 돌연변이, Decre뿐만 아니라 포함사용할 수있는 도구의 놀라운 깊이 용이성을 감안할 때 후생 유전 학적 기반 분자 치료 3,4,28을 조사하는 데 사용할 수 mRNA의 섭동 (젖은) 효모 돌연변이 라이브러리 및 합성 히스톤 H3 및 H4 돌연변이 컬렉션에 의해 ased 풍부 방법론 및 필요한 제한된 인프라, 이러한 접근은 화학적 화합물의기구에 대하여 다양한 기능 정보에 액세스하기위한 액세스 가능한 형식을 제공한다.

유전 도구와 모델 생물 사카로 미세스 세 레비 시아에 이용 가능한 자원 일괄 유전자 네트워크 생물학적 시스템의 요구 사항을 이행하는 방법으로서 기능에 대한 새로운 통찰력을 제공 대규모 기능 유전체학 연구있게되었다. 이러한 도구의 초석은 효모 1, 2의 모든 열려있는 독서 프레임의 비 필수 유전자 결실의 완전한 세트의 공동 제작했다. 눈에 띄는 관찰 표준 실험실 조건에서 haploids로 성장하면 효모의 유전자 만 ~ 20 %가 생존에 필요한 것이 었습니다. 이것은 다른 생물학적 경로의 이용을 통해 게놈 섭동에 대하여 버퍼링 세포의 능력을 강조한다. 유전 개별적으로 가능한 있습니다 돌연변이하지만 조합에 치명적인는 연결 또는 수렴 병렬 생물학적 경로를 신호 및 생물학적 기능을 설명하는 유전자 상호 작용 네트워크를 형성한다. 조건부 TE의 발전과 함께필수 유전자의 mperature에 민감하고 hypomorphic 대립이 기술은 중요하지 않은 유전자 3,4의 연구에 국한되지 않았습니다. 이 개념은 유사한 세포 과정에 관여하는 유전자 (5)가 함께 클러스터링 방법을 설명하는 편견 유전자 상호 작용지도를 생산하는 게놈 규모로 적용되었습니다. 유전자 네트워크의 화학 교란 모방 유전자 결실 (그림 1) 6. 과민성위한 결실 균주의 고밀도 배열 대해 성장 저해 화합물을 조회하면 화학적 스트레스를 허용하는 데 필요한 유전자의리스트, 즉 화학적 상호 작용 유전자 프로파일을 식별한다. 유전 적 상호 작용과 마찬가지로, 화학 라이브러리의 대형 스크린은 액션 함께 클러스터 (7)의 모드를 갖는 화합물과 유사한 것으로 나타났다. 따라서, 화합물의 화학적 상호 작용 유전자 프로파일을 구축하여 작업의 모드는 LAR과 비교하여 추론 할 수있다GE의 규모의 합성 유전자 및 화학 유전자 상호 작용은 8,9 데이터 집합. 화합물의 점수가, 심문하고있는 큰 규모의 화학 유전 스크린, 바코드 경쟁 분석에 의해 수행되었다. 이 방법에서는, 삭제 균주의 풀링 된 컬렉션 화학 물질을 포함하는 미디어의 작은 볼륨에서 여러 세대에 한꺼번에 성장한다. 각 삭제 돌연변이가 고유 한 유전자 바코드를 품고 있기 때문에, 삭제 균주의 풀 내의 개별 돌연변이의 생존 / 성장은 마이크로 어레이 또는 높은 처리량 시퀀싱 (10)에 의해 추적됩니다. 생체 활성 화합물을 함유하는 고체 아가상에서 성장 물리적으로 배열 된 돌연변이 콜로니 크기를 모니터링하여 적응도를 추론하는 것은 화학적 상호 작용 11,12 유전자를 확인하는 효과적인 방법이다. 이 방식은 경쟁 기반 스크리닝에 비용 효율적인 대안을 제공하고, 화학 물질의 작은 라이브러리를 분석하기에 적합하다.여기에 설명 된 S.의 화학적 상호 작용 유전자의리스트를 생성하기위한 간단한 방법이다 생물학 조작 또는 인프라 분자에 의존하지 않는 cerevisiae의는. 그것은 단지 효모 삭제 수집, 로봇 또는 수동 피닝 장치 및 무료로 사용할 이미지 분석 소프트웨어가 필요합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="987">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Name of Material/ Equipment&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Catalog Number&#160;</td>
			<td style="width:457px;">Comments/Description&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:213px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:161px;">BioBasic</td>
			<td>G0961</td>
			<td style="width:457px;">For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:213px;">Tyrptone Powder</td>
			<td style="width:161px;">BD Biosciences</td>
			<td>211820</td>
			<td style="width:457px;">For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:213px;">Dextrose</td>
			<td style="width:161px;">Anachemia</td>
			<td style="width:156px;">31096-380</td>
			<td style="width:457px;">For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) - Do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Agar A</td>
			<td style="width:161px;">Bio Basic</td>
			<td>FB0010</td>
			<td style="width:457px;">For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:213px;">G418</td>
			<td style="width:161px;">A.G. Scientific Inc.</td>
			<td style="width:156px;">G-1033</td>
			<td style="width:457px;">Prepare 1000x stock at 200mg/ml in dH2O and filter sterilize.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">12 well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">5ml culture tubes</td>
			<td>Evergreen Scientific</td>
			<td>222-2376-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">10cm Petri Dish</td>
			<td style="width:161px;">VWR</td>
			<td>25384-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ROTOR HDA</td>
			<td>Singer Instruments&#160;</td>
			<td>ROT-001</td>
			<td>high-throughput microbial array pinning robot</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PLUSPLATE&#169; Petri Dish</td>
			<td>Singer Instruments&#160;</td>
			<td>PLU-001</td>
			<td>Box of 200 dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">384 Short-Pin RePad</td>
			<td>Singer Instruments&#160;</td>
			<td>RP-MP-384</td>
			<td>Box of 1000 pads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1536 Short-Pin RePad</td>
			<td>Singer Instruments&#160;</td>
			<td>RP-MP-1536</td>
			<td>Box of 1000 pads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alternative Pinning Tools:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fully Automated Robtic Systems</td>
			<td>S&#38;P robotics</td>
			<td>http://www.sprobotics.com</td>
			<td>Several automated colony handling robitic and imagining systems available.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manual Pinning Tools</td>
			<td>V&#38;P Scientific</td>
			<td>http://www.vp-scientific.com</td>
			<td>Handheld replication tools and accessories.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid identification of chemical genetic interactions in saccharomyces cerevisiae

