Analyse de la dysfonction contractile cardiaque et des transitoires Ca²⁺ dans les myocytes de rongeurs

Un ensemble de protocoles est présenté qui décrit la mesure de la fonction contractile via la détection de la longueur du sarcomère ainsi que la mesure transitoire du calcium (Ca²⁺) dans les myocytes isolés du rat. L’application de cette approche pour les études sur des modèles animaux d’insuffisance cardiaque est également incluse.

La dysfonction contractile et les transitoires Ca²⁺ sont souvent analysés au niveau cellulaire dans le cadre d’une évaluation complète des lésions cardiaques et / ou du remodelage. Une approche pour évaluer ces altérations fonctionnelles utilise le raccourcissement à vide et les analyses transitoires Ca²⁺ dans les myocytes cardiaques primaires adultes. Pour cette approche, les myocytes adultes sont isolés par digestion de collagénase, rendus tolérants au Ca²⁺ , puis collés à des lamelles de couverture recouvertes de laminine, suivies d’une stimulation électrique dans des milieux sans sérum. Le protocole général utilise des myocytes cardiaques de rat adulte, mais peut être facilement ajusté pour les myocytes primaires d’autres espèces. Les altérations fonctionnelles des myocytes des cœurs blessés peuvent être comparées à des myocytes fictifs et/ou à des traitements thérapeutiques in vitro . La méthodologie comprend les éléments essentiels nécessaires à la stimulation des myocytes ainsi que la chambre cellulaire et les composants de la plate-forme. Le protocole détaillé de cette approche intègre les étapes de mesure du raccourcissement à vide par détection de longueur de sarcomère et des transitoires cellulaires Ca²⁺ mesurés avec l’indicateur ratiométrique Fura-2 AM, ainsi que pour l’analyse des données brutes.

L’analyse de la fonction de la pompe cardiaque nécessite souvent une gamme d’approches pour obtenir des informations adéquates, en particulier pour les modèles animaux d’insuffisance cardiaque (IC). L’échocardiographie ou les mesures hémodynamiques donnent un aperçu de la dysfonction cardiaque in vivo ¹, tandis que les approches in vitro sont souvent utilisées pour déterminer si la dysfonction provient de changements dans le myofilament et / ou le transitoire Ca²⁺ responsable du couplage de l’excitation, ou le potentiel d’action, avec la fonction contractile (par exemple, couplage excitation-contraction [E-C]). Les approches in vitro offrent également l’occasion de dépister la réponse fonctionnelle aux neurohormones, aux altérations génétiques induites par les vecteurs, ainsi qu’aux agents thérapeutiques potentiels² avant de poursuivre des stratégies de traitement in vivo coûteuses et/ou laborieuses.

Plusieurs approches sont disponibles pour étudier la fonction contractile in vitro, y compris les mesures de force dans les trabécules intactes³ ou les myocytes perméabilisés⁴, ainsi que le raccourcissement à vide et les transitoires Ca²⁺ dans les myocytes intacts en présence et en l’absence de HF ^5,6. Chacune de ces approches se concentre sur la fonction contractile des myocytes cardiaques, qui est directement responsable de la fonction de la pompe cardiaque ^2,7. Cependant, l’analyse de la contraction et du couplage E-C est le plus souvent effectuée en mesurant le raccourcissement de la longueur musculaire et les transitoires Ca 2+ dans les myocytes adultes isolés tolérants au Ca²⁺. Le laboratoire utilise un protocole publié détaillé pour isoler les myocytes des cœurs de rats pour cette étape⁸.

Le transitoire Ca²⁺ et les myofilaments contribuent au raccourcissement et à l’allongement des myocytes intacts et peuvent contribuer à la dysfonction contractile ^2,7. Ainsi, cette approche est recommandée lorsque l’analyse fonctionnelle in vitro nécessite un myocyte intact contenant la machinerie de cycle Ca²⁺ plus les myofilaments. Par exemple, des myocytes isolés intacts sont souhaitables pour étudier la fonction contractile après modification du myofilament ou de la fonction de cycle Ca²⁺ par transfert^{de gène 9}. De plus, une approche des myocytes intacts est suggérée pour analyser l’impact fonctionnel des neurohormones lors de l’étude de l’impact des voies de signalisation des seconds messagers en aval et/ou de la réponse aux agents thérapeutiques². Une mesure alternative de la force dépendante de la charge dans les myocytes simples est le plus souvent effectuée après perméabilisation membranaire (ou écorchage) à basse température (≤15 °C) pour éliminer la contribution transitoire Ca²⁺ et se concentrer sur la fonction myofilamentaire¹⁰. La mesure de la force dépendante de la charge plus les transitoires Ca²⁺ dans les myocytes intacts est rare en grande partie en raison du défi complexe et technique de l’approche¹¹, en particulier lorsque le débit plus élevé est nécessaire, par exemple pour mesurer les réponses à la signalisation neurohormonale ou comme dépistage d’agents thérapeutiques. L’analyse des trabécules cardiaques surmonte ces défis techniques, mais peut également être influencée par les non-myocytes, la fibrose et / ou le remodelage de la matrice extracellulaire². Chacune des approches décrites ci-dessus nécessite une préparation contenant des myocytes adultes car les myocytes néonatals et les myocytes dérivés de cellules souches pluripotentes inductibles (CSPi) n’expriment pas encore le complément complet des protéines de myofilament adultes et n’ont généralement pas le niveau d’organisation du myofilament présent dans le myocyte² adulte en forme de bâtonnet. À ce jour, les données probantes dans les CSPi indiquent que la transition complète vers les isoformes adultes dépasse plus de 134 jours en culture¹².

