설치류 근육 세포에서 심장 수축 기능 장애 및^{Ca 2+} 과도 현상 분석

분리된 쥐 근세포에서 칼슘(^{Ca 2+}) 과도 측정과 함께 근절 길이 검출을 통한 수축 기능의 측정을 설명하는 일련의 프로토콜이 제시됩니다. 심부전 동물 모델에서의 연구에 대한이 접근법의 적용도 포함됩니다.

수축성 기능 장애 및^{Ca 2+} 과도 현상은 종종 심장 유발 손상 및/또는 리모델링에 대한 포괄적인 평가의 일부로 세포 수준에서 분석됩니다. 이러한 기능적 변화를 평가하기 위한 한 가지 접근법은 원발성 성인 심장 근세포에서 무부하 단축 및^{Ca 2+} 과도 분석을 활용합니다. 이 접근법을 위해, 성체 근세포는 콜라게나제 소화에 의해 분리되고,^{Ca 2+} 에 내성이 있게 된 다음, 라미닌 코팅 커버슬립에 부착된 다음, 무혈청 배지에서 전기 페이싱을 한다. 일반적인 프로토콜은 성인 쥐 심장 근육 세포를 사용하지만 다른 종의 원발성 근육 세포에 대해 쉽게 조정할 수 있습니다. 손상된 심장에서 근육 세포의 기능적 변화는 가짜 근육 세포 및 / 또는 시험관 내 치료 치료와 비교 될 수 있습니다. 이 방법론에는 세포실 및 플랫폼 구성 요소와 함께 근세포 페이싱에 필요한 필수 요소가 포함됩니다. 이 접근법에 대한 자세한 프로토콜은 원시 데이터 분석뿐만 아니라 비율 측정 지표 Fura-2 AM으로 측정 된 근절 길이 감지 및 셀룰러^{Ca 2+} 과도 현상에 의한 무부하 단축을 측정하는 단계를 통합합니다.

심장 펌프 기능의 분석은 특히 심부전(HF)의 동물 모델에서 적절한 통찰력을 얻기 위해 다양한 접근법을 필요로 하는 경우가 많습니다. 심 초음파 또는 혈역학 적 측정은 생체 내 심장 기능 장애¹에 대한 통찰력을 제공하는 반면, 체외 접근법은 종종 기능 장애가 여기 결합 또는 활동 전위와 수축 기능 (예 : 여기 수축 [E-C] 결합)을 담당하는 근필라멘트 및 / 또는^{Ca 2+} 과도 현상의 변화로 인해 발생하는지 여부를 식별하는 데 사용됩니다. 시험관내 접근법은 또한 비용이 많이 들거나 힘든 생체내 치료 전략을 추구^{하기 전에 신경}호르몬, 벡터-유도된 유전적 변형 및 잠재적인 치료제2에 대한 기능적 반응을 스크리닝할 수 있는 기회를 제공한다.

HF ^5,6의 존재 및 부재 하에서 손상되지 않은 근세포에서의 무부하 단축 및^{Ca 2+} 과도 현상뿐만 아니라 손상되지 않은 섬유주³ 또는 투과화 된 근육 세포⁴에서의 힘 측정을 포함하여 시험관 내 수축 기능을 조사하기 위해 여러 접근법을 사용할 수 있습니다. 이러한 각 접근법은 심장 펌프 기능 ^2,7을 직접 담당하는 심장 근육 세포 수축 기능에 중점을 둡니다. 그러나, 수축 및 E-C 결합 둘 다의 분석은 단리된,^Ca2+ 내성 성인 근세포에서 근육 길이 및^Ca2+ 과도 현상의 단축을 측정함으로써 가장 자주 수행된다. 실험실은 이⁸단계를 위해 쥐 심장에서 근세포를 분리하기 위해 상세한 공개된 프로토콜을 활용합니다.

^{Ca 2+} 일시적 및 근섬유 모두 손상되지 않은 근세포의 단축 및 재연장에 기여하며 수축성 기능 장애에 기여할 수 있습니다 ^2,7. 따라서, 이 접근법은 시험관내 기능 분석에 Ca²⁺ 사이클링 기계와 미오필라멘트를 포함하는 온전한 근세포가 필요할 때 권장된다. 예를 들어, 온전한 단리된 근세포는^{유전자 전달9}을 통해 근필라멘트 또는^Ca2+ 순환 기능을 변형시킨 후 수축 기능을 연구하는 데 바람직하다. 또한, 다운스트림 제2 메신저 신호전달 경로의 영향 및/또는 치료제²에 대한 반응을 연구할 때 신경호르몬의 기능적 영향을 분석하기 위해 온전한 근세포 접근법이 제안된다. 단일 근육 세포에서 부하 의존적 힘의 대안적인 측정은 저온 (≤15 ° C)에서 막 투과화 (또는 스키닝) 후에^Ca2+ 과도 기여를 제거하고 근섬유 기능¹⁰에 초점을 맞추기 위해 가장 자주 수행됩니다. 손상되지 않은 근세포에서 부하 의존적 힘과^{Ca 2+} 과도 현상의 측정은 특히 신경 호르몬 신호 전달에 대한 반응을 측정하거나 치료제에 대한 스크린과 같이 더 높은 처리량이 필요한 경우 접근법¹¹의 복잡하고 기술적 인 도전으로 인해 드뭅니다. 심장 섬유주의 분석은 이러한 기술적 문제를 극복하지만 비근세포, 섬유증 및/또는 세포외^{기질 리모델링의} 영향을 받을 수도 있습니다2. 신생아 근세포 및 유도성 만능줄기세포(iPSC)로부터 유래된 근세포는 아직 성체 근필라멘트 단백질의 완전한 보체를 발현하지 못하고 일반적으로 성체 막대형 근세포에 존재하는 근필라멘트 조직의 수준이 부족하기 때문에 상술한 각각의 접근법은 성체 근세포를 함유하는 제제를 필요로^한다2. 현재까지 iPSC의 증거는 성체 이소 형으로의 완전한 전환이 배양^{12에서 134} 일 이상을 초과한다는 것을 나타냅니다.

