עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק R00AG031911 מהמכון הלאומי להזדקנות של המכונים הלאומיים לבריאות לPHM התוכן של מאמר זה אינו משקף בהכרח דעות רשמיות של המכון הלאומי לבריאות.

<ol>
	<li>Maslov, A. Y., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+instability,+cancer+and+aging.">Genome instability, cancer and aging.</a> Biochim Biophys Acta. 1790, 963-969 (2009).</li><li>Maher, R. L., Branagan, A. M., Morrical, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+DNA+replication+and+recombination+activities+in+the+maintenance+of+genome+stability.">Coordination of DNA replication and recombination activities in the maintenance of genome stability.</a> J Cell Biochem. 112, 2672-2682 (2011).</li><li>Longo, V. D., Shadel, G. S., Kaeberlein, M., Kennedy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+and+chronological+aging+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Replicative and chronological aging in Saccharomyces cerevisiae.</a> Cell Metab. 16, 18-31 (2012).</li><li>Madia, F., Gattazzo, C., Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+model+system+for+age-dependent+DNA+damage+and+cancer.">A simple model system for age-dependent DNA damage and cancer.</a> Mech Ageing Dev. 128, 45-49 (2007).</li><li>Madia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogene+homologue+Sch9+promotes+age-dependent+mutations+by+a+superoxide+and+Rev1/Polzeta-dependent+mechanism.">Oncogene homologue Sch9 promotes age-dependent mutations by a superoxide and Rev1/Polzeta-dependent mechanism.</a> J Cell Biol. 186, 509-523 (2009).</li><li>Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+lifespan+microscopic+observation+of+budding+yeast+aging+through+a+microfluidic+dissection+platform.">Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 4916-4920 (2012).</li><li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phenotyping+of+aging+in+single+yeast+cells+using+a+novel+microfluidic+device.">Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device.</a> Aging Cell. 11, 599-606 (2012).</li><li>McMurray, M. A., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+age-induced+switch+to+a+hyper-recombinational+state.">An age-induced switch to a hyper-recombinational state.</a> Science. 301, 1908-1911 (2003).</li><li>Foster, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+determining+spontaneous+mutation+rates.">Methods for determining spontaneous mutation rates.</a> Methods Enzymol. 409, 195-213 (2006).</li><li>Boeke, J. D., LaCroute, F., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+positive+selection+for+mutants+lacking+orotidine-5&amp;#34;-phosphate+decarboxylase+activity+in+yeast:+5-fluoro-orotic+acid+resistance.">A positive selection for mutants lacking orotidine-5&amp;#34;-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance.</a> Mol Gen Genet. 197, 345-346 (1984).</li><li>Whelan, W. L., Gocke, E., Manney, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CAN1+locus+of+Saccharomyces+cerevisiae:+fine-structure+analysis+and+forward+mutation+rates.">The CAN1 locus of Saccharomyces cerevisiae: fine-structure analysis and forward mutation rates.</a> Genetics. 91, 35-51 (1979).</li><li>Lindstrom, D. L., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mother+enrichment+program:+a+genetic+system+for+facile+replicative+life+span+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The mother enrichment program: a genetic system for facile replicative life span analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 183, 413-422 (2009).</li><li>Lindstrom, D. L., Leverich, C. K., Henderson, K. A., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+age+induces+mitotic+recombination+in+the+ribosomal+RNA+gene+cluster+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Replicative age induces mitotic recombination in the ribosomal RNA gene cluster of Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS Genet. 