בידוד גרעינים אופטימלי מדגימות גידול מוצק טרי וקפוא לריצוף מולטיומי

הפרוטוקול מספק גישה אמינה ואופטימלית לבידוד גרעינים מדגימות גידולים מוצקים לצורך ריצוף מולטיומי באמצעות פלטפורמת 10x Genomics, כולל המלצות לתנאי דיסוציאציה של רקמות, שימור בהקפאה של תרחיפים חד-תאיים והערכה של גרעינים מבודדים.

ריצוף מולטיום, המספק RNA חד-תאי זהה/מזווג והבדיקה עבור כרומטין נגיש לטרנספוזאז עם נתוני ריצוף (ATAC-sequencing), מייצג פריצת דרך ביכולתנו להבחין בהטרוגניות של תאי הגידול - מוקד עיקרי של מחקר סרטן תרגומי בשלב זה. עם זאת, איכות נתוני הרצף הנרכשים באמצעות מודל מתקדם זה תלויה מאוד באיכות חומר הקלט.

תנאי העיכול צריכים להיות אופטימליים כדי למקסם את תפוקת התאים מבלי להקריב את האיכות. זה מאתגר במיוחד בהקשר של גידולים מוצקים עם מטריצות דסמופלסטיות צפופות שיש לפרק בעדינות לשחרור תאים. תאים שבודדו טריים מרקמת גידול מוצקה הם שבירים יותר מאלה שבודדו משורות תאים. בנוסף, מכיוון שסוגי התאים המבודדים הם הטרוגניים, יש לבחור תנאים שיתמכו באוכלוסיית התאים הכוללת.

לבסוף, תנאי בידוד גרעיני חייבים להיות אופטימליים בהתבסס על תכונות אלה במונחים של זמני ליזה וסוגים/יחסים מגיבים. במאמר זה, אנו מתארים את הניסיון שלנו עם בידוד גרעיני עבור פלטפורמת ריצוף 10x Genomics multiome מדגימות גידול מוצק. אנו מספקים המלצות לעיכול רקמות, אחסון של תרחיפים חד-תאיים (אם רוצים), בידוד גרעיני והערכה.

ככל שהידע שלנו על ביולוגיה של הגידול גדל, החשיבות של ניתוח תאים הטרוגניים על פני מיקרו-סביבה של הגידול גדלה גם היא ^1,2. היכולת לרכוש RNA חד-תאי והבדיקה לכרומטין נגיש לטרנספוזאז עם נתוני ריצוף (ATAC-sequencing) מאותו תא בצורה זוגית (ריצוף מולטיום) מספקת התקדמות משמעותית לקראת מטרה זו ^3,4. עם זאת, ניסויים אלה יקרים וגוזלים זמן, ואיכות וההשפעה של הנתונים המתקבלים תלויים מאוד באיכות תנאי הניסוי והחומרים. פרוטוקולים סטנדרטיים לבידוד גרעינים פורסמו ^5,6. רקמות טריות והטרוגניות דורשות אופטימיזציה של פרוטוקול מכיוון שתאים שבודדו טריים מדגימות גידול מוצקות הם שבירים יותר מאלה שבודדו משורות תאים.

שיקול נוסף הוא שעבור גידולים מוצקים, דגימות כירורגיות לרוב אינן זמינות מחדר הניתוח עד מאוחר ביום. ככזה, זה בדרך כלל לא ריאלי להמשיך ישירות מרכישת דגימה ללכידת גרעינים ללא שלב שימור בהקפאה. מניסיוננו, הקפאת תרחיף חד-תאי מניבה גרעינים באיכות הגבוהה ביותר (ולא רקמה שלמה קפואה בהבזק או שיטות שימור אחרות). זה נכון במיוחד עבור סוגי רקמות אנזימטיות עם תוכן RNase גבוה כגון הלבלב.

