Analisi della disfunzione contrattile cardiaca e dei transitori Ca²⁺ nei miociti dei roditori

Viene presentata una serie di protocolli che descrivono la misurazione della funzione contrattile tramite il rilevamento della lunghezza del sarcomero insieme alla misurazione transitoria del calcio (Ca²⁺) nei miociti isolati di ratto. È inclusa anche l'applicazione di questo approccio per studi su modelli animali di insufficienza cardiaca.

La disfunzione contrattile e i transitori di Ca²⁺ sono spesso analizzati a livello cellulare come parte di una valutazione completa della lesione indotta da cuore e / o del rimodellamento. Un approccio per valutare queste alterazioni funzionali utilizza l'accorciamento a vuoto e le analisi transitorie di Ca²⁺ nei miociti cardiaci primari adulti. Per questo approccio, i miociti adulti vengono isolati dalla digestione della collagenasi, resi tolleranti al Ca²⁺ e quindi aderenti a vetrini di copertura rivestiti di laminina, seguiti da stimolazione elettrica in mezzi privi di siero. Il protocollo generale utilizza miociti cardiaci di ratto adulto, ma può essere facilmente adattato per miociti primari di altre specie. Le alterazioni funzionali nei miociti da cuori feriti possono essere paragonate a miociti fittizi e/o a trattamenti terapeutici in vitro . La metodologia include gli elementi essenziali necessari per la stimolazione dei miociti, insieme alla camera cellulare e ai componenti della piattaforma. Il protocollo dettagliato per questo approccio incorpora le fasi per misurare l'accorciamento a vuoto mediante rilevamento della lunghezza del sarcomero e transitori cellulari Ca²⁺ misurati con l'indicatore raziometrico Fura-2 AM, nonché per l'analisi dei dati grezzi.

L'analisi della funzione della pompa cardiaca richiede spesso una serie di approcci per ottenere una visione adeguata, in particolare per i modelli animali di insufficienza cardiaca (HF). L'ecocardiografia o le misurazioni emodinamiche forniscono informazioni sulla disfunzione cardiaca in vivo ¹, mentre gli approcci in vitro sono spesso impiegati per identificare se la disfunzione deriva da cambiamenti nel miofilamento e / o nel transitorio Ca²⁺ responsabile dell'eccitazione dell'accoppiamento, o del potenziale d'azione, con la funzione contrattile (ad esempio, accoppiamento eccitazione-contrazione [E-C]). Gli approcci in vitro offrono anche l'opportunità di esaminare la risposta funzionale ai neuroormoni, alle alterazioni genetiche indotte da vettori e ai potenziali agenti terapeutici² prima di perseguire strategie di trattamento in vivo costose e/o laboriose.

Sono disponibili diversi approcci per studiare la funzione contrattile in vitro, comprese le misurazioni della forza nelle trabecole intatte³ o nei miociti permeabilizzati⁴, nonché l'accorciamento a vuoto e i transitori di Ca²⁺ in miociti intatti in presenza e assenza di HF ^5,6. Ciascuno di questi approcci si concentra sulla funzione contrattile dei miociti cardiaci, che è direttamente responsabile della funzione della pompa cardiaca ^2,7. Tuttavia, l'analisi sia della contrazione che dell'accoppiamento E-C insieme viene spesso eseguita misurando l'accorciamento della lunghezza muscolare e dei transitori di Ca 2+ in miociti adulti isolati e tolleranti a Ca²⁺. Il laboratorio utilizza un protocollo dettagliato pubblicato per isolare i miociti dai cuori di ratto per questa fase⁸.

Sia il Ca²⁺ transitorio che i miofilamenti contribuiscono ad accorciare e riallungare i miociti intatti e possono contribuire alla disfunzione contrattile ^2,7. Pertanto, questo approccio è raccomandato quando l'analisi funzionale in vitro richiede un miocita intatto contenente il meccanismo ciclico Ca²⁺ più i miofilamenti. Ad esempio, miociti isolati intatti sono desiderabili per studiare la funzione contrattile dopo aver modificato il miofilamento o la funzione ciclica di Ca²⁺ tramite trasferimento genico⁹. Inoltre, viene suggerito un approccio miocitario intatto per analizzare l'impatto funzionale dei neuroormoni quando si studia l'impatto delle vie di segnalazione del secondo messaggero a valle e/o della risposta agli agenti terapeutici². Una misura alternativa della forza dipendente dal carico nei singoli miociti viene spesso eseguita dopo la permeabilizzazione della membrana (o scuoiatura) a basse temperature (≤15 °C) per rimuovere il contributo transitorio di Ca²⁺ e concentrarsi sulla funzione del miofilamento¹⁰. La misurazione della forza dipendente dal carico più transitori Ca²⁺ nei miociti intatti è rara a causa in gran parte della sfida complessa e tecnica dell'approccio¹¹, specialmente quando è necessaria una maggiore produttività, come per misurare le risposte alla segnalazione neuroormonale o come schermo per agenti terapeutici. L'analisi delle trabecole cardiache supera queste sfide tecniche, ma può anche essere influenzata da non-miociti, fibrosi e/o rimodellamento della matrice extracellulare². Ciascuno degli approcci sopra descritti richiede una preparazione contenente miociti adulti perché i miociti neonatali e i miociti derivati da cellule staminali pluripotenti inducibili (iPSC) non esprimono ancora l'intero complemento delle proteine del miofilamento adulto e di solito mancano del livello di organizzazione del miofilamento presente nel miocita adulto a forma di bastoncello². Ad oggi, l'evidenza nelle iPSC indica che la transizione completa alle isoforme adulte supera più di 134 giorni nella coltura¹².