7, e1002015 (2011).</li><li>Feser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+histone+expression+promotes+life+span+extension.">Elevated histone expression promotes life span extension.</a> Mol Cell. 39, 724-735 (2010).</li><li>Afonso, B., Silver, P. A., Ajo-Franklin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+circuit+for+selectively+arresting+daughter+cells+to+create+aging+populations.">A synthetic circuit for selectively arresting daughter cells to create aging populations.</a> Nucleic Acids Res. 38, 2727-2735 (2010).</li><li>Smeal, T., Claus, J., Kennedy, B., Cole, F., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+transcriptional+silencing+causes+sterility+in+old+mother+cells+of+S.+cerevisiae.">Loss of transcriptional silencing causes sterility in old mother cells of S. cerevisiae.</a> Cell. 84, 633-642 (1996).</li><li>Lam, Y. T., Aung-Htut, M. T., Lim, Y. L., Yang, H., Dawes, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+reactive+oxygen+species+begin+early+during+replicative+aging+of+Saccharomyces+cerevisiae+cells.">Changes in reactive oxygen species begin early during replicative aging of Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Free Radic Biol Med. 50, 963-970 (2011).</li><li>Dang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H4+lysine+16+acetylation+regulates+cellular+lifespan.">Histone H4 lysine 16 acetylation regulates cellular lifespan.</a> Nature. 459, 802-807 (2009).</li><li>Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).</li><li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C:+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications.">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14, 115-132 (1998).</li><li>Maxwell, P. H., Burhans, W. C., Curcio, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrotransposition+is+associated+with+genome+instability+during+chronological+aging.">Retrotransposition is associated with genome instability during chronological aging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 20376-20381 (2011).</li><li>Hall, B. M., Ma, C. X., Liang, P., Singh, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuation+analysis+CalculatOR:+a+web+tool+for+the+determination+of+mutation+rate+using+Luria-Delbruck+fluctuation+analysis.">Fluctuation analysis CalculatOR: a web tool for the determination of mutation rate using Luria-Delbruck fluctuation analysis.</a> Bioinformatics. 25, 1564-1565 (2009).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+estimator+of+mutation+rates.">A robust estimator of mutation rates.</a> Mutat Res. 661, 101-109 (2009).</li><li>Aguilaniu, H., Gustafsson, L., Rigoulet, M., Nystr&#246;m, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+inheritance+of+oxidatively+damaged+proteins+during+cytokinesis.">Asymmetric inheritance of oxidatively damaged proteins during cytokinesis.</a> Science. 299, 1751-1753 (2003).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה משלב מספר שיטות כדי לאפשר משאבים וגישות זמינים בSaccharomyces מערכת מודל cerevisiae להיות מיושם ביעילות למחקר של חוסר יציבות הגנום במהלך הזדקנות תא mitotic. מגוון רחב של מבחני לכמת צורות שונות של חוסר יציבות הגנום באמצעות בחירת פנוטיפי יכול להיות משולב עם מיון מגנטי ללמוד אפשריים ספציפי לגיל שינויים בהצטברות של צורות מסוימות של מוטציות או שחלופי כרומוזום. בעוד גישות רצף הגנום יכולות לספק מידע נוסף על הסוגים הכלליים של שינויים המתרחשים בגנום עם גיל, את היכולת להשתמש במערכות בחירת פנוטיפי להשיג מדידות שיעור מוטציות וכדי לבודד מעדיף סוגים מסוימים של שינויים גנטיים הם יתרונות חשובים ללימוד מכניסטית היבטים של חוסר יציבות הגנום הקשורות להזדקנות. התייעלות קביעת גיל תא והפוטנציאל לבצע מדידות מקבילות של physiologiשינויי קלוריות באמצעות cytometry זרימה לספק אמצעים יעיל כדי לתאם חוסר יציבות הגנום עם שינויים תאיים אחרים