생리 활성 화학 물질의 작용 모드를 결정하는 학술, 제약의 넓은 범위에 관심, 산업 과학자이다. 사카로 미세스 세 레비 시아, 또는 신진 효모, 모델 진핵 생물이되는 ~ 6,000 유전자 삭제 돌연변이 hypomorphic 필수 유전자의 전체 모음 돌연변이 체는 시판되고있다. 이러한 돌연변이의 수집 체계적 화학 견딜 필요 유전자 화학적 상호 작용, 즉 유전자를 검출하는데 사용될 수있다. 이 정보는, 차례대로, 화합물의 작용 가능성 모드에보고한다. 여기에서 우리는 효모 신진 화학 - 유전자 상호 작용의 신속한 식별을위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 액션의 잘 정의 된 메커니즘이 화학 요법 제 5- 플루오로 우라실 (5-FU)을 사용하는 방법을 보여준다. 우리의 결과는 핵 TRAMP가 엑소 및 DNA 복구 효소 이전 m과 일관성이 5-FU의 존재하에 증식에 필요한 RNA 보여기반 바 코딩 화학 유전 적 접근과 5-FU에 악영향을 모두 RNA 및 DNA 신진 대사에 영향을 미치는 것을 지식을 icroarray. 이러한 높은 처리량 스크린 필요한 검증 프로토콜은 또한 기술된다.

