Multiome Sequencing을 위한 신선 및 냉동 고형 종양 검체에서 최적화된 핵 분리

이 프로토콜은 조직 해리 조건, 단일 세포 현탁액의 동결 보존 및 분리된 핵 평가에 대한 권장 사항을 포함하여 10x Genomics 플랫폼을 사용하여 다중 종양 시퀀싱을 위해 고형 종양 검체에서 핵을 분리하는 데 신뢰할 수 있고 최적화된 접근 방식을 제공합니다.

동일 세포/쌍을 이루는 단일 세포 RNA 및 염기서열분석(ATAC-sequencing) 데이터를 통해 transposase 접근 가능한 염색질에 대한 분석을 제공하는 Multiome 염기서열분석은 현재 중개암 연구의 주요 초점인 종양 세포 이질성을 식별하는 능력의 돌파구를 나타냅니다. 그러나 이 고급 양식을 사용하여 수집된 염기서열분석 데이터의 품질은 입력 자료의 품질에 크게 의존합니다.

품질 저하 없이 세포 수율을 극대화하기 위해 분해 조건을 최적화해야 합니다. 이는 세포 방출을 위해 부드럽게 분해되어야 하는 조밀한 탈형성 매트릭스가 있는 고형 종양의 맥락에서 특히 어렵습니다. 고형 종양 조직에서 갓 분리한 세포는 세포주에서 분리한 세포보다 더 취약합니다. 또한 분리된 세포 유형이 이질적이기 때문에 전체 세포 집단을 지원하기 위한 조건을 선택해야 합니다.

마지막으로, 핵 격리 조건은 용해 시간 및 시약 유형/비율 측면에서 이러한 특성을 기반으로 최적화되어야 합니다. 이 기사에서는 고형 종양 표본에서 10x Genomics 멀티오메 염기서열 분석 플랫폼에 대한 핵 분리에 대한 경험을 설명합니다. 당사는 조직 분해, 단세포 현탁액 보관(원하는 경우), 핵 분리 및 평가에 대한 권장 사항을 제공합니다.

종양 생물학에 대한 지식이 증가함에 따라 종양 미세환경 전반에 걸쳐 이종 세포를 분석하는 것의 중요성도 증가했습니다 ^1,2. 단일 세포 RNA를 획득하고 쌍 세포 방식(멀티오메 시퀀싱)으로 동일한 세포에서 염기서열분석(ATAC-sequencing) 데이터를 사용하여 transposase-accessible chromatin에 대한 분석을 획득하는 능력은 이러한 목적을 향한 상당한 발전을 제공합니다 ^3,4. 그러나 이러한 실험은 비용과 시간이 많이 소요되며 수집된 데이터의 품질과 영향은 실험 조건 및 재료의 품질에 크게 좌우됩니다. 핵 분리를 위한 표준화된 프로토콜이 발표되었습니다 ^5,6. 신선하고 이질적인 조직은 고형 종양 검체에서 갓 분리한 세포가 세포주에서 분리한 세포보다 더 취약하기 때문에 프로토콜 최적화가 필요합니다.

또 다른 고려 사항은 고형 종양의 경우 수술실에서 늦은 시간까지 수술 표본을 구할 수 없는 경우가 많다는 것입니다. 따라서 일반적으로 냉동 보존 단계 없이 샘플 획득에서 핵 캡처로 직접 진행하는 것은 불가능합니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 단세포 현탁액을 동결하면 최고 품질의 핵을 얻을 수 있습니다(급속 냉동 전체 조직 또는 기타 보존 방식이 아닌). 이는 췌장과 같이 RNase 함량이 높은 효소 조직 유형의 경우 특히 그렇습니다.

또한 조직 분해 조건은 품질 저하 없이 세포 수율을 극대화할 수 있도록 설계되어야 한다⁷. 조밀한 탈형성 기질^{(desmoplastic} matrix)8을 갖는 고형 종양 유형의 맥락에서, 세포외 기질은 세포 방출을 위해 완만하게 분해되어야 한다. 또한 분리된 세포 유형이 이질적이기 때문에 전체 세포 집단을 지원하도록 조건을 조정해야 합니다. 인간 췌장암(췌관 선암) 샘플이 설명된 프로토콜에서 사용됩니다. 췌장암은 탈형성 종양 유형으로, 상대적으로 끈적끈적한 조직과 세포를 예고합니다. 또한 연구에 사용할 수 있는 췌장 종양 검체도 상대적으로 적은 경향이 있기 때문에 포획된 세포의 양을 최대화하기 위한 노력이 필요합니다.