בזמן טווחי גיל ספציפיים. קביעת פוטנציאל תלוי גיל שינויים בשיעורים של מוטציות מצטברות דורשת: 1) קביעה מדוקדקת של שיעורים באוכלוסיות תאים צעירים, 2) קביעה מדויקת של גיל תא, ו3) היכולת להעשיר באופן מהימן אוכלוסיות גדולות מספיק של תאי אם למדוד reproducibly חוסר יציבות הגנום בגיל המבוגר. גישה זו מאפשרת למערכת שמרי המודל לתרום להגדרת מנגנונים אחראים לתלוי גיל שינויים בשיעורים ו / או תדרים של חוסר יציבות הגנום בתאי mitotically פעילים שבבסיס. יתר על כן, גורמים גנטיים וסביבתיים ניתן להעריך במהירות לתרומות לחוסר יציבות הגנום תלוי גיל. סופו של דבר, אפיונים אלה יכולים להוביל לפיתוח מודלים המסבירים את האופן שבו מוטציות מצטברות במהלך הזדקנות replicative. שיטה זו תלויה ביכולת לזהות מוטציות או סוגים אחרים של חוסר יציבות הגנום באמצעות הופעתו של פנוטיפים לבחירה למדידת שיעורים של אירועים כאלה. עם זאת, יצירתיות בעיצוב assay יכולה להרשות להיבטים רבים של חוסר יציבות הגנום להיחקר. לדוגמא, URA3 וגני CAN1 יכולים להיות ממוקמים באתרים גנומיים שונים כדי לבדוק את כל השפעות של מיקום גנטי על תוצאות. חזרה של אללים של גן שאינו פונקציונליים ספציפיים לאללים גן פונקציונליים יכול לבדוק תהליכי מוטציה מסוימים. כמו כן, כניסתה של אללים פעילים מרובים של גן או איגוף גן עם רצפים חוזרים יכולה לשמש כדי לבחון אירועי רקומבינציה דרך שיקום או אובדן של תפקוד גן, בהתאמה. בדיקות תנודות הן הגישה סטנדרטית לקביעת שיעורי אלה אירועי חוסר היציבות הגנום השונים 9. הפרוטוקול נכתב באמצעות האומדן החציוני לאה-Coulson המקובל היטב ופשוט יחסית כדי לקבוע mutaשיעור tion כדי להפוך אותו נגיש יותר לחוקרים מגוונים, למרות ששיטת אומדן סבירות MSS-מקסימום נחשבת הגישה הטובה ביותר לקביעת שיעורי מוטציה 9. אומדן סבירות MSS-המרבי נבדק בעבר בפירוט 9, ויכול לשמש כשיטת חלופית, אבל דורש חישובים מתוחכמים יותר. לחלופין, תוכנה חופשית לחישוב שיעורי מוטציה בשיטה זו הפכה לזמינה 22. קבלת אמצעים לשחזור של שיעורי מוטציה דורשת תשומת לב לכמה היבטים של תכנון ניסוי, כוללים שימוש בתרבויות לשכפל מספיק, ייחסו תרבויות בצפיפות תא נמוכה מספיק ראשונית שעולה גודל אוכלוסייה על ידי כרכי תרבות המתאימים 10,000 פי או יותר, ובחירה, כך שכל אוכלוסייה של תאים ניתן להפיץ על גבי מצע סלקטיבי. לנקודה האחרונה, נוסחה שתוארה לעיל יכולה לשמש כדי להתאים את שיעור מוטציות המבוססות על חלק קטן של טסט התרבותד 9. וריאציה בקצב צמיחה של תרבויות יכולה לסבך את קביעת שיעור מוטציות לשחזור, ואומדן המבוסס על חציון שונה שעשויים להניב תוצאות לשחזור יותר במצבים כאלה תוארו 23 לאחרונה. היכולת למדוד גיל תא בצורה מדויקת היא גורם נוסף שהוא חשוב לקביעה אם תדרי חוסר יציבות הגנום בתאים ישנים שונים מהערכים הצפויים בשל שיעור האירועים בתאים צעירים. מצאנו כתמי WGA להיות עדיף על calcofluor צביעה לבנה, הן מבחינת רקע וגמישות, מאז WGA זמין מצומדות למולקולות ניאון שונות. גמישות זו יכולה לספק יותר הזדמנויות למדידות בו זמניות של מאפייני תא אחרים עם ריאגנטים ניאון. עבודה ראשונית ליצור מערכת יחסים בין עוצמת האות לצביעת WGA והמספר המתאים של צלקות ניצן על תאים ולאחר מכן יכול להוביל ליותרקביעה מהירה של גיל תא דרך cytometry זרימה. גישה זו גם מאפשרת שימוש בגדלי אוכלוסייה גדולים יותר ממה שאפשר בחן בדרך כלל על ידי מיקרוסקופ לשחזור משופר של מדידות. ניתן אמנם עשו את כל קביעות הגיל באמצעות בדיקה מיקרוסקופית של התאים, אנחנו מרגישים שזרימת גישת cytometry מאפשרת סינון מהיר של גורמים המשפיעים על חוסר יציבות הגנום תלוי גיל. בנוסף למדידת גיל תא באופן מהימן, שיקול צריך להיות נתון למספר חלוקות תא תאי אמא מותר לעבור עם כל סיבוב של גידול ומיון תאים רצוף. השתמש בגודל קטן יותר ראשוני אוכלוסייה או גדול יותר נפח תרבות יכול לאפשר לתאים לעבור יותר חלוקות תא לפני שהגיע לצפיפות התאים הרצויה. לדוגמא, חוקרים אחרים השתמשו רק בשני סבבי מיון להשיג תאים ישנים מאוד שמרים 16, שבו יש יתרון הברור של קבלת תאים ישנים עם פחות experimeצעדי פתיחות opening סגירות closures. כאשר שוקלים האם להגדיל נפח התרבות כדי לאפשר את התאים כדי להשלים יותר חלוקות תא לפני המיון, יש לזכור את המגבלה על המספר הכולל של תאים שיכולים להיות מעובד בעמודה אחת. השתמש של גדול יותר נפח תרבות עשוי להצריך שימוש בעמודות מרובות כדי למיין אוכלוסיית תא אחד. כמו כן, אם תאים עוברים פחות סיבובים של חלוקת תא בין נקודות