이 방법의 유효성으로서 우리는 위에서 설명한 프로토콜은 다음 화학 요법 제 5- 플루오로 우라실 (5-FU)의 대표적인 화학적 상호 작용 유전자 스크린을 수행 하였다. 5-FU는 티미 신타뿐만 아니라 DNA와 RNA 대사 (18)을 방해하는 것으로 알려져있다. 5-FU의 화학적 유전 적 상호 작용은 공부 잘하고 이질 동형 접합 삭제 컬렉션 8,19를 모두 사용하여 효모 바코드 마이크로 어레이 기술에 의해 조사되었다. 여기서 우리는 유사한 결과가 돌연변이 콜로니 크기의 정량 비교함으로써 얻어 질 수 있음을 보여준다. 그것은 수행 화면 비 필수 유전자의 결실 반수성 컬렉션을 이용하는 것을 유의해야한다. 이 유형의 스크린은 또한 필수 유전자 돌연변이의 포함을 허용 이배체 균주, 온도에 민감한 돌연변이 및 hypomorphic 대립 유전자를 사용하여 수행 될 수있다. 반수체 삭제 컬렉션을 활용 장점 중 하나는 약물 센스티브을 증가목표 경로의 성만은 유전자 생성물의 완전한 부재를 부여. 그러나, 두 가지 중요한 단점은 필수 유전자 과민성 조회 할 수 없다고하고, 반수체 컬렉션은 다수의 증식을 통해 선정되는 자발적인 돌연변이 억제하는 경향이있다. 이 컬렉션의 악화로 이어질 수 있습니다. 따라서, 약물의 효과에 배열과 감성의 무결성과 폭 사이에 떨어져 고유의 무역이있다. 이 고려되어야하며, 선택된 가장 적절한 변이체 컬렉션은 원하는 응용에 기초. 먼저, 5-FU의 적절한 치사량 농도가 스크린에 사용되는 (5-FU의 농도 증가에 BY4741 (마타 HIS3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) 세포 성장과 시각 효모 콜로니의 성장을 평가하여 10 μM로 측정되었다 도 3A). 대안 적으로, 유사한 결과가 성장 너희함으로써 얻을 수있다이전 그룹 (10, 20)에 의해 설명 된대로 액체 배양 및 마이크로 플레이트 리더 (도 3b)를 이용하여 배양 광학 밀도의 빈번한 모니터링 마이크로 타이 터 플레이트에서 AST. 가수 ROTOR를 사용하여 효모 DMA 10 μM 5-FU 또는 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 대조군 (도 4a)를 포함하는 매체 상 접시 밀도 당 1,536 콜로니로 복제 하였다. 상기 플레이트를 실온에서 24 시간 동안 배양하고 플랫 베드 스캐너 상에 묘화 하였다. 모두 실험 및 제어 플레이트의 각 변이체에 대한 콜로니 크기 측정 Balony 이미지 분석 엔진 (15)을 사용하여 수행 하였다. Balony 소프트웨어 제어 실험 배열 상대적인 콜로니의 크기 비율을 계산한다. 사용자는 비 임계 값을 설정할 수 있으며, 화면에서 수행되는 경우, 적어도 P 값은 각각의 변이체에 대해 할당된다 삼배하다. 고려했다 ≤0.8의 비율을 보여 우리의 대표 화면 돌연변이 체에서에드 히트합니다. 콜로니 정량화의 결과는 Y 축상의 각 콜로니 X 축에 배열 위치 (도 4B) 또는 비 (도 4C)에 의해 지시 유전자 결실에 대한 크기 비율을 플롯 팅하여 그래픽으로 표시 될 수있다. 합성 아픈은 / 화면에서 확인 치명적인 돌연변이는 유전자 온톨로지 (GO) 분석을 수행하여 기능 설명에 따라 그룹화 할 수 있습니다. S. 목록의 GO 분석을위한 몇 가지 공개적으로 사용할 수있는 도구가 있습니다 cerevisiae의 유전자; Funspec (21), 데이비드 생물 정보학 데이터베이스 22, 23, 및 사카로 마이 세스 게놈 데이터베이스 (SGD) 이동 기간 찾기 (24) 포함. 5-FU 화면 0.8 이하의 비율을 가지고있는 유전자 결실은 Funspec위한 입력리스트로 하였다. Funspec 체계적인 또는 일반 효모 유전자 이름의 목록을 받아 하다며뿐만 아니라 유전자 온톨로지, 기능 분류, 현지화, 단백질 복합체의 요약을 출력그 목록에 충실 그녀의 유용한 분류. 수행 대표 화면 우리 딘 수정 및 RNA 감시 장치, 및 DNA 손상 (표 1)에 응답하여, 워블의 tRNA는, RNA 대사 온톨로지 농축 하였다. 이러한 결과는 핵 재단 / Rrp6 / 항공 / MTR4 폴리아 데 닐화 (TRAMP) 엑소 (25)에 의해 처리되는 폴리아 데 닐화 비 암호화 RNA를,의 축적에서 5-FU 치료 결과를 보여 이전의 연구에 동의합니다. 따라서 이러한 연구 결과는 이전의 화학 유전 스크린 계약과 5-FU의 생리 활성의 8,19의 알려진 메커니즘에 있습니다. 모두 높은 처리량 기능적 게놈 접근법으로는 결과를 검증 할 필요가있다. 