Dato il focus di questa raccolta sull'HF, i protocolli includono approcci e analisi per differenziare la funzione contrattile nei miociti intatti in fallimento rispetto a quelli non falliti. Esempi rappresentativi sono forniti da miociti di ratto studiati 18-20 settimane dopo una coartazione surrenale, descritta in precedenza ^5,13. Vengono quindi effettuati confronti con miociti di ratti trattati con finzione.

Il protocollo e la piattaforma di imaging qui descritti sono utilizzati per analizzare e monitorare i cambiamenti nell'accorciamento e nei transitori Ca²⁺ nei miociti cardiaci a forma di bastoncello durante lo sviluppo di HF. Per questa analisi, 2 x 10 miociti tolleranti a forma di bastoncello^{tolleranti a} 4 Ca 2+ sono placcati su vetrini (CS) rivestiti di laminina da^{22 mm e} coltivati durante la notte, come descritto in precedenza⁸. I componenti assemblati per questa piattaforma di imaging, insieme ai supporti e ai buffer utilizzati per l'imaging ottimale, sono forniti nella tabella dei materiali. Qui viene fornita anche una guida per l'analisi dei dati utilizzando un software e i risultati rappresentativi. Il protocollo generale è suddiviso in sottosezioni separate, con le prime tre sezioni incentrate sui miociti isolati di ratto e sull'analisi dei dati, seguite da esperimenti transitori cellulari di Ca²⁺ e analisi dei dati nei miociti.

Gli studi condotti sui roditori hanno seguito la politica del servizio sanitario pubblico sulla cura umana e l'uso di animali da laboratorio e sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Michigan. Per questo studio, i miociti sono stati isolati da ratti Sprague-Dawley di 3-34 mesi e F344BN del peso ≥ 200 g⁵. Sono stati utilizzati sia i tassi maschili che quelli femminili.

1. Stimolazione miocitaria per studi sulla funzionalità contrattile

1. Crea nuovi supporti basati su M199 per ogni set di miociti isolati (Tabella dei materiali). 1 giorno prima della stimolazione, placcare 2 x 10^{miociti tolleranti a forma} di bastoncino 4 Ca 2+ su vetrini (CS) rivestiti di laminina da^{22 mm,} come descritto in precedenza⁸.
2. Per preparare le camere, immergere ogni camera in candeggina al 10% per 1 ora. Quindi, sciacquare le camere con acqua corrente del rubinetto per 30-45 minuti, seguita da acqua distillata sostituita ogni 5 minuti per 30 minuti, seguita da acqua deionizzata sostituita ogni 5 minuti per 30 minuti e un risciacquo finale in acqua deionizzata.
3. Asciugare le camere su una superficie pulita per 20-30 minuti (Figura supplementare 1A-C). Successivamente, i raggi UV trattano le camere in un armadio di biosicurezza per 5 minuti in ciascuna direzione (totale = 20 min). Questo passaggio non è necessario per le camere pre-sterilizzate.
   ATTENZIONE: Lasciare l'area per ridurre al minimo l'esposizione ai raggi UV.
4. Rimuovere il coperchio dalla camera, aggiungere 3 mL di materiale a base di M199 (vedere Tabella dei materiali) a ciascun pozzetto (Figura supplementare 1B), sostituire il coperchio e preriscaldare la camera in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO 2 e il 20% di O₂.
5. Sterilizzare la pinza in uno sterilizzatore a perline calde a 250 °C per 20-25 s. Trasferire la camera di stimolazione preriscaldata dall'incubatore a un armadio di biosicurezza.
6. Trasferire ogni coprislip (CS) contenente miociti cardiaci ai singoli pozzetti nella camera di stimolazione usando una pinza sterile. Trasferire i CS quattro alla volta, seguito dal riscaldamento per 10 minuti prima del trasferimento dei restanti quattro CS per mantenere la temperatura del fluido.
7. Attaccare i banana jack alla camera di stimolazione su un'estremità (Figura supplementare 1C) e allo stimolatore all'altra estremità (Figura supplementare 1D).
8. Impostare la frequenza dello stimolatore su 0,2 Hz e impostare la tensione (~12 V) per ottenere la contrazione in ~10%-20% di tutti i miociti cardiaci a forma di bastoncello all'interno di un pozzetto. Per determinare il numero di miociti contratti, posizionare la camera sotto un microscopio invertito con ingrandimento da 4x a 10x.
9. Posizionare la camera di stimolazione in un'incubatrice a 37 °C in 5% di CO₂ (Figura supplementare 1E). Cambiare il fluido ogni 12 h utilizzando un fluido preriscaldato in un incubatore a 37 °C, 5% CO₂ per 20-25 minuti. Continuare la stimolazione elettrica per un massimo di 3 giorni con il mezzo cambiato ogni 12 ore.