HF에 대한 이 수집의 초점을 감안할 때, 프로토콜에는 실패한 것과 실패하지 않는 손상되지 않은 온전한 근세포에서 수축 기능을 구별하기 위한 접근 방식과 분석이 포함됩니다. 대표적인 예는 앞서 설명한 신장 상부 축착 후 18-20주 후에 연구된 쥐 근세포로부터 제공된다(^5,13). 그런 다음 가짜 처리 된 쥐의 근육 세포와 비교합니다.

여기에 설명된 프로토콜 및 이미징 플랫폼은 HF 발달 동안 막대 모양의 심장 근세포에서 단축 및^{Ca 2+} 과도 현상의 변화를 분석하고 모니터링하는 데 사용됩니다. 이 분석을 위해, 2 x 10^{4 Ca2+}-내성, 막대-형상의 근세포를 22^mm2 라미닌-코팅된 유리 커버슬립(CSs) 상에 플레이팅하고, 앞서⁸에 기술된 바와 같이 밤새 배양하였다. 이 이미징 플랫폼을 위해 조립된 구성 요소는 최적의 이미징에 사용되는 미디어 및 버퍼와 함께 재료 표에 제공됩니다. 소프트웨어를 사용한 데이터 분석 가이드와 대표 결과도 여기에 제공됩니다. 전체 프로토콜은 별도의 하위 섹션으로 나뉘며, 처음 세 섹션은 분리된 쥐 근세포 및 데이터 분석에 초점을 맞추고 세포 Ca²⁺ 과도 실험 및 근세포에서의 데이터 분석이 이어집니다.

설치류에 대해 수행 된 연구는 실험실 동물의 인도적 관리 및 사용에 관한 공중 보건 서비스 정책을 따랐으며 미시간 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 이 연구를 위해, 근육 세포는 체중이 200g⁵ 인 3-34 개월 된 Sprague-Dawley 및 F344BN 쥐≥ 분리되었습니다. 남성과 여성 요금이 모두 사용되었습니다.

1. 수축 기능 연구를 위한 근세포 페이싱

1. 분리 된 근육 세포의 각 세트에 대해 신선한 M199 기반 배지를 만듭니다 (재료 표). 페이싱 1일 전에, 플레이트 2 x 10^{4 Ca} 2+-내성, 막대 모양의 근세포를 앞서 설명한 바와 같이 22^mm2 라미닌 코팅 유리 커버슬립(CSS^{) 상에} 8.
2. 챔버를 준비하려면 각 챔버를 10% 표백제에 1시간 동안 담그십시오. 그런 다음 30-45분 동안 흐르는 수돗물로 챔버를 세척한 다음 30분 동안 5분마다 증류수를 교체한 다음 30분 동안 5분마다 탈이온수를 교체하고 탈이온수에서 최종 헹굼합니다.
3. 깨끗한 표면에서 챔버를 20-30분 동안 건조시킵니다(보충 그림 1A-C). 다음으로, UV는 생물안전 캐비닛에서 챔버를 각 방향으로 5분 동안 처리합니다(총 = 20분). 이 단계는 사전 멸균 된 챔버에는 필요하지 않습니다.
   주의 : UV 노출을 최소화하기 위해 해당 지역을 떠나십시오.
4. 챔버에서 덮개를 제거하고 각 웰에 3mL의 M199 기반 배지(재료 표 참조)를 추가하고(보충 그림 1B) 덮개를 교체하고 37°C 인큐베이터에서 5% CO2 및 20%_O2로 챔버를 예열합니다.
5. 250 ° C의 뜨거운 비드 멸균기에서 20-25 초 동안 집게를 소독하십시오. 예열 된 자극 챔버를 인큐베이터에서 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다.
6. 심장 근육 세포가 포함 된 각 커버 슬립 (CS)을 멸균 집게를 사용하여 자극 챔버의 개별 웰로 옮깁니다. CS를 한 번에 4개씩 전사한 후 나머지 4개의 CS를 전사하기 전에 10분 동안 가열하여 매체 온도를 유지합니다.
7. 바나나 잭을 한쪽 끝의 자극 챔버(보충 그림 1C)와 다른 쪽 끝의 자극기(보조 그림 1D)에 부착합니다.
8. 자극기 주파수를 0.2Hz로 설정하고 전압(~12V)을 설정하여 우물 내의 모든 막대 모양의 심장 근육 세포의 ~10%-20%에서 수축을 달성합니다. 수축하는 근육 세포의 수를 결정하려면 챔버를 4x에서 10x 배율의 도립 현미경 아래에 놓습니다.
9. 자극 챔버를 5%_CO2 의 37°C에서 인큐베이터에 놓는다(보충 그림 1E). 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 20-25분 동안 예열된 배지를 사용하여₁₂ 시간마다 배지를 교체합니다. 12시간마다 미디어를 교체한 상태에서 최대 3일 동안 전기 자극을 계속합니다.