화학 유전자 상호 작용 효모 돌연변이가 먼저 표적 유전자의 프로모터 및 KANMX 중단 카세트 내에서 어닐링 프라이머를 PCR은-을 검증해야합니다 확인합니다. 유효 기간 균주의 선택ATION 강한 표현형을 보여주는 기능적 그룹 좋은 출발점을 제공 다소 임의적 그러나 우선 순위 돌연변이이다. 다음에, 화학 물질 과민증이 스포팅 분석, 효모 돌연변이의 체력을 측정하기위한 일반적인 방법을 사용하여 확인된다. 이를 위해, 효모의 연속 희석은 해당 화학 물질의 투여 량뿐만 아니라 컨트롤을 포함하는 매체를 그리드에서 발견된다. 예를 들어, 우리는 (그림 5) TRAMP 단지의 air1과 trf5 돌연변이와 5-FU의 화학 유전자의 상호 작용을 확인합니다. 이 유전자는 TRAMP 핵 엑소의 구성 요소를 인코딩합니다. 우리는 핵심 TRAMP의 3&#39;-5 &#39;엑소 뉴 클레아 제 활성을 결여 rrp6 균주가, 우리가 실험실의 고밀도 DMA 컬렉션 잃었다 있습니다. 신선한 rrp6 돌연변이를 얻기에 우리는 그 rrp6을 확인하고 5-FU는 또한 TRAMP 활동이 5-FU를 허용하는 데 필요한 설정, 화학 유전자 상호 작용을 표시합니다. 이 보여큰 삭제 컬렉션의 무결성 적절한 DMA 유지 보수 및 변형 검증이 중요하고, 시간이 지남에 따라 손상된 될 수. 우리의 화면이 민감한 5-FU로 (rad50, rad52 및 mre11 포함) 여러 DNA 수리 효소에 돌연변이를 확인했다. 식민지 크기의 점수는 야생형에 비해 0.7, 0.65, 0.42로 10 μM 5-FU에 이러한 돌연변이의 상대 체력을 지적했다. 우리 확증 스폿 팅 분석 (도 5)에 기초하여, 이들 값 인해 콜로니 크기 터뜨려 체력 측정의 제한된 동적 범위 과소 쉽다. 이는 독립적으로 일련의 상호 작용에 의한 얼룩을 확인하는 두 번째 이유를 강조한다 몇몇 화학적 상호 작용 유전자의 크기는 기본 데이터 분석에서 과소 평가 될 수있다. 우리의 결과는 중으로 ~ 4800 - 변형 반수체 삭제 컬렉션을 수행 성장 기반 화학 유전자 화면, 적절한 레졸을 제공한다는 설명<html> 의 ution 자신있게 특정 화학 유전자 상호 작용을 분리합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52345/52345fig1highres.jpg" /> 그림 1 :. 화학 섭동에 과민 반응이 발생할 화학 유전자 상호 작용의 개략도 유전자 삭제는 화학 물질의 대상이 생물학적 과정의 식별을 위해 수 있습니다. (A) 수렴 경로는 하나의 유전자 삭제 (geneA) 또는 화학적 (geneB)에 의해 중단 될 수 있습니다. 개별적으로, 이러한 세포 모욕으로 인해 생물학적 경로의 고유의 중복을 허용 할 수 있습니다. 그러나, 조합 세포 생존 능력에 어느 합성 아프거나 치사 표현형 손상된다. (B) 또한 과민 반응의 원인이 화학적 처리에 의해 중단 생물학적 경로를 나타내는 화학적으로 유발 된 스트레스를 완화하기위한 중요한 유전자 (geneC)의 삭제.<html> jove.com/files/ftp_upload/52345/52345fig1large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52345/52345fig2highres.jpg" width="700" /> 그림 2 : 화학 유전자 화면 워크 플로 서브 억제 용량의 (A) 결정 :. 부모 효모 균주 고정 단계로 성장 1 희석 : 5,000, 확산이 증가하고 화학 복용량을 포함하는 고체 YEPD 미디어에 도금. 이하인 10~15% 성장 억제를 갖지 않는 최고 농도는 DMA에 대해 스크리닝을 위해 선택된다. (B) 화학 체계적인 유전 화면 : S. 로봇 피닝 높은 처리량 어레이를 이용 cerevisiae의 DMA는 시험 물질의 농도를 함유하는 적당한 매체 상으로 도금 된 복제본이다. 플레이트를 24-48 시간 동안 실온에서 인큐베이션 이미지화 및 상대 콜로니 크기가 결정된다.심판 = &quot;https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52345/52345fig2highres.jpg&quot;대상 = &quot;_ 빈&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52345/52345fig3highres.jpg" /> 그림 3 :. 하위 억제 농도의 결정. 5 fluouracil를 포함하는 고체 배지에 BY4741 세포의 (A) 성장. 