2. Analisi della funzione contrattile di miociti cardiaci di ratto adulto

1. Preriscaldare un impacco di gel e un fluido in un'incubatrice a 37 °C per 30 minuti prima dell'esperimento.
2. Accendere i componenti della piattaforma funzionale contrattile elencati nella Tabella dei Materiali e mostrati nella Figura Supplementare 2, con particolare attenzione ai componenti chiave, che includono una tabella antivibrante (Figura supplementare 2A-1) con un microscopio invertito con un filtro rosso intenso (590 nm) (Figura supplementare 2A-2,3) e una camera CCD (Figura supplementare 2A-4) collegata a un controller CCD (Figura supplementare 2A-5 e Figura supplementare 2C-5) e integrato con un computer PC (Figura supplementare 2B-14).
3. Assemblare i tubi nella pompa peristaltica (Figura supplementare 2A-8; Figura supplementare 2A-8), trasferire il pacchetto di gel preriscaldato nel supporto del tubo (Figura supplementare 2A-9) e accendere il vuoto (Figura supplementare 2A-11) e l'alimentazione allo stimolatore cellulare (Figura supplementare 2B-13).
4. Posizionare un tubo da 50 mL con il fluido nel supporto del tubo isolato (Figura supplementare 2A-9) e iniziare la perfusione a ~0,5 mL/min attraverso il tubo della pompa peristaltica (Figura supplementare 2E-8).
5. Aggiungere una piccola quantità di fluido preriscaldato a una piccola barca di pesatura (~2 ml). Trasferire un CS contenente miociti dalla camera di stimolazione alla barca di pesatura. Riportare la camera di stimolazione a 37 °C nell'incubatore al 5% di CO₂ .
6. Rimuovere il CS dal contenitore di pesatura e pulire delicatamente la parte inferiore. Trasferire il CS in una camera CS appena unta (Figura supplementare 2A,F-10; freccia nera) e aggiungere delicatamente una goccia di supporto (~200 μL) sul CS.
7. Posizionare un supporto per elettrodo di platino sopra il CS (Figura supplementare 2F; freccia grigia) e posare un nuovo CS sopra la parte superiore usando una pinza. Posizionare un supporto superiore (Figura supplementare 2F; freccia bianca) sopra il sandwich CS e quindi installare due o quattro viti a testa panoramica #0 per completare l'assemblaggio della camera.
8. Una volta che il fluido è presente in tutto il tubo della pompa, collegare il tubo al preriscaldatore, quindi collegare il preriscaldatore alla camera CS assemblata nel punto 2.7. Iniziare la perfusione a 0,5 ml/min e posizionare una salvietta di tessuto sotto la camera per assicurarsi che non ci siano perdite.
9. Posizionare la camera CS nell'adattatore di scena. Il mezzo perfuso viene raccolto all'estremità opposta della camera con tubi collegati a un sistema di vuoto. Accendere il sistema di riscaldamento (Figura supplementare 2A, D-7) ed equilibrare la camera, l'obiettivo e il preriscaldatore per ~5-10 minuti per ottenere una temperatura costante del fluido di 37 °C. Visualizza i miociti con l'obiettivo di immersione in acqua 40x sul microscopio durante questo tempo di equilibrio.
10. Attivare lo stimolatore di stimolazione (Figura supplementare 2B-13) impostando la tensione a 1,5 volte l'impostazione necessaria per la contrazione dell'80% delle cellule a forma di bastoncello, che è tipicamente 35-40 V. Impostare la frequenza di stimolazione su 0,2 Hz per ottimizzare la funzione contrattile e la sopravvivenza dei miociti.
11. Raccogliere tracce contrattili di accorciamento e ri-allungamento da miociti continuamente perfusi e stimolati. Per raccogliere le misure di accorciamento, utilizzare una telecamera CCD (Figura supplementare 2A-4) collegata a un controller CCD (Figura supplementare 2B-5,C) e un computer dedicato con una scheda controller I/O (Figura supplementare 2B-14; vedere Tabella dei materiali). La piattaforma misura l'accorciamento del sarcomero nei miociti di ratto, sebbene risultati simili siano ottenuti dalle misurazioni dei miociti raccolte dai bordi longitudinali dei miociti (vedi Ecklerle et ^al.14).
12. Per raccogliere le tracce di accorciamento del sarcomero, aprire il software sul computer, selezionare OK, quindi File > nuovo. Preparare un modello di schermata selezionando Tracce > Modifica limiti utente > Lunghezza sarcomero e quindi impostando valori massimi e minimi, che in genere sono compresi tra 2,0 μm e 1,5 μm. Calibrare la telecamera CCD con un reticolo di 0,01 mm prima di effettuare misurazioni nei miociti (Figura 1D).
13. Per registrare le tracce della lunghezza del sarcomero, selezionare File > Nuovo. Identificare un miocita in contrazione e posizionarlo lungo l'asse longitudinale della telecamera in modo che il modello di striatura sia verticale (Figura 1B).
14. Utilizzare il mouse del computer per posizionare la casella della regione di interesse (ROI) (riquadro rosa) sul miocita (Figura 1C). Selezionare Raccogli e inizia per registrare la funzione contrattile. Accorciamento record per 60 s da ciascun miocita a basse frequenze di stimolazione (≤0,5 Hz).
15. Registrare l'accorciamento del sarcomero da 5-10 cellule per CS. Eseguire misurazioni a 1 cellula/CS se gli studi includono il trattamento con agonisti/antagonisti. Preparare un fluido preriscaldato separato e un diverso tubo di perfusione dedicato caricato in una pompa peristaltica multicanale e seguire i passaggi 2.9.-2.14. misurare l'impatto della somministrazione di farmaci o neuroormoni sulla funzione contrattile dei miociti.
16. Per misurare l'accorciamento su un intervallo di frequenze, accelerare i miociti a ciascuna frequenza per ottenere un accorciamento allo stato stazionario prima della registrazione⁵. Per questi studi, raddoppiare la velocità di perfusione e iniziare a registrare 15-20 s dopo la stimolazione a una nuova frequenza per ottenere risposte contrattili stazionarie coerenti per frequenze nell'intervallo di 0,2 Hz e 2 Hz. In genere, registrare non più di 2 miociti / CS per accorciare attraverso l'intervallo dato di frequenze di stimolazione.
17. Registrare almeno 7 contrazioni/cella per ottenere dati mediati dal segnale affidabili durante l'analisi delle registrazioni (vedere il passaggio 3.).

