ניתוח של תפקוד לקוי של התכווצות הלב ו- Ca^{2 +} טרנזיינטים במיוציטים של מכרסמים

מוצגת סדרה של פרוטוקולים המתארים את מדידת פונקציית ההתכווצות באמצעות זיהוי אורך סרקומר יחד עם מדידת סידן (Ca²⁺) במיוציטים של חולדות מבודדות. היישום של גישה זו למחקרים במודלים של בעלי חיים של אי ספיקת לב נכלל גם הוא.

תפקוד לקוי של התכווצויות ו-Ca²⁺ מנותחים לעתים קרובות ברמה התאית כחלק מהערכה מקיפה של פגיעה הנגרמת על ידי הלב ו / או שיפוץ. גישה אחת להערכת שינויים תפקודיים אלה משתמשת בקיצור פרוק ובניתוחים חולפים של Ca²⁺ במיוציטים לבביים בוגרים ראשוניים. לצורך גישה זו, מיוציטים בוגרים מבודדים על ידי עיכול קולגן, הופכים את Ca²⁺ לסובלני, ולאחר מכן נדבקים לכיסויים מצופים למינין, ולאחר מכן לקצב חשמלי במדיה נטולת סרום. הפרוטוקול הכללי משתמש במיוציטים לבביים של חולדות בוגרות, אך ניתן להתאים אותו בקלות למיוציטים ראשוניים ממינים אחרים. ניתן להשוות שינויים תפקודיים במיוציטים מלבבות פגועים למיוציטים ו/או לטיפולים במבחנה . המתודולוגיה כוללת את המרכיבים החיוניים הדרושים לקצב מיוציטים, יחד עם מרכיבי תא התא והפלטפורמה. הפרוטוקול המפורט לגישה זו משלב את השלבים למדידת התקצרות נפרקת על ידי זיהוי אורך סרקומר וטרנזיינטים סלולריים Ca²⁺ שנמדדו באמצעות מחוון היחס Fura-2 AM, כמו גם לניתוח נתונים גולמיים.

ניתוח תפקוד משאבת הלב דורש לעתים קרובות מגוון גישות כדי לקבל תובנה מספקת, במיוחד עבור מודלים של בעלי חיים של אי ספיקת לב (HF). אקוקרדיוגרפיה או מדידות המודינמיות מספקות תובנה לגבי תפקוד לב in vivo ¹, בעוד שגישות in vitro משמשות לעתים קרובות כדי לזהות אם תפקוד לקוי נובע משינויים במיופילמנט ו/או ב-Ca²⁺ חולף האחראי על עירור צימוד, או פוטנציאל הפעולה, עם פונקציית התכווצות (למשל, צימוד עירור-כיווץ [E-C]). גישות במבחנה מספקות גם הזדמנות לסנן את התגובה התפקודית לנוירוהורמונים, שינויים גנטיים הנגרמים על ידי וקטורים, כמו גם סוכנים טיפוליים פוטנציאליים² לפני נקיטת אסטרטגיות טיפול in vivo יקרות ו / או מייגעות.

מספר גישות זמינות כדי לחקור את תפקוד ההתכווצות במבחנה, כולל מדידות כוח בטרבקולה³ שלמה או מיוציטים מחלחלים⁴, כמו גם קיצור לא טעון ו- Ca²⁺ טרנזיינטים במיוציטים שלמים בנוכחות והיעדר HF ^5,6. כל אחת מהגישות הללו מתמקדת בתפקוד התכווצות המיוציטים הלבביים, האחראי ישירות על תפקוד משאבת הלב ^2,7. עם זאת, הניתוח של התכווצות וצימוד E-C יחד מבוצע לרוב על ידי מדידת קיצור אורך השריר ו- Ca 2+ חולפים במיוציטים בוגרים מבודדים, Ca²⁺ סובלניים. המעבדה משתמשת בפרוטוקול מפורט שפורסם כדי לבודד מיוציטים מלבבות חולדות עבור שלב⁸ זה.

