Die Autoren möchten die Developmental Studies Hybridoma der Bank an der University of Iowa danken für die Zusendung Antikörper. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium (Nr. 29/08) von der Israel Science Foundation unterstützt. AS wird auch durch ein Forschungsstipendium der DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) gefördert.

Bevor Sie beginnen <ol><li> Wachsen Sie die gewünschten fly Kulturen. Die Durchstechflaschen nicht überfüllt (ca. 30 Fliegen pro 50 ml Fläschchen). Lassen Sie die Fliegen legen ihre Eier nur für einen Tag in jedem Fläschchen. Dies wird den Larven ausreichende Versorgung mit Lebensmitteln und ihnen zu ermöglichen maximale Größe vor kriecht aus der Nahrung in Kontakt kommen. Die Durchstechflaschen im entsprechenden Temperatur bis zum dritten Larvenstadium, um auf dem Fläschchen Wand wandern beginnen. </li><li> Bereiten Sie einen frischen Vorrat an Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) und PBT (0,1% Tween in PBS). Halten 10 ml PBS auf Eis. </li><li> Bereiten Sie 1-5 ml frisches Fixativ (4% Formaldehyd in PBT) und halten Sie sie auf Eis. Wir verwenden in Flaschen 37-38% Formaldehyd als Stammlösung. </li></ol> 1. Dissection und Fixierung von Dritten Larvenstadium <ol><li> Wählen Sie einen wandernden dritten Larvenstadium aus dem Fläschchen Wand und legen Sie sie in einem 50 ul Tropfen eiskaltem PBS auf einer Platte Sylgard Dissektion (aus Sylgard 184 Silikon-Elastomer-Kit, Dow Corning Corporation in einGewebekulturschale). </li><li> Halten Sie die Larve, dorsal oben, nahe der Mündung Haken, mit feinen Pinzetten (Dumont Nr. 5 Zangen), und kleben Sie ein Insekt Stift (minutien, 0,1 mm, Edelstahl) durch die Larve des Gehirns. </li><li> Besorgen Sie sich die hintere Ende der Larve mit der Zange, ziehen Sie vorsichtig und sanft dehnen die Larve der Länge nach. Kleben Sie ein anderes Insekt Stift zwischen den beiden hinteren Luftlöcher. </li><li> Mit Feder Schere zwei horizontale Schnitte in der Körperwand (senkrecht zu der Vorwärts-Rückwärts-Achse), in der Nähe der vorderen und hinteren Stiften. </li><li> Mit den Frühling Schere die larvalen Körper Mauer entlang der dorsalen Mittellinie von der vorderen bis zum hinteren Einschnitt. </li><li> Entfernen der inneren Organe (Darm, Speicheldrüsen, Malpighischen Gefäße etc.) und die Luftröhre mit einer feinen Pinzette. Waschen Sie sanft ein-oder zweimal mit PBS. </li><li> Besorgen Sie sich die zwei Karosserievarianten Wandklappen mit einer Pinzette, strecken sie aus und hänge sie an der Platte mit Hilfe von zwei Insektennadeln für jede Seite. </li><li> Entfernen Sie den PBS und 50 ul der Fixierlösung (4% Formaldehyd in PBT). Inkubieren 20 min bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie das Fixativ. Zweimal mit PBS waschen. Ziehen Sie die Insektennadeln. Mit einer Schere geschnitten Frühjahr die Larven Kopf und Schwanz Verlassen eines rechteckigen Filet. Übertragen Sie das feste Gewebe auf ein gekühltes Eppendorf-Röhrchen mit PBS. </li><li> Sobald eine ausreichende Anzahl von Larven befestigt sind, kann man direkt weiter Antikörperfärbung. Wenn eine sofortige Färbung nicht erwünscht ist, sollte der feste Larven 3 Mal für jeweils 5 Minuten mit 95% Ethanol gewaschen und aufbewahrt werden in 95% Ethanol bei -20 ° C </li></ol> 2. Dissection und Fixierung der Puppen Teil I <ol><li> Kümmern Sie sich um den Fläschchen als für Larven Fixierung, bis dritten Larvenstadium zu pupariate beginnen. Untersuchen Sie die Vials pro Stunde und Mark, die Larven haben pupariated. Lassen Sie die markierten Puppen auf 30-40 Stunden bei 24 ° C oder 24-27 Stunden zu entwickeln bei 29 ° C. </li><li> Mit feinen Pinzetten holen 20-30 Puppen von the entsprechenden Alter und steckte sie in einen dunklen Porzellan Multi-Well-Sezieren Gericht. Achten Sie darauf, das Gewebe von Interesse zu beschädigen. </li><li> Entpacken Sie die Puppen aus der Puppenhülle. Beginnen Sie mit dem Abziehen des Operculum und weiter, bis die Puppe ist kostenlos. Legen Sie die Puppe in einen Brunnen mit PBT gefüllt. Weiter Extrahieren all die Puppen. Steps 2,4-2,6 sollte in kleinen Chargen von fünf Puppen zu einer Zeit durchgeführt werden. </li><li> Legen Sie fünf Puppen auf einer ebenen Fläche zwischen dem Brunnen des Sezieren Gericht. Mit einem Messer geschnitten Mikrodissektion die Spitze des Kopfes und der hinteren Spitze des Bauches (alternativ ist es möglich, zwei Paare von Zangen verwenden, um Löcher an beiden Enden der Puppe reißen). </li><li> Halten Sie die Puppe an Ort und Stelle mit einer feinen Pinzette und verwenden Sie ein 1 ml-Spritze zum Auswaschen der inneren Organe der Puppe, durch Einspritzen von PBT durch die vordere Öffnung. </li><li> Waschen Sie den sezierten Puppe kurz durch Eintauchen in eine gut mit PBS gefüllt und verschieben Sie sie in die kalte Fixativ in ein Eppendorf-Röhrchen auf Eis gehalten. </li><li> Über Nacht (ON) bei 4 ° C </li></ol> Teil II <ol start="8"><li> Entsorgen Sie das Fixativ und waschen die Puppen dreimal je 5 Minuten, mit PBT. Halten Sie die gewaschenen Puppen auf dem Eis. </li><li> Füllen Sie zwei Vertiefungen der Sezieren Gericht mit PBT. Verwendung einer Polyethylen Pasteurpipette Übertragung mehreren Puppen einem der Vertiefungen. </li><li> Bewegen um eine Puppe zu einer Zeit, in der zweiten Wanne. Mit zwei Paar scharfe Zange mit perfekt ausgerichtet Tipps, ziehen Sie die transparente Puppenstadium Kutikula des Flügels: Sicherung der Puppe auf den Grund des Brunnens mit einer Pinzette, sanft und reißen die Nagelhaut mit dem zweiten Pinzette. Sobald die Nagelhaut gerissen ist, diese abziehen des Flügels. Achten Sie darauf, um den Flügel aus der Puppe trennen. Nach Abziehen des