3. Analisi dei dati della funzione contrattile in miociti isolati

1. Per iniziare, selezionare File, scegliere una traccia registrata e quindi fare clic su Apri. Selezionare la scheda 1 (lato sinistro) della traccia di base, quindi impostare il pannello giallo nella parte superiore della traccia su Sarc-Length. Selezionare Tracce e il modello di schermata preparato nel passaggio 2.12.
2. Per preparare un modello di analisi, selezionare Operazioni, Opzioni di analisi transitoria monotona, Indicatore evento TTL nella casella Definizione di t0 e le seguenti opzioni dal menu: Linea di base (lunghezza del sarcomero a riposo), Velocità di partenza relativa a t0 (dep v), Picco (altezza del picco e %altezza del picco/linea di base o bl%picco h), Velocità di ritorno relativa a tPeak (ret v), Time to Peak 50% (TTP 50%) utilizzando t0 e Time to Baseline 50% (TTR_50%) utilizzando tPeak. Salvare queste opzioni di analisi selezionando Modelli > Salva modello di analisi con un identificatore. Caricare questo modello di analisi prima di analizzare ogni traccia.
3. Per iniziare l'analisi dei dati, selezionare Contrassegna > gate > Aggiungi > transitori Converti da indicatore di evento > intervallo di analisi. Ora imposta l'intervallo di tempo da -0,01 s a 1,20 s per i miociti a 0,2 Hz (Figura 2A, segni rossi sulla parte inferiore della traccia grezza). Selezionare un intervallo di tempo più breve per i miociti stimolati a frequenze più elevate.
4. Produrre una traccia mediata dal segnale selezionando Operazioni > Eventi medi. Una registrazione mediata dal segnale viene visualizzata sotto la traccia di base originale.
5. Selezionare la scheda 1 della traccia media del segnale (lato sinistro dello schermo), quindi selezionare Indicatori nel menu superiore, quindi Aggiungi temporaneo. Selezionare Operazioni dal menu superiore e Analisi transitoria monotona per visualizzare i valori mediati dal segnale per la lunghezza del sarcomero basale, l'altezza del picco, bl%picco h, dep v, ret v, TTP 50% e TTR_50% nel pannello di visualizzazione mediato del segnale.
6. Trasferire ogni analisi dei transienti del sarcomero in un foglio di calcolo per l'analisi composita di più miociti selezionando Esporta > Analisi transitoria monotona > Corrente degli appunti. Incolla questi dati nel foglio di calcolo per ogni traccia.
7. Per copiare la traccia media del segnale, selezionare Esporta > traccia corrente > Appunti > Opzioni e impostare le posizioni decimali su 5, quindi selezionare Delimitatore tabulazioni e fare clic su OK e OK. Incolla le tracce mediate dal segnale per ogni registrazione dei miociti in un secondo foglio di calcolo.

4. Registrazione di transitori Ca²⁺ in miociti cardiaci adulti di ratto

1. Prima di misurare i transitori Ca 2+, accendere i componenti della piattaforma descritti nel passaggio 2.2., insieme ad altri componenti di imaging a fluorescenza (vedere componenti aggiuntivi per l'analisi di imaging Ca²⁺ nella tabella dei materiali; Figura supplementare 2A-5,6; 2B-12).
2. Preparare la soluzione madre di Fura-2AM contenente 1 mM di Fura-2AM più 0,5 M di probenecid in dimetilsolfossido (DMSO). Probenecid riduce al minimo la perdita di Fura-2AM¹⁵.
3. Diluire la soluzione madre a 5 μM di Fura-2AM e 2,5 mM di probenecid in 2,5 mL di terreno (vedere Tabella dei materiali) in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Aggiungere 2,5 mL di materiale da solo (senza Fura-2AM) a tre pozzetti aggiuntivi nella piastra, coprire la piastra con un foglio di alluminio e preriscaldare il fluido a 37 °C.
4. Trasferire un CS contenente miociti dalla camera di stimolazione al pozzetto contenente Fura-2AM, coprire e riportare la piastra all'incubatore a 37 °C con il 5% di CO₂ per 4 minuti. Montare i tubi nella pompa di perfusione e perfondere con il fluido durante il periodo di caricamento Fura-2AM, come descritto al punto 2.4.
5. Spegnere o ridurre a icona le luci della stanza per ridurre il fotosbiancamento a fluorescenza e ottimizzare il segnale di fluorescenza. Rimuovere la piastra a 6 pozzetti dall'incubatore, quindi lavare il CS per 10 s in ciascuno dei tre pozzetti contenenti solo il fluido. Trasferire il CS su una piccola barca di pesatura contenente fluidi preriscaldati (senza aggiunta di Fura-2AM).
6. Montare il CS nella camera CS appena unta dopo aver pulito delicatamente la parte inferiore del CS. Aggiungere delicatamente una goccia di supporto al CS, quindi assemblare il supporto dell'elettrodo sul CS, seguito da un secondo CS e dal supporto superiore. Utilizzare viti a testa panoramica #0 per completare l'assemblaggio della camera della cella, come descritto nei passaggi 2.6.-2.7.
7. Collegare il tubo della pompa riempito di fluido al preriscaldatore, collegare il preriscaldatore alla camera CS e inserire un adattatore di fase, come descritto al punto 2.8. Raccogliere il fluido con il sistema di tubi a vuoto e accendere il sistema di riscaldamento (Figura supplementare 2A,D-7) per equilibrare la camera a 37°C, come descritto nei punti 2.8.-2.9.
8. Attivare lo stimolatore di stimolazione (Figura supplementare 2B-13) impostato su 35-40 V e 0,2 Hz, come descritto al punto 2.10.
9. Prima di registrare un transiente Ca²⁺ , accendere una piccola torcia o una luce da libro montata vicino alla tastiera del computer per facilitare la visualizzazione della tastiera. Inoltre, registrare lo sfondo di fluorescenza in un'area senza miociti cardiaci. Per iniziare, selezionare File > Avvia > Nuovo, come descritto nel passaggio 2.12.
10. Selezionare un ROI e impostare una scheda (o barra di traccia, lato sinistro) per il numeratore non elaborato e una seconda scheda per il denominatore non elaborato, definito nella parte superiore centrale di ogni scheda. Registra lo sfondo per 10-20 s. Fare clic con il pulsante destro del mouse e trascinare su un pannello della barra di traccia per ottenere i valori del numeratore e del denominatore mediati dal segnale non elaborato. Immettere questi valori selezionando Operazioni > Costanti e immettere i valori non elaborati.
11. Preparare un nuovo modello di schermata per raccogliere sia i transitori di accorciamento che quelli di Ca²⁺ . Per la lunghezza del sarcomero, selezionare la scheda 1 e utilizzare lo stesso processo descritto nel passaggio 2.13. Per la creazione di immagini Ca²⁺ , selezionare Rapporto > scheda 2 (in alto al centro della scheda) > Tracce > Modifica limiti utente per impostare i livelli minimo e massimo per il rapporto, che in genere sono impostati tra 1 e 5. Utilizzare lo stesso processo per definire gli intervalli di numeratori e denominatori per le schede 3 e 4 (lato sinistro).
12. Posizionare una casella ROI su un'immagine miocitaria, come descritto nel passaggio 2.14. Selezionare File > Nuovo > Raccogli. Ora seleziona Start per raccogliere i dati di accorciamento e raziometrici Ca²⁺ . Registrare ≥7 contrazioni/cellula per l'analisi mediata del segnale.
13. Ripetere la registrazione della traccia in background descritta al punto 4.10. dopo aver registrato 2-4 miociti. In genere, registrare 4-5 miociti / CS o meno miociti se ci sono cambiamenti significativi nella lettura dello sfondo.