גם Ca²⁺ חולף וגם מיופילמנטים תורמים לקיצור והארכה מחדש של מיוציטים שלמים ויכולים לתרום לתפקוד לקוי של התכווצות ^2,7. לפיכך, גישה זו מומלצת כאשר ניתוח פונקציונלי במבחנה דורש מיוציט שלם המכיל את מכונות המחזור Ca²⁺ בתוספת המיופילמנטים. לדוגמה, מיוציטים מבודדים שלמים רצויים לחקר תפקוד התכווצות לאחר שינוי תפקוד המיופילמנט או Ca²⁺ מחזורי באמצעות העברת גנים⁹. בנוסף, גישת מיוציטים שלמים מוצעת לניתוח ההשפעה התפקודית של נוירוהורמונים כאשר חוקרים את ההשפעה של מסלולי איתות שליח שני במורד הזרם ו / או תגובה לסוכנים טיפוליים². מדידה חלופית של כוח תלוי עומס במיוציטים בודדים מבוצעת לרוב לאחר חדירת ממברנה (או עור) בטמפרטורות נמוכות (≤15 מעלות צלזיוס) כדי להסיר את התרומה החולפת Ca²⁺ ולהתמקד בפונקציית מיופילמנט¹⁰. מדידת כוח תלוי עומס בתוספת Ca²⁺ חולפים במיוציטים שלמים היא נדירה בעיקר בשל האתגר המורכב והטכני של גישה¹¹, במיוחד כאשר יש צורך בתפוקה גבוהה יותר, כגון למדידת תגובות לאיתות נוירוהורמונים או כמסך לסוכנים טיפוליים. הניתוח של טרבקולה לבבית מתגבר על אתגרים טכניים אלה, אך עשוי להיות מושפע גם משינויים שאינם מיוציטים, פיברוזיס ו/או מטריצה חוץ-תאית². כל אחת מהגישות שתוארו לעיל דורשת תכשיר המכיל מיוציטים בוגרים מכיוון שמיוציטים ילודים ומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים בלתי ניתנים להשראה (iPSCs) עדיין אינם מבטאים את ההשלמה המלאה של חלבוני מיופילמנט בוגרים ובדרך כלל חסרים את רמת ארגון המיופילמנט הקיימת במיוציטים בצורת מוט בוגר². נכון להיום, עדויות ב- iPSCs מצביעות על כך שהמעבר המלא לאיזופורמים בוגרים עולה על יותר מ -134 ימים בתרבית¹².

בהתחשב בהתמקדות של אוסף זה ב- HF, הפרוטוקולים כוללים גישות וניתוח כדי להבדיל בין תפקוד התכווצות במיוציטים שלמים כושלים לעומת מיוציטים שלמים שאינם נכשלים. דוגמאות מייצגות מסופקות ממיוציטים של חולדות שנחקרו 18-20 שבועות לאחר כריתה על-כלייתית, שתוארה קודם^{לכן 5,13}. לאחר מכן נעשות השוואות למיוציטים מחולדות שטופלו בבושה.

הפרוטוקול ופלטפורמת ההדמיה המתוארים כאן משמשים לניתוח וניטור שינויים בקיצור ו- Ca²⁺ חולפים במיוציטים לבביים בצורת מוט במהלך התפתחות HF. לצורך ניתוח זה, 2 x 10⁴ Ca 2+-סובלניים, מיוציטים בצורת מוט מצופים על²² מ"מ 2 מ^{"מ 2} כיסויי זכוכית מצופים למינין (CSs) ומתורבתים לילה, כפי שתואר קודם^{לכן 8}. הרכיבים שהורכבו עבור פלטפורמת הדמיה זו, יחד עם המדיה והמאגרים המשמשים להדמיה אופטימלית, מסופקים בטבלת החומרים. מדריך לניתוח נתונים באמצעות תוכנה והתוצאות המייצגות מסופקים גם כאן. הפרוטוקול הכולל מחולק לתתי-סעיפים נפרדים, כאשר שלושת החלקים הראשונים מתמקדים במיוציטים של חולדות מבודדות ובניתוח נתונים, ולאחר מכן ניסויים ארעיים של Ca²⁺ וניתוח נתונים במיוציטים.