מיני / אוסף, אז יש יותר הזדמנויות לצפות חריגות מתדרי מוטציה צפויות בנקודות זמן שונות במהלך תוחלת חיים. לדוגמא, דגימה רק בתחילה ונקודות זמן מאוחר במהלך תוחלת חיים עשויה לייצר נתונים המצביעים על עלייה מתמדת בשכיחות מוטציה, אבל דגימה בזמנים ביניים נוספים במהלך תוחלת חיים עשויים להראות כי עלייה בתדירות מוטציה במהירות ולאחר מכן מישורים. עם זאת, מאז פרוטוקול זה מבודד את תאי אמא ישנים, יש הזדמנות להשיג מדד ישיר יותר של שינויים בשיעורי מוטציה עם גיל. בדיקות תנודות יכולות bדואר מתבצע באמצעות תאי אמא בגילים שונים כדי לקבוע אם שיעור המוטציות יהיה שונה מהשיעור שהושג תוך שימוש בתאים צעירים. בעוד התרבויות לבדיקות תנודות אלה תהפוך לתערובת של תאים זקנים וצעירים כאשר הם גדלים, כל חריגה משיעורים שהושגו החל מתאים צעירים אפשר לייחס לשימוש באוכלוסיית המוצא מבוגר. היכולת להשיג reproducibly מספיק אוכלוסייה גדולה של תאי אמא של גילאים עד למדוד חוסר יציבות הגנום מדויק היא קריטית להצלחה של גישה זו. בעוד הפרוטוקול מתאר את השימוש במערכת מיון מגנטי מסוימת למטרה זו, קבוצות אחרות שמסודרות על תאי אמא של שמרים עם מערכות חלופיות 14,18 (ראה טבלה של חומרים). מערכות חלופיות כגון צריכה גם לעבוד בשיטה זו, אם כי עשויה להידרש כמה אופטימיזציה של הפרוטוקולים של היצרנים. ללא קשר למערכת הספציפית בשימוש, גודל האוכלוסייה דורשנבדל ד בהתאם לתדר של הסוג של סידור מחדש מוטציה או הגנום שנבחר למחקר. לכל הפחות, חייבת להיות מספיק תאי אם להשיג מושבה מוטציה אחת לפחות לכל אוכלוסייה לחישוב תדירות מוטציה. בפועל, תוצאות יכולות להיות די משתנים ולו רק אפס עד חמש מושבות מוטציה צפויות מגודל האוכלוסייה, ואפילו עלייה קטנה בגודל אוכלוסייה, ולכן כי חמישה עד עשר מושבות מוטציה צפויות, יכול לשפר את שחזור באופן משמעותי. כאשר יוטין תיוג אוכלוסייה מתחילה, התאוששות היעילות עבור כל סוג צריכה להילקח בחשבון כדי לסייע בזיהוי גודל האוכלוסייה המתאים דרוש כדי למדוד תדירות מוטציה בתאי אמא ישנות. עם התאוששות 90% מתאי אם לאחר כל סוג, רק 59% מהאוכלוסייה המקורית היו להיות התאוששו לאחר חמישה סבבים של צמיחה ומיון. זה יורד ל ~ התאוששות 33% מהאוכלוסייה המקורית לאחר חמישה סבבים של צמיחה ומיון אם רק 80% מתאי אמא שכותרתו להתאוששed במהלך כל סוג שהוא. מדידה ולמקסם את ההתאוששות היא חיונית כאשר מודדים אירועים בתדירות נמוכים, שכן 2:58 ירידה של פי גודל אוכלוסייה יכולה בקלות להוביל למספרים לא אמינים של מושבות מוטציה לאוכלוסייה. ישנם מספר רב של אפשרויות להרחבה או שינוי בפרוטוקול זה כדי להשיג הבנה רחבה יותר של חוסר יציבות הגנום במהלך הזדקנות תא mitotic. דוגמאות פשוטות כוללות ניתוח איך שינויים בפונקציות גן, שינויים בתקשורת, או שינויי מצב סביבתי אחרים לשנות את ההצטברות של מוטציות עם גיל. שיעורי מוטציה בתאים צעירים עם תפקוד גן שעבר שינוי או במצב המתאים יהיו נמדדו ומשמשים כדי לקבוע אם מוטציות מצטברות באופן שונה מהצפוי על ידי ערכי השיעור ואופן שונה מאשר באוכלוסיות תאי שליטה. אוכלוסיות תאים בנקודות שונות במהלך הזדקנות replicative עלולות להיחשף לגורמי לחץ מסוימים, כגון מיני חמצן תגובתי או סוכנים מזיקים DNA.חשיפה חולפת וקלה לסטרס חמצונים משמעותי לא שינתה את היכולת לבצע מיון תא (איור 3), אבל לחצים קשים יותר עלולים לסבך התאוששות של תאים. ניסויים ראשוניים יהיו צורך לוודא שעדיין יכולים להיות התאוששו תאי אמא ביעילות אחרי לחצים ספציפיים. בנוסף, המאפיינים התאיים של תאי אם מבודדים יכולים להיות מנותחים בפירוט, כוללים רמות של מיני חמצן מגיבים, מורפולוגיה של המיטוכונדריה וvacuolar, ומאפיינים פיסיולוגיים אחרים הקשורים להזדקנות 3. יתר על כן, תאי אמא יכולים להיות אוכלוסייה מתחילה לטיפול או מניפולציה נוסף. מאחר ותאים אם ובתה מופרדים פיזי במהלך ההליך, תאי הבת הם גם עדיין זמינים לניתוח. לדוגמא, שינויים במאפיינים פיסיולוגיים של תאי בת או הירושה סימטרית של מקרומולקולות הפגומה בין שמרי אם ותאי בת <sעד&gt; 24 יכולים להיות בהשוואה לעיתוי של שינויים מעניינים בתדרים / שיעורי מוטציה. יכולים גם להיות מושגת תדרי מוטציה לאוכלוסיות תאי בת על מנת לנסות לדגמן אם יש ירושה סימטרית של מוטציות במהלך הזדקנות replicative. לסיכום, שילוב של ההעשרה של תאי אם דרך תא מגנטי מיון עם בדיקות תנודות מאפשר את היתרונות של ס מערכת מודל cerevisiae להיות מיושמת ביעילות לחקר מנגנונים אחראים להצטברות של שינויים גנטיים במהלך הזדקנות תא mitotic.