Étant donné que cette collection met l’accent sur l’IC, les protocoles comprennent des approches et des analyses pour différencier la fonction contractile des myocytes intacts défaillants par rapport aux myocytes intacts non défaillants. Des exemples représentatifs sont fournis à partir de myocytes de rats étudiés 18 à 20 semaines après une coarctation suprarénale, décrite précédemment ^5,13. Des comparaisons sont ensuite faites avec des myocytes de rats traités fictivement.

Le protocole et la plateforme d’imagerie décrits ici sont utilisés pour analyser et surveiller les changements dans le raccourcissement et les transitoires Ca²⁺ dans les myocytes cardiaques en forme de bâtonnets au cours du développement de l’IC. Pour cette analyse, 2 x 10^{4 Ca} 2+-tolérants, en forme de bâtonnet, sont plaqués sur des lamelles de verre laminées (CS) de^{22 mm 2} et cultivés pendant la nuit, comme décrit précédemment⁸. Les composants assemblés pour cette plate-forme d’imagerie, ainsi que les supports et les tampons utilisés pour une imagerie optimale, sont fournis dans le tableau des matériaux. Un guide pour l’analyse des données à l’aide d’un logiciel et les résultats représentatifs sont également fournis ici. Le protocole global est divisé en sous-sections distinctes, les trois premières sections se concentrant sur les myocytes isolés de rats et l’analyse des données, suivies des expériences transitoires Ca²⁺ cellulaires et de l’analyse des données dans les myocytes.

Les études réalisées sur les rongeurs ont suivi la politique du Service de santé publique sur les soins et l’utilisation sans cruauté des animaux de laboratoire et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Michigan. Pour cette étude, des myocytes ont été isolés chez des rats Sprague-Dawley et F344BN âgés de 3 à 34 mois pesant ≥ 200 g⁵. Les taux des hommes et des femmes ont été utilisés.

1. Stimulation des myocytes pour les études de la fonction contractile

1. Fabriquer de nouveaux supports à base de M199 pour chaque ensemble de myocytes isolés (Tableau des matériaux). 1 jour avant la stimulation, plaquer 2 x 10^{4 Ca2+} tolérants, myocytes en forme de bâtonnets sur des lamelles de verre recouvertes de laminine (CS) de 22^mm 2, comme décrit précédemment⁸.
2. Pour préparer les chambres, faites tremper chaque chambre dans de l’eau de Javel à 10% pendant 1 h. Ensuite, rincer les chambres à l’eau courante du robinet pendant 30-45 min, puis remplacer l’eau distillée toutes les 5 minutes pendant 30 min, puis remplacer l’eau désionisée toutes les 5 minutes pendant 30 minutes et un rinçage final à l’eau désionisée.
3. Sécher les chambres sur une surface propre pendant 20 à 30 minutes (figure supplémentaire 1A-C). Ensuite, les UV traitent les chambres dans une armoire de biosécurité pendant 5 minutes dans chaque direction (total = 20 min). Cette étape n’est pas nécessaire pour les chambres pré-stérilisées.
   ATTENTION : Laissez la zone pour minimiser l’exposition aux UV.
4. Retirez le couvercle de la chambre, ajoutez 3 mL de média à base de M199 (voir le tableau des matériaux) à chaque puits (figure supplémentaire 1B), remplacez le couvercle et préchauffez la chambre dans un incubateur à 37 °C contenant 5 % de CO₂ et 20 % d’O2.
5. Stériliser les pinces dans un stérilisateur à billes chaudes à 250 °C pendant 20-25 s. Transférez la chambre de stimulation préchauffée de l’incubateur à une armoire de biosécurité.
6. Transférer chaque feuillet de couverture (CS) contenant des myocytes cardiaques dans des puits individuels dans la chambre de stimulation à l’aide de pinces stériles. Transférer les CS quatre à la fois, puis les chauffer pendant 10 minutes avant le transfert des quatre CS restants pour maintenir la température du fluide.
7. Fixez des vérins bananes à la chambre de stimulation à une extrémité (figure supplémentaire 1C) et au stimulateur à l’autre extrémité (figure supplémentaire 1D).
8. Réglez la fréquence du stimulateur à 0,2 Hz et réglez la tension (~12 V) pour obtenir une contraction de ~10%-20% de tous les myocytes cardiaques en forme de bâtonnet dans un puits. Pour déterminer le nombre de myocytes contractants, placez la chambre sous un microscope inversé avec un grossissement de 4x à 10x.
9. Placer la chambre de stimulation dans un incubateur à 37 °C dans 5% de CO₂ (Figure supplémentaire 1E). Changez le média toutes les 12 heures en utilisant un média préchauffé dans un incubateur à 37 °C, 5% CO₂ pendant 20-25 min. Continuez la stimulation électrique jusqu’à 3 jours avec le support changé toutes les 12 heures.