5. Analisi dei dati dei transitori di Ca²⁺ in miociti isolati.

1. Aprire il file desiderato per l'analisi e selezionare Modelli > Modello schermo per accorciare più i transitori Ca²⁺ . Quindi, seleziona le schede 1 e 2 (a sinistra) per mostrare rispettivamente la lunghezza del sarcomero e il rapporto Ca²⁺ . Selezionare Operazioni > Costanti e immettere i valori del numeratore e del denominatore dalla traccia di sfondo Ca²⁺ .
2. Preparare modelli di analisi per accorciare più dati temporanei Ca²⁺ . Selezionare la scheda 1 (lato sinistro) e utilizzare lo stesso processo descritto nel passaggio 3.2. per impostare il modello di analisi della lunghezza del sarcomero.
3. Selezionare la scheda 2 (lato sinistro), quindi selezionare Operazioni, Opzioni di analisi transitoria monotona, Segno evento TTL nella casella Definizione di t0 e le seguenti opzioni dal menu: Linea di base (rapporto basale), Velocità di partenza relativa a t0 (dep v), Picco (altezza picco e %altezza picco/linea di base o bl%picco h), Velocità di decadimento relativa a tPeak (ret v), Time to Peak 50% (TTP 50%) utilizzando t0 e Time to Baseline 50% (TTR_50%) utilizzando tPeak. Salvare queste opzioni di analisi selezionando Modelli e Salva modello di analisi utilizzando un nuovo nome identificativo. Caricare questo modello di analisi prima di analizzare ogni traccia.
4. Utilizzare lo stesso processo descritto nei passaggi 3.3.-3.6. per calcolare la media del segnale e quindi analizzare la lunghezza del sarcomero, seguito dagli stessi passaggi per i transitori Ca²⁺ . Impostare segni separati per la lunghezza del sarcomero e per la traccia del rapporto transitorio Ca²⁺ .

Gli studi sulla funzionalità contrattile vengono eseguiti su miociti di ratto a partire dal giorno dopo l'isolamento (giorno 2) fino a 4 giorni dopo l'isolamento. Sebbene i miociti possano essere registrati il giorno dopo l'isolamento (cioè il giorno 2), sono spesso necessari tempi di coltura più lunghi dopo il trasferimento genico o i trattamenti per modificare la funzione contrattile⁸. Per i miociti coltivati per più di 18 ore dopo l'isolamento, il protocollo di stimolazione descritto nella sezione 1 aiuta a mantenere i tubuli t e risultati consistenti di accorciamento e riallungamento.

Una porzione rappresentativa di un CS contenente miociti per gli studi di accorciamento è mostrata nella Figura 1A, insieme a un miocita posizionato in modo appropriato prima di impostare il ROI (Figura 1B). Una volta identificato un ROI (Figura 1C; riquadro rosa), le informazioni dell'algoritmo mostrate sotto il miocita aiutano anche a ottimizzare il posizionamento dei miociti prima della registrazione. In particolare, la densità ottica lineare (LOD; linea nera) è un indicatore per il numero e la spaziatura dei sarcomeri e uno spettro di potenza nitido nella traccia di trasformata di Fourier veloce (FFT, linea rossa) aiuta a ottenere un allineamento ottimale per la registrazione di accorciamenti e riallungamenti. Il modello di reticolo utilizzato per la calibrazione della lunghezza del sarcomero (e il rilevamento dei bordi) è mostrato nella Figura 1D. Una tipica registrazione allineata dell'accorciamento della lunghezza del sarcomero è mostrata nella Figura 2A (pannello superiore), insieme all'analisi mediata del segnale descritta nella sezione 3 (pannello inferiore).