Nagelhaut vom Flügel Klinge, Peeling weiterhin die Schuppenschicht des Flügels Scharnier (wo die Flügel Chos befinden). </li><li> Nach Abziehen des Flügels Cuticula, kann man versuchen Abziehen des Schenkels Cuticula in einer ähnlichen Weise.Viele Beine sind wahrscheinlich in den Prozess verloren, aber trotz der geringen Ausbeute, dieser Schritt ist sehr zu empfehlen, da es stark verbessert die Färbung von Chos Bein. Die Chos des Haltere und Bauch kann ohne weiteres Abziehen der Cuticula sichtbar gemacht werden. </li><li> Platzieren Sie den &quot;geschält&quot; Puppe in ein Eppendorf-Röhrchen mit Methanol gefüllt und bei Raumtemperatur aufbewahren. Weiter Abziehen der Kutikula von all den Puppen, und fügen Sie sie dem gleichen Rohr. Mindestens 10 schön geschält Puppen sollten für jede Färbung gesammelt werden. </li><li> Entfernen Sie das Methanol und dreimal für jeweils 5 Minuten, mit 95% Ethanol. Feste Puppen können für längere Zeit in 95% Ethanol bei -20 ° C aufbewahrt werden </li></ol> 3. Immunfärbung von Larven und Puppen <ol><li> Waschen des fixierten Gewebes mit PBT dreimal jeweils 30 Minuten bei Raumtemperatur. Larven können unter leichtem Schütteln auf einer rotierenden Platte gewaschen werden. Die Puppen sind ohne Schütteln gewaschen. </li><li> Ersetzen Sie das PBT mit Blocking-Puffer (PBT + 5% nOrmal Ziegenserum) und inkubieren ON bei 4 ° C </li><li> Entfernen Sie die Blockierung Puffer und Inkubation mit primären Antikörpern (verdünnt in Blocking-Puffer) ON bei 4 ° C </li><li> Mal Waschen mit PBT, wie in Schritt 3.1. </li><li> Entfernen Sie die PBT und inkubieren mit Sekundärantikörper (verdünnt in Blocking-Puffer) ON bei 4 ° C </li><li> Waschen zweimal mit PBT und einmal mit PBS, wie in Schritt 3.1. </li><li> Ersetzen Sie das PBS mit Eindeckmedium (Dako Fluorescent Mounting Medium (Dako Cytomation, Glostrup, Dänemark) und inkubieren Sie bei 4 ° C auf. </li></ol> 4. Montage der Larven <ol><li> Die Larven werden auf einem Objektträger in einem Tropfen Eindeckmittel mit ihrer Kutikula nach unten und Körperwand Muskeln nach oben montiert. Setzen Sie einen kleinen Tropfen Eindeckmedium auf einem sauberen Deckglas und verwenden es, um die Herstellung zu decken. Wenden Sie keine Druck auf die Larven montiert. </li></ol> 5. Montage der Puppen <ol><li> Bereiten Sie zwei Objektträgermit einem Tropfen Eindeckmedium, eine für Zerlegung und den zweiten für die Montage. </li><li> Setzen Sie mehrere Puppen auf einem der Dias. </li><li> Mit Hilfe einer Schere entfernen Frühjahr den Kopf und den hinteren Teil des Bauches. </li><li> Trennen Sie die dorsale Hälfte des Thorax aus der ventralen Hälfte, indem zwischen den Flügeln und den Beinen. </li><li> Legen Sie die sezierten Körperteile der Puppe auf der zweiten Objektträger in einem Tropfen Montagelösung. Sicherstellen, dass die Flügel und Beine gestreckt werden und versuchen, Überlagerung von Gewebe so weit wie möglich zu minimieren. </li><li> Geben Sie einen Tropfen Eindeckmedium auf einem Deckglas und legen Sie es über der Probe. Üben Sie keinen Druck auf die Probe montiert. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für Immuno-gefärbten Chos der dritten Larvenstadium ist in Abbildung 1 dargestellt. Dieses Beispiel zeigt eine schön gedehnt Abdominalsegment, in dem sieben der acht Chos sind deutlich sichtbar. Neuronen sind LaboreLED mit MAb22C10 (1:20, aus der Developmental Studies Hybridoma der Bank an der University of Iowa erhalten);. die Kappe, Band, Mütze und Band-Befestigung Befestigung Zellen werden mit anti-αTub85E (1:10, Klein et al beschriftet, 2010). Sekundärantikörper für Fluoreszenzfärbung waren Cy3, Cy5-konjugierten oder anti-mouse/rabbit (1:200, Jackson Immunoresearch Laboratories). Die Proben wurden unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie (LSM 510, Zeiss). Ein Cluster von Flügel Chos am ventralen radiale Vene eines 35 h alte Puppe ist in Abbildung 2 dargestellt. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3846/3846fig1.jpg" /> Abbildung 1 (A) Schematische Darstellung der sechs Zelltypen, die eine einzelne Ch Orgel darstellen:. Vakuumierkappe (CA), Kappe (C), scolopale (S), Neuron (N), Band (L) und Lig. Befestigung (LA ). Die LCh5 Organ, in dem fünf Chos gruppiert sind, wird über die Gruppe der lateralen Quermuskeln (LT gestreckt1-4). Die laterale Längsmuskulatur (LL1), ventrale Längsmuskeln (VL1-4) und seitlichen schrägen Muskel (LO1) sind ebenfalls dargestellt. Tendon-Zellen werden als braune Kugeln (Entnommen aus Klein et al., 2010) dargestellt. (B) Ein Abdominalsegment eines dritten Larvenstadium mit einer 10X Vergrößerung betrachtet. Sieben der acht Chos, die in jedem Abdominalsegment liegen auf der Hand: fünf seitlichen Organe, die zusammen den pentascolopidial Orgel (LCh5), einen einzigen seitlichen Orgel (LCh1) und einer der beiden ventralen Chos (VChB). Die Neuronen (N) der Chos mit den neuronalen Marker MAb 22C10 (rot) markiert. Das Ligament (L), Kappe (C) und Befestigung Zellen (LA, CA) mit markierten Anti-αTub-85E (blau). Die Kappe und Lig. Zellen sind zusätzlich mit einer CHO-spezifischen GFP-Reporter beherbergen ein regulatorisches Element aus dem dei Locus (Nachman et al., Unveröffentlichte Daten) beschriftet. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3846/3846fig2.jpg" /> Abbildung 2. </sTrong&gt; Die Flügel Chordotonalorganen am ventralen Vene radiale werden bei einer 40-facher Vergrößerung betrachtet. Die Neuronen (N) mit den neuronalen Marker 22C10 (Rot, B) gekennzeichnet. Das Band (L) und der Kappe (C)-Zellen werden mit anti-Antikörper αTub85E (Blue, C) und einer CHO-spezifischen GFP-Reporter-Transgen (Nachman et al., Unveröffentlichte Daten) zusammen markiert.