2. Analyse de la fonction contractile des myocytes cardiaques de rats adultes

1. Préchauffer un sachet de gel et un média dans un incubateur à 37 °C pendant 30 minutes avant l’expérience.
2. Allumez les composants de la plate-forme de fonction contractile répertoriés dans le tableau des matériaux et illustrés à la figure supplémentaire 2, en accordant une attention particulière aux composants clés, qui comprennent une table antivibratoire (figure supplémentaire 2A-1) avec un microscope inversé avec un filtre rouge foncé (590 nm) (figure supplémentaire 2A-2,3) et une caméra CCD (figure supplémentaire 2A-4) connectée à un contrôleur CCD (figure supplémentaire 2A-5 et Figure supplémentaire 2C-5) et intégré à un ordinateur PC (Figure supplémentaire 2B-14).
3. Assembler le tube dans la pompe péristaltique (figure supplémentaire 2A-8; Figure supplémentaire 2A-8), transférer le pack de gel préchauffé dans le porte-tube (Figure supplémentaire 2A-9), puis allumer le vide (Figure supplémentaire 2A-11) et alimenter le stimulateur cellulaire (Figure supplémentaire 2B-13).
4. Placer un tube de 50 mL avec du fluide dans le support de tube isolé (figure supplémentaire 2A-9) et commencer la perfusion à ~0,5 mL/min à travers le tube péristaltique de la pompe (figure supplémentaire 2E-8).
5. Ajouter une petite quantité de média préchauffé à un petit bateau de pesée (~2 mL). Transférer un CS contenant des myocytes de la chambre de stimulation au bateau de pesée. Remettre la chambre de stimulation à 37 °C dans l’incubateur à 5% de CO₂ .
6. Retirez le CS du bateau de pesage et essuyez doucement le dessous. Transférer le CS dans une chambre CS fraîchement graissée (Figure supplémentaire 2A, F-10; flèche noire) et ajouter doucement une goutte de média (~200 μL) sur le CS.
7. Placez un support d’électrode en platine sur le CS (Figure supplémentaire 2F ; flèche grise) et posez un nouveau CS sur le dessus à l’aide d’une pince. Placez un support supérieur (Figure supplémentaire 2F; flèche blanche) sur le sandwich CS, puis installez deux ou quatre vis à tête panoramique #0 pour terminer l’assemblage de la chambre.
8. Une fois que le fluide est présent dans tout le tube de la pompe, fixez le tube au préchauffeur, puis connectez le préchauffeur à la chambre CS assemblée à l’étape 2.7. Commencez la perfusion à 0,5 mL/min et placez une lingette en tissu sous la chambre pour vous assurer qu’il n’y a pas de fuites.
9. Placez la chambre CS dans l’adaptateur de scène. Le fluide perfusé est recueilli à l’extrémité opposée de la chambre avec un tube relié à un système de vide. Allumez le système de chauffage (figure supplémentaire 2A, D-7) et équilibrez la chambre, l’objectif et le préchauffeur pendant ~5-10 min pour atteindre une température constante du fluide de 37 °C. Visualisez les myocytes avec l’objectif d’immersion dans l’eau 40x au microscope pendant ce temps d’équilibration.
10. Activez le stimulateur de stimulation (Figure supplémentaire 2B-13) en réglant la tension à 1,5 fois le réglage nécessaire pour que 80 % des cellules en forme de bâtonnets se contractent, ce qui est généralement de 35 à 40 V. Réglez la fréquence de stimulation sur 0,2 Hz pour optimiser la fonction contractile et la survie des myocytes
11. Recueillir des traces de raccourcissement et d’allongement contractiles à partir de myocytes perfusés et rythmés en continu. Pour collecter des mesures de raccourcissement, utilisez une caméra CCD (Figure supplémentaire 2A-4) connectée à un contrôleur CCD (Figure supplémentaire 2B-5,C) et un ordinateur dédié avec une carte contrôleur d’E/S (Figure supplémentaire 2B-14 ; voir Tableau des matériaux). La plateforme mesure le raccourcissement du sarcomère dans les myocytes du rat, bien que des résultats similaires soient obtenus à partir de mesures de myocytes recueillies sur les bords longitudinaux des myocytes (voir Ecklerle et ^al.14).
12. Pour collecter des traces de raccourcissement du sarcomère, ouvrez le logiciel sur l’ordinateur, sélectionnez OK, puis Fichier > Nouveau. Préparez un modèle d’écran en sélectionnant Traces > Modifier les limites utilisateur > la longueur du sarcomère , puis en définissant des valeurs maximales et minimales, généralement comprises entre 2,0 μm et 1,5 μm. Calibrer la caméra CCD avec un graticule de 0,01 mm avant d’effectuer des mesures dans les myocytes (Figure 1D).
13. Pour enregistrer les traces de longueur du sarcomère, sélectionnez Fichier > Nouveau. Identifiez un myocyte en contraction et positionnez-le le long de l’axe longitudinal de la caméra de manière à ce que le motif de striation soit vertical (Figure 1B).
14. Utilisez la souris de l’ordinateur pour placer la zone de région d’intérêt (ROI) (boîte rose) sur le myocyte (Figure 1C). Sélectionnez Collecter et Commencer pour enregistrer la fonction contractile. Raccourcissement record pendant 60 s de chaque myocyte à de faibles fréquences de stimulation (≤0,5 Hz).
15. Enregistrer le raccourcissement du sarcomère de 5 à 10 cellules par CS. Effectuer des mesures à 1 cellule/CS si les études incluent un traitement avec des agonistes/antagonistes. Préparez un média préchauffé séparé et un autre morceau de tuyau de perfusion dédié chargé dans une pompe péristaltique multicanal et suivez les étapes 2.9.-2.14. pour mesurer l’impact de l’administration de médicaments ou de neurohormones sur la fonction contractile des myocytes .
16. Pour mesurer le raccourcissement sur une gamme de fréquences, rythmer les myocytes à chaque fréquence pour obtenir un raccourcissement à l’état d’équilibre avant d’enregistrer⁵. Pour ces études, doubler le taux de perfusion et commencer à enregistrer 15-20 s après la stimulation à une nouvelle fréquence pour obtenir des réponses contractiles constantes à l’état d’équilibre pour des fréquences comprises entre 0,2 Hz et 2 Hz. En règle générale, n’enregistrez pas plus de 2 myocytes / CS pour raccourcir la plage donnée de fréquences de stimulation.
17. Enregistrez au moins 7 contractions/cellule pour obtenir des données fiables moyennées du signal lors de l’analyse des enregistrements (voir étape 3.).

