המחברים מבקשים להודות בנק מחקרים Hybridoma התפתחותית באוניברסיטת איווה לשליחת לנו נוגדנים. עבודה זו נתמכה על ידי מענק (מס &#39;29/08) מן הקרן הלאומית למדע. כפי נתמכת גם על ידי מענק מחקר של DFG (דויטשה Forschungsgemeinschaft).

לפני שתתחיל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול התרבויות לטוס הרצויות. שמור את צלוחיות צפופות (כ 30 זבובים בכל בקבוקון 50 מ&quot;ל). בואו הזבובים להטיל ביצים ליום אחד בלבד בבקבוקון אחד. זה יספק היצע מספיק זחלי המזון ולאפשר להם להגיע לגודל מקסימלי לפני לזחול החוצה של מזון. שמור את צלוחיות בטמפרטורה המתאימה עד 3 זחלים instar להתחיל לנדוד על הקיר את הבקבוקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מלאי חדש של פוספט בופר סליין (PBS) וכן PBT (0.1% ב Tween PBS). שמור על 10 מ&quot;ל של PBS על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין 1-5 מ&quot;ל של מקבע טרי (פורמלדהיד 4% PBT) ולשמור את זה על הקרח. אנו משתמשים פורמלדהיד 37-38% בבקבוקים כפתרון המניות. </li></ol> 1. דיסקציה ו קיבוע של הזחלים Instar השלישי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר נדודים 3 הזחל instar מהקיר בקבוקון ולמקם אותו טיפה 50 μl של קר כקרח PBS על צלחת לנתיחה Sylgard (עשוי ערכת Sylgard 184 סיליקון אלסטומר, Dow Corning תאגידרקמת מנה התרבות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק, זחל בצד הגב למעלה, ליד הפה ווים, באמצעות מלקחיים עדינים (דומונט # 5 מלקחיים), ולתקוע סיכה חרק (minutien, 0.1 מ&quot;מ, נירוסטה) דרך המוח של הזחל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את הקצה האחורי של הזחל עם המלקחיים, למשוך בעדינות למתוח את הזחל בעדינות לאורכו. מקל עוד סיכה חרק בין שני spiracles האחוריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האביב מספריים חותכים שני חתכים אופקיים הקיר הגוף (בניצב לציר הקדמי, האחורי), קרוב סיכות הקדמי וגם האחורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים חותכים האביב הקיר גוף הזחל לאורך קו האמצע של הגב הקדמי כדי החתך האחורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של האיברים הפנימיים (המעיים, בלוטות הרוק, malpighian tubules וכו &#39;) ואת קנה הנשימה באמצעות מלקחיים עדינים. לשטוף בעדינות פעם או פעמיים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את קיר מדפים שתי הגוף עם מלקחיים, למתוח אותם ולהדק אותם לצלחת באמצעות שתי סיכות חרקים לכל צד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את PBS ולהוסיף 50 μl של פתרון תיקון (פורמלין 4% PBT). דגירה 20 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מקבע. שטפו פעמיים עם PBS. משוך את הפינים חרקים. האביב מספריים חותכים את הראש והזנב הזחל ולהשאיר פילה מלבני. העברת רקמות קבוע צינור Eppendorf צונן עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מספר מספיק של הזחלים הם קבועים, אפשר להמשיך ישירות מכתים נוגדנים. אם מכתים מיידית אינו רצוי, הזחלים קבוע יש לשטוף 3 פעמים, 5 דקות כל אחד, עם 95% אתנול ו מאוחסן אתנול 95% ב -20 ° C. </li></ol> 2. דיסקציה ו קיבוע של גלמים חלק א <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשתתף את צלוחיות כמו קיבעון הזחלים, עד 3 זחלים instar מתחילים pupariate. לבחון את צלוחיות כל הזחלים שעה סימן כי יש pupariated. אפשר גלמים ניכרת לפתח השעות 30-40 ב 24 ° C, או 24-27 שעות ב 29 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מלקחיים עדינים לקחת 20-30 גלמים של הדואר בגיל המתאים ולשים אותם בצלחת חרסינה כהה