2. 성체 쥐 심장 근세포의 수축 기능 분석

1. 실험 전에 37°C 인큐베이터에서 겔 팩과 배지를 30분 동안 예열합니다.
2. 재료 표에 나열되고 보충 그림 2에 표시된 수축 기능 플랫폼 구성 요소를 켜고 진한 빨간색(590nm) 필터가 있는 도립 현미경이 있는 진동 방지 테이블(보충 그림 2A-1)(보충 그림 2A-2,3) 및 CCD 컨트롤러에 연결된 CCD 카메라(보충 그림 2A-4)(보충 그림 2A-5 및 보충 그림 2C-5) 및 PC 컴퓨터와 통합됩니다(보충 그림 2B-14).
3. 연동 펌프에 튜브를 조립합니다(보충 그림 2A-8; 보충 그림 2A-8), 예열된 젤 팩을 튜브 홀더로 옮기고(보충 그림 2A-9), 진공을 켜고(보충 그림 2A-11) 세포 자극기의 전원을 켭니다(보충 그림 2B-13).
4. 매체가 있는 50mL 튜브를 절연 튜브 홀더(보충 그림 2A-9)에 놓고 연동 펌프 튜브를 통해 ~0.5mL/분으로 관류를 시작합니다(보충 그림 2E-8).
5. 소량의 예열된 배지를 소형 계량 보트(~2mL)에 추가합니다. 근육 세포를 포함하는 하나의 CS를 자극 챔버에서 계량 보트로 옮깁니다. 자극 챔버를 5%_CO2 배양기에서 37°C로 되돌린다.
6. 계량 보트에서 CS를 제거하고 밑면을 부드럽게 닦습니다. CS를 새로 그리스를 칠한 CS 챔버(보충 그림 2A, F-10, 검은색 화살표)로 옮기고 CS에 한 방울의 미디어(~200μL)를 부드럽게 추가합니다.
7. CS 위에 백금 전극 마운트를 놓고 (보충 그림 2F, 회색 화살표) 집게를 사용하여 새 CS를 맨 위에 놓습니다. CS 샌드위치 위에 상단 마운트(보충 그림 2F, 흰색 화살표)를 놓은 다음 2개 또는 4개의 #0 팬 헤드 나사를 설치하여 챔버 조립을 완료합니다.
8. 펌프 튜브 전체에 매체가 있으면 튜브를 예열기에 부착한 다음 예열기를 단계 2.7에서 조립된 CS 챔버에 연결합니다. 0.5mL/분으로 관류를 시작하고 챔버 아래에 티슈 와이프를 놓아 누출이 없는지 확인합니다.
9. CS 챔버를 스테이지 어댑터에 놓습니다. 관류 매체는 진공 시스템에 연결된 튜브로 챔버의 반대쪽 끝에 수집됩니다. 가열 시스템(보충 그림 2A, D-7)을 켜고 챔버, 대물렌즈 및 예열기를 ~5-10분 동안 평형화하여 37°C의 일정한 매체 온도를 달성합니다. 이 평형 시간 동안 현미경에서 40x 물 침지 대물렌즈로 근세포를 시각화합니다.
10. 막대 모양의 세포의 80%가 수축하는 데 필요한 설정(일반적으로 35-40V)의 1.5배로 전압을 설정하여 페이싱 자극기(보충 그림 2B-13)를 활성화합니다. 자극 주파수를 0.2Hz로 설정하여 수축 기능과 근세포 생존을 최적화합니다.
11. 지속적으로 관류되고 진행되는 근육 세포에서 수축성 단축 및 재 연장 흔적을 수집합니다. 단축 측정값을 수집하려면 CCD 컨트롤러(보충 그림 2B-5,C)와 I/O 컨트롤러 보드가 있는 전용 컴퓨터(보충 그림 2B-14, 재료 표 참조)에 연결된 CCD 카메라(보충 그림 2A-4)를 사용하십시오. 이 플랫폼은 쥐 근세포에서 육종 단축을 측정하지만, 유사한 결과가 근세포의 세로 가장자리에서 수집 된 근세포 측정에서 얻어진다 (Ecklerle et ^al.14 참조).
12. 근절 단축 추적을 수집하려면 컴퓨터에서 소프트웨어를 열고 확인을 선택한 다음 파일 > 새로 만들기를 선택합니다. [추적> Sarcomere 길이> 사용자 제한 편집 ]을 선택한 다음 일반적으로 2.0μm에서 1.5μm 사이의 최대값과 최소값을 설정하여 화면 템플릿을 준비합니다. 근세포에서 측정하기 전에 0.01mm 격자선으로 CCD 카메라를 보정합니다(그림 1D).
13. 근절 길이 추적을 기록하려면 파일 > 새로 만들기를 선택합니다. 수축하는 근세포를 식별하고 줄무늬 패턴이 수직이 되도록 카메라의 세로 축을 따라 근세포를 배치합니다(그림 1B).
14. 컴퓨터 마우스를 사용하여 관심 영역(ROI) 상자(분홍색 상자)를 근세포 위에 놓습니다(그림 1C). 수집 및 시작을 선택하여 수축 기능을 기록합니다. 낮은 자극 주파수 (≤0.5Hz)에서 각 근육 세포에서 60 초 동안 단축을 기록합니다.
15. CS당 5-10개 세포에서 근절 단축을 기록합니다. 연구에 작용제/길항제 치료가 포함된 경우 1 cell/CS에서 측정을 수행합니다. 별도의 예열된 매체와 다중 채널 연동 펌프에 로드된 다른 전용 관류 튜브를 준비하고 2.9.-2.14단계를 따릅니다. 근육 세포 수축 기능에 대한 약물 또는 신경 호르몬 전달의 영향을 측정합니다.
16. 주파수 범위에 걸친 단축을 측정하려면 각 주파수에서 근육 세포의 페이스를 측정하여 기록 전에 정상 상태 단축을 얻습니다⁵. 이러한 연구의 경우 관류 속도를 두 배로 늘리고 새로운 주파수에서 자극 후 15-20초 기록을 시작하여 0.2Hz 및 2Hz 범위의 주파수에 대해 일관된 정상 상태 수축 반응을 얻습니다. 일반적으로 주어진 자극 주파수 범위에서 단축을 위해 2개 이하의 근세포/CS를 기록합니다.
17. 기록을 분석할 때 신뢰할 수 있는 신호 평균 데이터를 얻기 위해 최소 7개의 수축/셀을 기록합니다(3단계 참조).