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E., Cantera, R., Urban, J., Technau, G., Kafatos, F. C., Barrio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spalt+modifies+EGFR-mediated+induction+of+chordotonal+precursors+in+the+embryonic+PNS+of+Drosophila+promoting+the+development+of+oenocytes.">Spalt modifies EGFR-mediated induction of chordotonal precursors in the embryonic PNS of Drosophila promoting the development of oenocytes.</a> Development. 128, 711-722 (2001).</li><li>Todi, S. V., Sharma, Y., Eberl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+and+molecular+design+of+the+Drosophila+antenna+as+a+flagellar+auditory+organ.">Anatomical and molecular design of the Drosophila antenna as a flagellar auditory organ.</a> Microsc. Res. Tech. 63, 388-399 (2004).</li><li>zur Lage, P., Jarman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+of+EGFR+and+notch+signalling+in+the+reiterative+recruitment+of+Drosophila+adult+chordotonal+sense+organ+precursors.">Antagonism of EGFR and notch signalling in the reiterative recruitment of Drosophila adult chordotonal sense organ precursors.</a> Development. 126, 3149-3159 (1999).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Das Protokoll in diesem Video beschrieben bietet eine Möglichkeit, propriozeptiven Chos während Larven und Puppen Stufen sichtbar zu machen. Studien über die Struktur und Entwicklung der propriozeptiven Chos wurden bisher hauptsächlich zur Gewinnung von embryonalen Stadien und larvalen Imaginalscheiben beschränkt. So viele Aspekte der späteren Stadien der Entwicklung, der sowohl juvenilen und adulten Chos, weitgehend unbekannt. Das beschriebene Protokoll, mit gemeinsamen genetischen Werkzeuge in Drosophila kombiniert wird, kann genutzt werden, um zu identifizieren und studieren neue Gene und Signalwege, die eine Rolle in späteren Stadien der Entwicklung Chos werden. Dieses Protokoll wurde für die Visualisierung von CHO optimiert, aber es kann für die Färbung von anderen Geweben, wie Puppen Flügel 6 angepasst werden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes / Werkzeug </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Dumont # 5 (oder # 55) Zangen, Biologie Spitze </td><td> FST </td><td> 11252-20 oder 11252-10 (Oder ähnlich Zange) </td><td></td></tr><tr><td> Austerlitz Edelstahl Insektennadeln, minutiens 0.1mm </td><td> Roboz Surgical Instrument Co </td><td> RS-6083 bis 10 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 Siliconelastomer Kit </td><td> Dow Corning Corporation </td><td> 240.4019862 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas Mikro-Schere (gerade, 7,5 cm, Klinge 3mm) </td><td> AS Mdeizintechnik GmbH </td><td> 11-590-00 </td><td> Vannas Frühling Schere mit identischen technischen Daten sich von Roboz Surgical Instrument Co. erworben werden </td></tr><tr><td> Orbitalschüttler - Rotamax-120 </td><td&gt; Heidolph </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Dako Fluorescent Mounting Medium </td><td> Dako Cytomation, Glostrup, Dänemark </td><td> DK-5302392 </td><td></td></tr><tr><td> X10 PBS Formulierung </td><td colspan="2"> 2 gr / lit KCl, 2 gr / lit KH 2 PO 4, 80 gr / lit NaCl, 21,7 gr / lit Na 2 HPO4.7H 2 O </td><td> Die Qualität der PBS ist entscheidend für den Erfolg dieses Protokolls </td></tr><tr><td> PBT </td><td colspan="2"> X1 PBS + 0,1% Tween 20 </td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of proprioceptors in drosophila larvae and pupae

