マルチオームシーケンシングのための新鮮および凍結固形腫瘍標本からの最適化された核分離(英語)

このプロトコルは、10x Genomicsプラットフォームを使用したマルチオームシーケンシングのための固形腫瘍標本からの核の分離に信頼性が高く最適化されたアプローチを提供し、組織解離条件、単一細胞懸濁液の凍結保存、および単離された核の評価に関する推奨事項を含みます。

マルチオームシーケンシングは、同一細胞/ペアのシングルセルRNAおよびトランスポザーゼアクセス可能なクロマチンのアッセイとシーケンシング(ATACシーケンシング)データを提供し、現時点でのトランスレーショナルがん研究の主な焦点である腫瘍細胞の不均一性を識別する能力のブレークスルーを表しています。しかし、この高度なモダリティを用いて得られたシーケンシングデータの品質は、インプット材料の品質に大きく依存します。

品質を犠牲にすることなく細胞収量を最大化するには、消化条件を最適化する必要があります。これは、細胞放出のために穏やかに分解する必要がある高密度の線維形成マトリックスを伴う固形腫瘍の状況で特に困難です。固形腫瘍組織から新たに単離された細胞は、細胞株から単離された細胞よりも脆弱です。さらに、単離された細胞タイプは不均一であるため、全細胞集団をサポートする条件を選択する必要があります。

最後に、核分離条件は、溶解時間と試薬の種類/比率の観点から、これらの品質に基づいて最適化する必要があります。本稿では、固形腫瘍標本からの10x Genomicsマルチオームシーケンシングプラットフォームの核分離に関する当社の経験について説明します。組織消化、単一細胞懸濁液の保管(必要な場合)、核の単離と評価に関する推奨事項を提供します。

腫瘍生物学に関する知識が深まるにつれて、腫瘍微小環境全体で不均一な細胞を分析することの重要性も高まっています^1,2。シングルセルRNAと、同じ細胞からペアセル方式(マルチオームシーケンシング)でトランスポザーゼアクセス可能なクロマチンとシーケンシング(ATACシーケンシング)データを取得する能力は、この目的に向けて大きな進歩をもたらします^3,4。しかし、これらの実験には費用と時間がかかり、得られたデータの品質と影響は、実験条件と材料の品質に大きく依存します。核単離のための標準化されたプロトコル^{が公開されています5,6}。固形腫瘍標本から新たに単離された細胞は、細胞株から単離された細胞よりも脆弱であるため、新鮮で不均一な組織にはプロトコルの最適化が必要です。

また、固形腫瘍の場合、手術標本が手術室から夜遅くまで手に入らないことが多いことも考慮する必要があります。そのため、凍結保存ステップなしでサンプル取得から核捕捉に直接進むことは一般的には不可能です。私たちの経験では、単一細胞懸濁液を凍結すると、(組織全体を瞬間凍結したり、他の保存方法ではなく)最高品質の核が得られます。これは、膵臓などのRNase含量の高い酵素組織タイプに特に当てはまります。

また、組織消化条件は、品質を犠牲にすることなく細胞収量を最大化するように設計する必要があります⁷。緻密な線維形成マトリックス⁸を有する固形腫瘍型では、細胞外マトリックスを細胞放出のために穏やかに分解しなければならない。さらに、単離された細胞タイプは不均一であるため、全細胞集団をサポートするように条件を調整する必要があります。ヒト膵臓がん(膵管腺がん)サンプルは、説明されているプロトコルで使用されます。膵臓がんは、高度に線維形成性の高い腫瘍タイプであり、比較的粘着性の組織や細胞の前兆です。また、研究に利用できる膵臓腫瘍の標本も比較的少ない傾向にあるため、捕捉する細胞の量を最大化するための努力が払われています。

核の単離には、細胞溶解の条件とタイミング、試薬の種類と比率の点で最も最適化が必要です。単離の過程で核を取り扱うことにも細心の注意が必要です。本稿では、固形腫瘍組織からの10x Genomicsマルチオームシーケンシングプラットフォームの核分離を最適化した経験について述べる(図1)。組織消化、単一細胞懸濁液の凍結保存(必要な場合)、および核単離に関する推奨事項を提供します。

ヒト膵臓癌(膵管腺癌)のサンプルは、IRBが承認したプロトコルに従って私たちの研究室で取得されました。組織採取について患者からインフォームドコンセントが得られました。組織は手術室から実験室に運ばれ、その後次のように処理されました。

1.組織の解離(消化)