מחקרים שבוצעו על מכרסמים עקבו אחר מדיניות שירות בריאות הציבור בנושא טיפול הומני ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת מישיגן. לצורך מחקר זה, מיוציטים בודדו מחולדות ספראג-דאולי ו-F344BN בנות 3-34 חודשים במשקל ≥-200 גרם⁵. נעשה שימוש בשיעורי זכר ונקבה כאחד.

1. קצב מיוציטים למחקרי תפקוד התכווצות

1. הכינו מדיה טרייה מבוססת M199 עבור כל קבוצה של מיוציטים מבודדים (טבלת חומרים). יום אחד לפני הקצב, צלחת 2 x 10⁴ Ca 2+-סובלני, בצורת מוט מיוציטים על²² מ"מ 2 מ"מ² כיסויי זכוכית מצופים למינין (CSs), כפי שתואר קודם^{לכן 8}.
2. כדי להכין את התאים, משרים כל תא ב-10% אקונומיקה למשך שעה אחת. לאחר מכן, יש לשטוף את התאים במי ברז זורמים למשך 30-45 דקות, ולאחר מכן מים מזוקקים שהוחלפו כל 5 דקות למשך 30 דקות, ולאחר מכן מים שעברו דה-יוניזציה הוחלפו כל 5 דקות למשך 30 דקות, ושטיפה אחרונה במים שעברו דה-יוניזציה.
3. יבשו את התאים על משטח נקי במשך 20-30 דקות (איור משלים 1A-C). לאחר מכן, UV לטפל בתאים בארון biosafety במשך 5 דקות לכל כיוון (סה"כ = 20 דקות). שלב זה אינו נחוץ עבור תאים מעוקרים מראש.
   אזהרה: יש לעזוב את האזור כדי למזער את החשיפה לקרינת UV.
4. הסר את המכסה מהתא, הוסף 3 מ"ל של מדיה מבוססת M199 (ראו טבלת חומרים) לכל באר (איור משלים 1B), החלף את הכיסוי וחמם את התא באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 ו- 20% O₂.
5. יש לחטא מלקחיים במעקר חרוזים חמים בטמפרטורה של 250 מעלות צלזיוס למשך 20-25 שניות. העבירו את תא הגירוי שחומם מראש מהאינקובטור לארון בטיחות ביולוגית.
6. העבירו כל כיסוי (CS) המכיל מיוציטים לבביים לבארות בודדות בתא הגירוי באמצעות מלקחיים סטריליים. העבר CSs ארבעה בכל פעם, ולאחר מכן חימום במשך 10 דקות לפני ההעברה של ארבעת CSs הנותרים כדי לשמור על טמפרטורת המדיה.
7. הצמידו שקעי בננה לתא הגירוי בקצה אחד (איור משלים 1C) ולממריץ בקצה השני (איור משלים 1D).
8. הגדר את תדר הגירוי ל-0.2 הרץ והגדר את המתח (~12 V) כדי להשיג התכווצות ב~10%-20% מכל המיוציטים הלבביים בצורת מוט בתוך באר. כדי לקבוע את מספר המיוציטים המתכווצים, מקם את התא מתחת למיקרוסקופ הפוך עם הגדלה של 4x עד 10x.
9. מקמו את תא הגירוי באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% CO₂ (איור משלים 1E). שנה את המדיה כל 12 שעות באמצעות מדיה שחוממה מראש בחממה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ למשך 20-25 דקות. המשך בגירוי חשמלי למשך עד 3 ימים כאשר המדיה מוחלפת כל 12 שעות.