רב גם לנתח. להיזהר לא לפגוע ברקמות של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ גלמים ממקרה גלמי. בגין על ידי קילוף operculum וממשיכים עד גולם ללא תשלום. שים את הגולם אל מלא גם עם PBT. המשך מיצוי כל גלמים. צעדים 2.4-2.6 צריך להיעשות בקבוצות קטנות של גלמים 5 בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 5 גלמים על משטח ישר בין הבארות של צלחת לנתח. בעזרת סכין דיסקציה מיקרו לחתוך את קצה הראש וקצה האחורי של הבטן (לחילופין, ניתן להשתמש בשני זוגות של מלקחיים לקרוע חורים בשני הקצוות של גלמים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את גולם במקום באמצעות מלקחיים עדינים ולהשתמש מזרק 1 מ&quot;ל לשטוף את האיברים הפנימיים של גולם, על ידי הזרקת PBT דרך הפתח הקדמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בקצרה גזור גולם על ידי טבילה אותו מילא היטב עם PBS והעבר אותו לתוך מקבע קר בצינור Eppendorf כל הזמן על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בין לילה (ON) בשעה 4 ° C. </li></ol> חלק ב &#39; <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק מקבע ולשטוף את גלמים שלוש פעמים, 5 דקות כל אחד, עם PBT. שמור על גלמים דהוי על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את שתי בארות של המנה לנתח עם PBT. שימוש פוליאתילן פסטר העברת פיפטה גלמים כמה לאחד הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז 1 גולם בכל פעם אל הבאר 2. באמצעות שני זוגות מלקחיים חדות עם טיפים מיושר לגמרי, לקלף את העור המת גלמי שקוף של האגף: להבטיח את הגולם אל החלק התחתון של זוג 1 גם באמצעות מלקחיים, בעדינות לקרוע את העור המת באמצעות זוג נוסף של מלקחיים. לאחר לציפורן נקרע, לקלף אותו באגף. היזהר שלא לנתק את הזרוע מן הגולם. לאחר קילוף העור המת מן הלהב כנף, להמשיך פילינג לציפורן של ציר הזרוע (שם ChOs כנף נמצאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קילוף העור המת האגף, אפשר לנסות לקלף את העור המת רגל באופן דומה.רגליים רבים עשויים ללכת לאיבוד בתהליך, אך למרות התשואה הנמוכה, שלב זה מומלץ ביותר שכן הוא משפר באופן משמעותי את צביעת ChOs הרגל. את ChOs של haltere והבטן ניתן דמיינו בלי יותר קילוף העור המת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את &quot;קלופים&quot; גולם בצינור Eppendorf מלא מתנול לשמור בטמפרטורת החדר. המשך לקלף את העור המת של גלמים הכל, ולהוסיף אותם הצינור אותו דבר. לפחות 10 גלמים קלופים יפה יש לאסוף את כל מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מתנול לשטוף שלוש פעמים, 5 דקות כל אחד, עם 95% אתנול. גלמים קבוע יכולים להישמר במשך תקופות זמן ארוכות באתנול 95% ב -20 ° C. </li></ol> 3. Immunostaining של זחלים וגלמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הרקמה קבוע עם PBT שלוש פעמים, 30 דקות כל אחד, בטמפרטורת החדר. הזחלים ניתן לכבס עם טלטול עדין על צלחת מסתובבת. גלמים נשטפים בלי לרעוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף PBT עם חיץ חוסם (PBT + 5% nעז סרום ormal) ו דגירה על על 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חוצץ חסימת דגירה עם נוגדנים ראשוניים (מדולל חסימת חיץ) ביום ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ארבע פעמים עם PBT כמתואר בשלב 3.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PBT ו דגירה עם נוגדנים משניים (מדולל חסימת חיץ) ביום ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו פעמיים עם PBT ופעם עם PBS כמתואר בשלב 3.