3. Analyse des données de la fonction contractile dans les myocytes isolés

1. Pour commencer, sélectionnez Fichier, choisissez une trace enregistrée, puis sélectionnez Ouvrir. Sélectionnez l’onglet 1 (côté gauche) de la trace de base, puis définissez le panneau jaune en haut de la trace sur Longueur Sarc. Sélectionnez Traces et le modèle d’écran préparé à l’étape 2.12.
2. Pour préparer un modèle d’analyse, sélectionnez Opérations, Options d’analyse transitoire monotone, Marque d’événement TTL dans la zone Définition de t0, ainsi que les options suivantes dans le menu : Ligne de base (longueur du sarcomère au repos), Vitesse de départ par rapport à t0 (dep v), Pic (hauteur du pic et %hauteur du pic/ligne de base ou bl%crête h), Vitesse de retour par rapport à tPic (ret v), Time to Peak 50 % (TTP 50 %) avec t0, et Time to Baseline 50 % (TTR_{50 %)} avec tPeak. Enregistrez ces options d’analyse en sélectionnant Modèles > Enregistrer le modèle d’analyse avec un identificateur. Chargez ce modèle d’analyse avant d’analyser chaque trace.
3. Pour commencer l’analyse des données, sélectionnez Marques > Porte > Ajouter une > Conversion transitoire à partir de la marque d’événement > plage d’analyse. Fixez maintenant la plage de temps de -0,01 s à 1,20 s pour les myocytes cadencés à 0,2 Hz (Figure 2A, marques rouges sur la partie inférieure de la trace brute). Sélectionnez une plage de temps plus courte pour les myocytes stimulés à des fréquences plus élevées.
4. Produisez une trace moyennée du signal en sélectionnant Opérations > Événements moyens. Un enregistrement moyenné par signal apparaît sous la trace de base d’origine.
5. Sélectionnez l’onglet 1 de la trace moyennée du signal (côté gauche de l’écran), puis sélectionnez Marques dans le menu supérieur, puis Ajouter transitoire. Sélectionnez Opérations dans le menu supérieur et Analyse transitoire monotone pour afficher les valeurs moyennes du signal pour la longueur du sarcomère de base, la hauteur du pic, le bl%peak h, le dep v, le ret v, le TTP 50 % et le TTR_{50 %} dans le panneau d’affichage de la moyenne du signal.
6. Transférez chaque analyse transitoire du sarcomère dans une feuille de calcul pour l’analyse composite de plusieurs myocytes en sélectionnant Exporter > Analyse transitoire monotone > Courant du presse-papiers. Collez ces données dans la feuille de calcul pour chaque trace.
7. Pour copier la trace moyennée du signal, sélectionnez Exporter > trace actuelle > Options > du Presse-papiers et définissez les décimales sur 5, puis sélectionnez Délimiteur de tabulations, puis cliquez sur OK, puis sur OK. Collez les traces moyennées par le signal pour chaque enregistrement de myocytes dans une deuxième feuille de calcul.

4. Enregistrement des transitoires Ca²⁺ chez les myocytes cardiaques adultes de rat

1. Avant de mesurer les transitoires Ca 2+, activez les composants de la plate-forme décrits à l’étape 2.2., ainsi que les composants d’imagerie par fluorescence supplémentaires (voir les composants supplémentaires pour l’analyse d’imagerie Ca²⁺ dans le Tableau des matériaux; Figure supplémentaire 2A-5,6; 2B-12).
2. Préparer la solution mère Fura-2AM contenant 1 mM Fura-2AM plus 0,5 M probénécide dans du diméthylsulfoxyde (DMSO). Le probénécide minimise la fuite Fura-2AM¹⁵.
3. Diluer la solution mère dans 5 μM de Fura-2AM et 2,5 mM de probénécide dans 2,5 mL de milieu (voir le tableau des matériaux) dans un puits d’une plaque de 6 puits. Ajouter 2,5 ml de média seul (pas de Fura-2AM) à trois puits supplémentaires dans la plaque, couvrir la plaque avec du papier d’aluminium et préchauffer le média à 37 °C.
4. Transférer un CS contenant des myocytes de la chambre de stimulation au puits contenant Fura-2AM, couvrir et remettre la plaque dans l’incubateur à 37 °C avec 5% de CO₂ pendant 4 min. Monter le tube dans la pompe de perfusion et perfuser avec le fluide pendant la période de chargement Fura-2AM, comme décrit à l’étape 2.4.
5. Éteignez ou minimisez l’éclairage de la pièce pour réduire le photoblanchiment par fluorescence et optimiser le signal de fluorescence. Retirez la plaque à 6 puits de l’incubateur, puis lavez le CS pendant 10 s dans chacun des trois puits contenant uniquement des fluides. Transférer le CS dans un petit bateau de pesage contenant des milieux préchauffés (pas de Fura-2AM ajouté).
6. Montez le CS sur une chambre CS fraîchement graissée après avoir essuyé doucement la face inférieure du CS. Ajoutez doucement une goutte de média au CS, puis assemblez le support d’électrode sur le CS, suivi d’un deuxième CS et du support supérieur. Utilisez des vis à tête panoramique #0 pour terminer l’assemblage de la chambre cellulaire, comme décrit aux étapes 2.6.-2.7.
7. Connectez le tuyau de pompe rempli de média au préchauffeur, connectez le préchauffeur à la chambre CS et placez-le dans un adaptateur d’étage, comme décrit à l’étape 2.8. Recueillir le média avec le système de tube à vide et allumer le système de chauffage (figure supplémentaire 2A,D-7) pour équilibrer la chambre à 37 °C, comme décrit aux étapes 2.8.-2.9.
8. Activez le stimulateur de stimulation (Figure supplémentaire 2B-13) réglé sur 35-40 V et 0,2 Hz, comme décrit à l’étape 2.10.
9. Avant d’enregistrer un Ca²⁺ transitoire, allumez une petite lampe de poche ou une lampe de bibliothèque montée près du clavier de l’ordinateur pour vous aider à voir le clavier. De plus, enregistrez le fond de fluorescence dans une zone sans myocytes cardiaques. Pour commencer, sélectionnez Fichier > Démarrer > Nouveau, comme décrit à l’étape 2.12.
10. Sélectionnez un retour sur investissement et définissez un onglet (ou barre de trace, côté gauche) pour le numérateur brut et un deuxième onglet pour le dénominateur brut, défini dans le centre supérieur de chaque onglet. Enregistrer l’arrière-plan pendant 10-20 s. Cliquez avec le bouton droit de la souris et faites glisser le pointeur sur un panneau de barre de trace pour obtenir les valeurs brutes moyennes du numérateur et du dénominateur du signal. Entrez ces valeurs en sélectionnant Opérations > Constantes, puis entrez les valeurs brutes.
11. Préparez un nouveau modèle d’écran pour collecter à la fois les raccourcissements et les transitoires Ca²⁺ . Pour la longueur du sarcomère, sélectionnez Tab 1 et utilisez le même processus que celui décrit à l’étape 2.13. Pour l’imagerie Ca²⁺ , sélectionnez Tab 2 > Ratio (en haut au centre de l’onglet) > Traces > Modifier les limites utilisateur pour définir les niveaux minimum et maximum du rapport, qui sont généralement définis entre 1 et 5. Utilisez le même processus pour définir le numérateur et les plages de dénominateurs pour les onglets 3 et 4 (côté gauche).
12. Placez une boîte ROI sur une image de myocyte, comme décrit à l’étape 2.14. Sélectionnez Fichier > Nouveau > collecte. Sélectionnez maintenant Démarrer pour collecter les données de raccourcissement et ratiométriques Ca²⁺ . Enregistrer ≥7 contractions/cellule pour une analyse moyenne du signal.
13. Répétez l’enregistrement de suivi en arrière-plan décrit à l’étape 4.10. après avoir enregistré 2-4 myocytes. En règle générale, notez 4-5 myocytes / CS ou moins de myocytes s’il y a des changements significatifs dans la lecture de fond.