핵을 분리하려면 세포 용해 조건과 타이밍, 시약 유형 및 비율 측면에서 가장 많은 최적화가 필요합니다. 분리 과정에서 핵을 다루는 것도 세심한 주의가 필요합니다. 이 기사에서는 고형 종양 조직에서 10x Genomics 멀티오메 염기서열 분석 플랫폼을 위한 핵 분리를 최적화한 경험을 설명합니다(그림 1). 당사는 조직 분해, 단세포 현탁액의 동결 보존(원하는 경우) 및 핵 분리에 대한 권장 사항을 제공합니다.

인간 췌장암(췌관 선암) 샘플은 우리 실험실에서 IRB 승인 프로토콜에 따라 획득되었습니다. 조직 채취를 위해 환자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다. 조직을 수술실에서 실험실로 이송한 후 다음과 같이 처리하였다.

1. 조직 해리(소화)

1. 다이제스트 버퍼를 준비합니다( 재료 표 참조).
2. 종양 절제 후 가능한 한 빨리 관심 조직을 확보하고 검체를 담금질 완충액(~5% 소 태아 혈청이 포함된 DMEM F-12) 또는 얼음 위의 1x PBS로 운반합니다.
3. 깨끗한 겸자와 가위를 사용하여 90mm 페트리 접시에 담긴 3-5mL의 분해 완충액에 조직을 다집니다(그림 2A).
4. 다진 조직을 50mL 원뿔형 튜브에 옮기고 진탕 기능이 있는 수조 또는 건식 교반기를 사용하여 37°C에서 30분 동안 ~10mL의 분해 완충액에서 해리합니다.
5. 교반기에서 제거하고 ~20mL의 담금질 배지로 담금질합니다. 100μm 셀 스트레이너를 통해 용액을 깨끗한 원뿔형 튜브로 여과합니다.
6. 스트레이너에서 남아 있는 고형 조직을 수집하고(필요한 경우 남은 조직 조각을 다시 다져서) ~10mL의 신선한 Digest Buffer에 교반하면서 37°C에서 30분 더 넣습니다. 모든 종양 조직이 해리될 때까지 반복합니다.
7. 세포 현탁액을 합치고 70μm를 통과한 다음 40μm 세포 여과기를 통해 얼음 위의 깨끗한 원뿔형 튜브에 넣습니다.
8. 4°C에서 5분 동안 500× g 의 펠릿 셀로 원심분리한 다음 상층액을 디캔팅합니다.

2. 냉동 보존

1. 펠릿을 1x PBS 1mL에 재현탁시켜 세포를 헹굽니다.
2. 세포 현탁액(최적의 동결을 위한 ~1-1,000만 세포/튜브)을 얼음 위의 1.5mL cryovial로 옮깁니다.
3. 4°C에서 5분 동안 500× g 의 펠릿 셀로 원심분리한 다음 상층액을 디캔팅합니다.
4. 1mL의 Bambanker 용액에 세포를 재현탁시키고, 1.5 또는 2mL 극저온으로 옮기고(그림 2B), -80°C에서 -1°C/min 냉각 속도 동결 용기(100% 이소프로필 알코올 포함)를 사용하여 동결하거나, 시료를 장기간 보관할 것으로 예상되는 경우 액체 질소로 옮깁니다.