Propriozeption ist die Fähigkeit, die Bewegung oder Position von Körperteilen, indem sie auf Reize, die sich innerhalb des Körpers zu erfassen. In Fruchtfliegen und andere Insekten Propriozeption wird von spezialisierten Sinnesorgane bezeichnet Chordotonalorganen (chos) 2 zur Verfügung gestellt. Wie viele andere Organe in Drosophila, entwickeln Chos zweimal während des Lebenszyklus der Fliege. Zuerst entwickeln sich die Larven Chos während der Embryogenese. Starten Sie dann die erwachsenen Chos in den larvalen Imaginalscheiben entwickeln und auch weiterhin während der Metamorphose zu unterscheiden. Die Entwicklung der Larven Chos während der Embryogenese wurde ausgiebig studiert 10,11,13,15,16. Das Herzstück eines jeden Cho ist eine sinnliche Einheit eines Neurons und einem scolopale Zelle zusammen. Die sensorische Einheit wird zwischen zwei Arten von akzessorischen Zellen, die an der Kutikula über spezialisierte epidermalen Zellen 1,9,14 Befestigung anbringen gestreckt. Wenn ein Larve bewegt, die relative Verschiebung der Epidermal Anlage Zellen führt zu einer Dehnung des sensorische Einheit und damit Öffnung bestimmter transient receptor potential vanilloid (TRPV) Kanäle an der äußeren Segment des Dendriten 8,12. Die ausgelöste Signal wird dann an den Bewegungsapparat CPG Schaltung in das zentrale Nervensystem übertragen. Mehrere Chos in der erwachsenen Fliege 7 beschrieben. Diese werden in der Nähe der Gelenke der erwachsenen Fliege Ansätze (Beine, die Flügel und Halfter) und in der Brust und Bauch liegt. Darüber hinaus wurden mehrere hundert Chos bilden gemeinsam die Johnston Organ beim Erwachsenen Antenne, transduzieren akustische, mechanische Energie 3,5,17,4. Im Gegensatz zu dem umfangreichen Wissen über die Entwicklung der Chos in embryonalen Stadien, wird sehr wenig über die Morphologie dieser Organe während der Larvenstadien bekannt. Darüber hinaus, mit Ausnahme der femoralen Chos 18 und Johnston Organ, unseren KenntnissenGE über die Entwicklung und Struktur der Chos in der erwachsenen Fliege ist sehr lückenhaft. Hier beschreiben wir eine Methode zur Färbung und Visualisierung in Chos dritten Larvenstadium Larven und Puppen. Diese Methode kann zusammen mit genetischen Werkzeugen aufgetragen werden, um besser zu charakterisieren und zu verstehen, die Morphologie, die Entwicklung der verschiedenen Chos in-the-fly.