תנאי עיכול רקמות צריכים גם להיות מתוכננים כדי למקסם את תפוקת התאים מבלי להקריב איכות⁷. בהקשר של סוגי גידולים מוצקים עם מטריצות דסמופלסטיות צפופות⁸, יש לפרק בעדינות את המטריצה החוץ תאית לשחרור תאים. בנוסף, מאחר שסוגי התאים המבודדים הם הטרוגניים, יש להתאים את התנאים לתמיכה באוכלוסיית התאים הכוללת. דגימות סרטן הלבלב האנושי (אדנוקרצינומה של צינור הלבלב) משמשות בפרוטוקול המתואר. סרטן הלבלב מייצג סוג גידול דסמופלסטי מאוד, אשר מבשר רקמות ותאים דביקים יחסית. יתר על כן, מכיוון שדגימות גידול הלבלב הזמינות למחקר נוטות להיות קטנות יחסית, נעשים מאמצים למקסם את כמות התאים שנלכדים.

בידוד גרעינים דורש את האופטימיזציה הרבה ביותר במונחים של תנאי ליזה התא ועיתוי, כמו גם סוגים ויחסים מגיבים. גם הטיפול בגרעינים במהלך הבידוד דורש זהירות רבה. במאמר זה אנו מתארים את הניסיון שלנו במיטוב בידוד גרעיני עבור פלטפורמת ריצוף מולטי-ome 10x Genomics מרקמת גידול מוצקה (איור 1). אנו מספקים המלצות לעיכול רקמות, שימור בהקפאה של תרחיפים חד-תאיים (אם רוצים) ובידוד גרעיני.

דגימות סרטן הלבלב האנושי (אדנוקרצינומה של צינור הלבלב) נרכשו על פי פרוטוקול שאושר על ידי IRB במעבדה שלנו. התקבלה הסכמה מדעת של המטופלים לאיסוף רקמות. הרקמה הועברה מחדר הניתוח למעבדה ולאחר מכן טופלה באופן הבא.

1. דיסוציאציה רקמות (עיכול)

1. הכן את מאגר Digest (ראה טבלת חומרים).
2. השג את הרקמה המעניינת בהקדם האפשרי לאחר כריתת הגידול והעביר את הדגימה במאגר מרווה (DMEM F-12 עם ~ 5% נסיוב בקר עוברי) או 1x PBS על קרח.
3. טחנו את הרקמה באמצעות מלקחיים נקיים ומספריים ב-3-5 מ"ל של חיץ Digest בצלחת פטרי בקוטר 90 מ"מ (איור 2A).
4. מעבירים את הרקמה הטחונה לצינור חרוטי של 50 מ"ל ומנתקים ב~10 מ"ל של חיץ Digest למשך 30 דקות ב-37°C באמצעות אמבט מים עם פונקציית רעד או תסיסה יבשה.
5. הסר מן התסיסה להרוות עם ~ 20 מ"ל של מדיום מרווה. סנן את התמיסה דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי נקי.
6. אספו את כל הרקמה המוצקה שנותרה מהמסננת (טחנו מחדש את חתיכות הרקמה הנותרות במידת הצורך), והניחו ב~10 מ"ל של חיץ Digest טרי למשך 30 דקות נוספות בטמפרטורה של 37°C עם תסיסה. חזור על הפעולה עד שכל רקמת הגידול מנותקת.
7. תרחיף תאי הבריכה מתעלים ומסננים דרך 70 מיקרומטר ואחריו מסננת תאים של 40 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי נקי על קרח.
8. צנטריפוגה לתאי גלולה ב 500 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן decant supernatant.

2. שימור בהקפאה

1. לשטוף את התאים על ידי השעיה מחדש של הגלולה ב 1 מ"ל של 1x PBS.
2. העבר את תרחיף התא (~ 1-10 מיליון תאים / צינור להקפאה אופטימלית) לקריביאל של 1.5 מ"ל על קרח.
3. צנטריפוגה לתאי גלולה ב 500 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן decant supernatant.
4. השהה מחדש את התאים ב-1 מ"ל של תמיסת במבנקר, העבר לקריביאל של 1.5 או 2 מ"ל (איור 2B), והקפיא באמצעות מיכל הקפאה בקצב קירור של -1°C/min (המכיל 100% אלכוהול איזופרופיל) ב-80°C-, או העבירו לחנקן נוזלי אם צפוי אחסון ארוך טווח של הדגימה.

