Isolamento ottimizzato dei nuclei da campioni di tumore solido freschi e congelati per il sequenziamento di più omi

Il protocollo fornisce un approccio affidabile e ottimizzato all'isolamento dei nuclei da campioni di tumore solido per il sequenziamento multioma utilizzando la piattaforma 10x Genomics, comprese le raccomandazioni per le condizioni di dissociazione tissutale, la crioconservazione delle sospensioni a singola cellula e la valutazione dei nuclei isolati.

Il sequenziamento multiomico, che fornisce RNA a singola cellula/appaiata e il saggio per la cromatina accessibile alla trasposasi con dati di sequenziamento (sequenziamento ATAC), rappresenta una svolta nella nostra capacità di discernere l'eterogeneità delle cellule tumorali, un obiettivo primario della ricerca traslazionale sul cancro in questo momento. Tuttavia, la qualità dei dati di sequenziamento acquisiti utilizzando questa modalità avanzata dipende in larga misura dalla qualità del materiale in ingresso.

Le condizioni di digestione devono essere ottimizzate per massimizzare la resa cellulare senza sacrificare la qualità. Ciò è particolarmente impegnativo nel contesto di tumori solidi con matrici desmoplastiche dense che devono essere delicatamente scomposte per il rilascio cellulare. Le cellule appena isolate da tessuto tumorale solido sono più fragili di quelle isolate da linee cellulari. Inoltre, poiché i tipi di cellule isolate sono eterogenei, è necessario selezionare le condizioni per supportare la popolazione cellulare totale.

Infine, le condizioni di isolamento nucleare devono essere ottimizzate in base a queste qualità in termini di tempi di lisi e tipi/rapporti di reagenti. In questo articolo, descriviamo la nostra esperienza con l'isolamento nucleare per la piattaforma di sequenziamento multioma 10x Genomics da campioni di tumore solido. Forniamo raccomandazioni per la digestione tissutale, la conservazione di sospensioni unicellulari (se lo si desidera) e l'isolamento e la valutazione nucleare.

Con l'aumento della nostra conoscenza della biologia dei tumori, è aumentata anche l'importanza di analizzare cellule eterogenee nel microambiente tumorale ^1,2. La capacità di acquisire RNA a singola cellula e il saggio per la cromatina accessibile alla trasposasi con dati di sequenziamento (sequenziamento ATAC) dalla stessa cellula in modo accoppiato (sequenziamento multiomico) fornisce un progresso significativo verso questo obiettivo ^3,4. Tuttavia, questi esperimenti sono costosi e richiedono molto tempo e la qualità e l'impatto dei dati acquisiti dipendono fortemente dalla qualità delle condizioni sperimentali e dei materiali. Sono stati pubblicati protocolli standardizzati per l'isolamento dei nuclei ^5,6. I tessuti freschi ed eterogenei richiedono l'ottimizzazione del protocollo poiché le cellule appena isolate da campioni tumorali solidi sono più fragili di quelle isolate da linee cellulari.

Un'altra considerazione è che per i tumori solidi, i campioni chirurgici spesso non sono disponibili dalla sala operatoria fino a tarda ora. Pertanto, non è generalmente possibile procedere direttamente dall'acquisizione del campione alla cattura dei nuclei senza una fase di crioconservazione. Nella nostra esperienza, il congelamento di una sospensione unicellulare produce nuclei di altissima qualità (piuttosto che l'intero tessuto congelato o altre modalità di conservazione). Ciò è particolarmente vero per i tipi di tessuto enzimatico ad alto contenuto di RNasi come il pancreas.

Anche le condizioni di digestione dei tessuti devono essere progettate per massimizzare la resa cellulare senza sacrificare la qualità⁷. Nel contesto dei tipi di tumore solido con matrici desmoplastiche dense⁸, la matrice extracellulare deve essere delicatamente scomposta per il rilascio cellulare. Inoltre, poiché i tipi di cellule isolate sono eterogenei, le condizioni devono essere adattate per supportare la popolazione cellulare totale. Nel protocollo descritto vengono utilizzati campioni di carcinoma pancreatico umano (adenocarcinoma duttale pancreatico). Il cancro del pancreas rappresenta un tipo di tumore altamente desmoplastico, che fa presagire tessuti e cellule relativamente appiccicosi. Inoltre, poiché anche i campioni di tumore pancreatico disponibili per la ricerca tendono ad essere relativamente piccoli, vengono fatti sforzi per massimizzare la quantità di cellule catturate.