3. 분리된 근육세포의 수축 기능에 대한 데이터 분석

1. 시작하려면 파일을 선택하고 기록된 추적을 선택한 다음 열기를 선택합니다. 기본 추적의 탭 1 (왼쪽)을 선택한 다음 추적 맨 위에 있는 노란색 패널을 Sarc-Length로 설정합니다. 추적 및 2.12단계에서 준비한 화면 템플릿을 선택합니다.
2. 해석 템플릿을 준비하려면 t0의 정의 상자에서 작업, 단조 과도 해석 옵션, TTL 이벤트 마크 를 선택하고 메뉴에서 기준선(정지 근절 길이), t0에 대한 출발 속도(dep v), 피크(피크 높이 및 %피크 높이/기준선 또는 bl%피크 h), tPeak에 대한 반환 속도(ret v), t0를 사용하면 피크까지 50%(TTP 50_%), tPeak를 사용하여 기준 50%(TTR_50%)까지 걸리는 시간입니다. 템플릿 > 식별자 와 함께 분석 템플릿 저장을 선택하여 이러한 분석 옵션을 저장합니다. 각 추적을 분석하기 전에 이 분석 템플릿을 로드합니다.
3. 데이터 분석을 시작하려면 분석 범위에서 > 게이트 마크> 과도 상태 추가 > 변환을 선택합니다> 이제 0.2Hz에서 진행되는 근육 세포에 대해 -0.01 초에서 1.20 초까지의 시간 범위를 설정하십시오 (그림 2A, 원시 흔적의 하단 부분에 빨간색 표시). 더 높은 주파수에서 자극되는 근육 세포에 대해 더 짧은 시간 범위를 선택하십시오.
4. 작업 > 평균 이벤트를 선택하여 신호 평균 추적을 생성합니다. 신호 평균 기록이 원래 기본 트레이스 아래에 나타납니다.
5. 신호 평균 추적의 탭 1(화면 왼쪽)을 선택한 다음 위쪽 메뉴에서 표시를 선택한 다음 과도 추가를 선택합니다. 상단 메뉴 및 단조 과도 분석에서 연산을 선택하여 신호 평균 디스플레이 패널에 기준선 육종 길이, 피크 높이, bl%피크 h, dep v, ret v, TTP 50% 및 TTR_50%에 대한 신호 평균 값을 표시합니다.
6. 각 근절 과도 분석을 스프레드시트로 전송하여 여러 근세포의 복합 분석을 위해 [ > 단조 과도 분석 > 클립보드 전류] 내보내기를 선택합니다. 이 데이터를 각 추적의 스프레드시트에 붙여넣습니다.
7. 신호 평균 트레이스를 복사하려면 > 현재 트레이스 > 클립보드 > 옵션 내보내기 를 선택하고 소수 자릿수를 5로 설정한 다음 탭 구분 기호를 선택하고 확인을 클릭하고 확인을 클릭합니다. 각 근세포 기록에 대한 신호 평균 트레이스를 두 번째 스프레드시트에 붙여넣습니다.

4. 쥐 성인 심장 근육 세포에서 Ca²⁺ 과도 현상 기록

1. Ca 2+ 과도 상태를 측정하기 전에 추가 형광 이미징 구성 요소와 함께 단계 2.2에 설명된 플랫폼 구성 요소를 켭니다(재료 표의^{Ca 2+} 이미징 분석을 위한 추가 구성 요소 참조; 보충 그림 2A-5,6; 2B-12).
2. 디메틸설폭사이드(DMSO)에 1mM Fura-2AM과 0.5M 프로베네시드를 포함하는 Fura-2AM 스톡 용액을 준비합니다. 프로베네시드는 Fura-2AM 누출을 최소화합니다¹⁵.
3. 스톡 용액을 6-웰 플레이트의 한 웰에서 2.5mL의 배지( 재료 표 참조)에 5μM Fura-2AM 및 2.5mM 프로베네시드로 희석합니다. 플레이트의 추가 웰 3개에 2.5mL 배지(Fura-2AM 없음)를 추가하고 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 배지를 37°C로 예열합니다.
4. Cs 함유 근세포를 페이싱 챔버로부터 Fura-2AM을 함유하는 웰로 옮기고, 덮개를 덮고, 플레이트를 4분 동안 5%_CO2 를 갖는 37°C 인큐베이터로 되돌린다. 관류 펌프에 튜브를 장착하고 2.4단계에 설명된 대로 Fura-2AM 로딩 기간 동안 매체로 관류합니다.
5. 형광 광퇴색을 줄이고 형광 신호를 최적화하기 위해 실내 조명을 끄거나 최소화합니다. 인큐베이터로부터 6-웰 플레이트를 제거하고, 이어서 배지 단독을 함유하는 3개의 웰 각각에서 CS를 10초 동안 세척한다. CS를 예열된 매체가 들어 있는 소형 계량 보트로 옮깁니다(Fura-2AM이 추가되지 않음).
6. CS의 밑면을 부드럽게 닦은 후 새로 그리스를 칠한 CS 챔버에 CS를 장착합니다. CS에 미디어 한 방울을 부드럽게 추가한 다음 전극 마운트를 CS 위에 조립한 다음 두 번째 CS와 상단 마운트를 조립합니다. #0 팬 헤드 나사를 사용하여 2.6.-2.7단계에 설명된 대로 셀 챔버 조립을 완료합니다.
7. 매체로 채워진 펌프 튜브를 예열기에 연결하고 예열기를 CS 챔버에 연결하고 2.8단계에 설명된 대로 스테이지 어댑터에 넣습니다. 진공 튜브 시스템으로 매체를 수집하고 가열 시스템(보충 그림 2A,D-7)을 켜서 37단계-2.8.9단계에 설명된 대로 챔버를 37°C로 평형을 이룹니다.
8. 2.10단계에 설명된 대로 35-40V 및 0.2Hz로 설정된 페이싱 자극기(보충 그림 13B-2.10)를 활성화합니다.
9. Ca²⁺ 과도 상태를 기록하기 전에 컴퓨터 키보드 근처에 장착된 작은 손전등이나 북라이트를 켜서 키보드를 볼 수 있도록 하십시오. 또한 심장 근육 세포가없는 영역에서 형광 배경을 기록하십시오. 시작하려면 2.12단계에서 설명한 대로 파일 > 새로 시작 > 선택합니다.
10. ROI를 선택하고 원시 분자에 대해 하나의 탭(또는 왼쪽의 추적 막대)을 설정하고 원시 분모에 대해 두 번째 탭을 각 탭의 상단 중앙에 정의합니다. 10-20 초 동안 배경을 기록하십시오. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 하나의 트레이스 바 패널 위로 드래그하여 원시 신호 평균 분자 및 분모 값을 얻습니다. 연산 > 상수를 선택하여 이러한 값을 입력하고 원시 값을 입력합니다.
11. 쇼트닝 및 Ca²⁺ 과도 현상을 모두 수집하기 위해 새 화면 템플릿을 준비합니다. 근절 길이의 경우 탭 1 을 선택하고 2.13단계에서 설명한 것과 동일한 프로세스를 사용합니다. Ca²⁺ 이미징의 경우 탭 2 > 비율(탭 의 상단 중앙) > 추적 > 사용자 제한 편집을 선택하여 비율의 최소 및 최대 수준(일반적으로 1에서 5 사이로 설정됨)을 설정합니다. 동일한 프로세스를 사용하여 탭 3과 4(왼쪽)의 분자 및 분모 범위를 정의합니다.
12. 단계 2.14에 설명된 대로 근세포 이미지 위에 ROI 상자를 배치합니다. 파일 > 새 > 수집을 선택합니다. 이제 시작을 선택하여 단축 및 비율계량 Ca²⁺ 데이터를 수집합니다. 신호 평균 분석을 위해 셀당 ≥7 수축을 기록합니다.
13. 4.10단계에서 설명한 백그라운드 추적 기록을 반복합니다. 2-4 개의 근육 세포를 기록한 후. 일반적으로 배경 판독값에 상당한 변화가 있는 경우 4-5개의 근세포/CS 또는 더 적은 근세포를 기록합니다.