1. ダイジェストバッファーを調製します( 材料表を参照)。
2. 腫瘍切除後、できるだけ早く目的の組織を採取し、検体をクエンチバッファー(~5%のウシ胎児血清を含むDMEM F-12)または氷上で1x PBSで輸送します。
3. 清潔な鉗子とハサミを使用して、90 mmのシャーレに3〜5 mLのダイジェストバッファーを入れて組織をみじん切りにします(図2A)。
4. ミンチにした組織を50 mLのコニカルチューブに移し、~10 mLのダイジェストバッファー中で、振とう機能付きウォーターバスまたはドライアジテーターを使用して37°Cで30分間解離します。
5. 攪拌機から取り出し、~20 mLの急冷培地で急冷します。溶液を100 μmのセルストレーナーで濾過し、清潔なコニカルチューブに入れます。
6. ストレーナーから残りの固形組織を回収し(必要に応じて残りの組織片を再ミンチします)、~10 mLの新鮮なダイジェストバッファーに37°Cでさらに30分間、攪拌します。すべての腫瘍組織が解離するまで繰り返します。
7. 細胞懸濁液のアリコートをプールし、70 μmのセルストレーナーでろ過し、続いて40 μmのセルストレーナーで氷上の清潔なコニカルチューブに入れます。
8. 遠心分離機で細胞を500 × g 、4°Cで5分間ペレット化し、上清をデカントします。

2. 凍結保存

1. ペレットを1 mLの1x PBSに再懸濁して細胞をすすぎます。
2. 細胞懸濁液(最適な凍結のために1~1,000万個の細胞/チューブ)を氷上の1.5 mLクライオバイアルに移します。
3. 遠心分離機で細胞を500 × g 、4°Cで5分間ペレット化し、上清をデカントします。
4. 細胞を 1 mL の Bambanker 溶液に再懸濁し、1.5 mL または 2 mL のクライオバイアルに移し(図 2B)、-80 °C で -1 °C/分の冷却速度凍結容器(100% イソプロピルアルコールを含む)を使用して凍結するか、サンプルの長期保存が予想される場合は液体窒素に移します。

3. 核の単離

1. 細胞懸濁液のクライオバイアルを速やかに融解し、ウェットアイス上に置きます。
2. 融解した細胞懸濁液を2 mLの微量遠心チューブに移し、バイアルを2 mLの溶液に1x PBSで補充して細胞をすすぎます。
3. 血球計算盤を使用して手動で細胞数を取得し、細胞の量と質の両方を評価します(図2C)。
4. 遠心分離機で細胞を500 × g 、4°Cで5分間ペレット化した後、徐々に小さくなるピペットチップを使用して上清を静かにデカントし、乾燥ペレットを残して氷上で維持します。
   1. すべての遠心分離ステップにスイングバケットローターを使用してください。細胞収量を最大化するには、ヒンジを外側に向けてチューブを遠心分離機に入れ、ピペットチップをチューブの反対側に向けてデカントします(図2D)。
      注:上清をデカントする場合は、徐々に小さくなるピペットチップを使用して液体を除去し、デカントする液体の量を最大化しながらペレットの破壊を制限します。この戦略は、核ペレットが一般に見えないため、核抽出後のプロトコルで特に役立ちます。
5. 公表されているプロトコルに従って、1x Cell Lysis Buffer、Cell Lysis Dilution Buffer、およびWash Buffer(図3A)を調製し、以下の変更を加えます( 表1、材料表を参照)。
   注:使用前にジギトニンを65°Cの加熱ブロックに置き、沈殿物を溶解してください(図3B)。通常、これには約 10 分かかります。
6. 1x Cell Lysis Buffer 100 μLとCell Lysis Dilution Buffer(細胞溶解希釈バッファー900 μL)を混ぜ合わせて0.1x Cell Lysis Bufferを調製し、ピペットで静かに混合し、氷上に置いてください。
7. 細胞ペレットを100 μLの冷やした0.1x Cell Lysis Bufferに再懸濁し、ピペットで静かに5回混合します。
8. 氷上で3分間インキュベートします(図3C)。
9. 冷やしたWash Bufferを1 mL加え、ピペットで上下させ、5回静かに混ぜ合わせます。
10. 遠心分離機で核を500 × g で4°Cで5分間ペレット化し、上清を乾燥ペレットに静かにデカントし、氷上で維持します。
    注:開始細胞数が少ない場合(100,000-200,000細胞)、2 mLの微量遠心チューブではなく200 μLのPCRチューブで細胞溶解と洗浄のステップを行い、チューブの表面積を減らし、損失を最小限に抑えます。この場合、洗浄バッファーの容量を下げて、チューブの容量を小さくします。
11. 手順3.9〜3.10を2回繰り返して、合計3回洗浄します。
12. 顕微鏡下で血球計算盤のスライドを使用して、手動で核を数えます。必要に応じてトリパンブルー色素を使用して、核を見るためのコントラストを提供し、未溶解細胞から核を区別しやすくします。
13. 公表されているプロトコルに従って、1x Nuclei Buffer Stock(20x Nuclei Buffer stock、1 mM DTT、1 U/μL RNase Inhibitor)をヌクレアーゼフリー水に調製し、氷上に保管します( 材料表を参照)。
14. 目標を目標とする核回収率に基づいて、核ペレットを1x Nuclei Bufferに再懸濁します。
    注:濃度が十分に高い場合は、25 μLの予想される容量損失とろ過による濃度の20%の減少(ステップ3.15)を考慮して、開始再懸濁量を決定する際に、このステップで10,000またはわずかに高い回収率(3,230-8,060 nuclei/μL)を目指してください。
15. 再懸濁した核ボリュームを40 μmのピペットチップセルストレーナーに静かに通し、核を氷上に置います(図3D)。
16. 核を数え直します(図4A-C)。必要に応じて、最終溶液をNuclei Bufferでさらに希釈します。
17. 氷上で核を輸送し、公開されているプロトコルに従ってすぐに核の捕獲を進めます。