מיקרואורגניזמים, כגון שמרי Saccharomyces cerevisiae, הם מודלים מצוינים לחקירת שיעורי מוטציה, אבל מודלים אלה לא נוצלו במלוא לחקור את ההצטברות של מוטציות במהלך הזדקנות mitotic של תאים. הצטברות מוטציות בגנום הגרעיני כבר שיערו לתרום להזדקנות על ידי וכתוצאה מכך אובדן ההדרגתי של (או וריאציה) פונקציות גן 1. היכולת להשתמש במערכת של חיידקים כדי לחקור את המנגנונים והשלכות של הצטברות מוטציות במהלך ההזדקנות עלול להאיץ את זיהוי של גורמים גנטיים וסביבתיים משפיעים על התהליך הזה, משום שמערכות גנטיות קלילה וקל לכימות שינויי פנוטיפי נדירים במיקרואורגניזמים רב. גורמי תיקון דנ&quot;א וחלבוני תגובת נזק לדנ&quot;א נשמרים היטב על פני מינים שונים 2, ודמיון יסודי בהזדקנות האורגניזם זוהה עבור אורגניזמים מגוונים כמו ס &#39; cerevisiaeיונקי ד 3, שהופכים אותו סביר להניח כי תוצאות שהתקבלו ממחקרים בשמרים יהיו רלוונטיות להזדקנות באורגניזמים רבים. מחקרים של ההזדקנות בס cerevisiae לעשות שימוש בשני מודלים הזדקנות המודדים הזדקנות כרונולוגית או הזדקנות replicative של תאים. הזדקנות כרונולוגית מאופיינת באובדן ההדרגתי של יכולת קיום באוכלוסיות שמרי תא שנמצאות במצב (שלב נייח) החלוקה הלא בשל דלדול מזין 3. מודל ההזדקנות הכרונולוגי כבר בשימוש על מנת להוכיח כי מוטציות מצטברות עם עלייה בגיל 4, שכן אוכלוסיות תאים גדולות מתקבלות בקלות במודל זה כדי לבצע בחירות פנוטיפי לתאים שעברו מוטציה. במקרה זה, הצטברות מוטציה מופיעה להיות מושפעת מסלולי איתות צמיחה וסטרס חמצונים 5, וכל אחד מהגורמים הללו הוא רלוונטי להבנת הזדקנות אאוקריוטים רב תאיים 3. מודל הזדקנות replicative מנצל divisi סימטריעל בין ס תאים אם ובתה cerevisiae לחקירת הזדקנות המתרחשת עם דורות תא רצופים 3. הזדקנות replicative שמרים כבר נמדדה לעתים קרובות באמצעות מיקרומניפולציה של אוכלוסיות קטנות של אמא ותאי בת, או יותר לאחרונה, באמצעות וידאו מיקרוסקופי של אוכלוסיות קטנות של תאי שמרים במכשירי microfluidic 6,7. גודל אוכלוסייה מוגבל לעשות גישות אלה אינם מתאימים לחקירת הצטברות מוטציה במהלך הזדקנות המיטוטי אלא אם כן מידע כלל הגנום מתקבל מהתאים בודדים או שינויים גנטיים גבוהה מאוד בתדירות נמדדים 8. רצף הגנום של תאים בודדים מספק ערכות נתונים משמעותיות לחקירת הצטברות מוטציות, אבל יש לי מערכות בחירת פנוטיפי היתרון החשוב של מתן אמצעי למדידת שיעורי מוטציה ללמוד מנגנוני צבירת מוטציה בסיסית. מחקרים כדי לבחון תדרי מוטציה ושיעורים דרך בחירות פנוטיפי בhaploiזני שמרי ד במהלך הזדקנות replicative טרם דווח. שיעורי מוטציה נפוצה נמדדים באמצעות בדיקות תנודות 9. ערכי תדירות מוטציה משקפים את המספר הכולל של תאי מחסה מוטציה ברצף גן באוכלוסייה. זה כולל תאים בי מוטציות עצמאיות להתרחש וכל צאצאים של אותם תאים שפשוט יורשים מוטציות קיימות מראש. בניגוד לכך, שיעורי מוטציה נמדדו באמצעות בדיקות תנודות מייצגים את מספר המוטציות עצמאיות שזה עתה להתעורר עם כל דור תא. בדיקות אלו בדרך כלל כרוכים בלחסן תרבויות לשכפל רבות בצפיפות תא נמוכה כדי להקטין את הסיכוי של הוספת תאים עם קיימות מראש מוטציות ברצף יעד, גדלו תרבויות לרוויה ליד, וזיהוי תאים שעברו מוטציה על ידי צמיחה במצע סלקטיבי. מספרם של תאים שעברו מוטציה שזוהו באוכלוסיות לשכפל משמש לאחר מכן באחד מכמה מודלים מתמטיים כדי להעריך את המספר שלימוטציות ndependent שעלו במהלך הצמיחה 9. השוואת מספר המוטציות עצמאיות לגודל האוכלוסייה הממוצע מספקת מדד של שיעור המוטציות. בס cerevisiae, תדרים ושיעורי מוטציה לעתים קרובות נמדדו באמצעות גני URA3 וCAN1, מאז מוטציות אובדן של פונקציה בגנים אלה לייצר פנוטיפים לבחירה. אובדן תפקוד URA3 הופך תאים עמידים ל5-fluoroorotic חומצה (5-פואה), מאז החלבון מקודד על ידי URA3 ממיר 5-פואה למולקולה רעילה 10. אובדן התפקוד של CAN1 מאפשר לתאים להפוך לעמידים בפני canavanine, אנלוגי ארגינין רעיל, מאז החלבון מקודד על ידי CAN1 משלוחי ארגינין וcanavanine לתאים 11. שני אסטרטגיות המיון הגנטיות ופיסיות כבר מועסקות בהצלחה להשיג אוכלוסיות גדולות יותר של ס &#39; תאי אם cerevisiae כדי להקל על חקירות של הזדקנות replicative. אסטרטגיות גנטיות כוללות גישות חכמות שתבחרנה נגד הישרדות תא בת באוכלוסייה. תכנית העשרת אמא (חבר הפרלמנט האירופי) כרוכה אינדוקציה בטא אסטרדיול ביטוי recombinase