5. 분리된 근세포에서 Ca²⁺ 과도 현상의 데이터 분석.

1. 분석을 위해 원하는 파일을 열고 단축을 위한 템플릿 > 화면 템플릿 과 Ca²⁺ 과도 현상을 선택합니다. 그런 다음 탭 1과 2 (왼쪽)를 선택하여 각각 근절 길이와 Ca^{2 +} 비율을 표시합니다. 연산 > 상수를 선택하고 Ca²⁺ 백그라운드 추적에서 분자 및 분모 값을 입력합니다.
2. 단축과 Ca²⁺ 과도 데이터를 위한 분석 템플릿을 준비합니다. 탭 1(왼쪽)을 선택하고 3.2단계에서 설명한 것과 동일한 프로세스를 사용합니다. 을 클릭하여 근절 길이 분석 템플릿을 설정합니다.
3. 탭 2(왼쪽)를 선택하고 t0의 정의 상자에서 작업, 단조 과도 해석 옵션, TTL 이벤트 표시를 선택하고 메뉴에서 기준선(기초 비율), t0에 대한 출발 속도(dep v), 피크(피크 높이 및 %피크 높이/기준선 또는 bl%피크 h), tPeak에 대한 감쇠 속도(ret v), t0를 사용하면 피크까지 50%(TTP 50_%), tPeak를 사용하여 기준 50%(TTR_50%)까지 걸리는 시간입니다. 템플릿을 선택하여 이러한 분석 옵션을 저장하고 새 식별자 이름을 사용하여 분석 템플릿 저장을 선택합니다. 각 추적을 분석하기 전에 이 분석 템플릿을 로드합니다.
4. 3.3.-3.6단계에서 설명한 것과 동일한 프로세스를 사용합니다. 신호를 평균화 한 다음 근절 길이를 분석 한 다음 Ca²⁺ 과도 상태에 대해 동일한 단계를 수행합니다. 근절 길이와 Ca²⁺ 과도 비율 추적에 대해 별도의 표시를 설정합니다.

수축 기능 연구는 격리 다음날(2일차)부터 격리 후 최대 4일까지 쥐 근세포에 대해 수행됩니다. 근육 세포는 분리 다음 날 (즉, 2 일째)에 기록 될 수 있지만, 수축 기능을 수정하기 위해 유전자 전달 또는 치료 후 더 긴 배양 시간이 종종 필요합니다⁸. 분리 후 18시간 이상 배양된 근세포의 경우, 섹션 1에 설명된 페이싱 프로토콜은 t-세뇨관과 일관된 단축 및 재연장 결과를 유지하는 데 도움이 됩니다.

단축 연구를 위한 근세포를 포함하는 CS의 대표적인 부분이 ROI를 설정하기 전에 적절하게 배치된 근세포와 함께 도 1A에 도시되어 있다(도 1B). ROI가 식별되면(그림 1C, 분홍색 상자), 근세포 아래에 표시된 알고리즘 정보도 기록 전에 근세포 위치를 최적화하는 데 도움이 됩니다. 특히, 선형 광학 밀도 (LOD, 검은 색 선)는 육종의 수와 간격을 나타내는 지표이며, 고속 푸리에 변환 트레이스 (FFT, 빨간색 선)의 날카로운 전력 스펙트럼은 단축 및 재 연장 기록을위한 최적의 정렬을 달성하는 데 도움이됩니다. 근절 길이(및 에지 감지)의 교정에 사용되는 격자선 패턴은 그림 1D에 나와 있습니다. 근절 길이 단축에 대한 일반적인 정렬 기록은 섹션 3(하단 패널)에 설명된 신호 평균 분석과 함께 그림 2A (상단 패널)에 나와 있습니다.