La disfunzione viene spesso rilevata nei miociti quando c'è disfunzione in vivo nei modelli animali. Ad esempio, la disfunzione sistolica osservata dall'ecocardiografia in risposta al sovraccarico di pressione (PO)¹³ è rilevata anche negli studi di accorciamento dei miociti⁵. Per illustrare le tracce dei dati, vengono mostrate tracce rappresentative grezze (Figura 2; pannello superiore) e mediate dal segnale (Figura 2; pannello inferiore) ottenute a 0,2 Hz per miociti di ratti sham- (Figura 2A) e trattati con PO (Figura 2B). Per verificare se la funzione dei miociti potesse essere salvata dopo PO, il trasferimento genico mediato dal virus al momento dell'isolamento dei miociti è stato utilizzato anche per sostituire la troponina cardiaca endogena I (cTnI) con una sostituzione fosfo-mimetica cTnI T144D (T144D) nel sarcomero¹⁶. L'analisi iniziale mostra che la riduzione indotta da PO della funzione contrattile (Tabella 1, pannello superiore) è tornata verso livelli fittizi nei miociti PO 4 giorni dopo il trasferimento genico di cTnIT144D (Tabella 1; pannello inferiore).

Questa piattaforma può anche essere utilizzata per misurare i transitori Ca²⁺, insieme all'accorciamento nei miociti isolati. L'accorciamento e il Ca 2+ non sono stati registrati dopo PO perché PO riduce l'aderenza dei miociti di ratto alla laminina¹³ e un modello comparabile ha precedentemente mostrato che la manipolazione alterata di Ca²⁺ si sviluppa in un punto temporale simile¹⁷. Invece, sono stati eseguiti esperimenti rappresentativi in miociti caricati con Fura-2AM isolati da ratti di 2-3 mesi. Una registrazione rappresentativa e tracce mediate dal segnale sono mostrate nella Figura 3, insieme all'analisi dei dati nella Tabella 2. Per questa serie di esperimenti, miociti isolati da ratti adulti sono stati studiati 4 giorni dopo il trasferimento genico adenovirale-mediato (molteplicità di infezione = 100) di cTnIT144D o cTnI wild-type. Sia l'accorciamento del sarcomero che i transitori di Ca 2+ sono stati misurati dopo aver caricato miociti con^Fura-2AM. Il trasferimento genico di cTnIT144D ha migliorato l'accorciamento del picco e livelli diastolici elevati di Ca²⁺ rispetto a cTnI in questi studi iniziali (Tabella 2). Sebbene siano necessarie analisi più approfondite, i risultati iniziali suggeriscono che la sostituzione in vivo con cTnIT144D potrebbe produrre un fenotipo cardiaco complesso a causa di cambiamenti sia nella funzione contrattile che nella manipolazione di Ca²⁺ nel tempo.

Figura 1: Miociti cardiaci di ratto adulto utilizzati per studi funzionali. (A) Miociti cardiaci isolati rappresentativi di un ratto adulto (barra della scala = 50 μm). La freccia indica un miocita rappresentativo ripreso per l'analisi della funzione contrattile. (B) Miocita rappresentativo con un ROI (rosa) situato sul lato (barra della scala = 20 μm). (C) Miocita rappresentativo con un ROI (pannello superiore), il modello del sarcomero per questo miocita (pannello inferiore, blu; barra di scala = 20 μm) e il picco acuto dello spettro di potenza (pannello inferiore, rosso). (D) Cattura dello schermo di 0,01 mm di reticolo per calibrare le misure di accorciamento. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Registrazioni rappresentative di miociti di ratto. Una registrazione grezza (pannello superiore) e una traccia mediata dal segnale (pannello inferiore) registrata a 0,2 Hz nei miociti di ratti trattati con (A) sovraccarico di pressione (PO) e (B). I miociti sono stati isolati 18-20 settimane dopo l'intervento chirurgico, con PO prodotta dalla coartazione surrenale¹³. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Registrazione rappresentativa e analisi della lunghezza del sarcomero (SL) e dei transitori Ca 2+ da miociti cardiaci adulti caricati con Fura-2AM. (A) Tracce grezze per SL, rapporto transitorio Ca 2+ (rapporto) e numeratore e tracce del denominatore utilizzate per produrre il rapporto transitorio Ca²⁺. (B) Un esempio di tracce mediate dal segnale per SL (traccia superiore) e il rapporto transitorio Ca²⁺ (traccia inferiore). (C) Le tracce vengono analizzate per la lunghezza del sarcomero (SL) e il rapporto transitorio Ca²⁺ utilizzando l'algoritmo di traccia monotona. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Confronto della funzione contrattile nei miociti cardiaci in risposta al sovraccarico di pressione (PO) e al trasferimento genico. I risultati dell'accorciamento dei miociti provengono da cuori di ratto sham e PO 18-20 settimane dopo l'intervento chirurgico (pannello superiore)^5,13 e miociti da ratti sham e PO 4 giorni dopo il trasferimento del gene cTnIT144D (pannello inferiore). La funzione contrattile viene misurata 4 giorni dopo l'isolamento miocitario/trasferimento genico in tutti i gruppi. I risultati sono espressi come media ± SEM (n = numero di miociti). Ogni set di dati fittizi e PO viene confrontato da un test t di Student, con *p < 0,05 considerato statisticamente significativo. I risultati di ampiezza di picco per i soli miociti sham e PO sono stati riportati in precedenza in Ravichandran et ^al.5.