3. 핵 분리

1. 세포 현탁액의 냉동을 빠르게 해동하고 젖은 얼음 위에 놓습니다.
2. 해동된 세포 현탁액을 2mL 미세 원심분리 튜브로 옮기고 1x PBS로 바이알을 2mL 용액에 채워 세포를 헹굽니다.
3. 세포의 양과 질을 모두 평가하기 위해 혈구계를 사용하여 수동 세포 수를 얻습니다(그림 2C).
4. 4°C에서 5분 동안 500× g 의 펠릿 셀로 원심분리한 다음 점차적으로 더 작은 피펫 팁을 사용하여 상층액을 부드럽게 디캔팅하여 마른 펠릿을 남기고 얼음 위에 유지합니다.
   1. 모든 원심분리 단계에 스윙 버킷 로터를 사용하십시오. 셀 수율을 극대화하려면 힌지가 바깥쪽을 향하도록 튜브를 원심분리기에 넣은 다음 피펫 팁이 튜브의 반대쪽을 향하도록 디캔팅합니다(그림 2D).
      알림: 상층액을 디캔팅하려면 점진적으로 더 작은 피펫 팁을 사용하여 유체를 제거하여 펠릿의 중단을 제한하고 디캔팅된 유체의 부피를 최대화합니다. 이 전략은 핵 펠릿이 일반적으로 보이지 않기 때문에 핵 추출 후 프로토콜의 후반부에 특히 유용합니다.
5. 공개된 프로토콜에 따라 1x Cell Lysis Buffer, Cell Lysis Dilution Buffer 및 Wash Buffer(그림 3A)를 다음과 같이 수정하여 준비합니다( 표 1, 재료 표 참조).
   알림: 침전물을 용해시키기 위해 사용하기 전에 디지토닌을 65°C의 가열 블록에 놓습니다(그림 3B). 일반적으로 약 10분이 소요됩니다.
6. 1x Cell Lysis Buffer 100μL와 Cell Lysis Dilution Buffer 900μL를 혼합하여 0.1x Cell Lysis Buffer를 준비하고 피펫에 부드럽게 섞은 후 얼음 위에 놓습니다.
7. 식힌 0.1x 세포 용해 완충액 100μL에 세포 펠릿을 재현탁시키고 부드럽게 피펫팅하여 5배 혼합합니다.
8. 얼음 위에서 3분 동안 배양합니다(그림 3C).
9. 식힌 세척 버퍼 1mL와 피펫을 위아래로 추가하여 5배를 부드럽게 섞습니다.
10. 원심분리기를 하여 4°C에서 5분 동안 500× g 의 핵을 펠릿으로 펠트하고, 상층액을 건조한 펠릿으로 부드럽게 디캔팅하고, 얼음 위에서 유지합니다.
    참고: 시작 세포 수가 적은 경우(100,000-200,000개 세포) 2mL 미세 원심분리기 튜브 대신 200μL PCR 튜브에서 세포 용해 및 세척 단계를 수행하여 튜브 표면적을 줄이고 손실을 최소화합니다. 이 경우 더 작은 튜브 부피를 수용하도록 세척 버퍼 부피를 낮추십시오.
11. 3.9-3.10단계를 2회 반복하여 총 3회 세탁합니다.
12. 현미경 아래의 혈구계 슬라이드를 사용하여 수동으로 핵을 계산합니다. 원하는 경우 트리판 블루 염료를 사용하여 핵을 볼 수 있는 대비를 제공하고 용해되지 않은 세포에서 핵을 식별하는 데 도움을 줍니다.
13. 공개된 프로토콜에 따라 1x Nuclei Buffer를 준비합니다: 20x Nuclei Buffer stock, 1 mM DTT, 1 U/μL RNase Inhibitor를 뉴클레아제가 없는 물에 넣고 얼음 위에 보관합니다( 재료 표 참조).
14. 목표 표적 핵 회수에 따라 1x Nuclei Buffer에서 핵 펠릿을 재현탁시킵니다.
    참고: 농도가 충분히 높으면 25μL의 예상 부피 손실과 필터링(단계 3.15)으로 인한 농도 20% 감소를 감안할 때 시작 재현 부피를 결정할 때 이 단계(3,230-8,060핵/μL)에서 10,000 이상의 목표 회수율을 목표로 합니다(3.15단계).
15. 재현탁된 핵 부피를 40μm 피펫 팁 셀 스트레이너를 통해 부드럽게 통과시키고 핵을 얼음 위에 놓습니다(그림 3D).
16. 핵을 다시 계산합니다(그림 4A-C). 필요한 경우 최종 용액을 Nuclei Buffer로 더 희석합니다.
17. 얼음 위에서 핵을 운반하고 공개된 프로토콜에 따라 즉시 핵 포획을 진행합니다.

멀티오메 염기서열분석(그림 1)을 위해 환자 고형 종양 표본에서 고품질 핵을 분리하기 위해 종양 조직을 해리하고 단세포 현탁액을 동결 보존했습니다(그림 2A-D). 그런 다음 세포 현탁액은 계획된 멀티오메 포획 시 해동되었습니다. 핵 포획은 품질과 수율을 모두 극대화하기 위해 최적화된 용해 완충 시약과 타이밍으로 수행되었습니다(그림 3A-D). 대표적인 핵 이미지는 적절한 크기와 모양을 보여줍니다(그림 4A-C). 옅은 회색으로 동그라미를 친 핵은 봉투의 가벼운 점무늬를 보여줍니다.