3. בידוד גרעינים

1. הפשירו במהירות את ההקפאה של תרחיף התאים והניחו אותו על קרח רטוב.
2. העבירו את מתלה התאים המופשר לצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל ומלאו את הבקבוקון לתמיסת 2 מ"ל ב-1x PBS כדי לשטוף את התאים.
3. השיגו ספירת תאים ידנית באמצעות המוציטומטר כדי להעריך הן את כמות התאים והן את איכותם (איור 2C).
4. צנטריפוגה לתאי גלולה ב 500 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן בעדינות decarant supernatant באמצעות קצות פיפטה קטנים יותר ויותר כדי להשאיר מאחור גלולה יבשה ולשמור אותו על קרח.
   1. השתמש ברוטור דלי נדנדה עבור כל שלבי הצנטריפוגה. לתפוקת תאים מרבית, הניחו את הצינורות בצנטריפוגה כשהציר פונה החוצה ולאחר מכן דקאנט כשקצה הפיפטה מכוון לצד הנגדי של הצינור (איור 2D).
      הערה: כדי לנטרל את הסופרנטנט, השתמש בקצוות פיפטה קטנים יותר ויותר כדי להסיר נוזל כדי להגביל את ההפרעה של הגלולה תוך הגדלת נפח הנוזל decanted. אסטרטגיה זו מועילה במיוחד בהמשך הפרוטוקול לאחר מיצוי גרעינים מכיוון שכדורית הגרעינים בדרך כלל אינה נראית לעין.
5. הכינו 1x מאגר ליזה של תאים, מאגר דילול ליזה של תאים ומאגר שטיפה (איור 3A) בהתאם לפרוטוקול שפורסם עם השינויים הבאים (ראו טבלה 1, טבלת חומרים):
   הערה: הניחו את הדיגיטונין על גוש חימום בטמפרטורה של 65°C לפני השימוש כדי להמיס את המשקע (איור 3B). פעולה זו נמשכת בדרך כלל כ-10 דקות.
6. הכינו את מאגר הליזה של התאים 0.1x על ידי שילוב של 100 μL של 1x Cell Lysis Buffer ו-900 μL של Cell Lysis Dilution Buffer, פיפטה עדינה לערבוב והניחו אותה על קרח.
7. יש להשהות מחדש את כדורית התא ב-100 μL של חיץ ליזיס תאי 0.1x מקורר ולערבב פיפטה עדינה פי 5.
8. דגרו על קרח במשך 3 דקות (איור 3C).
9. הוסיפו 1 מ"ל של Wash Buffer צונן ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב בעדינות פי 5.
10. צנטריפוגה כדי להניע את הגרעינים ב 500 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, בעדינות decant supernatant לגלולה יבשה, ולשמור על קרח.
    הערה: אם מספר התא ההתחלתי נמוך (100,000-200,000 תאים), בצע את שלבי הליזה והשטיפה של התא בצינור PCR של 200 מיקרוליטר במקום בצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל כדי להקטין את שטח הפנים של הצינור ולמזער הפסדים. במקרה זה, כוונן את עוצמת הקול של מאגר הכביסה כלפי מטה כדי להתאים לנפח הצינור הקטן יותר.
11. חזור על שלבים 3.9-3.10 2x עבור שלוש כביסות בסך הכל.
12. ספור ידנית את הגרעינים באמצעות שקופית המוציטומטר מתחת למיקרוסקופ. השתמש בצבע כחול טריפאן אם תרצה כדי לספק ניגודיות לצפייה בגרעינים וכדי לעזור להבחין בין גרעינים לתאים שלא עברו ניתוח.
13. הכינו את מאגר הגרעינים 1x לפי הפרוטוקול שפורסם: מלאי מאגר גרעינים 20x, 1 mM DTT, 1 U/μL RNase Inhibitor במים נטולי נוקלאז ושמרו על קרח (ראו טבלת חומרים).
14. השהה מחדש את כדורית הגרעינים במאגר גרעינים 1x בהתבסס על שחזור גרעינים ממוקד מטרה.
    הערה: אם הריכוז גבוה מספיק, יש לשאוף להתאוששות ממוקדת של 10,000 או מעט גבוה יותר בשלב זה (3,230-8,060 גרעינים/μL) בעת קביעת נפח התרחיף ההתחלתי, בהתחשב באובדן הנפח הצפוי של 25 μL והירידה של 20% בריכוז עם סינון (שלב 3.15).
15. העבירו בעדינות את נפח הגרעינים המרחפים מחדש דרך מסננת פיפטה של 40 מיקרומטר והניחו את הגרעינים על קרח (איור 3D).
16. ספרו מחדש את הגרעינים (איור 4A-C). דללו את הפתרון הסופי עוד יותר עם Nuclei Buffer במידת הצורך.
17. העבירו את הגרעינים על קרח והמשיכו מיד בלכידת גרעינים לפי פרוטוקולים שפורסמו.