Cre רק בתאי בת, שמובילה לשיבוש בתו הספציפי של שני גנים חיוניים שהונדסו כדי להכיל אתרי loxP 12. ניתן לגדל זני חבר הפרלמנט האירופי, בדרך כלל בהיעדר inducer, אלא רק את תאי האם ימשיכו לחלק הבאים אינדוקציה, בעוד שתאי בת יעצרו בM-שלב בדרך כלל במהלך ההתקדמות הראשונה שלהם דרך מחזור 12 התא. בעוד מערכת זו לא נעשתה שימוש כדי ללמוד באופן רחב הצטברות מוטציה במהלך הזדקנות, זה כבר נעשה שימוש כדי ללמוד אובדן הטרוזיגוטיות, צורה תכופה יחסית של חוסר יציבות הגנום בזני שמרי דיפלואידי, כמו גם שינויים ביוכימיים בתאי אמא של הזדקנות 13,14. באופן דומה, מערכת הכלה arrester כרוך ביטוי בתו הספציפי של ס &#39; cereviגן siae URA3 15. זני הכלה arrester לגדול בדרך כלל עד 5-פואה מתווספת לבינונית, שבו תאי בת הנקודה להביע URA3 ימותו, ואילו תאי אם ימשיכו לגדול 15. אלה הם מערכות שימושיות להעשרה לתאי אמא, אבל הם תלויים בתחזוקה של פונקציות הגן, המהוות את מערכת הבחירה. מוטציות אקראיות ברכיב אחד או יותר של מערכת הבחירה עלולות לגרום לתאי בת שלהימלט הבחירה ולהתרבות באופן אקספוננציאלי. במהלך פיתוח של זני חבר הפרלמנט האירופי, בגדלים אוכלוסייה מתאימים היו נחושים בדעתו להימנע ממראית העין של תאי בת מוטציה שיכל לברוח הבחירה 12. עם זאת, מגבלה זו בגודל אוכלוסייה פוגעת בזיהוי של צורות נדירות של חוסר יציבות הגנום במהלך הזדקנות replicative. הגבלה זו על גודל אוכלוסייה ניתן להתגבר חלקית על ידי שימוש בזני שמרי דיפלואידי עם שני עותקים של כל גן תורמים למערכת הבחירה, שכן רובמוטציות עלולות להיות רצסיבי 12. עם זאת, שימוש בזני דיפלואידי מגביל את סוגי אירועי מוטאציות שניתן לאתר בקלות בהשוואה לאלו שניתן לאתר בקלות בתאי שמרים הפלואידים. אסטרטגיות מיון פיזיות כוללות בידוד של תאי אמא עם תא שטח שכותרתו מתאי בת ללא תווית להעשיר לאוכלוסיות גדולות של תאי אמא. התצפית שחלבוני פני השטח תא (דופן תא חלבונים) של ס &#39; תאי בת cerevisiae מסונתזים חדשים בניצנים נוצל לתייג תאי אמא בלי תיוג תאי הבת שהם מייצרים 16. לדוגמא, אוכלוסייה ראשונית של תאי שמרים שכותרתו על פני השטח שלהם עם ביוטין ניתן לגדל ולאחר מכן מבודדת מתאי הבת שלהם באמצעות microbeads אנטי ביוטין והמגנטי מיון 16 כי תאי הבת שנוצרו על ידי האוכלוסייה הראשונית לא יכילו ביוטין על פני השטח שלהם . וצמיחה סידורימיון מאפשר אוכלוסיות בהדרגה ישנות יותר של תאי אמא שתתקבל וינותחו. הליך זה שמש בהצלחה לבחינת שינויים בפיזיולוגיה של תא וביטוי גנים במהלך הזדקנות replicative של שמרים 13,14,17,18. השיטה הנוכחית מתאים את עצמו תיוג ביוטין זה וטכניקת מיון מגנטית להעשיר עבור תאי אמא עם צורך מדידת ההצטברות של מוטציות שעלולים להיות נדירות או צורות אחרות של חוסר יציבות הגנום assayed באמצעות בחירות פנוטיפי. צמיחה סידורי ומיון פיזי מאפשרים ניתוח של הצטברות מוטציות בתאי אמא בהדרגה מבוגרת, כמו גם באוכלוסיות תאי הבת שלהם. קביעת שיעורי מוטציה לדור מאפשרת תדירות מוטציה צפויה תחושב עבור תאי אמא שעברו מספר מסוים של חלוקות תא. מאחר וערכי תדירות חזו מבוססים על הגידול הצפוי בשל סיבובים נוספים של חלוקת תא, סטיות משמעותיות בmutati נצפהעל תדרים בהשוואה לערכים החזויים לספק ראיות לגיל ספציפי שינויים בשער של מוטציות מצטברות. שימוש בפרוטוקול זה, מכתים ניאון של צלקות ניצן שמתאימות לאתרים של חלוקות תא בתאי אמא בשילוב עם ניתוח על ידי cytometry זרימה יכול לשמש כדי לקבוע את התפלגות הגילים של אוכלוסייה ממוינת ולא ממוינת במהירות. ריאגנטים נוספים ניאון, כגון אלו המשמשים לאיתור מיני חמצן תגובתי, יכולים גם להיות מנוצלים במהלך פרוטוקול זה. בסך הכל, פרוטוקול זה מאפשר ניתוח יעיל של גיל תלוי שינויים בחוסר יציבות הגנום עם הפוטנציאל למתאם הלקשורות לגיל שינויים פיסיולוגיים תא באורגניזם מודל מתאים ללימוד הגורמים הגנטיים וסביבתיים המשפיעים על חוסר יציבות הגנום הקשורות להזדקנות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="802">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:108px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:359px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td style="width:108px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21335</td>
			<td style="width:359px;">100mg</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-Biotin Microbeads</td>