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Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Eine Methode zur Immunfärbung und visualisieren Chordotonalorganen in Larven und Puppen von<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Beschrieben.

Visualisierung von Propriozeptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven und Puppen

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

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Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

Visualisierung von Larven segmentalen Nerven in 3 Rd Instar Drosophila Larven Vorbereitungen

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

Forschung

Neurowissenschaften

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

Visualisierung des embryonalen Nervensystems in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

In-vivo-Visualisierung von synaptischen Vesikeln Innerhalb Drosophila Larven Segmentale Axone

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-Cell-Imaging von Sinnesorgan Vorläuferzellen im Intact Drosophila Puppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.
The Drosophila larva is an established model system to study thermal nociception, a sensory response to potentially harmful temperatures that is evolutionarily conserved across species1,2. The advantages of Drosophila for such studies are the relative simplicity of its nervous system and the sophistication of the genetic techniques that can be used to dissect the molecular basis of the underlying biology4-6 In Drosophila, as in all metazoans, the response to noxious thermal stimuli generally involves a "nocifensive" aversive withdrawal to the presented stimulus7. Such stimuli are detected through free nerve endings or nociceptors and the amplitude of the organismal response depends on the number of nociceptors receiving the noxious stimulus8. In Drosophila, it is the class IV dendritic arborization sensory neurons that detect noxious thermal and mechanical stimuli9 in addition to their recently discovered role as photoreceptors10. These neurons, which have been very well studied at the developmental level, arborize over the barrier epidermal sheet and make contacts with nearly all epidermal cells11,12. The single axon of each class IV neuron projects into the ventral nerve cord of the central nervous system11 where they may connect to second-order neurons that project to the brain.
Under baseline conditions, nociceptive sensory neurons will not fire until a relatively high threshold is reached. The assays described here allow the investigator to quantify baseline behavioral responses or, presumably, the sensitization that ensues following tissue damage. Each assay provokes distinct but related locomotory behavioral responses to noxious thermal stimuli and permits the researcher to visualize and quantify various aspects of thermal nociception in Drosophila larvae. The assays can be applied to larvae of desired genotypes or to larvae raised under different environmental conditions that might impact nociception. Since thermal nociception is conserved across species, the findings gleaned from genetic dissection in Drosophila will likely inform our understanding of thermal nociception in other species, including vertebrates.