포화 BY4741 문화는 1 희석 : 5,000 및 5- 플루오로 우라실의 농도 증가에 도금. 5 flurouracil를 포함하는 액체 배지에서 BY4741 세포 (B) 성장 곡선. ~ 4 x 104 세포를 22 시간 동안 10 분마다 측정 된 5-FU 및 ODS 증가하는 농도에서 삼중으로 증착 하였다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52345/52345fig4highres.jpg" width="700" /> 그림 4 : 5의 화학 유전자 화면플루오로 우라실. (A) S. cerevisiae의 결실 돌연변이 배열은 10 μM 5-FU (오른쪽)를 함유 YEPD 한천 및 DMSO 제어 (왼쪽)에 복제. (B) 화학 유전 화면의 결과 : 배열 위치에 의해 주문 DMSO 제어에 비해 10 μM 5-FU에 돌연변이의 상대 성장. 식민지 크기 비율에 의해 주문 DMSO 제어에 비해 10 μM 5-FU에 돌연변이 (C) 상대 성장. ≤0.8의 비율 임계 값이 두 그래프에 표시됩니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52345/52345fig4highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52345/52345fig5highres.jpg" /> 그림 5 : 화학 유전자 상호 작용의 확인. DMSO 제어 (A) 상에 성장 여러 격리 변이주 희석액, 10 μM 5-FU ( <str옹&gt; B), 또는 0.015 % 메틸 메탄 술포 네이트 (MMS; C). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> GO 카테고리 </td><td fo:width="0.7in"> P-값 </td><td> 확인 된 유전자 (히트) </td><td fo:width="0.4in"> # 히트 </td><td fo:width="0.6in"> GO 카테고리에서 유전자의 총 # </td></tr><tr><td> tRNA의 동요 딘 수정 [GO : 0002098]를 </td><td> 2.24 × 10 -6 </td><td> SIT4 NCS6 URM1 KTI12 IKI3 TUM1 ELP3 </td><td> 7 </td><td> (24) </td></tr><tr><td> 전사, DNA 의존적 [GO : 0006351] </td><td> 1.69 × 10-5 </td><td> PDR3 LDB7 HIR1 HAP3 ROX3 SPT7 SNF5 RPA14 SAC3 HMO1 NGG1 SPT3 IES6 AFT1 RAI1 STB5 SDS3 MET18 CTK2 RPB4 SWI3 RPA12 KTI12 ASH1 SWI6 IKI3 GCR2 POP2 LEO1 SSN3 SGF11 ELP3 </td><td> (32) </td><td> (540) </td></tr><tr><td> 번역 [GO : 0006412] </td><td> 4.28 × 10-5 </td><td> RPL19B RPS11B FES1 RPS9B RPL31A RPL24A RPL7A RPS25A RPL26B RPL11B RPL27A RPL34B RPL14A TEF4 RPS29A RPL6A AEP1 RPS16A MRP7의 RPS19B의 RPS19A의 RPS7A </td><td> (22) </td><td> (318) </td></tr><tr><td> tRNA의 동요 위치 딘의 티올은 [GO : 0002143]를 </td><td> 1.88 × 10 -4 </td><td> NCS6 URM1 TUM1 </td><td> 3 </td><td> (5) </td></tr><tr><td> 전사의 규제, DNA 의존적 [GO : 0006355] </td><td> 4.98 × 10 -4 </td><td> PDR3 LDB7 HIR1 HAP3 ROX3 SPT7 SNF5 SAC3 HMO1 NGG1 SPT3 IES6 AFT1 RAI1 STB5 SDS3 SWI3 KTI12 ASH1 SWI6 IKI3 GCR2 POP2 LEO1 SSN3 SGF11 ELP3 </td><td> (27) </td><td> (507) </td></tr><tr><td> 단백질 urmylation은 [GO : 0032447]를 </td><td> 6.33 × 10 -4 </td><td> NCS6 URM1 URE2 </td><td> 3 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> 응답 핵에서 mRNA의 수출은 [열 응력GO : 0031990]를 </td><td> 