5. Analyse des données des transitoires Ca²⁺ dans les myocytes isolés.

1. Ouvrez le fichier souhaité pour analyse et sélectionnez Modèles > Modèle d’écran pour raccourcir plus Ca²⁺ transitoires. Ensuite, sélectionnez les onglets 1 et 2 (à gauche) pour afficher la longueur du sarcomère et le rapport Ca²⁺ , respectivement. Sélectionnez Opérations > constantes et entrez les valeurs du numérateur et du dénominateur de la trace d’arrière-plan Ca²⁺ .
2. Préparez des modèles d’analyse pour raccourcir plus les données transitoires Ca²⁺ . Sélectionnez l’onglet 1 (côté gauche) et utilisez le même processus que celui décrit à l’étape 3.2. pour définir le modèle d’analyse de longueur de Sarcomère.
3. Sélectionnez l’onglet 2 (côté gauche), puis sélectionnez Opérations, Options d’analyse transitoire monotone, Marque d’événement TTL dans la zone Définition de t0 et les options suivantes dans le menu : Ligne de base (rapport basal), Vitesse de départ par rapport à t0 (dep v), Pic (hauteur du pic et %hauteur du pic/ligne de base ou bl%crête h), Vitesse de décroissance par rapport à tPic (ret v), Time to Peak 50 % (TTP 50 %) avec t0, et Time to Baseline 50 % (TTR_{50 %)} avec tPeak. Enregistrez ces options d’analyse en sélectionnant Modèles et Enregistrer le modèle d’analyse à l’aide d’un nouveau nom d’identificateur. Chargez ce modèle d’analyse avant d’analyser chaque trace.
4. Utilisez le même processus que celui décrit aux étapes 3.3.-3.6. pour faire la moyenne du signal, puis analyser la longueur du sarcomère, suivie des mêmes étapes pour les transitoires Ca²⁺ . Définissez des marques distinctes pour la longueur du sarcomère et pour la trace du rapport transitoire Ca²⁺ .

Les études de la fonction contractile sont effectuées sur les myocytes de rat à partir du lendemain de l’isolement (jour 2) jusqu’à 4 jours après l’isolement. Bien que les myocytes puissent être enregistrés le lendemain de l’isolement (c.-à-d. le jour 2), des temps de culture plus longs sont souvent nécessaires après le transfert de gènes ou les traitements pour modifier la fonction contractile⁸. Pour les myocytes cultivés pendant plus de 18 heures après l’isolement, le protocole de stimulation décrit à la rubrique 1 aide à maintenir les tubules en T et à obtenir des résultats constants de raccourcissement et d’allongement.

Une partie représentative d’un CS contenant des myocytes pour les études de raccourcissement est montrée à la figure 1A, ainsi qu’un myocyte positionné de manière appropriée avant d’établir le retour sur investissement (Figure 1B). Une fois qu’un retour sur investissement est identifié (Figure 1C ; encadré rose), les informations de l’algorithme affichées sous le myocyte aident également à optimiser le positionnement du myocyte avant l’enregistrement. Plus précisément, la densité optique linéaire (LOD; ligne noire) est un indicateur du nombre et de l’espacement des sarcomères, et un spectre de puissance net dans la trace rapide de la transformée de Fourier (FFT, ligne rouge) aide à obtenir un alignement optimal pour l’enregistrement du raccourcissement et de l’allongement. Le motif de graticule utilisé pour l’étalonnage de la longueur du sarcomère (et de la détection des bords) est illustré à la figure 1D. Un enregistrement aligné typique du raccourcissement de la longueur du sarcomère est illustré à la figure 2A (panneau supérieur), ainsi que l’analyse moyenne du signal décrite à la section 3 (panneau inférieur).