2. ניתוח תפקוד התכווצות של מיוציטים לבביים של חולדות בוגרות

1. מחממים מראש חבילת ג'ל ומדיה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני הניסוי.
2. הפעל את רכיבי פלטפורמת הפונקציה המכווצת המפורטים בטבלת החומרים ומוצגים באיור משלים 2, עם תשומת לב מיוחדת לרכיבי המפתח, הכוללים טבלה נגד רטט (איור משלים 2A-1) עם מיקרוסקופ הפוך עם מסנן אדום עמוק (590 ננומטר) (איור משלים 2A-2,3) ומצלמת CCD (איור משלים 2A-4) המחוברים לבקר CCD (איור משלים 2A-5 ו- איור משלים 2C-5) ומשולב עם מחשב PC (איור משלים 2B-14).
3. הרכבת צינורות לתוך המשאבה הפריסטלטית (איור משלים 2A-8; איור משלים 2A-8), העבירו את אריזת הג'ל שחוממה מראש למחזיק הצינור (איור משלים 2A-9), והפעילו את הוואקום (איור משלים 2A-11) ואת הכוח לממריץ התא (איור משלים 2B-13).
4. הנח צינור של 50 מ"ל עם מדיה במחזיק הצינור המבודד (איור משלים 2A-9) והתחל זלוף במהירות של ~0.5 מ"ל/דקה דרך צינורות המשאבה הפריסטלטיים (איור משלים 2E-8).
5. הוסף כמות קטנה של מדיה שחוממה מראש לסירת משקל קטנה (~ 2 מ"ל). מעבירים CS אחד המכיל מיוציטים מתא הגירוי לסירת השקילה. החזירו את תא הגירוי ל-37 מעלות צלזיוס באינקובטור 5% CO₂ .
6. הסר את ה- CS מסירת השקילה ונגב בעדינות את החלק התחתון. העבירו את ה-CS לתא CS משומן טרי (איור משלים 2A,F-10; חץ שחור) והוסיפו בעדינות טיפת מדיה (~200 μL) על ה-CS.
7. הניחו תושבת אלקטרודת פלטינה מעל ה-CS (איור משלים 2F; חץ אפור) והניחו CS חדש מעל החלק העליון באמצעות מלקחיים. הניחו תושבת עליונה (איור משלים 2F; חץ לבן) מעל כריך CS ולאחר מכן התקינו שניים או ארבעה ברגים עם ראש מחבת #0 כדי לסיים את הרכבת התא.
8. לאחר שהמדיה נוכחת לאורך צינורות המשאבה, חברו את הצינורות למחמם המקדים, ולאחר מכן חברו את החימום המקדים לתא CS שהורכב בשלב 2.7. יש להתחיל בזלוף במהירות של 0.5 מ"ל/דקה ולהניח מגבון רקמות מתחת לתא כדי לוודא שאין דליפות.
9. מקם את תא CS במתאם הבמה. המדיה המנומרת נאספת בקצה הנגדי של התא עם צינורות המחוברים למערכת ואקום. הפעל את מערכת החימום (איור משלים 2A,D-7) ושזור את התא, המטרה והחימום המקדים למשך ~5-10 דקות כדי להשיג טמפרטורת מדיה קבועה של 37 מעלות צלזיוס. דמיינו את המיוציטים עם מטרת טבילת המים פי 40 במיקרוסקופ במהלך זמן שיווי משקל זה.