2.04 × 10 -3 </td><td> RPB4 NUP120 NUP133 </td><td> 3 </td><td> (10) </td></tr><tr><td> 핵 폴리아 데 닐화에 의존 CUT 이화 과정은 [GO : 0071039]를 </td><td> 2.04 × 10 -3 </td><td> AIR1 TRF5 MPP6 </td><td> 3 </td><td> (10) </td></tr><tr><td> 트립토판 대사 과정 [GO : 0006568]를 </td><td> 2.15 × 10 -3 </td><td> TRP5 TRP3 </td><td> 이 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> 초기 골지 수송 엔도 좀 [GO : 0034498]를 </td><td> 2.75 × 10 -3 </td><td> ENT5 TCA17 RCY1 </td><td> 3 </td><td> (11) </td></tr><tr><td> 리보솜 작은 서브 유닛의 생합성은 [GO : 0042274]를 </td><td> 3.63 × 10 -3 </td><td> SAC3 LTV1 RPS19B의 RPS19A </td><td> 4 </td><td> (24) </td></tr><tr><td> 염색질 수정 [GO : 0016568]를 </td><td> 3.64 × 10 -3 </td><td> LDB7 HIR1 SPT7 NGG1 SPT3 SDS3 ASH1의 SGF11ELP3 </td><td> 9 </td><td> (114) </td></tr><tr><td> ATP 대사 과정은 [GO : 0046034]를 </td><td> 4.23 × 10 -3 </td><td> VMA2 VMA1 </td><td> 이 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 액포 양성​​자 수송 V 형은 복잡한 어셈블리를 ATPase의 [GO : 0070072]를 </td><td> 4.23 × 10 -3 </td><td> VMA21 VPH2 </td><td> 이 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 염색체 현지화 [이 GO : 0050000]를 </td><td> 4.23 × 10 -3 </td><td> NUP120 NUP133 </td><td> 이 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> mRNA의 교통 [GO : 0051028]를 </td><td> 4.59 × 10 -3 </td><td> DHH1 SAC3 LOC1 KAP114 NUP120 NUP133 </td><td> (6) </td><td> (58) </td></tr><tr><td> 액포의 산성화 [GO : 0007035]를 </td><td> 4.89 × 10 -3 </td><td> VMA2 VMA1 VMA5 VPH2 </td><td> 4 </td><td> (26) </td></tr><tr><td> 핵에서 rRNA의 수출 [GO : 0006407] </td><td> 5.63 × 10 &lt;SUP&gt; -3 </td><td> NUP120 NUP133 RPS19B의 RPS19A </td><td> 4 </td><td> (27) </td></tr><tr><td> 엔도 시토 시스 [GO : 0006897] </td><td> 6.57 × 10 -3 </td><td> SLA1 EDE1 CDC50 ART5 RCY1 VPS1 END3 </td><td> 7 </td><td> (82) </td></tr><tr><td> mRNA의 3&#39;- 말단 처리의 핵 mRNA의 감시 [GO : 0071031]를 </td><td> 6.92 × 10 -3 </td><td> AIR1 MPP6 </td><td> 이 </td><td> (5) </td></tr><tr><td> ncRNA 폴리아 데 닐화는 [GO : 0043629]를 </td><td> 6.92 × 10 -3 </td><td> AIR1 TRF5 </td><td> 이 </td><td> (5) </td></tr><tr><td> 핵 폴리아 데 닐화에 의존하는 snoRNA 이화 과정은 [GO : 0071036]를 </td><td> 6.92 × 10 -3 </td><td> AIR1 TRF5 </td><td> 이 </td><td> (5) </td></tr><tr><td> 핵 폴리아 데 닐화에 의존 snRNA 이화 과정은 [GO : 0071037]를 </td><td> 6.92 × 10 -3 </td><td> AIR1 