Le dysfonctionnement est souvent détecté dans les myocytes lorsqu’il y a un dysfonctionnement in vivo dans des modèles animaux. Par exemple, un dysfonctionnement systolique observé par échocardiographie en réponse à une surcharge de pression (PO)¹³ est également détecté dans les études de raccourcissement des myocytes⁵. Pour illustrer les traces de données, des traces brutes (Figure 2; panneau supérieur) et moyennes de signaux (Figure 2; panneau inférieur) obtenues à 0,2 Hz sont présentées pour les myocytes de rats simulés (Figure 2A) et traités PO (Figure 2B). Pour tester si la fonction myocytaire pouvait être sauvée après PO, le transfert de gènes à médiation virale au moment de l’isolement des myocytes a également été utilisé pour remplacer la troponine cardiaque endogène I (cTnI) par une substitution phospho-mimétique cTnI T144D (T144D) dans le sarcomère¹⁶. L’analyse initiale montre que la réduction de la fonction contractile induite par l’OP (tableau 1, panneau supérieur) est revenue vers des niveaux fictifs dans les myocytes PO 4 jours après le transfert du gène de cTnIT144D (tableau 1; panneau inférieur).

Cette plate-forme peut également être utilisée pour mesurer les transitoires Ca²⁺, ainsi que le raccourcissement dans les myocytes isolés. Le raccourcissement et le Ca 2+ n’ont pas été enregistrés après la PO parce que PO réduit l’adhérence des myocytes de rat à la laminine¹³, et un modèle comparable a précédemment montré une manipulation modifiée du Ca²⁺ se développe à un moment similaire¹⁷. Au lieu de cela, des expériences représentatives ont été réalisées sur des myocytes chargés de Fura-2AM isolés de rats âgés de 2 à 3 mois. Un enregistrement représentatif et des traces moyennées du signal sont présentés à la figure 3, ainsi que l’analyse des données dans le tableau 2. Pour cet ensemble d’expériences, des myocytes isolés de rats adultes ont été étudiés 4 jours après le transfert de gènes médiés par l’adénovira (multiplicité de l’infection = 100) de cTnIT144D ou de cTnI de type sauvage. Le raccourcissement du sarcomère et les transitoires Ca 2+ ont été mesurés après la charge des myocytes avec^Fura-2AM. Le transfert génique de cTnIT144D a amélioré le raccourcissement maximal et les taux diastoliques élevés de Ca²⁺ par rapport à cTnI dans ces études initiales (tableau 2). Bien qu’une analyse plus approfondie soit nécessaire, les premiers résultats suggèrent que le remplacement in vivo par cTnIT144D pourrait produire un phénotype cardiaque complexe en raison de changements dans la fonction contractile et la manipulation du Ca²⁺ au fil du temps.

Figure 1 : Myocytes cardiaques de rats adultes utilisés pour les études fonctionnelles. (A) Myocytes cardiaques isolés représentatifs d’un rat adulte (barre d’échelle = 50 μm). La flèche pointe vers un myocyte représentatif imagé pour l’analyse de la fonction contractile. (B) Myocytes représentatifs avec un ROI (rose) situé sur le côté (barre d’échelle = 20 μm). (C) Myocytes représentatifs avec un ROI (panneau supérieur), le motif sarcomère pour ce myocyte (panneau inférieur, bleu; barre d’échelle = 20 μm) et le pic aigu du spectre de puissance (panneau inférieur, rouge). (D) Capture d’écran de 0,01 mm graticule pour calibrer les mesures de raccourcissement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Enregistrements représentatifs de myocytes de rat. Un enregistrement brut (panneau supérieur) et une trace de moyenne de signal (panneau inférieur) enregistrés à 0,2 Hz dans des myocytes de rats traités par placebo (A) et (B) par surcharge de pression (PO). Les myocytes ont été isolés 18 à 20 semaines après la chirurgie, avec PO produite par coarctation suprarénale¹³. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Enregistrement et analyse représentatifs de la longueur du sarcomère (SL) et des transitoires Ca 2+ des myocytes cardiaques adultes chargés de Fura-2AM. (A) Traces brutes pour SL, rapport transitoire Ca 2+ (rapport), et numérateur et dénominateur traces utilisés pour produire le rapport transitoire Ca²⁺. (B) Un exemple de traces moyennées par signal pour SL (trace supérieure) et le rapport transitoire Ca²⁺ (trace inférieure). (C) Les traces sont analysées pour la longueur du sarcomère (SL) et le rapport transitoire Ca²⁺ à l’aide de l’algorithme de trace monotone. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Comparaison de la fonction contractile dans les myocytes cardiaques en réponse à une surcharge de pression (PO) et au transfert de gènes. Les résultats du raccourcissement des myocytes proviennent de cœurs de rats fictifs et PO 18 à 20 semaines après la chirurgie (panneau supérieur)^5,13 et de myocytes de rats fictifs et PO 4 jours après le transfert du gène cTnIT144D (panneau inférieur). La fonction contractile est mesurée 4 jours après l’isolement des myocytes / transfert de gènes dans tous les groupes. Les résultats sont exprimés en moyenne ± MEB (n = nombre de myocytes). Chaque ensemble de données fictives et PO est comparé par le test t d’un étudiant, avec *p < 0,05 considéré comme statistiquement significatif. Les résultats d’amplitude maximale pour les myocytes fictifs et PO seuls ont été rapportés plus tôt dans Ravichandran et ^al.5.