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף PBS עם הרכבה בינונית (Dako בינוני פלורסנט הרכבה (Dako Cytomation, Glostrup, דנמרק) ואת דגירה על 4 מעלות צלזיוס ב. </li></ol> 4. הרכבה של הזחלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזחלים הם רכובים על שקופיות מיקרוסקופ בטיפת התקשורת גובר עם לציפורן שלהן פונה כלפי מטה וקיר שרירי הגוף כלפי מעלה. לשים טיפה קטנה של המדיום גובר על פיסת כיסוי נקי ולהשתמש בו כדי לכסות את ההכנה. אינן חלות על כל לחץ על זחלים עלה. </li></ol> 5. הרכבה של גלמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו שתי שקופיות מיקרוסקופעם ירידה של המדיום גובר, 1 לנתיחה והשני עבור הרכבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשים כמה גלמים על אחת השקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האביב באמצעות מספריים להסיר את הראש ואת חלקו האחורי של הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפריד 1/2 הגב של בית החזה מהמחצית הגחון על ידי חיתוך בין בכנפיים וברגליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את חלקי גופות מבותרות של גולם בשקופית מיקרוסקופ השני ירידה של פתרון גובר. להבטיח את הכנפיים והרגליים מתוחות ולנסות למזער בכיסוי של רקמות ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ירידה של המדיום גובר על פיסת כיסוי ומניחים אותו על המדגם. אל תפעיל לחץ על מדגם רכוב. </li></ol> 6. נציג תוצאות דוגמה חיסונית המוכתמים ChOs של הזחל instar 3 מוצג באיור 1. דוגמה זו מראה הבטן נמתח קטע יפה שבו 7 מתוך שמונת ChOs גלויים לעין. הנוירונים הם במעבדההופנו אליה עם MAb22C10 (01:20, המתקבל בנק Hybridoma מחקרים התפתחותית באוניברסיטת איווה), כובע, רצועה, מכסה, מצורף והקשר תאים ברצועות מסומנים עם אנטי αTub85E (01:10, קליין ואחרים. 2010). נוגדנים משנה של מכתים ניאון היו Cy3 או Cy5-מצומדות anti-mouse/rabbit (1:200, ג&#39;קסון Immunoresearch מעבדות). דוגמאות נתפסו באמצעות מיקרוסקופ confocal (LSM 510, Zeiss). מקבץ של ChOs כנף על הווריד רדיאלי הגחון של 35 שעות בן גולם מוצג באיור 2. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3846/3846fig1.jpg" /> איור 1 (א) איור סכמטי של ששת סוגי התאים המרכיבים איבר יחיד: Ch. קבצים מצורפים שוק (CA), שוק (C), scolopale (S), תא עצב (N), רצועה (L) מצורף רצועה (LA ). איבר LCh5, שבו חמש ChOs מקובצים, נמתח על פני קבוצה של שרירים רוחביים לרוחב (LT1-4). שריר האורך לרוחב (LL1), שרירי האורך הגחון (VL1-4) שרירים אלכסונית לרוחב (LO1) באים לידי ביטוי גם. תאים גיד באים לידי כמו כדורים חומים (מתוך קליין et al., 2010). (ב) קטע אחד הבטן של הזחל instar 3 הנצפים בהגדלה של 10X. שבעה מתוך שמונה ChOs הנוכחי בכל מגזר בטן ניכרים: איברים צדדיים חמש שיחד יוצרות איברים pentascolopidial (LCh5), איבר אחד לרוחב (LCh1) ואחד משני ChOs הגחון (VChB). הנוירונים (N) של ChOs את מסומנים בטוש העצבית MAB 22C10 (אדום). רצועה (L), שוק (C) ותאי צירוף קובץ (לוס אנג&#39;לס, קליפורניה) מסומנים עם אנטי αTub-85E (כחול). התאים את המכסה רצועה מסומנים בנוסף עם כתב צ&#39;ו ספציפי GFP מחסה אלמנט הרגולציה מן לוקוס dei (נחמן et al., נתונים שלא פורסמו). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3846/3846fig2.jpg" /> איור 2. </sטרונג&gt; האיברים chordotonal כנף על הווריד רדיאלי הגחון נתפסים בהגדלה של 40X. הנוירונים (N) מסומנים עם 22C10 סמן עצביים (אדום, ב &#39;). את הרצועה (L) שווי שוק (C) התאים הם שיתוף התווית נגד αTub85E נוגדנים (כחול, C) ו צ &#39;ו ספציפי GFP כתב transgene (נחמן et al., נתונים שלא פורסמו).