TRF5 </td><td> 이 </td><td><html> (5) </td></tr><tr><td> 트립토판 생합성 과정은 [GO : 0000162]를 </td><td> 6.92 × 10 -3 </td><td> TRP5 TRP3 </td><td> 이 </td><td> (5) </td></tr><tr><td> ER 막에 단백질 삽입 [GO : 0045048]를 </td><td> 6.92 × 10 -3 </td><td> GET1 GET4 </td><td> 이 </td><td> (5) </td></tr><tr><td> mRNA의 안정화 [GO : 0048255]를 </td><td> 6.92 × 10 -3 </td><td> ATP25 IGO1 </td><td> 이 </td><td> (5) </td></tr><tr><td> DNA 손상 자극에 대한 반응은 [GO : 0006974]를 </td><td> 7.05 × 10 -3 </td><td> MUS81 R​​AD2 MET18 CTK2 RPB4 GRR1 DEF1 MMS22 RAD52 MRE11 RAD50 RMI1 </td><td> (12) </td><td> 197 </td></tr></tbody></table><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> GO 카테고리 </td><td fo:width="0.7in"> P-값 </td><td> 확인 된 유전자 (히트) </td>&quot;&gt; # 1 안타 </td><td fo:width="0.6in"> GO 카테고리에서 유전자의 총 # </td></tr><tr><td> 핵 폴리아 데 닐화에 의존하는 rRNA의 이화 과정은 [GO : 0071035]를 </td><td> 8.46 × 10 -3 </td><td> AIR1 TRF5 MPP6 </td><td> 3 </td><td> (16) </td></tr></tbody></table> 표 1 : 유전자 온톨로지 (GO) 5- 플루오로 우라실 민감한 돌연변이 체의 특성.

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Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

화학 유전자 상호 작용의 신속한 식별<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

rapid-identification-chemical-genetic-interactions-saccharomyces

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

10.3K 조회수.  University of Victoria. Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

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Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

의 해부 Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

연구

생물학

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

S. cerevisiae의의 양적 proteomics와 단백질 단지의 식별

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

지방산의 정량 Phosphoproteomics은 자극 Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray 분석을위한 Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

효모에서 모니터링 Mitophagy을위한 형광 현미경 분석 Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

의 낭성 섬유증의 Transmembrane의 전도성 조절 단백질의 표현과 정제 Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

헤어 재생시 상피 - 중간 엽 시그널링의 빠른 유전 분석

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

의 모니터링 단백질 접힘에 대한 결합 분석 실험<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.