Tabella 2: Funzione contrattile e transitori di Ca²⁺ nei miociti adulti di ratto 4 giorni dopo il trasferimento del gene cTnIT144D. Un'analisi della funzione contrattile (pannello superiore) e dei transitori di Ca²⁺ (pannello inferiore) è mostrata nei miociti dopo il trasferimento genico di cTnIT144D rispetto al cTnI wild-type. I miociti sono isolati da ratti adulti di 2-3 mesi e i dati sono presentati come media ± SEM (n = numero di miociti). I confronti statistici della funzione contrattile (a sinistra) e dei transitori Ca²⁺ (a destra) vengono eseguiti utilizzando un test t di Student spaiato con significatività impostata su *p < 0,05.

Figura supplementare 1: Componenti del sistema di stimolazione per miociti placcati su CS rivestiti di laminina. (A) Camera di stimolazione personalizzata contenente elettrodi di platino in ciascuna camera. (B) Camera di stimolazione con le prime quattro camere riempite di mezzi. (C) Camera di stimolazione collegata a cavi di banana-jack, collegati alla camera e (D) allo stimolatore. (E) Il collegamento tra lo stimolatore (a destra) e l'incubatore a 37 °C (a sinistra). Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Componenti necessari per la funzione contrattile dei miociti e/o misurazioni transitorie di Ca²⁺. (A) La piattaforma funzionale contrattile che mostra ciascun componente, con gli elementi numerati spiegati più dettagliatamente nella Tabella dei materiali. I componenti della piattaforma includono una tavola antivibrante , un microscopio a campo chiaro invertito (# 2,3), una telecamera CCD # 4, un controller CCD e un alimentatore allo xeno # 5, una sorgente luminosa a doppia emissione # 6, un regolatore di temperatura # 7, una pompa peristaltica (# 8), un supporto per tubi isolato (# 10), una camera di perfusione montata su coprislip (# 10) e un sistema di vuoto (# 11). (B) Ulteriori componenti includono l'interfaccia a fluorescenza (#12), lo stimolatore a camera (#13) e il computer PC (#14), che sono spiegati più dettagliatamente nella Tabella dei materiali. Le viste ravvicinate degli elementi numerati nel pannello A sono mostrate in C-F. (C) Vista dell'alimentatore allo xeno (a sinistra) e del controller CCD (a destra). (D) Regolatore di temperatura. (E) Pompa peristaltica. (F) Vista della base per la camera di perfusione CS (freccia nera), il supporto per elettrodo in platino (freccia grigia) e il supporto superiore (freccia bianca) con viti a testa panoramica #0. Clicca qui per scaricare questo file.

Il protocollo di stimolazione cronica delineato nella fase 1 estende il tempo utile per studiare miociti isolati e valutare l'impatto di trattamenti più lunghi. Nel nostro laboratorio, sono stati ottenuti risultati coerenti fino a 4 giorni dopo l'isolamento durante la misurazione della funzione contrattile utilizzando la lunghezza del sarcomero su miociti cronicamente stimolati. Tuttavia, la funzione contrattile dei miociti si deteriora rapidamente quando si utilizzano mezzi più vecchi di 1 settimana per accelerare i miociti.

Per gli studi sulla funzione contrattile, i dati sono raccolti a 37 °C, che è vicino alla temperatura corporea per i ratti. Per ottimizzare la vitalità dei miociti e ottenere tracce coerenti per ciascun miocita, questi esperimenti vengono eseguiti a una frequenza di stimolazione inferiore alla frequenza cardiaca fisiologica di ~ 5 Hz nei ratti. Queste impostazioni producono dati coerenti sulla funzione contrattile, ma la temperatura della camera e/o la frequenza di stimolazione possono essere regolate se le tracce di accorciamento rimangono coerenti tra più CS contenenti lo stesso gruppo di trattamento di miociti. Inoltre, i risultati ottimali si ottengono scegliendo miociti privi di macchie, aderiscono completamente a un CS e si contraggono ad entrambe le estremità di una cellula a forma di bastoncello. Le cellule attaccate a una sola estremità, quelle con più macchie e / o miociti che si contraggono a una sola estremità non sono desiderabili e sono spesso più difficili da registrare a causa del movimento dello sfondo. Per questi studi, ≥20 sarcomeri sono inclusi nel ROI per ottenere un picco di spettro di potenza nitido, lunghezze di sarcomero a riposo riproducibili e un rapporto segnale/rumore ottimale per la traccia di accorciamento. Un ROI con un minimo di sette sarcomeri può essere utilizzato se il picco dello spettro di potenza rimane nitido. La lunghezza del sarcomero a riposo nei miociti isolati di ratto varia solitamente da 2,00-1,80 μm. Se una lunghezza del sarcomero a riposo è inferiore a 1,5 μm, una contrazione attiva non è realistica sulla base della nostra comprensione dell'architettura del sarcomero¹⁸ e di solito è il risultato di un orientamento miocitario non ottimale.

La misurazione della funzione contrattile con o senza misurazioni transitorie di Ca²⁺ in miociti intatti è un approccio a produttività più elevata che richiede meno investimenti nello sviluppo delle competenze tecniche necessarie per le misurazioni della forza in singole cellule intatte¹¹. Gli studi sui miociti intatti si concentrano anche esclusivamente sulla funzione dei miociti, senza il contributo di altri tipi cellulari nei preparati multicellulari². Un'area emergente in questo campo è lo sviluppo di analisi a più alta produttività misurando simultaneamente l'accorciamento e/o i transitori di Ca²⁺ in più miociti intatti per accelerare lo screening degli agenti terapeutici a livello cellulare prima di un'analisi in vivo più estesa.