기능장애는 동물 모델에서 생체내 기능장애가 있을 때 근육세포에서 종종 검출된다. 예를 들어, 압력 과부하 (PO)¹³에 대한 반응으로 심 초음파로 관찰 된 수축기 기능 장애는 근육 세포 단축 연구⁵에서도 감지됩니다. 데이터 트레이스를 설명하기 위해, 0.2Hz에서 얻어진 대표적인 원시 (그림 2; 상부 패널) 및 신호 평균 (하부 패널) 트레이스가 가짜 (그림 2A) 및 PO 처리 (그림 2B) 쥐로부터의 근세포에 대해 도시된다. 근세포 기능이 PO 후에 구제될 수 있는지 여부를 시험하기 위해, 근세포 단리시에 바이러스-매개 유전자 전달을 또한 육종¹⁶에서 내인성 심장 트로포닌 I (cTnI)를 포스포-모방 cTnI T144D 치환 (T144D)으로 대체하기 위해 사용하였다. 초기 분석은 cTnIT144D의 유전자 전달 4일 후에 PO 근세포에서 가짜 수준으로 돌아온 수축 기능의 PO-유도 감소(표 1, 상부 패널)를 보여준다(표 1; 하부 패널).

이 플랫폼은 또한 분리된 근세포의 단축과 함께 Ca²⁺ 과도 현상을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 쇼트닝 및 Ca2+는 PO 후에 기록되지 않았는데, 이는 PO가 라미닌 13에 대한 래트 근세포의 부착을 감소시키기 때문이며, 이전에 유사한 모델은 변경된^Ca2+ 취급이 유사한 시점 ¹⁷에서 발달하는 것을 보여주었다. 대신, 대표적인 실험은 2-3 개월 된 쥐로부터 분리 된 Fura-2AM 로딩 근육 세포에서 수행되었다. 대표적인 기록 및 신호 평균 트레이스가 표 2의 데이터 분석과 함께 그림 3에 나와 있습니다. 이러한 일련의 실험을 위해, cTnIT144D 또는 야생형 cTnI의 아데노바이러스 매개 유전자 전달 (감염의 다중성 = 100) 4일 후에 성인 래트로부터 단리된 근세포를 연구하였다. 근절 단축 및^{Ca 2+} 과도 현상은 모두 근세포에 Fura-2AM을 로딩한 후 측정하였다. cTnIT144D의 유전자 전달은 이러한 초기 연구에서 cTnI에 비해 피크 단축 및 이완기^Ca2+ 수준 상승을 향상시켰습니다(표 2). 보다 광범위한 분석이 필요하지만, 초기 결과는 cTnIT144D로의 생체 내 대체가 시간 경과에 따른 수축 기능 및^{Ca 2+} 처리의 변화로 인해 복잡한 심장 표현형을 생성 할 수 있음을 시사합니다.

그림 1: 기능 연구에 사용된 성체 쥐 심장 근세포. (A) 성인 래트로부터 대표적인 단리된 심장 근세포(스케일 바 = 50 μm). 화살표는 수축 기능 분석을 위해 이미징된 대표적인 근세포를 가리킨다. (b) 측면에 위치한 ROI(분홍색)를 갖는 대표적인 근세포(scale bar = 20 μm). (C) ROI를 갖는 대표적인 근세포(상부 패널), 이 근세포에 대한 근섬유 패턴(하부 패널, 청색; 스케일 바 = 20μm) 및 파워 스펙트럼의 날카로운 피크(하부 패널, 적색). (D) 단축 측정을 보정하기 위한 0.01mm 격자선의 화면 캡처. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 쥐 근세포의 대표적인 기록. 원시 기록 (상부 패널) 및 신호 평균 (하부 패널) 추적은 (A) 가짜 및 (B) 압력 과부하 (PO) 처리 된 쥐의 근육 세포에서 0.2Hz로 기록되었습니다. 근육 세포는 수술 후 18-20 주에 분리되었으며, PO는 신장 위 축착¹³에 의해 생성되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: Fura-2AM이 장착된 성인 심장 근세포에서 근섬유 길이(SL) 및^{Ca 2}+ 과도 현상의 대표적인 기록 및 분석. (A) SL, Ca2+ 과도 비율(ratio), 및^Ca2+ 과도 비율을 생성하는 데 사용되는 분자 및 분모 트레이스에 대한 원시 트레이스. (B) SL (상부 트레이스) 및^Ca2+ 과도 비 (하부 트레이스)에 대한 신호 평균 트레이스의 예. (C) 단조 추적 알고리즘을 사용하여 근절 길이 (SL) 및^Ca2+ 과도 비율에 대해 트레이스를 분석합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1 : 압력 과부하 (PO)와 유전자 전달에 대한 심장 근육 세포의 수축 기능 비교. 근세포 단축 결과는 수술 후 18-20주 후에 가짜 및 PO 쥐 심장(상부 패널)^5,13 및 cTnIT144D 유전자 전달 후 4일 후 가짜 및 PO 쥐의 근세포(하부 패널)에서 나온 것입니다. 수축 기능은 모든 그룹에서 근세포 분리/유전자 전달 후 4일 후에 측정됩니다. 결과는 평균± SEM(n=근세포의 수)으로 나타내었다. 각 가짜 및 PO 데이터 세트는 스튜던트 t-검정으로 비교되며, *p < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주됩니다. 가짜 및 PO 근세포 단독에 대한 피크 진폭 결과는 Ravichandran et ^al.5에서 이전에보고되었습니다.

표 2: cTnIT144D 유전자 전달 4일 후 성인 래트 근세포에서의 수축성 기능 및^Ca2+ 과도 현상. 수축 기능 (상부 패널) 및^Ca2+ 과도 현상 (하부 패널)의 분석은 야생형 cTnI와 비교하여 cTnIT144D의 유전자 전달 후 근육 세포에서 나타난다. 근세포는 2-3개월 된 성인 쥐로부터 분리되고, 데이터는 평균 ± SEM(n=근세포의 수)으로 제시된다. 수축 기능(왼쪽)과 Ca²⁺ 과도 현상(오른쪽)의 통계적 비교는 유의성이 *p < 0.05로 설정된 쌍을 이루지 않은 스튜던트 t-검정을 사용하여 수행됩니다.