Tableau 2 : Fonction contractile et transitoires Ca²⁺ dans les myocytes de rats adultes 4 jours après le transfert du gène cTnIT144D. Une analyse de la fonction contractile (panneau supérieur) et des transitoires Ca²⁺ (panneau inférieur) est montrée dans les myocytes après transfert de gène de cTnIT144D par rapport à cTnI de type sauvage. Les myocytes sont isolés chez des rats adultes âgés de 2 à 3 mois, et les données sont présentées sous forme de MEB moyen ± (n = nombre de myocytes). Les comparaisons statistiques de la fonction contractile (à gauche) et des transitoires Ca²⁺ (à droite) sont effectuées à l’aide d’un test t de Student non apparié avec une signification définie à *p < 0,05.

Figure supplémentaire 1 : Composants du système de stimulation pour les myocytes plaqués sur des CS recouverts de laminine. (A) Chambre de stimulation personnalisée contenant des électrodes de platine dans chaque chambre. (B) Chambre de stimulation avec les quatre premières chambres remplies de médias. (C) Chambre de stimulation fixée à des câbles de prise de banane, qui sont reliés à la chambre et (D) au stimulateur. (E) La connexion entre le stimulateur (à droite) et l’incubateur à 37 °C (à gauche). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Composants nécessaires à la fonction contractile myocytaire et/ou aux mesures transitoires Ca²⁺. (A) La plate-forme de fonction contractile montrant chaque composant, les éléments numérotés étant expliqués plus en détail dans le tableau des matériaux. Les composants de la plate-forme comprennent une table antivibratoire # 1, un microscope à fond clair inversé (# 2,3), une caméra CCD # 4, un contrôleur CCD et une alimentation au xénon # 1, une source lumineuse à double émission # 10, un contrôleur de température # 3, une pompe péristaltique #, un support de tube isolé (# 10), une chambre de perfusion montée sur couvercle (# 10) et un système de vide (# 11). (B) Les composants supplémentaires comprennent l’interface de fluorescence (#12), le stimulateur de chambre (#13) et l’ordinateur PC (#14), qui sont expliqués plus en détail dans le tableau des matériaux. Les vues rapprochées des éléments numérotés dans le panneau A sont indiquées dans C-F. (C) Vue de l’alimentation au xénon (à gauche) et du contrôleur CCD (à droite). (D) Régulateur de température. E) Pompe péristaltique. (F) Vue de la base de la chambre de perfusion CS (flèche noire), du support d’électrode en platine (flèche grise) et du support supérieur (flèche blanche) avec vis à tête panoramique #0. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Le protocole de stimulation chronique décrit à l’étape 1 prolonge le temps utile pour étudier les myocytes isolés et évaluer l’impact de traitements plus longs. Dans notre laboratoire, des résultats cohérents ont été obtenus jusqu’à 4 jours après l’isolement lors de la mesure de la fonction contractile en utilisant la longueur du sarcomère sur des myocytes à rythme chronique. Cependant, la fonction contractile myocytaire se détériore rapidement lors de l’utilisation de milieux âgés de plus de 1 semaine pour rythmer les myocytes.

Pour les études de la fonction contractile, les données sont recueillies à 37 °C, ce qui est proche de la température corporelle pour les rats. Pour optimiser la viabilité des myocytes et obtenir des traces cohérentes pour chaque myocyte, ces expériences sont réalisées à une fréquence de stimulation inférieure à la fréquence cardiaque physiologique de ~5 Hz chez le rat. Ces paramètres produisent des données cohérentes sur la fonction contractile, mais la température de la chambre et / ou la fréquence de stimulation peuvent être ajustées si les traces de raccourcissement restent cohérentes entre plusieurs CS contenant le même groupe de traitement de myocytes. De plus, des résultats optimaux sont obtenus en choisissant des myocytes dépourvus de blebs, pleinement adhérés à un CS et se contractant aux deux extrémités d’une cellule en forme de bâtonnet. Les cellules attachées à une seule extrémité, celles avec plusieurs blebs et / ou les myocytes se contractant à une seule extrémité ne sont pas souhaitables et sont souvent plus difficiles à enregistrer en raison du mouvement de fond. Pour ces études, ≥20 sarcomères sont inclus dans le retour sur investissement pour obtenir un pic de spectre de puissance net, des longueurs de sarcomères au repos reproductibles et un rapport signal / bruit optimal pour la trace de raccourcissement. Un retour sur investissement avec aussi peu que sept sarcomères peut être utilisé si le pic du spectre de puissance reste net. La longueur du sarcomère au repos dans les myocytes isolés du rat varie généralement de 2,00 à 1,80 μm. Si la longueur d’un sarcomère au repos est inférieure à 1,5 μm, une contraction active n’est pas réaliste sur la base de notre compréhension de l’architecture du sarcomère¹⁸ et est généralement le résultat d’une orientation myocytaire sous-optimale.

La mesure de la fonction contractile avec ou sans mesures transitoires Ca²⁺ dans les myocytes intacts est une approche à débit plus élevé nécessitant moins d’investissement dans le développement de l’expertise technique nécessaire pour les mesures de force dans des cellules individuelles intactes¹¹. Les études sur les myocytes intacts se concentrent également exclusivement sur la fonction des myocytes sans l’apport d’autres types cellulaires dans les préparations multicellulaires². Un domaine émergent dans ce domaine est le développement de l’analyse à débit plus élevé en mesurant simultanément le raccourcissement et / ou les transitoires Ca²⁺ dans plusieurs myocytes intacts afin d’accélérer le criblage d’agents thérapeutiques au niveau cellulaire avant une analyse in vivo plus approfondie.