<ol>
	<li>Brewster, R., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+specification+of+type+II+sensory+neurons+in+Drosophila.">Origin and specification of type II sensory neurons in Drosophila.</a> Development. 121, 2923-2936 (1995).</li><li>Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+analysis+of+larval+locomotion+in+Drosophila+chordotonal+organ+mutants.">Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila chordotonal organ mutants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16053-16053 (2003).</li><li>Eberl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeling+the+vibes:+chordotonal+mechanisms+in+insect+hearing.">Feeling the vibes: chordotonal mechanisms in insect hearing.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 9, 389-393 (1999).</li><li>Eberl, D. F., Boekhoff-Falk, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Johnston's+organ+in+Drosophila.">Development of Johnston's organ in Drosophila.</a> Int. J. Dev. Biol. 51, 679-687 (2007).</li><li>Eberl, D. F., Hardy, R. W., Kernan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+similar+transduction+mechanisms+for+touch+and+hearing+in+Drosophila.">Genetically similar transduction mechanisms for touch and hearing in Drosophila.</a> J. Neurosci. 20, 5981-5988 (2000).</li><li>Egoz-Matia, N., Nachman, A., Halachmi, N., Toder, M., Klein, Y., Salzberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulation+of+cell+adhesion+in+the+Drosophila+wing+is+mediated+by+Delilah,+a+potent+activator+of+&#946;PS+integrin+expression.">Spatial regulation of cell adhesion in the Drosophila wing is mediated by Delilah, a potent activator of &#946;PS integrin expression.</a> Dev Biol. 351, 99-109 (2011).</li><li>Field, L. H., Matheson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chordotonal+organs+of+insects.">Chordotonal organs of insects.</a> Advances in Insect Physiology. 27, 1-228 (1998).</li><li>Gong, Z., Son, W., Chung, Y. D., Kim, J., Shin, D. W., McClung, C. A., Lee, Y., Lee, H. W., Chang, D. J., Kaang, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+interdependent+TRPV+channel+subunits,+inactive+and+Nanchung,+mediate+hearing+in+Drosophila.">Two interdependent TRPV channel subunits, inactive and Nanchung, mediate hearing in Drosophila.</a> J. Neurosci. 24, 9059-9066 (2004).</li><li>Inbal, A., Volk, T., Salzberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+ectodermal+attachment+cells+via+an+EGFR-dependent+mechanism+during+the+organogenesis+of+Drosophila+proprioceptors.">Recruitment of ectodermal attachment cells via an EGFR-dependent mechanism during the organogenesis of Drosophila proprioceptors.</a> Dev. Cell. 7, 241-250 (2004).</li><li>Jarman, A. P., Grau, Y., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=atonal+is+a+proneural+gene+that+directs+chordotonal+organ+formation+in+the+Drosophila+peripheral+nervous+system.">atonal is a proneural gene that directs chordotonal organ formation in the Drosophila peripheral nervous system.</a> Cell. 73, 1307-1321 (1993).</li><li>Jarman, A. P., Sun, Y., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+proneural+gene,+atonal,+in+formation+of+Drosophila+chordotonal+organs+and+photoreceptors.">Role of the proneural gene, atonal, in formation of Drosophila chordotonal organs and photoreceptors.</a> Development. 121, 2019-2030 (1995).</li><li>Kim, J., Chung, Y. D., Park, D. Y., Choi, S., Shin, D. W., Soh, H., Lee, H. W., Son, W., Yim, J., Park, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+TRPV+family+ion+channel+required+for+hearing+in+Drosophila.">A TRPV family ion channel required for hearing in Drosophila.</a> Nature. 424, 81-84 (2003).</li><li>Klein, Y., Halachmi, N., Egoz-Matia, N., Toder, M., Salzberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proprioceptive+and+contractile+systems+in+Drosophila+are+both+patterned+by+the+EGR+family+transcription+factor+Stripe.">The proprioceptive and contractile systems in Drosophila are both patterned by the EGR family transcription factor Stripe.</a> Dev. Biol. 337, 458-470 (2010).</li><li>Matthews, K. A., Miller, D. F., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+implications+of+the+unusual+spatial+distribution+of+a+minor+alpha-tubulin+isotype+in+Drosophila:+a+common+thread+among+chordotonal+ligaments,+developing+muscle,+and+testis+cyst+cells.">Functional implications of the unusual spatial distribution of a minor alpha-tubulin isotype in Drosophila: a common thread among chordotonal ligaments, developing muscle, and testis cyst cells.</a> Dev. Biol. 137, 171-183 (1990).</li><li>Okabe, M., Okano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+induction+of+chordotonal+organ+precursors+in+Drosophila+embryogenesis.">Two-step induction of chordotonal organ precursors in Drosophila embryogenesis.</a> Development. 124, 1045-1053 (1997).</li><li>Rusten, T. E., Cantera, R., Urban, J., Technau, G., Kafatos, F. C., Barrio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spalt+modifies+EGFR-mediated+induction+of+chordotonal+precursors+in+the+embryonic+PNS+of+Drosophila+promoting+the+development+of+oenocytes.">Spalt modifies EGFR-mediated induction of chordotonal precursors in the embryonic PNS of Drosophila promoting the development of oenocytes.</a> Development. 128, 711-722 (2001).</li><li>Todi, S. V., Sharma, Y., Eberl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+and+molecular+design+of+the+Drosophila+antenna+as+a+flagellar+auditory+organ.">Anatomical and molecular design of the Drosophila antenna as a flagellar auditory organ.</a> Microsc. Res. Tech. 63, 388-399 (2004).</li><li>zur Lage, P., Jarman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+of+EGFR+and+notch+signalling+in+the+reiterative+recruitment+of+Drosophila+adult+chordotonal+sense+organ+precursors.">Antagonism of EGFR and notch signalling in the reiterative recruitment of Drosophila adult chordotonal sense organ precursors.</a> Development. 126, 3149-3159 (1999).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