マルチオームシーケンシングのために患者の固形腫瘍標本から高品質の核を単離するために(図1)、腫瘍組織を解離し、単一細胞懸濁液を凍結保存しました(図2A-D)。その後、細胞懸濁液は、計画されたマルチオーム捕獲時に融解しました。核の捕捉は、品質と収量の両方を最大化するために、最適化された溶解バッファー試薬とタイミングで行いました(図3A-D)。代表的な核画像は、適切なサイズと形状を示しています(図4A-C)。淡い灰色で囲まれた核は、エンベロープの軽度の点描を示しています。

図1:核単離ワークフローの概略図。 腫瘍組織標本全体から、核の捕捉、マルチオームライブラリの調製、そして最終的にはscRNAおよびATACシーケンシングのために提出する準備ができている単一核懸濁液までの基本的なワークフローを示す概略図。略語:scRNA =シングルセルRNA;ATAC-seq = シーケンシングによるトランスポザーゼアクセス可能クロマチンのアッセイ。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:組織消化、凍結保存、細胞評価、遠心分離のステップ。 (A)腫瘍組織標本をミンチするための装置のセットアップ。(b)細胞懸濁液凍結保存;(c)細胞懸濁液の顕微鏡的評価、(D)このプロトコルの遠心分離へのアプローチ。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:試薬の調製、核抽出、ろ過 。 (a)核抽出試薬の調製、(B)使用前に65°Cでジギトニンを溶解する。(C)氷上での細胞溶解のためのサンプルのインキュベーション、(D)抽出した核の濾過。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:複雑な腫瘍組織標本から採取した核の代表的な顕微鏡画像。 (A-C)トリパンブルー染色あり/なしの核の代表的な画像。(B、C)淡い灰色で囲まれた原子核は、核膜の軽度の点描を示しています。10倍と40倍の対物レンズを使用。スケールバー = 50 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

表1:このプロトコルで使用されるソリューション。

腫瘍微小環境に存在する不均一な細胞集団を解きほぐすことは、がん生物学における活発な焦点分野です。同様に、創傷治癒や線維症などの良性の病状には複雑な組織が存在します。マルチオームシーケンシングは、同じ細胞のペアのscRNAおよびATAC-seqデータの取得を可能にする強力なツールとして登場しました。このプロトコルは新しく、壊れやすい、小さい腫瘍の標本を処理することの設定の最適化を要求する核の隔離を記述する。ここでは、線維形成性固形腫瘍組織標本からの核分離のプロトコルを提供します。このアプローチにより、核の単離や捕獲前に細胞懸濁液を凍結した場合でも、信頼性の高い高品質のデータが得られることがわかっています。

アッセイ全体を通してアルブミン濃度を上げることは、腫瘍サンプルを扱う際に問題となる細胞および下流の核の凝集を制限するのに役立ちます。組織消化に関しては、必要に応じて消化キット試薬をこのプロトコルで使用することもできます( 材料表を参照)。使用する場合でも、生細胞の収量を最大化するために、30分ごとの消化/クエンチおよびバッファー交換に従うことをお勧めします。組織解離後、赤血球溶解はメーカーのプロトコルに従って行うことができます。グラジエント細胞分離プロトコルは、研究者の裁量で実施することもできます( 材料表を参照)。これらのプロトコルを日常的に実施しているわけではありませんが、同様のサンプルに同様のプロトコルを適用しましたが、結果に顕著な違いはありません。核濾過後に重大な小さな破片が認められた場合は、さらなる精製のために蛍光活性化核選別(FANS)を検討することができます。プロトコルの推奨事項を含む FANS の詳細な説明は利用可能ですが、このプロトコルの範囲を超えています。注目すべきは、細胞溶解前の固定ステップを検討するプロトコルが文献にあることです。しかし、scATAC-seqは固定されていない組織⁹に最も適しているため、非固定組織および核で進めることを好みます。