La fonction contractile et les mesures transitoires Ca²⁺ sont également possibles dans les myocytes intacts isolés d’autres modèles de rongeurs tels que les souris, bien qu’il existe des considérations et des différences importantes par rapport aux myocytes de rat. Les myocytes de souris sont viables en culture pendant 24-36 heures, mais la viabilité diminue progressivement dans les myocytes cultivés pendant plus de 48 h¹⁹. Cet intervalle de culture tronqué doit être pris en compte lors de l’utilisation du transfert de gènes à base de vecteurs, en particulier pour les protéines de myofilament qui ont une demi-vie en jours plutôt qu’en heures²⁰. Contrairement aux myocytes de rat, le succès de l’isolement et de la culture des myocytes de souris dépend également de l’ajout d’inhibiteurs de la myosine ATPase, tels que le monoxime de 2,3-butanedione ou la blébbistatine, dans les milieux de culture¹⁹. Par conséquent, la stimulation chronique n’est pas une option viable dans les cultures de myocytes de souris. Un temps d’équilibrage plus long de 15-20 min est également nécessaire pour éliminer l’impact fonctionnel de ces inhibiteurs de la myosine sur les myocytes isolés de souris. Enfin, les myocytes de souris sont rythmés de manière optimale à 0,5 Hz pour obtenir des traces de raccourcissement reproductibles par rapport aux 0,2 Hz utilisés pour les myocytes de rat.

Dans les études sur des rats traités par PO, la dysfonction contractile est systématiquement détectée avec une stimulation à basse fréquence dans les myocytes de rat. Une réduction plus importante du raccourcissement en fonction de la fréquence est également détectée dans les myocytes après PO par rapport aux rats fictifs lorsqu’il existe une dysfonction contractile in vivo ^5,13. Au cours d’une étude utilisant une gamme de fréquences, le doublement de la vitesse de la pompe pour fournir un milieu adéquat a produit un raccourcissement à l’état d’équilibre en 15-20 s après avoir changé la fréquence de stimulation entre 0,2 et 2 Hz. Les myocytes de rat répondent également à la stimulation à court terme à des fréquences plus élevées jusqu’à 8 Hz, bien que la viabilité cellulaire se détériore rapidement à ces fréquences plus élevées. Dans l’ensemble, la fonction contractile des myocytes s’est avérée être une approche reproductible pour confirmer ou valider la dysfonction cardiaque in vivo chez le rat, comme PO- par rapport aux rats traités fictifs (tableau 1; voir Kim et al.13). En outre, cette plateforme peut tester si un traitement ciblant les myocytes restaure ou altère la fonction contractile avant de poursuivre des approches in vivo plus coûteuses et / ou laborieuses. L’accouchement aigu et une exposition plus longue à des agents thérapeutiques et/ou après l’administration de gènes pendant la culture primaire sont possibles en utilisant cette approche. Par exemple, les expériences de transfert de gènes visant à remplacer le cTnI endogène par le cTnIT144D n’indiquent aucun changement significatif dans le raccourcissement de l’amplitude des myocytes de rats fictifs. En revanche, cTnIT144D restaure l’amplitude de raccourcissement maximale vers des valeurs fictives dans les myocytes de rats traités PO (tableau 1). Une faiblesse inhérente à cette approche est l’absence de la charge typique présente dans les myocytes dans des conditions in vivo. Par conséquent, les réponses peuvent différer des réponses fonctionnelles dépendantes de la charge, et l’exemple d’expérience indique que des approches in vivo sont nécessaires pour déterminer si cTnIT144D améliore les performances cardiaques pendant la PO.

La mesure du raccourcissement et des transitoires Ca²⁺ dans le même myocyte est un avantage de cette plateforme. Par exemple, la direction du changement peut différer pour les transitoires Ca²⁺ par rapport à la fonction contractile. Comme le montre le tableau 2, le raccourcissement maximal augmente considérablement après le transfert du gène de cTnIT144D dans les myocytes de rats âgés de 2 à 3 mois. Ce résultat diffère des données obtenues chez les myocytes plus âgés traités de manière simulée (tableau 1) et peut être lié à l’âge de⁵ ans chez le rat. Cependant, d’autres tests sont nécessaires pour prouver cette interprétation. Les données du tableau 2 montrent également que cTnIT144D ne modifie pas l’amplitude maximale Ca 2+ et, au contraire, tend à ralentir le taux de désintégration Ca 2+ et à élever le Ca ²⁺ au repos. Ces résultats suggèrent que l’expression de cTnIT144D améliore la fonction contractile, tandis que la machine cycliste Ca²⁺ compense pour atténuer cet effet. Ces résultats mettent en évidence la capacité de cette approche à faire la distinction entre les changements dans la fonction contractile et le cycle Ca²⁺. Bien que les résultats spécifiques présentés ici ne soient pas encore définitifs, ils fournissent une justification solide pour le développement d’un modèle animal génétique pour exprimer le cTnIT144D myocardique et évaluer si son expression atténue le dysfonctionnement causé par la PO à l’avenir. Une dernière observation des données transitoires Ca 2⁺ est que les colorants fluorescents tels que Fura-2AM modifient la cinétique de la fonction contractile dans les myocytes²¹. Bien que la réponse relative produite par un traitement ou un modèle animal donné soit comparable dans les myocytes chargés de Fura-2, ces résultats ne doivent pas être combinés avec des mesures de raccourcissement effectuées en l’absence de Fura-2AM. Pour optimiser l’utilisation de Fura-2AM pour l’analyse transitoire Ca 2+, le laboratoire mesure le plus souvent le raccourcissement en l’absence de Fura-2AM et effectue un sous-ensemble d’expériences pour mesurer les transitoires Ca²⁺.

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents ou d’autres conflits d’intérêts.

Ce travail est soutenu par la subvention R01 HL144777 (MVW) des National Institutes of Health (NIH).