כדי לבודד גרעינים באיכות גבוהה מדגימות של גידולים מוצקים של מטופלים לצורך ריצוף מולטיומי (איור 1), רקמת הגידול נותקה ותרחיף של תא בודד נשמר בהקפאה (איור 2A-D). לאחר מכן הופשר מתלה התא בזמן לכידת המולטיום המתוכננת. לכידת גרעינים בוצעה עם ריאגנטים ותזמון אופטימליים של חיץ ליזיס כדי למקסם הן את האיכות והן את התפוקה (איור 3A-D). תמונות גרעינים מייצגות מציגות גודל וצורה מתאימים (איור 4A-C). הגרעינים המוקפים באפור בהיר מראים חבטה קלה של המעטפה.

איור 1: סכמה של זרימת עבודה של בידוד גרעינים. סכמטי המציג את זרימת העבודה הבסיסית מדגימת רקמת גידול שלמה לתרחיף גרעין יחיד המוכן להגשה ללכידת גרעינים, הכנת ספריית מולטיום, ובסופו של דבר ריצוף scRNA ו- ATAC. קיצורים: scRNA = RNA חד-תאי; ATAC-seq = בדיקה עבור כרומטין נגיש transposase עם ריצוף. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: עיכול רקמות, שימור בהקפאה, הערכת תאים ושלבי צנטריפוגה. (א) התקנת ציוד לטחינת דגימות רקמת גידול; (ב) שימור בהקפאה של תרחיף תאים; (C) הערכה מיקרוסקופית של השעיית תאים; (ד) גישה לצנטריפוגה לפרוטוקול זה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: הכנת ריאגנטים, מיצוי גרעינים וסינון. (א) הכנת ריאגנטים למיצוי גרעינים; (ב) המסת דיגיטונין ב-65°C לפני השימוש; (C) דגירה של דגימות לליזה של תאים על קרח; (D) סינון גרעינים שחולצו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: תמונות מיקרוסקופיות מייצגות של גרעינים שנקצרו מדגימות מורכבות של רקמת גידול. (A-C) תמונות מייצגות של גרעינים שנקטפו עם ובלי צביעת טריפאן כחולה. (ב,ג) הגרעינים המוקפים באפור בהיר מראים חבטה קלה של מעטפת הגרעין. נעשה שימוש במטרות פי 10 ופי 40. פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: פתרונות המשמשים בפרוטוקול זה.