La funzione contrattile e le misurazioni transitorie di Ca²⁺ sono possibili anche in miociti intatti isolati da altri modelli di roditori come i topi, sebbene ci siano alcune importanti considerazioni e differenze rispetto ai miociti di ratto. I miociti di topo sono vitali in coltura per 24-36 ore, ma la vitalità diminuisce progressivamente nei miociti coltivati per più di 48 ore¹⁹. Questo intervallo di coltura troncato dovrebbe essere considerato quando si utilizza il trasferimento genico basato su vettori, specialmente per le proteine del miofilamento che hanno un'emivita in giorni anziché ore²⁰. A differenza dei miociti di ratto, il successo dell'isolamento e della coltura dei miociti di topo dipende anche dall'aggiunta di inibitori della miosina ATPasi, come il 2,3-butanedione monoxime o la blebbistatina, ai terreni di coltura¹⁹. Di conseguenza, la stimolazione cronica non è un'opzione praticabile nelle colture di miociti di topo. È inoltre necessario un tempo di equilibrio più lungo di 15-20 minuti per rimuovere l'impatto funzionale di questi inibitori della miosina sui miociti isolati del topo. Infine, i miociti di topo sono stimolati in modo ottimale a 0,5 Hz per ottenere tracce di accorciamento riproducibili rispetto agli 0,2 Hz utilizzati per i miociti di ratto.

Negli studi su ratti trattati con PO, la disfunzione contrattile viene costantemente rilevata con stimolazione a bassa frequenza nei miociti di ratto. Una maggiore riduzione dell'accorciamento dipendente dalla frequenza è rilevata anche nei miociti dopo PO rispetto ai ratti fittizi quando c'è disfunzione contrattile in vivo ^5,13. Durante uno studio che utilizza una gamma di frequenze, raddoppiando la velocità della pompa per fornire mezzi adeguati si è prodotto un accorciamento dello stato stazionario entro 15-20 s dopo aver modificato la frequenza di stimolazione tra 0,2 e 2 Hz. I miociti di ratto rispondono anche alla stimolazione a breve termine a frequenze più alte fino a 8 Hz, sebbene la vitalità cellulare si deteriori rapidamente a queste frequenze più elevate. Nel complesso, la funzione contrattile dei miociti ha dimostrato di essere un approccio riproducibile per confermare o convalidare la disfunzione cardiaca in vivo in modelli di ratto, come PO- rispetto ai ratti trattati con sham (Tabella 1; vedi Kim et al.13). Inoltre, questa piattaforma può verificare se un trattamento mirato ai miociti ripristina o altera la funzione contrattile prima di perseguire approcci in vivo più costosi e / o laboriosi. Sia la somministrazione acuta che l'esposizione prolungata agli agenti terapeutici e/o dopo la somministrazione genica durante la coltura primaria sono possibili utilizzando questo approccio. Ad esempio, gli esperimenti di trasferimento genico per sostituire cTnI endogeno con cTnIT144D non indicano alcun cambiamento significativo nell'accorciamento dell'ampiezza nei miociti di ratti fittizi. Al contrario, cTnIT144D ripristina l'ampiezza di accorciamento del picco verso valori fittizi nei miociti di ratti trattati con PO (Tabella 1). Una debolezza intrinseca di questo approccio è l'assenza del carico tipico presente nei miociti in condizioni in vivo. Di conseguenza, le risposte possono differire dalle risposte funzionali dipendenti dal carico e l'esperimento di esempio indica che sono necessari approcci in vivo per indagare ulteriormente se cTnIT144D migliora le prestazioni cardiache durante la PO.

La misurazione sia dell'accorciamento che dei transitori Ca²⁺ nello stesso miocita è un vantaggio di questa piattaforma. Ad esempio, la direzione del cambiamento può differire per i transitori Ca²⁺ rispetto alla funzione contrattile. Come mostrato nella Tabella 2, l'accorciamento del picco aumenta significativamente dopo il trasferimento genico di cTnIT144D nei miociti di ratti di 2-3 mesi. Questo risultato differisce dai dati ottenuti nei miociti più vecchi trattati con sham (Tabella 1) e può essere correlato^all'età 5 del ratto. Tuttavia, sono necessari ulteriori test per dimostrare questa interpretazione. I dati nella Tabella 2 mostrano anche che cTnIT144D non modifica l'ampiezza del picco di Ca 2+ e, invece, tende a rallentare il tasso di decadimento di Ca 2+ ed elevare il Ca ²⁺ a riposo. Questi risultati suggeriscono che l'espressione di cTnIT144D migliora la funzione contrattile, mentre la macchina da ciclismo Ca²⁺ compensa per smorzare questo effetto. Questi risultati evidenziano la capacità di questo approccio di distinguere tra cambiamenti nella funzione contrattile e cicli Ca²⁺. Mentre i risultati specifici presentati qui non sono ancora definitivi, forniscono un solido razionale per lo sviluppo di un modello animale genetico per esprimere il miocardio cTnIT144D e valutare se la sua espressione attenua la disfunzione causata da PO in futuro. Un'ultima osservazione dai dati transitori di Ca 2⁺ è che i coloranti fluorescenti come Fura-2AM modificano la cinetica della funzione contrattile nei miociti²¹. Sebbene la risposta relativa prodotta da un dato trattamento o modello animale sia comparabile all'interno dei miociti caricati con Fura-2, questi risultati non devono essere combinati con misurazioni di accorciamento effettuate in assenza di Fura-2AM. Per ottimizzare l'uso di Fura-2AM per l'analisi transitoria Ca 2+, il laboratorio misura più spesso l'accorciamento in assenza di Fura-2AM ed esegue un sottoinsieme di esperimenti per misurare i transitori Ca²⁺.

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.

Questo lavoro è supportato dalla sovvenzione R01 HL144777 (MVW) del National Institutes of Health (NIH).