פרוטוקול המתואר בסרט הזה מספק דרך לדמיין ChOs פרופריוצפטיביות בשלבי הזחל ו גלמי. מחקרים על מבנה ופיתוח של ChOs פרופריוצפטיביות היה מוגבל עד כה בעיקר בשלבים עובריים וכן דיסקים דמותי הזחל. כך, היבטים רבים של בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות, של ChOs הן הזחל ומבוגרים, אינם ידועים ברובם. הפרוטוקול המתואר, בשילוב עם כלים גנטיים משותפים תסיסנית, יכול להיות מנוצל כדי ללמוד לזהות גנים חדשים ושבילים כי תפקיד בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות ChOs. פרוטוקול זה מותאם במיוחד להדמיה של צ &#39;ו, אבל זה יכול להיות מותאמים עבור צביעה של רקמות אחרות, כגון כנפיים גלמי 6.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / כלי </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> דומון # 5 (או # 55) מלקחיים, biologie עצה </td><td> FST </td><td> 11252-20 או 11252-10 (או מלקחיים דומות) </td><td></td></tr><tr><td> אוסטרליץ נירוסטה סיכות חרקים, minutiens 0.1mm </td><td> Roboz Co כלי כירורגי </td><td> RS-6083-10 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 אלסטומר סיליקון ערכת </td><td> חברת Dow Corning </td><td> 240.4019862 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas מיקרו מספריים (ישר, 7.5 ס&quot;מ, להב 3mm) </td><td> כפי Mdeizintechnik בע&quot;מ </td><td> 11-590-00 </td><td> מספריים Vannas אביב עם מפרט זהה ניתן לרכוש Roboz כלי ושות כירורגי </td></tr><tr><td> Orbital שאכר - Rotamax-120 </td><tד&gt; Heidolph </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Dako פלורסנט הרכבה בינונית </td><td> Dako Cytomation, Glostrup, דנמרק </td><td> DK-5302392 </td><td></td></tr><tr><td> X10 ניסוח PBS </td><td colspan="2"> 2 גר &#39;/ מואר KCl, 2 גר&#39; / מואר KH 2 PO 4, 80 גר &#39;/ מואר NaCl, 21.7 גר &#39;/ מואר Na 2 HPO4.7H 2 O </td><td> איכות PBS הוא קריטי להצלחה של פרוטוקול זה </td></tr><tr><td> PBT </td><td colspan="2"> X1 PBS + 0.1% Tween 20 </td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of proprioceptors in drosophila larvae and pupae