그림 1: 핵 분리 워크플로우의 개략도. 전체 종양 조직 검체에서 핵 캡처, 다중 종양 라이브러리 준비, 그리고 궁극적으로 scRNA 및 ATAC 염기서열 분석을 위해 제출할 준비가 된 단일 핵 현탁액까지의 기본 워크플로우를 보여주는 개략도. 약어: scRNA = 단일 세포 RNA; ATAC-seq = 염기서열분석을 통한 transposase-accessible chromatin에 대한 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 조직 분해, 냉동 보존, 세포 평가 및 원심분리 단계. (A) 종양 조직 표본 다지기 위한 장비 설정; (B) 세포 현탁액 동결 보존; (C) 세포 현탁액의 현미경 평가; (D) 이 프로토콜에 대한 원심분리 접근 방식. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 시약 준비, 핵 추출 및 여과. (A) 핵 추출 시약의 제조; (B) 사용 전 65°C에서 디지토닌 용해; (C) 얼음 상에서의 세포 용해를 위한 샘플의 배양; (D) 추출된 핵의 필터링. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 복잡한 종양 조직 표본에서 채취한 핵의 대표적인 현미경 이미지. (A-C) Trypan Blue 염색이 있거나 없는 상태에서 채취한 핵의 대표 이미지. (나,씨) 옅은 회색으로 동그라미를 친 핵은 핵 외피의 가벼운 점각을 보여준다. 10x 및 40x 대물렌즈 사용. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 이 프로토콜에 사용되는 솔루션.

종양 미세환경에 존재하는 이질적인 세포 집단을 푸는 것은 암 생물학에서 활발하게 중점적으로 연구하는 분야입니다. 마찬가지로, 상처 치유 및 섬유증과 같은 양성 병리학에는 복잡한 조직이 존재합니다. 멀티오메 염기서열분석은 동일 세포 쌍을 이룬 scRNA 및 ATAC-seq 데이터를 획득할 수 있는 강력한 도구로 부상했습니다. 이 프로토콜은 신선하고 깨지기 쉬운 작은 종양 검체를 처리하는 환경에서 최적화가 필요한 핵의 분리를 설명합니다. 여기서는 탈형성 고형 종양 조직 표본에서 핵 분리를 위한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 이 접근 방식이 핵 분리 및 포획 전에 세포 현탁액이 동결된 경우에도 신뢰할 수 있는 고품질 데이터를 산출한다는 것을 발견했습니다.

분석 전반에 걸쳐 알부민 농도를 높이면 종양 샘플로 작업할 때 문제가 될 수 있는 세포 및 다운스트림 핵 응집을 제한하는 데 도움이 됩니다. 조직 분해 측면에서, 원하는 경우 분해 키트 시약을 이 프로토콜과 함께 사용할 수도 있습니다( 재료 표 참조). 사용하는 경우 생존 가능한 세포의 수율을 극대화하기 위해 30분마다 분해/소멸 및 완충액 교환을 수행하는 것이 좋습니다. 조직 해리 후 적혈구 용해는 제조업체의 프로토콜에 따라 수행할 수 있습니다. 그래디언트 세포 분리 프로토콜은 연구자의 재량에 따라 수행할 수도 있습니다( 재료 표 참조). 이러한 프로토콜을 일상적으로 수행하지는 않지만 결과의 현저한 차이 없이 유사한 샘플에 이러한 프로토콜을 적용했습니다. 핵 여과 후 중요한 작은 파편이 발견되면 추가 정제를 위해 FANS(Fluorescence-Activated Nuclei Sorting)를 고려할 수 있습니다. 프로토콜 권장 사항을 포함하여 FANS에 대한 자세한 설명이 가능하지만 이 프로토콜의 범위를 벗어납니다. 참고로, 문헌에는 세포 용해 전에 고정 단계를 고려하는 프로토콜이 있습니다. 그러나 scATAC-seq는 고정되지 않은 조직에서 가장 잘 작동하므로 고정되지 않은 조직과 핵을 진행하는 것을 선호합니다⁹.

세포 용해의 경우, RNase 억제제는 비용이 많이 들기 때문에 시약의 비율이 비례를 유지하는 한, 원하는 경우 공개된 프로토콜에 제공된 부피와 비교하여 세포 용해 완충액(및 세포 용해 희석 완충액)의 준비된 부피를 축소하는 것이 합리적입니다. 채취한 핵을 평가하고 계수할 때 연구자의 재량에 따라 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit를 적용할 수 있습니다. 트리판 블루 염료는 또한 핵을 볼 수 있는 대비를 제공하고 필요한 경우 용해되지 않은 세포에서 핵을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 단일 세포 ATAC-seq에 대해 프로토콜별로 조정된 시약으로 동일한 세포 용해 조건을 적용하여 우수한 결과를 얻었다는 점에 주목할 필요가 있습니다¹⁰.