L'isolamento dei nuclei richiede la massima ottimizzazione in termini di condizioni e tempi di lisi cellulare, nonché di tipi e rapporti di reagenti. Anche la manipolazione dei nuclei nel corso dell'isolamento richiede grande attenzione. In questo articolo, descriviamo la nostra esperienza nell'ottimizzazione dell'isolamento nucleare per la piattaforma di sequenziamento multioma 10x Genomics da tessuto tumorale solido (Figura 1). Forniamo raccomandazioni per la digestione tissutale, la crioconservazione di sospensioni unicellulari (se lo si desidera) e l'isolamento nucleare.

I campioni di carcinoma pancreatico umano (adenocarcinoma duttale pancreatico) sono stati acquisiti secondo un protocollo approvato dall'IRB nel nostro laboratorio. È stato ottenuto il consenso informato dei pazienti per la raccolta dei tessuti. Il tessuto è stato trasportato dalla sala operatoria al laboratorio e poi processato come segue.

1. Dissociazione tissutale (digestione)

1. Preparare il tampone digestato (vedere la tabella dei materiali).
2. Ottenere il tessuto di interesse il prima possibile dopo l'escissione del tumore e trasportare il campione in tampone di tempra (DMEM F-12 con ~5% di siero fetale bovino) o 1x PBS su ghiaccio.
3. Tritare il tessuto utilizzando pinze e forbici pulite in 3-5 ml di tampone digestato in una capsula di Petri da 90 mm (Figura 2A).
4. Trasferire il tessuto tritato in una provetta conica da 50 mL e dissociarlo in ~10 mL di tampone digestato per 30 minuti a 37 °C utilizzando un bagno d'acqua con funzione di agitazione o un agitatore a secco.
5. Rimuovere dall'agitatore e spegnere con ~20 mL di mezzo di tempra. Filtrare la soluzione attraverso un colino cellulare da 100 μm in una provetta conica pulita.
6. Raccogliere il tessuto solido rimanente dal colino (tritare nuovamente i pezzi di tessuto rimanenti se necessario) e metterlo in ~10 mL di tampone digestato fresco per altri 30 minuti a 37 °C con agitazione. Ripetere fino a quando tutto il tessuto tumorale non è stato dissociato.
7. La sospensione della cella del pool aliquota e filtra attraverso un filtro cellulare da 70 μm seguito da un filtro cellulare da 40 μm in un tubo conico pulito su ghiaccio.
8. Centrifugare in celle di pellet a 500 × g per 5 minuti a 4 °C e poi travasare il surnatante.

2. Crioconservazione

1. Sciacquare le cellule risospendendo il pellet in 1 mL di 1x PBS.
2. Trasferire la sospensione cellulare (~1-10 milioni di cellule/provetta per un congelamento ottimale) in un crioviale da 1,5 mL su ghiaccio.
3. Centrifugare in celle di pellet a 500 × g per 5 minuti a 4 °C e poi travasare il surnatante.
4. Risospendere le cellule in 1 mL di soluzione di Bambanker, trasferirle in un crioviale da 1,5 o 2 mL (Figura 2B) e congelarle utilizzando un contenitore di congelamento a velocità di raffreddamento di -1 °C/min (contenente alcol isopropilico al 100%) a -80 °C, oppure trasferire in azoto liquido se si prevede una conservazione a lungo termine del campione.