10. הפעל את מגרה הקצב (איור משלים 2B-13) על ידי הגדרת המתח לפי 1.5 מההגדרה הדרושה ל-80% מהתאים בצורת מוט כדי להתכווץ, שהוא בדרך כלל 35-40 V. הגדר את תדר הגירוי ל-0.2 הרץ כדי למטב את תפקוד ההתכווצות ואת הישרדות המיוציטים.
11. לאסוף עקבות קיצור התכווצות והארכה מחדש ממיוציטים מחלחלים וקצביים באופן רציף. כדי לאסוף מדידות מקוצרות, השתמש במצלמת CCD (איור משלים 2A-4) המחוברת לבקר CCD (איור משלים 2B-5,C) ולמחשב ייעודי עם לוח בקר קלט/פלט (איור משלים 2B-14; ראו טבלת חומרים). הפלטפורמה מודדת התקצרות סרקומר במיוציטים של חולדות, אם כי תוצאות דומות מתקבלות ממדידות מיוציטים שנאספו מהקצוות האורכיים של מיוציטים (ראו Ecklerle et ^al.14).
12. כדי לאסוף עקבות קיצור sarcomere, פתח את התוכנה במחשב, בחר אישור ולאחר מכן קובץ > חדש. הכן תבנית מסך על-ידי בחירה באפשרות מעקבים > עריכת מגבלות משתמש > אורך Sarcomere ולאחר מכן הגדרת ערכי מקסימום ומינימום, שהם בדרך כלל בין 2.0 מיקרומטר ל- 1.5 מיקרומטר. כייל את מצלמת ה-CCD עם גרטיקולה של 0.01 מ"מ לפני ביצוע מדידות במיוציטים (איור 1D).
13. כדי להקליט מעקבים באורך סרקומר, בחר קובץ > חדש. זהה מיוציט מתכווץ ומקם את המיוציט לאורך ציר האורך של המצלמה כך שתבנית הסטריאציה תהיה אנכית (איור 1B).
14. השתמש בעכבר המחשב כדי למקם את תיבת אזור העניין (ROI) (תיבה ורודה) מעל המיוציטים (איור 1C). בחר אסוף והתחל כדי להקליט פונקציית חוזה. קיצור שיא של 60 שניות מכל מיוציט בתדרי גירוי נמוכים (≤0.5 הרץ).
15. רשום קיצור סרקומר מ-5-10 תאים לכל CS. בצע מדידות בתא אחד/CS אם המחקרים כוללים טיפול באגוניסטים/אנטגוניסטים. הכינו מדיה נפרדת שחוממה מראש ופיסת צינורות פרפוזיה ייעודית אחרת הטעונה במשאבה פריסטלטית רב-ערוצית ובצעו את השלבים 2.9.-2.14. כדי למדוד את ההשפעה של אספקת תרופות או נוירוהורמונים על תפקוד התכווצות מיוציטים.
16. כדי למדוד את הקיצור על פני טווח תדרים, קצב מיוציטים בכל תדר כדי לקבל קיצור מצב יציב לפני הקלטה⁵. עבור מחקרים אלה, הכפילו את קצב הזליפה והתחילו להקליט 15-20 שניות לאחר גירוי בתדר חדש כדי לקבל תגובות התכווצות עקביות במצב יציב עבור תדרים בטווח של 0.2 הרץ ו-2 הרץ. בדרך כלל, רשמו לא יותר מ-2 מיוציטים/CS לקיצור בטווח הנתון של תדרי הגירוי.
17. הקלט לפחות 7 צירים לתא כדי לקבל נתונים אמינים בממוצע אותות בעת ניתוח ההקלטות (ראה שלב 3.).