הפרופריוספציה היא היכולת לחוש את התנועה, או מיקום של חלקי הגוף על ידי להגיב לגירויים שמקורם בתוך הגוף. בפריזבוב וחרקים אחרים הפרופריוספציה מסופק על ידי אברי החישה מיוחדות המכונות איברים chordotonal (ChOs) 2. כמו איברים רבים אחרים תסיסנית, ChOs לפתח פעמיים במהלך מחזור החיים של הזבוב. ראשית, ChOs הזחל לפתח במהלך embryogenesis. לאחר מכן, את ChOs מבוגרים מתחילים להתפתח הדיסקים דמותי הזחל ולהמשיך להבדיל במהלך המטמורפוזה. הפיתוח של ChOs הזחל במהלך embryogenesis נחקרה בהרחבה 10,11,13,15,16. במרכזו של כל צ&#39;ו היא יחידה חושית המורכבת נוירון ו תא scolopale. היחידה החושית נמתח בין שני סוגים של תאים אביזר זה לצרף לציפורן באמצעות תאים מיוחדים התקשרות אפידרמיס 1,9,14. כאשר זחל זבוב מהלכים, תזוזה יחסית של דוארתאים מצורפים pidermal מוביל מתיחה של יחידת חושי פתיחת הסוגר של ספציפיים חולפים פוטנציאליים הקולטן vanilloid (TRPV) ערוצים בקטע החיצוני של 8,12 דנדריט. האות עורר הוא הועבר לאחר מכן במעגל מחולל מרכזי של תנועה דפוס במערכת העצבים המרכזית. ChOs מספר תוארו הזבוב הבוגר 7. אלה ממוקמים ליד המפרקים של הנספחים זבובים בוגרים (רגליים, כנפיים מטפחת) והן בית החזה והבטן. בנוסף, כמה מאות ChOs ביחד ליצור איברים של ג&#39;ונסטון אנטנה הבוגרת כי אקוסטית transduce לאנרגיה מכנית 3,5,17,4. בניגוד ידע רב על התפתחות ChOs בשלבים עובריים, מעט מאוד ידוע על המורפולוגיה של איברים אלה בשלבי הזחל. יתר על כן, למעט ChOs הירך 18 ועוגב של ג&#39;ונסטון, knowled שלנוGE על התפתחות ומבנה ChOs של הזבוב הבוגר הוא חלקי מאוד. כאן אנו מתארים שיטה מכתים באופן חזותי ChOs ב זחלים וגלמים instar השלישי. שיטה זו יכולה להיות מיושם יחד עם כלים גנטיים כדי לאפיין טוב יותר את המורפולוגיה ולהבין את התפתחותם של ChOs שונים לטוס.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae at JoVE.com