			<td style="width:108px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-485</td>
			<td style="width:359px;">2ml MicroBeads conjugated to monoclonal mouse anti-biotin antibodies (isotype: mouse IgG1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MACS LS columns</td>
			<td style="width:108px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td style="width:359px;">25 columns suitable for QuadroMACS separator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QuadroMACS separator</td>
			<td style="width:108px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-976</td>
			<td style="width:359px;">Separator Only</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">QuadroMACS Starting Kit</td>
			<td style="width:108px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-091-051</td>
			<td style="width:359px;">Includes:&#160; QuadroMACS Separator (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), LS Columns (130-042-401), MACS 15ml Tube Rack (130-091-052), One 2ml unit of MACS MicroBeads. Note: Alternative systems include Dynabeads Biotin Binder and MagnaBind Magnetic Beads</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BD Falcon Cell Strainer, 40 &#181;m</td>
			<td style="width:108px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td style="width:359px;">40 &#181;m for use with BD Falcon 50 ml Conical Tubes.&#160; 50 per pack</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6146</td>
			<td style="width:359px;">Powder, filtering after dissolving important to remove particulates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wheat germ agglutinin Alexa Fluor488</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">W11261</td>
			<td style="width:359px;">Conjugates with different excitation/emission spectra could also be used</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">P36930</td>
			<td>10 ml, other antifade reagents could also be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining magnetic sorting of mother cells and fluctuation tests to analyze genome instability during mitotic cell aging in saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae כבר מערכת מודל מצוינת לבחינת מנגנונים והשלכות של חוסר יציבות הגנום. המידע שנצבר משמרי מודל זה הוא רלוונטי לאורגניזמים רבים, כולל בני אדם, שכן גורמי תיקון DNA ותגובת הנזק לדנ&quot;א נשמרים גם בין זנים שונים. עם זאת, ס &#39; cerevisiae עדיין לא היה בשימוש כדי לטפל באופן מלא אם שיעור צבירת מוטציות שינויים עם replicative (mitotic) עלייה בגיל עקב אילוצים טכניים. לדוגמא, מדידות של אורך חיים replicative שמרים באמצעות מיקרומניפולציה כרוכות אוכלוסיות קטנות מאוד של תאים, האוסרות על גילוי של מוטציות נדירות. שיטות גנטיות כדי להעשיר לתאי אמא באוכלוסיות על ידי גרימת מוות של תאי בת פותחו, אבל בגדלים אוכלוסייה עדיין מוגבלים על ידי התדירות שבה מוטציות אקראיות שתתפשרנה מערכות הבחירה להתרחש. הפרוטוקול הנוכחי מנצל sorti המגנטיng של תאי שמרי אמא שכותרתו משטח להשיג מספיק אוכלוסיות גדולות של הזדקנות תאי אם לכמת מוטציות נדירות דרך בחירות פנוטיפי. שיעורי מוטציה, שנמדדו באמצעות בדיקות תנודות, ותדרי מוטציה הוקמו ראשון לתאים צעירים ומשמשים כדי לחזות את תדירות מוטציות בתאי אמא של גילאי replicative שונים. תדרי מוטציה לאחר מכן נקבעו לתאים ממוינים אמא, והגיל של תאי אמא נקבע באמצעות cytometry זרימה על ידי צביעה עם מגיב ניאון שמזהה צלקות ניצן נוצרו על משטחי התא שלהם בעת חלוקת תא. השוואה של תדרי מוטציה חזו מבוססים על מספר חלוקות תא לתדרים בניסוי נצפו עבור תאי אמא של גיל replicative נתון יכולה אז לזהות אם יש הקשורות לגיל שינויים בשער של מוטציות מצטברות. וריאציות של פרוטוקול בסיסי זה מספקות את האמצעים כדי לחקור את ההשפעה של שינויים בפונקציות גן ספציפיים אותנאים סביבתיים ספציפיים על הצטברות מוטציות כדי לטפל במנגנוני חוסר יציבות הגנום בסיסי במהלך הזדקנות replicative.