3. ניתוח נתונים של תפקוד התכווצות במיוציטים מבודדים

1. כדי להתחיל, בחר קובץ, בחר מעקב מוקלט ולאחר מכן בחר פתח. בחר Tab 1 (צד שמאל) של מעקב הבסיס ולאחר מכן הגדר את החלונית הצהובה בחלק העליון של העקיבה ל- Sarc-Length. בחר מעקבים ותבנית המסך שהוכנה בשלב 2.12.
2. כדי להכין תבנית ניתוח, בחר פעולות, אפשרויות ניתוח חולף מונוטוני, סימן אירוע TTL בתיבה הגדרת t0, וכן את האפשרויות הבאות מהתפריט: קו בסיס (אורך סרקומר במנוחה), מהירות יציאה ביחס ל- t0 (dep v), שיא (גובה שיא ו- %גובה שיא/קו בסיס או bl%peak h), מהירות החזרה יחסית ל- tPeak (ret v), זמן לשיא 50% (TTP 50%) באמצעות t0, וזמן לבסיס 50% (TTR_50%) באמצעות tPeak. שמור אפשרויות ניתוח אלה על-ידי בחירה באפשרות תבניות > שמור תבנית ניתוח עם מזהה. טען תבנית ניתוח זו לפני ניתוח כל מעקב.
3. כדי להתחיל בניתוח נתונים, בחר סימנים > שער > הוסף המרה > ארעית מטווח ניתוח של סימן אירוע >. כעת הגדר את טווח הזמן מ-0.01 שניות ל-1.20 שניות עבור מיוציטים בקצב של 0.2 הרץ (איור 2A, סימנים אדומים בחלק התחתון של העקבה הגולמית). בחר טווח זמן קצר יותר עבור מיוציטים מגורה בתדרים גבוהים יותר.
4. הפק מעקב ממוצע אותות על-ידי בחירת פעולות > אירועים ממוצעים. הקלטה ממוצעת של אות מופיעה מתחת לעקבות הבסיס המקוריות.
5. בחר Tab 1 של המעקב הממוצע של האות (הצד השמאלי של המסך) ולאחר מכן בחר סימנים בתפריט העליון, ולאחר מכן הוסף ארעי. בחר פעולות מהתפריט העליון ו- Monotonic Transient Analysis כדי להציג את הערכים הממוצעים של האות עבור אורך סרקומר בסיסי, גובה שיא, bl%peak h, dep v, ret v, TTP 50% ו- TTR_50% בלוח התצוגה הממוצע של האות.
6. העבר כל ניתוח ארעי של sarcomere לגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח מרוכב של מיוציטים מרובים על-ידי בחירה באפשרות ייצוא > ניתוח חולף מונוטוני > זרם לוח. הדבק נתונים אלה בגיליון האלקטרוני עבור כל מעקב.
7. להעתקת המעקב הממוצע של האות, בחרו 'ייצוא > 'מעקב נוכחי' > 'אפשרויות > אפשרויות' והגדירו את המקומות העשרוניים ל- 5, לאחר מכן בחרו 'מפריד טאבים' ולחצו על 'אישור' ו'אישור'. הדבק את העקבות הממוצעים של האותות עבור כל הקלטת מיוציטים בגיליון אלקטרוני שני.