3. Isolamento dei nuclei

1. Scongelare rapidamente il crioviale della sospensione cellulare e posizionarlo su ghiaccio bagnato.
2. Trasferire la sospensione cellulare scongelata in una provetta per microcentrifuga da 2 mL e rabboccare il flaconcino con una soluzione da 2 mL con 1x PBS per risciacquare le cellule.
3. Ottenere un conteggio manuale delle cellule utilizzando un emocitometro per valutare sia la quantità che la qualità delle cellule (Figura 2C).
4. Centrifugare in celle di pellet a 500 × g per 5 minuti a 4 °C e poi decantare delicatamente il surnatante utilizzando puntali di pipette progressivamente più piccoli per lasciare un pellet asciutto e mantenerlo sul ghiaccio.
   1. Utilizzare un rotore a benna oscillante per tutte le fasi di centrifugazione. Per ottenere la massima resa cellulare, posizionare le provette nella centrifuga con la cerniera rivolta verso l'esterno, quindi decantare con la punta della pipetta rivolta verso il lato opposto della provetta (Figura 2D).
      NOTA: Per decantare il surnatante, utilizzare puntali per pipette progressivamente più piccoli per rimuovere il fluido per limitare l'interruzione del pellet massimizzando al contempo il volume del fluido decantato. Questa strategia è particolarmente utile più avanti nel protocollo successivo all'estrazione dei nuclei, poiché il pellet di nuclei non è generalmente visibile.
5. Preparare 1x Cell Lysis Buffer, Cell Lysis Dilution Buffer e Wash Buffer (Figura 3A) secondo il protocollo pubblicato con le seguenti modifiche (vedere Tabella 1, Tabella dei materiali):
   NOTA: Posizionare la Digitonin su un blocco riscaldante a 65 °C prima dell'uso per sciogliere il precipitato (Figura 3B). Questa operazione richiede in genere circa 10 minuti.
6. Preparare il tampone di lisi cellulare 0,1x combinando 100 μL di 1x tampone di lisi cellulare e 900 μL di tampone di diluizione per lisi cellulare, pipettare delicatamente per mescolare e metterlo sul ghiaccio.
7. Risospendere il pellet cellulare in 100 μL di tampone di lisi cellulare 0,1x raffreddato e pipettare delicatamente per miscelare 5x.
8. Incubare su ghiaccio per 3 minuti (Figura 3C).
9. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio refrigerato e pipettare su e giù per mescolare delicatamente 5 volte.
10. Centrifugare per pellettare i nuclei a 500 × g per 5 minuti a 4 °C, travasare delicatamente il surnatante in un pellet secco e mantenere in ghiaccio.
    NOTA: Se il numero di cellule di partenza è basso (100.000-200.000 cellule), eseguire le fasi di lisi e lavaggio delle cellule in una provetta PCR da 200 μL anziché in una provetta da microcentrifuga da 2 mL per ridurre la superficie della provetta e ridurre al minimo le perdite. In questo caso, regolare il volume del tampone di lavaggio verso il basso per adattarlo al volume del tubo più piccolo.
11. Ripetere i passaggi 3.9-3.10 2 volte per un totale di tre lavaggi.
12. Contare manualmente i nuclei utilizzando un vetrino emocitometrico al microscopio. Se lo si desidera, utilizzare un colorante blu tripano per fornire contrasto per la visualizzazione dei nuclei e per aiutare a distinguere i nuclei dalle cellule non lisate.
13. Preparare 1x Nuclei Buffer secondo il protocollo pubblicato: 20x Nuclei Buffer stock, 1 mM DTT, 1 U/μL RNase Inhibitor in acqua priva di nucleasi e tenere in ghiaccio (vedere la tabella dei materiali).
14. Risospendere il pellet di nuclei in 1x Nuclei Buffer in base al recupero dei nuclei mirato.
    NOTA: Se la concentrazione è sufficientemente alta, puntare a un recupero mirato di 10.000 o leggermente superiore in questa fase (3.230-8.060 nuclei/μL) quando si determina il volume di risospensione iniziale, data la perdita di volume prevista di 25 μL e la diminuzione del 20% della concentrazione con il filtraggio (passaggio 3.15).
15. Far passare delicatamente il volume dei nuclei risospesi attraverso un filtro cellulare con punta per pipetta da 40 μm e posizionare i nuclei sul ghiaccio (Figura 3D).
16. Contate i nuclei (Figura 4A-C). Diluire ulteriormente la soluzione finale con Nuclei Buffer, se necessario.
17. Trasportare i nuclei sul ghiaccio e procedere immediatamente con la cattura dei nuclei secondo i protocolli pubblicati.

Per isolare nuclei di alta qualità da campioni di tumori solidi di pazienti per il sequenziamento del multioma (Figura 1), il tessuto tumorale è stato dissociato e una sospensione a singola cellula è stata crioconservata (Figura 2A-D). La sospensione cellulare è stata poi scongelata al momento della cattura pianificata del multioma. La cattura dei nuclei è stata condotta con reagenti tampone di lisi ottimizzati e tempistiche per massimizzare sia la qualità che la resa (Figura 3A-D). Le immagini rappresentative dei nuclei mostrano dimensioni e forma appropriate (Figura 4A-C). I nuclei cerchiati in grigio chiaro mostrano una lieve punteggiatura dell'involucro.