התרת הסבך של אוכלוסיות התאים ההטרוגניות הקיימות במיקרו-סביבה של הגידול היא תחום פעיל של התמקדות בביולוגיה של סרטן. באופן דומה, רקמות מורכבות קיימות בפתולוגיות שפירות כגון ריפוי פצעים ופיברוזיס. ריצוף Multiome התגלה ככלי רב עוצמה המאפשר רכישה של נתוני scRNA ו- ATAC-seq מזווגים של תאים זהים. פרוטוקול זה מתאר בידוד של גרעינים, הדורש אופטימיזציה בהגדרת עיבוד דגימות גידול טריות, שבריריות וקטנות. כאן אנו מספקים פרוטוקול לבידוד גרעינים מדגימות רקמת גידול מוצקה דסמופלסטית. מצאנו שגישה זו מניבה נתונים אמינים ואיכותיים גם כאשר מתלי התאים מוקפאים לפני בידוד ולכידת גרעינים.

הגדלת ריכוז האלבומין לאורך הבדיקה מועילה בהגבלת התגבשות גרעיני התא ובמורד הזרם, מה שיכול להוות בעיה בעבודה עם דגימות גידול. במונחים של עיכול רקמות, ריאגנטים של ערכות עיכול יכולים לשמש גם עם פרוטוקול זה במידת הצורך (ראה טבלת חומרים). אם נעשה בו שימוש, אנו עדיין ממליצים לעקוב אחר חילופי העיכול/מרווה והחיץ של כל 30 דקות כדי למקסם את התפוקה של תאים בני קיימא. לאחר דיסוציאציה של רקמות, ניתן לבצע ליזה של תאי דם אדומים בהתאם לפרוטוקול היצרן. פרוטוקול הפרדת תאים הדרגתי יכול להתבצע גם על פי שיקול דעתו של החוקר (ראה טבלת חומרים). איננו מבצעים פרוטוקולים אלה באופן שגרתי, אך יישמנו פרוטוקולים כאלה על דגימות דומות ללא הבדלים ניכרים בתוצאות. אם ניתן להבחין בפסולת קטנה משמעותית לאחר סינון גרעינים, ניתן לשקול מיון גרעינים מופעל פלואורסצנטי (FANS) לטיהור נוסף. דיון מפורט ב-FANS, כולל המלצות לפרוטוקולים, זמין אך מעבר להיקפו של פרוטוקול זה. יש לציין כי ישנם פרוטוקולים בספרות המתייחסים לשלב קיבוע לפני ליזה של תאים. עם זאת, אנו מעדיפים להמשיך עם רקמות וגרעינים לא קבועים מכיוון ש- scATAC-seq פועל בצורה הטובה ביותר על רקמה לא קבועה⁹.

עבור ליזה של תאים, מכיוון שמעכב RNase הוא יקר למדי, סביר להקטין את הנפח המוכן של מאגר הליזה התאית (ואת מאגר דילול הליזה של התא) בהשוואה לנפחים שסופקו בפרוטוקול שפורסם, אם תרצה, כל עוד יחסי הריאגנטים נשארים פרופורציונליים. בעת הערכה וספירה של הגרעינים שנקטפו, ניתן ליישם ערכת כדאיות חיה/מתה/ציטוטוקסיות לפי שיקול דעתו של החוקר. ניתן להשתמש בצבע כחול טריפאן גם כדי לספק ניגודיות לצפייה בגרעינים ולסייע בהבחנה בין גרעינים לתאים שלא עברו ניתוח במידת הצורך. לבסוף, ראוי לציין כי יישמנו את אותם תנאי ליזה התא עם ריאגנטים מותאמים לכל פרוטוקול עבור תא יחיד ATAC-seq עם תוצאות מצוינות¹⁰.

שלבים קריטיים בפרוטוקול הם תזמון מדויק של ליזה וטיפול עדין אך יעיל בגרעינים. תת-ערבוב יוביל לליזה לא שלמה או לא עקבית של תאים; עם זאת, ערבוב יתר יגזור את הכרומטין. כפי שצוין בפרוטוקולים אחרים של בידוד גרעינים, ערבוב גרעינים צריך להתבצע על ידי פיפטינג ולא מערבולות של הדגימה מכיוון שכוחות הגזירה יכולים לפגוע בגרעינים השבירים¹¹. בהקשר זה, חשוב להכין את מאגר הליזה של התאים טרי ממש לפני השימוש בכל פעם. מאמץ תאי פיפטה קצה (סינון) לאחר שלב הצנטריפוגה הסופי הוא המפתח מניסיוננו למניעת התגבשות גרעינים לפני הלכידה. ניתן לחזור על סינון זה לפני הטעינה אם עדיין מזוהים גושים בספירה הסופית או מתפתחים במהלך הובלת הדגימה לפני הטעינה, תוך התחשבות באובדן הנוסף בנפח ובריכוז עם כל שלב סינון נוסף. יש לציין כי לא אמורה להיות הפסקת זמן משמעותית בין בידוד גרעינים לבין לכידה.