Watch this Scientific Journal Video about Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.c

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

שיעורי מוטציה בתאי cerevisiae Saccharomyces הצעיר נמדדו באמצעות בדיקות תנודות משמשים כדי לחזות תדרי מוטציה בתאי אמא של גילאי replicative שונים. מיון וcytometry זרימה מגנטי משמש לאחר מכן למדידת תדרי מוטציה בפועל וגיל של תאי אם לזהות כל חריגה מתדרי מוטציה חזו.

שילוב מיון מגנטי של תאי אמא ומבחני תנודות לנתח חוסר יציבות הגנום במהלך הזדקנות תא mitotic ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

combining-magnetic-sorting-mother-cells-fluctuation-tests-to-analyze

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

12.5K Views.  Rensselaer Polytechnic Institute.  שיעורי מוטציה בתאי cerevisiae Saccharomyces הצעיר נמדדו באמצעות בדיקות תנודות משמשים כדי לחזות תדרי מוטציה בתאי אמא של גילאי replicative שונים. מיון וcytometry זרימה מגנטי משמש לאחר מכן למדידת תדרי מוטציה בפועל וגיל של תאי אם לזהות כל חריגה מתדרי מוטציה ח?...

Video: Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Dissection של Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoproteomics כמותיים חומצת שומן מגורה Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray ניתוח עבור Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

שלפוחיות בתיווך זיקה ליפידים כרומטוגרפיה באמצעות Cell מגנטי מיון פעיל (LIMACS): שיטה חדשה לנתח חלבון, שומנים אינטראקציה

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור Mitophagy ניטור השמרים Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

ביטוי וטיהור של חלבון פיברוזיס פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור מוליכות ב Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging

Aging tissue is characterized by a continuous decline in functional ability. Adult stem cells are crucial in maintaining tissue homeostasis particularly in tissues that have a high turnover rate such as the intestinal epithelium. However, adult stem cells are also subject to aging processes and the concomitant decline in function. The Drosophila midgut has emerged as an ideal model system to study molecular mechanisms that interfere with the intestinal stem cells&#8217; (ISCs) ability to function in tissue homeostasis. Although adult ISCs can be easily identified and isolated from midguts of young flies, it has been a major challenge to study endogenous molecular changes of ISCs during aging. This is due to the lack of a combination of molecular markers suitable to isolate ISCs from aged intestines. Here we propose a method that allows for successful dissociation of midgut tissue into living cells that can subsequently be separated into distinct populations by FACS. By using dissociated cells from the esg-Gal4, UAS-GFP fly line, in which both ISCs and the enteroblast (EB) progenitor cells express GFP, two populations of cells are distinguished based on different GFP intensities. These differences in GFP expression correlate with differences in cell size and granularity and represent enriched populations of ISCs and EBs. Intriguingly, the two GFP-positive cell populations remain distinctly separated during aging, presenting a novel technique for identifying and isolating cell populations enriched for either ISCs or EBs at any time point during aging. The further analysis, for example transcriptome analysis, of these particular cell populations at various time points during aging is now possible and this will facilitate the examination of endogenous molecular changes that occur in these cells during aging.

Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging

Understanding the endogenous molecular changes in adult stem cells during aging requires isolating the cells of interest. The method described here presents a simple and robust approach to enrich for and isolate Drosophila intestinal stem cells and the enteroblast progenitor cells by FACS at any time point during aging.

בידוד תאי גזע ממעיים למבוגרים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; Midguts ידי FACS ללמוד את התנהגות תאי גזע במהלך הזדקנות

Aging tissue is characterized by a continuous decline in functional ability. Adult stem cells are crucial in maintaining tissue homeostasis particularly ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.