Figura 1: Schema del flusso di lavoro per l'isolamento dei nuclei. Schema che mostra il flusso di lavoro di base da un intero campione di tessuto tumorale a una sospensione a nucleo singolo pronta per l'invio per la cattura dei nuclei, la preparazione della libreria multioma e, infine, il sequenziamento di scRNA e ATAC. Abbreviazioni: scRNA = RNA unicellulare; ATAC-seq = saggio per la cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Digestione dei tessuti, crioconservazione, valutazione cellulare e fasi di centrifugazione. (A) Configurazione dell'attrezzatura per la triturazione di campioni di tessuto tumorale; (B) crioconservazione in sospensione cellulare; (C) valutazione microscopica della sospensione cellulare; (D) approccio alla centrifugazione per questo protocollo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Preparazione dei reagenti, estrazione dei nuclei e filtraggio. (A) Preparazione dei reagenti per l'estrazione dei nuclei; (B) dissoluzione della digitonina a 65 °C prima dell'uso; (C) incubazione di campioni per la lisi cellulare su ghiaccio; (D) filtraggio dei nuclei estratti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Immagini microscopiche rappresentative di nuclei prelevati da campioni di tessuto tumorale complesso. (A-C) Immagini rappresentative di nuclei raccolti con e senza colorazione Trypan Blue. (B,C) I nuclei cerchiati in grigio chiaro mostrano una lieve punteggiatura dell'involucro nucleare. Obiettivi 10x e 40x utilizzati. Barre di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Soluzioni utilizzate in questo protocollo.

Districare le popolazioni cellulari eterogenee presenti nel microambiente tumorale è un'area di interesse attiva nella biologia del cancro. Allo stesso modo, i tessuti complessi esistono in patologie benigne come la guarigione delle ferite e la fibrosi. Il sequenziamento multioma è emerso come un potente strumento che consente l'acquisizione di dati scRNA- e ATAC-seq accoppiati nella stessa cellula. Questo protocollo descrive l'isolamento dei nuclei, che richiede un'ottimizzazione nell'ambito dell'elaborazione di campioni tumorali freschi, fragili e di piccole dimensioni. Qui forniamo un protocollo per l'isolamento dei nuclei da campioni di tessuto tumorale solido desmoplastico. Abbiamo scoperto che questo approccio produce dati affidabili e di alta qualità anche quando le sospensioni cellulari vengono congelate prima dell'isolamento e della cattura dei nuclei.

L'aumento della concentrazione di albumina durante il test è utile per limitare l'aggregazione delle cellule e dei nuclei a valle, che può essere un problema quando si lavora con campioni tumorali. In termini di digestione tissutale, i reagenti del kit di digestione possono essere utilizzati anche con questo protocollo, se lo si desidera (vedere la tabella dei materiali). Se utilizzato, consigliamo comunque di seguire gli scambi di digestione/spegnimento e tampone ogni 30 minuti per massimizzare la resa delle cellule vitali. Dopo la dissociazione dei tessuti, la lisi dei globuli rossi può essere eseguita secondo il protocollo del produttore. A discrezione del ricercatore può essere eseguito anche un protocollo di separazione cellulare a gradiente (vedi Tabella dei materiali). Non eseguiamo questi protocolli di routine, ma li abbiamo applicati a campioni simili senza differenze significative nei risultati. Se si notano piccoli detriti significativi dopo il filtraggio dei nuclei, si può prendere in considerazione il Fluorescence-Activated Nuclei Sorting (FANS) per un'ulteriore purificazione. Una discussione dettagliata di FANS, comprese le raccomandazioni del protocollo, è disponibile, ma esula dall'ambito di questo protocollo. Da notare che ci sono protocolli in letteratura che considerano una fase di fissazione prima della lisi cellulare. Tuttavia, preferiamo procedere con tessuti e nuclei non fissati, poiché scATAC-seq funziona meglio su tessuto non fissato⁹.

Per la lisi cellulare, poiché l'inibitore della RNasi è piuttosto costoso, è ragionevole ridurre il volume preparato del tampone di lisi cellulare (e del tampone di diluizione della lisi cellulare) rispetto ai volumi forniti nel protocollo pubblicato, se lo si desidera, purché i rapporti dei reagenti rimangano proporzionali. Durante la valutazione e il conteggio dei nuclei prelevati, è possibile applicare un kit di vitalità/citotossicità VIVO/MORTO a discrezione del ricercatore. Il colorante blu di tripano può anche essere utilizzato per fornire contrasto per la visualizzazione dei nuclei e per aiutare a distinguere i nuclei dalle cellule non lisate, se necessario. Infine, vale la pena notare che abbiamo applicato le stesse condizioni di lisi cellulare con reagenti aggiustati per protocollo per ATAC-seq a singola cellula con risultati eccellenti¹⁰.