המגבלות של פרוטוקול זה הן דיסוציאציה של רקמות ובמיוחד, תזמון הדגירה של התא ליזה והתנאים עשויים להיות אופטימליים עבור סוגים שונים של גידולים מוצקים¹². פרוטוקול זה הותאם לגידולים מוצקים דסמופלסטיים כגון קרצינומה של השד ואדנוקרצינומה של הלבלב ויושם בהצלחה גם על רקמות דסמופלסטיות שאינן גידוליות כגון פיברוזיס פרנכימלי, אך סוגי גידולים אחרים עשויים לדרוש התאמות נוספות. הוא מותאם הן למתלי תאים טריים והן למתלי תאים קפואים עם תפוקת גרעינים מצוינת משני אלה. אנו ממליצים לבצע אופטימיזציה כזו ברצף החל מדיסוציאציה של רקמות, ולאחר שהושג תרחיף אופטימלי של תא בודד, לעבור לאופטימיזציה של תנאי הליזה של התא כדי להניב תרחיף אופטימלי של גרעין יחיד.

ריצוף ATAC חד-תאי ולאחרונה ריצוף מולטי-אומי מהווים כלי פורץ דרך אדיר להתרת ההטרוגניות התאית של הגידול המוצק. ניתן לתחום תת-סוגים של תאים על סמך נגישות הכרומטין שלהם ומאפייני ביטוי הגנים, וניתן לבחון ישירות את השפעת הנגישות והביטוי של פקטורי שעתוק על התנהגות הגידול. פיתוחים מתודולוגיים אלה מיושמים באופן נרחב בהתחשב בפוטנציאל העצום שלהם לחשוף מטרות טיפוליות חדשות. ככזה, פיתוח פרוטוקולים אופטימליים להשגת נתונים אלה הוא בעל חשיבות עליונה. כאן אנו חולקים פרוטוקול זה לבידוד גרעינים בהקשר של רקמת סרטן הלבלב - סוג סרטן שעבורו קיימים מעט טיפולים וכולם עם יעילות מוגבלת עד כה.

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

ברצוננו להודות למתקן הגנומיקה הפונקציונלית של סטנפורד (SFGF), במיוחד לדהננג'אי וואג וג'ון קולר, ול-10x Genomics על עזרתם במיטוב הניסויים שלנו. ברצוננו גם להודות לד"ר ג'ורג' פולטסיידס, מוניקה דואה, ברנדן ויסר ובירן לי על עזרתם בהשגת דגימות מטופלים. ברצוננו להודות לארט ולאיליין טיילור, קרן רנץ, וורן וג'ודי קפלן על תמיכתם הנדיבה במאמצי המחקר שלנו. מקורות המימון כוללים מענקי NIH 1F32CA23931201A1 (D.S.F.), 1R01GM116892 (M.T.L.), 1R01GM136659 (M.T.L.), קרן גולדמן זאקס (J.A.N., D.S.F., M.T.L.), הקרן לחקר הסרטן ע"ש דיימון ראניון (D.D., M.T.L.), קרן גאן/אוליבייה, המכון לרפואה רגנרטיבית בקליפורניה, קרן סטיינהרט/ריד ומעבדת הייגי לרפואה רגנרטיבית בילדים. הריצוף הושג באמצעות מכונות שנרכשו בקרנות NIH (S10OD025212, S10OD018220 ו- 1S10OD01058001A1).