細胞溶解の場合、RNase阻害剤は非常に高価であるため、試薬の比率が比例している限り、必要に応じて、公開されたプロトコルで提供されている容量と比較して、細胞溶解バッファー(および細胞溶解希釈バッファー)の調製量をスケールダウンするのが合理的です。採取した核を評価およびカウントする場合、研究者の裁量でLIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kitを適用できます。トリパンブルー色素は、核を見るためのコントラストを提供し、必要に応じて未消化細胞から核を識別するためにも使用できます。最後に、シングルセルATAC-seqに対して、プロトコルごとに調整された試薬で同じ細胞溶解条件を適用し、優れた結果を得たことは注目に値します¹⁰。

プロトコルの重大なステップは核の換解そして穏やかで、しかし便宜的な処理の正確なタイミングである。混合が不十分な場合、細胞溶解が不完全または不整合になります。ただし、過剰に混合するとクロマチンがせん断されます。他の核単離プロトコルで述べられているように、核の混合は、せん断力が壊れやすい核を損傷する可能性があるため、サンプルのボルテックスではなくピペッティングによって達成されるべきである¹¹。この点に関して、細胞溶解バッファーは、その都度、使用直前に新鮮に調製することが重要です。最後の遠心分離ステップ後のピペットチップの細胞ひずみ(ろ過)は、捕捉前に核の凝集を防ぐための重要な経験です。このろ過は、最終カウントで凝集塊が検出された場合、またはロード前の試料の輸送中に発生する場合は、ローディング前に繰り返すことができ、各ろ過ステップが追加されると体積と濃度がさらに失われることを念頭に置いています。注目すべきは、核の単離と捕捉の間に大きな時間的休止があってはならないということです。

このプロトコルの限界は、組織の解離、特に細胞溶解のインキュベーションのタイミングと条件が、異なる固形腫瘍の種類に合わせて最適化する必要があるかもしれないことです¹²。このプロトコルは、乳がんや膵臓腺がんなどの線維形成性固形腫瘍に最適化されており、実質線維症などの非腫瘍線維形成組織にも正常に適用されていますが、他の腫瘍タイプでは追加の調整が必要になる場合があります。新鮮な細胞懸濁液と凍結細胞懸濁液の両方に最適化されており、どちらも優れた核収率が得られます。このような最適化は、組織の解離から順次進め、最適な単一細胞懸濁液が得られたら、最適な単核懸濁液が得られるように細胞溶解条件の最適化に移ることをお勧めします。

シングルセルATACシーケンシング、そして最近ではマルチオームシーケンシングは、固形腫瘍細胞の不均一性を解きほぐすための非常に画期的なツールです。細胞サブタイプは、クロマチンアクセシビリティと遺伝子発現特性の両方に基づいて描写することができ、転写因子のアクセシビリティと発現が腫瘍挙動に及ぼす影響を直接調べることができます。これらの方法論の進歩は、新しい治療標的を発見する大きな可能性を秘めているため、広く適用されています。そのため、これらのデータを取得するための最適化されたプロトコルの開発が最も重要です。ここでは、膵臓がん組織(治療法がほとんど存在せず、現在まで有効性が限られているがんタイプ)の文脈で核を分離するためのこのプロトコルを共有します。

著者には開示すべき利益相反はありません。

Stanford Functional Genomics Facility(SFGF)、特にDhananjay Wagh氏とJohn Coller氏、そして10x Genomics氏には、実験の最適化に協力していただいたことに感謝いたします。また、患者検体の入手に協力してくださったGeorge Poultsides博士、Monica Dua博士、Brendan Visser博士、Byrne Lee博士にも感謝します。アート・テイラーとエレイン・テイラー、ランツ財団、ウォーレン・カプランとジュディ・カプランには、私たちの研究活動に寛大な支援をしてくれたことに感謝します。資金源には、NIH助成金1F32CA23931201A1(D.S.F.)、1R01GM116892(M.T.L.)、1R01GM136659(M.T.L.)、ゴールドマン・サックス財団(J.A.N.、D.S.F.、M.T.L.)、デイモン・ラニヨンがん研究財団(D.D.、M.T.L.)、ガン/オリビエ基金、カリフォルニア再生医学研究所、スタインハート/リード財団、およびHagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicineが含まれます。シーケンシングは、NIHの資金で購入したマシン(S10OD025212、S10OD018220、および1S10OD01058001A1)を使用して取得しました。