I passaggi critici del protocollo sono la tempistica precisa della lisi e la manipolazione delicata ma opportuna dei nuclei. La sottomiscelazione porterà a una lisi cellulare incompleta o incoerente; Tuttavia, una miscelazione eccessiva taglierà la cromatina. Come osservato in altri protocolli di isolamento dei nuclei, la miscelazione dei nuclei deve essere effettuata mediante pipettaggio piuttosto che mediante vortice del campione, poiché le forze di taglio possono danneggiare i nuclei fragili¹¹. A questo proposito, è importante che il tampone di lisi cellulare sia preparato fresco appena prima dell'uso in ogni occasione. Il filtraggio delle cellule della punta della pipetta dopo la fase finale di centrifugazione è fondamentale, secondo la nostra esperienza, per evitare che i nuclei si aggreghino prima della cattura. Questo filtraggio può essere ripetuto prima del caricamento se vengono ancora rilevati grumi nel conteggio finale o si sviluppano durante il trasporto del campione prima del carico, tenendo presente l'ulteriore perdita di volume e concentrazione con ogni fase di filtrazione aggiunta. Da notare che non ci dovrebbe essere una pausa temporale significativa tra l'isolamento dei nuclei e la cattura.

I limiti di questo protocollo sono che la dissociazione tissutale e, in particolare, i tempi e le condizioni di incubazione della lisi cellulare potrebbero dover essere ottimizzati per diversi tipi di tumori solidi¹². Questo protocollo è stato ottimizzato per i tumori solidi desmoplastici come il carcinoma mammario e l'adenocarcinoma pancreatico ed è stato applicato con successo anche a tessuti desmoplastici non tumorali come la fibrosi parenchimale, ma altri tipi di tumore possono richiedere ulteriori aggiustamenti. È ottimizzato sia per le sospensioni cellulari fresche che per le sospensioni cellulari congelate con un'eccellente resa dei nuclei da entrambe. Si consiglia di perseguire tale ottimizzazione in sequenza a partire dalla dissociazione tissutale e, una volta ottenuta una sospensione unicellulare ottimale, passare all'ottimizzazione delle condizioni di lisi cellulare per produrre una sospensione mononucleo-nucleo ottimale.

Il sequenziamento ATAC a singola cellula e, più recentemente, il sequenziamento multioma rappresentano un enorme strumento rivoluzionario per districare l'eterogeneità cellulare dei tumori solidi. I sottotipi cellulari possono essere delineati in base sia alla loro accessibilità alla cromatina che alle caratteristiche di espressione genica, e l'influenza dell'accessibilità e dell'espressione del fattore di trascrizione sul comportamento del tumore può essere esaminata direttamente. Questi progressi metodologici vengono ampiamente applicati, dato il loro enorme potenziale per scoprire nuovi bersagli terapeutici. Pertanto, lo sviluppo di protocolli ottimizzati per ottenere questi dati è della massima importanza. Qui condividiamo questo protocollo per l'isolamento dei nuclei nel contesto del tessuto tumorale del pancreas, un tipo di cancro per il quale esistono poche terapie e tutte con efficacia limitata fino ad oggi.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Vorremmo ringraziare la Stanford Functional Genomics Facility (SFGF), in particolare Dhananjay Wagh e John Coller, e 10x Genomics per la loro assistenza nell'ottimizzazione dei nostri esperimenti. Vorremmo anche ringraziare i dottori George Poultsides, Monica Dua, Brendan Visser e Byrne Lee per la loro assistenza nell'acquisizione di campioni di pazienti. Vorremmo ringraziare Art ed Elaine Taylor, la Rantz Foundation, e Warren e Judy Kaplan per il loro generoso sostegno ai nostri sforzi di ricerca. Le fonti di finanziamento includono le sovvenzioni NIH 1F32CA23931201A1 (DSF), 1R01GM116892 (M.T.L.), 1R01GM136659 (M.T.L.), Goldman Sachs Foundation (J.A.N., D.S.F., M.T.L.), la Damon Runyon Cancer Research Foundation (D.D., M.T.L.), il Gunn/Olivier Fund, il California Institute for Regenerative Medicine, Stinehart/Reed Foundation e l'Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine. Il sequenziamento è stato ottenuto utilizzando macchine acquistate con fondi NIH (S10OD025212, S10OD018220 e 1S10OD01058001A1).