4. רישום Ca²⁺ חולפים במיוציטים לבביים בוגרים של חולדות

1. לפני מדידת טרנזיינטים Ca 2+, הפעל את רכיבי הפלטפורמה המתוארים בשלב 2.2., יחד עם רכיבי הדמיה פלואורסצנטיים נוספים (ראה רכיבים נוספים לניתוח הדמיה של Ca²⁺ בטבלת החומרים; איור משלים 2א-5,6; 2ב-12).
2. הכן תמיסת מלאי Fura-2AM המכילה 1 mM Fura-2AM בתוספת 0.5 M probenecid ב dimethylsulfoxide (DMSO). Probenecid ממזער דליפת Fura-2AM¹⁵.
3. יש לדלל את תמיסת המלאי ל-5 μM Fura-2AM ו-2.5 mM probenecid ב-2.5 מ"ל של מדיה (ראו טבלת חומרים) בבאר אחת של צלחת בעלת 6 בארות. הוסיפו מדיה של 2.5 מ"ל בלבד (ללא Fura-2AM) לשלוש בארות נוספות בצלחת, כסו את הצלחת ברדיד אלומיניום וחממו את המדיה ל-37 מעלות צלזיוס.
4. מעבירים CS המכיל מיוציטים מתא הקצב לבאר המכילה Fura-2AM, מכסים ומחזירים את הצלחת לחממה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ למשך 4 דקות. הרכב צינורות במשאבת הזלוף ושקע עם מדיה במהלך תקופת הטעינה של Fura-2AM, כמתואר בשלב 2.4.
5. כבו או צמצמו את אורות החדר כדי להפחית את הפוטו-הלבנה הפלואורסצנטית ולמטב את האות הפלואורסצנטי. הסר את צלחת 6 בארות מן האינקובטור, ולאחר מכן לשטוף את CS במשך 10 שניות בכל אחת משלוש בארות המכילות מדיה בלבד. מעבירים את ה-CS לסירת שקילה קטנה המכילה מדיה שחוממה מראש (ללא תוספת פורה-2:00).
6. הרכב את ה- CS לתא CS משומן טרי לאחר ניגוב עדין של החלק התחתון של ה- CS. הוסף בעדינות טיפת מדיה ל- CS, ולאחר מכן הרכיב את תושבת האלקטרודה מעל ה- CS, ולאחר מכן CS שני ואת התושבת העליונה. השתמש בברגים עם ראש פאן #0 כדי לסיים את הרכבת תא התא, כמתואר בשלבים 2.6.-2.7.
7. חבר את צינורות המשאבה המלאים במדיה למחמם הקדם, חבר את החימום המקדים לתא CS והנח מתאם שלב, כמתואר בשלב 2.8. אספו את המדיה באמצעות מערכת צינורות הוואקום והפעילו את מערכת החימום (איור משלים 2A,D-7) כדי לאזן את התא ל-37 מעלות צלזיוס, כמתואר בשלבים 2.8.-2.9.
8. הפעל את מגרה הקצב (איור משלים 2B-13) המוגדר ל-35-40 וולט ו-0.2 הרץ, כמתואר בשלב 2.10.
9. לפני הקלטת ארעי Ca²⁺ , הפעל פנס קטן או פנס ספרים המותקן ליד מקלדת המחשב כדי לסייע בהצגת המקלדת. בנוסף, להקליט את הרקע פלואורסצנטי באזור ללא מיוציטים לב. כדי להתחיל, בחר קובץ > התחל > חדש, כמתואר בשלב 2.12.
10. בחר ROI והגדר טאב אחד (או סרגל מעקב, בצד שמאל) עבור נומרטור גולמי וכרטיסייה שנייה עבור מכנה גולמי, המוגדר במרכז העליון של כל טאב. הקלט את הרקע במשך 10-20 שניות. לחצו לחיצה ימנית על העכבר וגררו מעל חלונית אחת של סרגל מעקב כדי לקבל את ערכי הנומרטור והמכנה הגולמיים הממוצעים של האות. הזן ערכים אלה על-ידי בחירה ב - Operations > Constants והזן את ערכי הגולמי.
11. הכן תבנית מסך חדשה כדי לאסוף גם את הקיצור וגם את ארעי Ca²⁺ . עבור אורך סרקומר, בחר Tab 1 והשתמש באותו תהליך כמתואר בשלב 2.13. להדמיית Ca²⁺ , בחר באפשרות Tab 2 > Ratio (מרכז עליון של הטאב) > מעקבים > ערוך מגבלות משתמש כדי להגדיר את הרמות המינימליות והמקסימליות עבור היחס, המוגדרות בדרך כלל בין 1 ל- 5. השתמש באותו תהליך כדי להגדיר את טווחי הנומרטור והמכנה עבור הכרטיסיות 3 ו- 4 (צד שמאל).
12. מקם תיבת החזר על ההשקעה מעל תמונת מיוציטים, כמתואר בשלב 2.14. בחר קובץ > > חדש לאסוף. כעת בחר התחל כדי לאסוף נתוני קיצור ויחס Ca²⁺ . שיא ≥7 התכווצויות/תא לניתוח ממוצע אותות.
13. חזור על הקלטת המעקב ברקע המתוארת בשלב 4.10. לאחר הקלטת 2-4 מיוציטים. בדרך כלל, הקלט 4-5 מיוציטים / CS או פחות מיוציטים אם יש שינויים משמעותיים בקריאת הרקע.

5. ניתוח נתונים של Ca²⁺ ארעיים במיוציטים מבודדים.