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.

Lokale und globale Methoden zur Beurteilung der thermischen Nozizeption in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

Appetitive Assoziative olfaktorischen Lernens in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer basic questions on how light information is processed and shared between rapid and circadian behaviors. Drosophila larvae display a stereotypical avoidance behavior when exposed to light. To investigate light dependent behaviors comparably simple light-dark preference tests can be applied. In vertebrates and arthropods the neural pathways involved in sensing and processing visual inputs partially overlap with those processing photic circadian information. The fascinating question of how the light sensing system and the circadian system interact to keep behavioral outputs coordinated remains largely unexplored. Drosophila is an impacting biological model to approach these questions, due to a small number of neurons in the brain and the availability of genetic tools for neuronal manipulation. The presented light-dark preference assay allows the investigation of a range of visual behaviors including circadian control of phototaxis.

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Here we describe a light-dark preference test for Drosophila larva. This assay provides information about innate and circadian regulation of light sensing and processing photobehavior.

Licht Vorlieben Assay zur angeborenen und Circadian geregelten Photobehavior in Studie<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the underlying neuronal components in the circuits1-6. Application of optogenetics7,8 in the larval neural circuit allows us to manipulate neuronal activity in spatially and temporally patterned ways9-13. Typically, specimens are broadly illuminated with a mercury lamp or LED, so specificity of the target neurons is controlled by binary gene expression systems such as the Gal4-UAS system14,15. In this work, to improve the spatial resolution to "sub-genetic resolution", we locally illuminated a subset of neurons in the ventral nerve cord using lasers implemented in a conventional confocal microscope. While monitoring the motion of the body wall of the semi-intact larvae, we interactively activated or inhibited neural activity with channelrhodopsin16,17 or halorhodopsin18-20, respectively. By spatially and temporally restricted illumination of the neural tissue, we can manipulate the activity of specific neurons in the circuit at a specific phase of behavior. This method is useful for studying the relationship between the activities of a local neural assembly in the ventral nerve cord and the spatiotemporal pattern of motor output.

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Here we describe a protocol for optogenetic manipulation of motoneuronal activity while monitoring changes in motor output (muscle contraction) in semi-intact Drosophila larvae using lasers within a conventional confocal microscope. This technique enables researchers to achieve local perturbation of neural activity in a few neuromeres to elucidate the dynamics of motor circuits.

Optogenetische Störung der neuronalen Aktivität mit Laser Illumination in Semi-intakt<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral variation. The larval path-length assay was developed to measure individual differences in foraging behavior that were later linked to the foraging gene. Larval path-length is an easily scored trait that facilitates the collection of large sample sizes, at minimal cost, for genetic screens. Here we provide a detailed description of the current protocol for the larval path-length assay first used by Sokolowski. The protocol details how to reproducibly handle test animals, perform the behavioral assay and analyze the data. An example of how the assay can be used to measure behavioral plasticity in response to environmental change, by manipulating feeding environment prior to performing the assay, is also provided. Finally, appropriate test design as well as environmental factors that can modify larval path-length such as food quality, developmental age and day effects are discussed.

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

We provide a detailed protocol for a Drosophila melanogaster foraging path-length assay. We discuss the preparation and handling of test animals, how to perform the assay and analyze the data.

Futter suchen Pfad-Länge-Protokoll für<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larvae

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

Neuartige Assay für kalte Nozizeption in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

Visualisierung von Propriozeptoren in

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Visualisierung von Larven segmentalen Nerven in 3^Rd Instar Drosophila Larven Vorbereitungen

Visualisierung des embryonalen Nervensystems in Whole-mount Drosophila Embryos

In-vivo-Visualisierung von synaptischen Vesikeln Innerhalb Drosophila Larven Segmentale Axone

Live-Cell-Imaging von Sinnesorgan Vorläuferzellen im Intact Drosophila Puppen

Lokale und globale Methoden zur Beurteilung der thermischen Nozizeption in

Appetitive Assoziative olfaktorischen Lernens in

Licht Vorlieben Assay zur angeborenen und Circadian geregelten Photobehavior in Studie

Optogenetische Störung der neuronalen Aktivität mit Laser Illumination in Semi-intakt

Futter suchen Pfad-Länge-Protokoll für

Neuartige Assay für kalte Nozizeption in