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

שיטה immunostain ולדמיין איברים chordotonal ב זחלים וגלמים של<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; מתוארת.

ויזואליזציה של Proprioceptors ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים וגלמים

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

visualization-of-proprioceptors-in-drosophila-larvae-and-pupae

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

12.0K Views.  Technion-Israel Institute of Technology. שיטה immunostain ולדמיין איברים chordotonal ב זחלים וגלמים של תסיסנית melanogaster מתוארת.

Video: Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

ויזואליזציה של עצבים המגזרי הזחל ב 3 Rd Instar תסיסנית הכנות הזחל

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

ויזואליזציה של מערכת העצבים כולה עובריים-Mount תסיסנית עוברים

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

בשנת vivo ויזואליזציה של שלפוחית ​​Synaptic בתוך האקסונים תסיסנית המגזרי הזחל

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.
The Drosophila larva is an established model system to study thermal nociception, a sensory response to potentially harmful temperatures that is evolutionarily conserved across species1,2. The advantages of Drosophila for such studies are the relative simplicity of its nervous system and the sophistication of the genetic techniques that can be used to dissect the molecular basis of the underlying biology4-6 In Drosophila, as in all metazoans, the response to noxious thermal stimuli generally involves a "nocifensive" aversive withdrawal to the presented stimulus7. Such stimuli are detected through free nerve endings or nociceptors and the amplitude of the organismal response depends on the number of nociceptors receiving the noxious stimulus8. In Drosophila, it is the class IV dendritic arborization sensory neurons that detect noxious thermal and mechanical stimuli9 in addition to their recently discovered role as photoreceptors10. These neurons, which have been very well studied at the developmental level, arborize over the barrier epidermal sheet and make contacts with nearly all epidermal cells11,12. The single axon of each class IV neuron projects into the ventral nerve cord of the central nervous system11 where they may connect to second-order neurons that project to the brain.
Under baseline conditions, nociceptive sensory neurons will not fire until a relatively high threshold is reached. The assays described here allow the investigator to quantify baseline behavioral responses or, presumably, the sensitization that ensues following tissue damage. Each assay provokes distinct but related locomotory behavioral responses to noxious thermal stimuli and permits the researcher to visualize and quantify various aspects of thermal nociception in Drosophila larvae. The assays can be applied to larvae of desired genotypes or to larvae raised under different environmental conditions that might impact nociception. Since thermal nociception is conserved across species, the findings gleaned from genetic dissection in Drosophila will likely inform our understanding of thermal nociception in other species, including vertebrates.

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.

שיטות מקומיים וכלל עולמיים של הערכת Nociception תרמי ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; רימה

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

למידה אסוציאטיבית הרחה באפטטיבית<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer basic questions on how light information is processed and shared between rapid and circadian behaviors. Drosophila larvae display a stereotypical avoidance behavior when exposed to light. To investigate light dependent behaviors comparably simple light-dark preference tests can be applied. In vertebrates and arthropods the neural pathways involved in sensing and processing visual inputs partially overlap with those processing photic circadian information. The fascinating question of how the light sensing system and the circadian system interact to keep behavioral outputs coordinated remains largely unexplored. Drosophila is an impacting biological model to approach these questions, due to a small number of neurons in the brain and the availability of genetic tools for neuronal manipulation. The presented light-dark preference assay allows the investigation of a range of visual behaviors including circadian control of phototaxis.

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Here we describe a light-dark preference test for Drosophila larva. This assay provides information about innate and circadian regulation of light sensing and processing photobehavior.

Assay העדפות אור לחקר Photobehavior מוסדר מולדת ויממה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the underlying neuronal components in the circuits1-6. Application of optogenetics7,8 in the larval neural circuit allows us to manipulate neuronal activity in spatially and temporally patterned ways9-13. Typically, specimens are broadly illuminated with a mercury lamp or LED, so specificity of the target neurons is controlled by binary gene expression systems such as the Gal4-UAS system14,15. In this work, to improve the spatial resolution to "sub-genetic resolution", we locally illuminated a subset of neurons in the ventral nerve cord using lasers implemented in a conventional confocal microscope. While monitoring the motion of the body wall of the semi-intact larvae, we interactively activated or inhibited neural activity with channelrhodopsin16,17 or halorhodopsin18-20, respectively. By spatially and temporally restricted illumination of the neural tissue, we can manipulate the activity of specific neurons in the circuit at a specific phase of behavior. This method is useful for studying the relationship between the activities of a local neural assembly in the ventral nerve cord and the spatiotemporal pattern of motor output.

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Here we describe a protocol for optogenetic manipulation of motoneuronal activity while monitoring changes in motor output (muscle contraction) in semi-intact Drosophila larvae using lasers within a conventional confocal microscope. This technique enables researchers to achieve local perturbation of neural activity in a few neuromeres to elucidate the dynamics of motor circuits.

הפרעות optogenetic של פעילות עצבית עם תאורת לייזר בחצי ללא פגע<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים בתנועה

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral variation. The larval path-length assay was developed to measure individual differences in foraging behavior that were later linked to the foraging gene. Larval path-length is an easily scored trait that facilitates the collection of large sample sizes, at minimal cost, for genetic screens. Here we provide a detailed description of the current protocol for the larval path-length assay first used by Sokolowski. The protocol details how to reproducibly handle test animals, perform the behavioral assay and analyze the data. An example of how the assay can be used to measure behavioral plasticity in response to environmental change, by manipulating feeding environment prior to performing the assay, is also provided. Finally, appropriate test design as well as environmental factors that can modify larval path-length such as food quality, developmental age and day effects are discussed.

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

We provide a detailed protocol for a Drosophila melanogaster foraging path-length assay. We discuss the preparation and handling of test animals, how to perform the assay and analyze the data.

פרוטוקול נתיב באורך שארגן לעצמו<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

Assay רומן עבור הקרה Nociception ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...