보충 그림 1: 라미닌 코팅 CS에 도금된 근세포의 페이싱 시스템 구성 요소. (A) 각 챔버에 백금 전극을 포함하는 맞춤형 페이싱 챔버. (B) 처음 4 개의 챔버가 미디어로 채워진 페이싱 챔버. (C) 챔버 및 (D) 자극기에 연결된 바나나 잭 케이블에 부착 된 페이싱 챔버. (E) 자극기 (오른쪽)와 37 °C 인큐베이터 (왼쪽) 사이의 연결. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2: 근세포 수축 기능 및/또는 Ca²⁺ 과도 측정에 필요한 구성 요소. (A) 각 구성 요소를 보여주는 수축 기능 플랫폼, 번호가 매겨진 항목은 재료 표에 자세히 설명되어 있습니다. 플랫폼의 구성 요소에는 방진 테이블, 도립 명시야 현미경(#2,3), CCD 카메라, CCD 컨트롤러 및 크세논 전원 공급 장치, 이중 방출 광원, 온도 컨트롤러, 연동 펌프, 절연 튜브 홀더, 커버슬립 장착 관류 챔버(#10) 및 진공 시스템(#11)이 포함됩니다. (B) 추가 구성 요소에는 형광 계면(#12), 챔버 자극기(#13) 및 PC 컴퓨터(#14)가 포함되며 이는 재료 표에 자세히 설명되어 있습니다. 패널 A에 번호가 매겨진 항목의 클로즈업 보기가 C-F에 표시됩니다. (C) 크세논 전원 공급 장치(왼쪽)와 CCD 컨트롤러(오른쪽)의 모습. (D) 온도 조절기. (E) 연동 펌프. (F) #0 팬 헤드 나사가 있는 CS 관류 챔버(검은색 화살표), 백금 전극 마운트(회색 화살표) 및 상단 마운트(흰색 화살표)의 베이스를 봅니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

1단계에 설명된 만성 페이싱 프로토콜은 분리된 근세포를 연구하고 더 긴 치료의 영향을 평가하는 데 유용한 시간을 연장합니다. 우리 실험실에서는 만성적으로 진행되는 근육 세포에서 근절 길이를 사용하여 수축 기능을 측정 할 때 격리 후 최대 4 일까지 일관된 결과를 얻었습니다. 그러나 근세포 수축 기능은 근세포의 속도를 조절하기 위해 1주일 이상 된 배지를 사용할 때 빠르게 악화됩니다.

수축 기능 연구를 위해, 데이터는 쥐의 체온에 가까운 37 ° C에서 수집됩니다. 근세포 생존력을 최적화하고 각 근세포에 대해 일관된 흔적을 얻기 위해 이러한 실험은 쥐의 생리적 심박수 ~5Hz보다 낮은 페이싱 주파수에서 수행됩니다. 이러한 설정은 일관된 수축 기능 데이터를 생성하지만, 단축 트레이스가 동일한 근세포 치료 그룹을 포함하는 여러 CS에서 일관되게 유지되는 경우 챔버 온도 및/또는 페이싱 빈도를 조정할 수 있습니다. 또한, 결점이없고, CS에 완전히 부착되고, 막대 모양의 세포의 양쪽 끝에서 수축하는 근육 세포를 선택하여 최적의 결과를 얻을 수 있습니다. 한쪽 말단에만 부착된 세포, 여러 개의 블렝이 있는 세포 및/또는 한쪽 말단에만 수축하는 근세포는 바람직하지 않으며 배경 이동으로 인해 기록하기가 더 어려운 경우가 많습니다. 이러한 연구의 경우 ≥20 개의 근절이 ROI에 포함되어 날카로운 전력 스펙트럼 피크, 재현 가능한 휴식 근절 길이 및 단축 추적을위한 최적의 신호 / 잡음비를 달성합니다. 근절이 7개에 불과한 ROI는 전력 스펙트럼 피크가 선명하게 유지되는 경우 사용할 수 있습니다. 분리 된 쥐 근육 세포에서 휴식 근절 길이는 일반적으로 2.00-1.80 μm 범위입니다. 휴지기 근절 길이가 1.5μm 미만인 경우, 능동적 수축은 근절 아키텍처¹⁸ 에 대한 우리의 이해를 기반으로 현실적이지 않으며 일반적으로 차선의 근세포 배향의 결과입니다.

온전한 근육세포에서^Ca2+ 과도 측정을 포함하거나 포함하지 않는 수축 기능의 측정은 무손상 단일 세포(¹¹)에서 힘 측정에 필요한 기술적 전문 지식을 개발하는 데 더 적은 투자를 필요로 하는 더 높은 처리량 접근법이다. 손상되지 않은 근세포 연구는 또한 다세포 제제에서 다른 세포 유형의 기여 없이 근세포 기능에만 초점을 맞춥니다². 이 분야에서 새롭게 부상하는 분야는 보다 광범위한 생체 내 분석 전에 세포 수준에서 치료제의 스크리닝을 가속화하기 위해 여러 온전한 근세포에서 단축 및/또는^{Ca 2+} 과도 현상을 동시에 측정하여 더 높은 처리량 분석을 개발하는 것입니다.