프로토콜의 중요한 단계는 정확한 용해 타이밍과 부드럽지만 편리한 핵 처리입니다. 과소 혼합은 불완전하거나 일관되지 않은 세포 용해로 이어집니다. 그러나 과도하게 혼합하면 염색질이 전단됩니다. 다른 핵 분리 프로토콜에서 언급된 바와 같이, 핵 혼합은 전단력이 깨지기 쉬운 핵⁽¹¹)을 손상시킬 수 있기 때문에 샘플의 와류보다는 피펫팅에 의해 수행되어야 한다. 이와 관련하여, Cell Lysis Buffer는 매번 사용하기 직전에 신선하게 준비하는 것이 중요합니다. 최종 원심분리 단계 후 피펫 팁 세포 변형(여과)은 캡처 전에 핵 응집을 방지하기 위한 당사의 경험에서 핵심입니다. 이 여과는 최종 계수에서 덩어리가 여전히 감지되거나 적재 전에 시편을 운반하는 동안 발생하는 경우 각 여과 단계가 추가될 때마다 부피 및 농도의 추가 손실을 염두에 두고 적재 전에 반복할 수 있습니다. 참고로, 핵 분리와 포획 사이에 상당한 시간 정지가 없어야 합니다.

이 프로토콜의 한계는 조직 해리, 특히 세포 용해 배양 시기 및 조건이 다양한 고형 종양 유형에 맞게 최적화되어야 할 수 있다는 것이다¹². 이 프로토콜은 유방암 및 췌장 선암과 같은 탈형성 고형 종양에 최적화되어 있으며 실질 섬유증과 같은 비종양 탈형성 조직에도 성공적으로 적용되었지만 다른 종양 유형은 추가 조정이 필요할 수 있습니다. 이 제품은 신선한 세포 현탁액과 냉동 세포 현탁액 모두에 최적화되어 있으며, 이 두 가지 모두에서 우수한 핵 수율을 제공합니다. 조직 해리를 시작으로 순차적으로 이러한 최적화를 추구하고, 최적의 단세포 현탁액이 달성되면 세포 용해 조건의 최적화로 이동하여 최적의 단핵 현탁액을 생성하는 것이 좋습니다.

단일 세포 ATAC 염기서열분석과 최근에는 다중종 염기서열분석은 고형 종양 세포 이질성을 풀기 위한 엄청난 획기적인 도구를 제공합니다. 세포 아형은 염색질 접근성과 유전자 발현 특성을 기반으로 설명할 수 있으며, 전사 인자 접근성 및 발현이 종양 거동에 미치는 영향을 직접 검사할 수 있습니다. 이러한 방법론적 발전은 새로운 치료 표적을 발견할 수 있는 엄청난 잠재력을 감안할 때 광범위하게 적용되고 있습니다. 따라서 이러한 데이터를 얻기 위해 최적화된 프로토콜을 개발하는 것이 가장 중요합니다. 여기에서 우리는 췌장암 조직의 맥락에서 핵 분리를 위한 이 프로토콜을 공유합니다 - 췌장암 조직에 대한 치료법이 거의 존재하지 않고 현재까지 모두 제한된 효능을 가진 암 유형입니다.

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

Stanford Functional Genomics Facility(SFGF), 특히 Dhananjay Wagh와 John Coller, 그리고 10x Genomics의 실험 최적화에 도움을 주신 데 대해 감사드립니다. 또한 환자 표본 획득에 도움을 주신 George Poultsides, Monica Dua, Brendan Visser, Byrne Lee 박사님께도 감사드립니다. 우리의 연구 노력에 대한 아낌없는 지원에 대해 Art와 Elaine Taylor, Rantz Foundation, Warren and Judy Kaplan에게 감사드립니다. 자금 출처에는 NIH 보조금 1F32CA23931201A1(D.S.F.), 1R01GM116892(M.T.L.), 1R01GM136659(M.T.L.), Goldman Sachs Foundation(J.A.N., D.S.F., M.T.L.), Damon Runyon Cancer Research Foundation(D.D., M.T.L.), Gunn/Olivier Fund, California Institute for Regenerative Medicine, Stinehart/Reed Foundation 및 Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine이 포함됩니다. 염기서열분석은 NIH 기금(S10OD025212, S10OD018220 및 1S10OD01058001A1)으로 구입한 기계를 사용하여 얻었다.