수축 기능 및^{Ca 2+} 과도 측정은 쥐 근육 세포와 비교하여 몇 가지 중요한 고려 사항 및 차이점이 있지만 마우스와 같은 다른 설치류 모델로부터 분리 된 손상되지 않은 근육 세포에서도 가능합니다. 마우스 근세포는 24-36 시간 동안 배양에서 생존 할 수 있지만, 48 시간 이상 배양 된 근육 세포에서 생존력이 점진적으로 감소합니다¹⁹. 벡터 기반 유전자 전달을 사용할 때, 특히 반감기가^{시간 20}이 아닌 일인 myofilament 단백질의 경우 이 잘린 배양 간격을 고려해야 합니다. 쥐 근세포와는 달리, 마우스 근세포의 성공적인 분리 및 배양은 또한 2,3-부탄디온 모노옥심 또는 블레비스타틴과 같은 미오신 ATPase 억제제를 배양 배지¹⁹에 첨가하는 것에 의존한다. 결과적으로, 만성 페이싱은 마우스 근세포 배양에서 실행 가능한 옵션이 아닙니다. 분리된 마우스 근세포에 대한 이러한 미오신 억제제의 기능적 영향을 제거하기 위해 15-20분의 더 긴 평형 시간도 필요합니다. 마지막으로, 마우스 근세포는 쥐 근세포에 사용되는 0.2Hz와 비교하여 재현 가능한 단축 흔적을 얻기 위해 0.5Hz에서 최적으로 진행됩니다.

PO 처리 된 쥐에 대한 연구에서, 수축 기능 장애는 쥐 근육 세포에서 저주파 페이싱으로 일관되게 검출된다. 단축의 더 큰 빈도 의존적 감소는 생체 내 수축 기능 장애가있을 때 가짜 쥐에 비해 PO 후 근육 세포에서도 발견됩니다 ^5,13. 주파수 범위를 사용하는 연구 중에 적절한 매체를 제공하기 위해 펌프 속도를 두 배로 늘리면 자극 주파수를 0.2Hz에서 2Hz 사이로 변경한 후 15-20초 이내에 정상 상태 단축이 생성되었습니다. 쥐 근세포는 또한 최대 8Hz의 더 높은 주파수에서 단기 자극에 반응하지만 이러한 높은 주파수에서는 세포 생존력이 빠르게 저하됩니다. 전반적으로, 근세포 수축 기능은 가짜 처리된 래트와 비교하여 PO-래트 모델에서 생체내 심장 기능장애를 확인하거나 검증하기 위한 재현가능한 접근법인 것으로 입증되었다 (표 1; Kim et al.13 참조). 또한, 이 플랫폼은 더 비싸거나 힘든 생체 내 접근법을 추구하기 전에 근세포를 표적으로 하는 치료가 수축 기능을 회복 또는 손상시키는지 여부를 테스트할 수 있습니다. 급성 전달 및 치료제에 대한 더 긴 노출 및/또는 1차 배양 중 유전자 전달 후 둘 다 이 접근법을 사용하여 가능하다. 예를 들어, 내인성 cTnI를 cTnIT144D로 대체하기 위한 유전자 전달 실험은 가짜 쥐의 근세포에서 진폭을 단축시키는 데 큰 변화가 없음을 나타냅니다. 대조적으로, cTnIT144D는 PO 처리 된 쥐의 근육 세포에서 가짜 값에 대한 피크 단축 진폭을 복원합니다 (표 1). 이 접근법의 고유 한 약점은 생체 내 조건에서 근육 세포에 존재하는 전형적인 부하가 없다는 것입니다. 결과적으로, 반응은 부하 의존적 기능적 반응과 다를 수 있으며, 예시적인 실험은 cTnIT144D가 PO 동안 심장 성능을 개선하는지 여부를 추가로 조사하기 위해 생체내 접근법이 필요함을 나타낸다.

동일한 근육 세포에서 쇼트닝 및^{Ca 2+} 과도 현상의 측정은이 플랫폼의 장점입니다. 예를 들어, 변화의 방향은 수축 기능과 비교하여^Ca2+ 과도 현상에 대해 다를 수 있습니다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 피크 단축은 cTnIT144D가 2-3 개월 된 쥐에서 근육 세포로 유전자 전달 된 후 유의하게 증가한다. 이 결과는 나이가 많고 가짜 처리된 근세포(표 1)에서 얻은 데이터와 다르며 쥐 연령⁵와 관련이 있을 수 있습니다. 그러나이 해석을 증명하기 위해서는 추가 테스트가 필요합니다. 표 2의 데이터는 또한 cTnIT144D가 피크 Ca2+ 진폭을 변화시키지 않고, 대신에 Ca2+ 붕괴 속도를 늦추고 휴지기^Ca2+를 상승시키는 경향이 있음을 보여준다. 이러한 발견은 cTnIT144D 발현이 수축 기능을 향상시키는 반면^{Ca 2+} 사이클링 기계는이 효과를 약화시키는 것을 보상한다는 것을 시사합니다. 이러한 결과는 수축 기능의 변화와^{Ca 2+} 사이클링을 구별하는 이 접근법의 능력을 강조합니다. 여기에 제시된 구체적인 결과는 아직 결정적이지 않지만 심근 cTnIT144D를 발현하고 그 발현이 향후 PO로 인한 기능 장애를 둔화하는지 여부를 평가하는 유전 동물 모델을 개발하기위한 확실한 근거를 제공합니다. ^Ca2+ 과도 데이터로부터의 최종 관찰은 Fura-2AM과 같은 형광 염료가 근세포(²¹)에서 수축 기능 동역학을 변화시킨다는 것이다. 주어진 치료 또는 동물 모델에 의해 생성 된 상대 반응은 Fura-2 로딩 근육 세포 내에서 유사하지만, 이러한 결과는 Fura-2AM이없는 상태에서 수행 된 단축 측정과 결합되어서는 안됩니다. Ca 2+ 과도 분석에 Fura-2AM의 사용을 최적화하기 위해 실험실에서는 Fura-2AM이 없을 때 단축을 가장 자주 측정하고 Ca²⁺ 과도 현상을 측정하기 위한 실험의 하위 집합을 수행합니다.

저자는 경쟁하는 재정적 이해 관계나 기타 이해 상충이 없습니다.

이 작업은 국립 보건원 (NIH) 보조금 R01 HL144777 (MVW)의 지원을받습니다.