1. פתח את הקובץ הרצוי לניתוח ובחר תבניות > תבנית מסך לקיצור בתוספת ארעי Ca²⁺ . לאחר מכן, בחר את הכרטיסיות 1 ו- 2 (משמאל) כדי להציג אורך סרקומר ויחס Ca²⁺ , בהתאמה. בחר פעולות > קבועים והזן את ערכי הנומרטור והמכנה ממעקב הרקע Ca²⁺ .
2. הכן תבניות ניתוח לקיצור בתוספת Ca²⁺ נתונים ארעיים. בחר באפשרות Tab 1 (צד ימין) והשתמש באותו תהליך כמתואר בשלב 3.2. כדי להגדיר את תבנית ניתוח אורך Sarcomere.
3. בחר בכרטיסייה 2 (צד שמאל) ובחר פעולות, אפשרויות ניתוח ארעי מונוטוני, סימן אירוע TTL בתיבה הגדרת t0 והאפשרויות הבאות מהתפריט: קו בסיס (יחס בסיסי), מהירות יציאה יחסית ל- t0 (dep v), שיא (גובה שיא ו- %גובה שיא/קו בסיס או bl%peak h), מהירות דעיכה יחסית ל- tPeak (ret v), זמן לשיא 50% (TTP 50%) באמצעות t0, וזמן לבסיס 50% (TTR_50%) באמצעות tPeak. שמור אפשרויות ניתוח אלה על-ידי בחירה באפשרות תבניות ושמירת תבנית ניתוח באמצעות שם מזהה חדש. טען תבנית ניתוח זו לפני ניתוח כל מעקב.
4. השתמש באותו תהליך כמתואר בשלבים 3.3.-3.6. כדי לממוצע את האות ולאחר מכן לנתח את אורך הסרקומרה, ולאחר מכן את אותם השלבים עבור Ca²⁺ ארעי. קבעו סימנים נפרדים לאורך סרקומר ולמעקב אחר יחס חולף Ca²⁺ .

מחקרי תפקוד התכווצות מבוצעים על מיוציטים של חולדות החל מהיום שלאחר הבידוד (יום 2) ועד 4 ימים לאחר הבידוד. למרות שניתן לרשום מיוציטים יום לאחר הבידוד (כלומר, יום 2), לעתים קרובות נדרשים זמני תרבית ארוכים יותר לאחר העברת גנים או טיפולים כדי לשנות את תפקוד ההתכווצות⁸. עבור מיוציטים שגודלו בתרבית במשך יותר מ-18 שעות לאחר הבידוד, פרוטוקול הקצב המתואר בסעיף 1 מסייע בשמירה על t-tubules ועל תוצאות קיצור והארכה מחדש עקביות.

חלק מייצג של CS המכיל מיוציטים למחקרי קיצור מוצג באיור 1A, יחד עם מיוציט הממוקם כראוי לפני קביעת ההחזר על ההשקעה (איור 1B). לאחר זיהוי החזר השקעה (איור 1C; תיבה ורודה), מידע האלגוריתם המוצג מתחת למיוציטים מסייע גם הוא למטב את מיקום המיוציטים לפני ההקלטה. באופן ספציפי, הצפיפות האופטית הליניארית (LOD; קו שחור) היא אינדיקטור למספר ולמרווח של סרקומרים, וספקטרום הספק חד במעקב התמרת פורייה המהיר (FFT, קו אדום) מסייע להשיג יישור אופטימלי להקלטת קיצור והארכה מחדש. תבנית הגרטיקולה המשמשת לכיול אורך הסרקומר (וזיהוי הקצוות) מוצגת באיור 1D. הקלטה מיושרת טיפוסית של קיצור אורך סרקומר מוצגת באיור 2A (הלוח העליון), יחד עם הניתוח הממוצע של האותות המתואר בסעיף 3 (הלוח התחתון).

תפקוד לקוי מזוהה לעתים קרובות במיוציטים כאשר יש תפקוד לקוי in vivo במודלים של בעלי חיים. לדוגמה, תפקוד לקוי סיסטולי שנצפה על ידי אקוקרדיוגרפיה בתגובה לעומס יתר בלחץ (PO)¹³ מזוהה גם במחקרי קיצור מיוציטים⁵. כדי להמחיש עקבות נתונים, עקבות גולמיים מייצגים (איור 2; פאנל עליון) וממוצע אותות (איור 2; פאנל תחתון) מוצגים עקבות גולמיים המתקבלים ב-0.2 הרץ עבור מיוציטים מחולדות שאם-(איור 2A) ו-PO שטופלו (איור 2B). כדי לבחון אם ניתן להציל את תפקוד המיוציטים לאחר PO, העברת גנים בתיווך נגידי בזמן בידוד מיוציטים שימשה גם להחלפת טרופונין לב אנדוגני I (cTnI) בהחלפת cTnI T144D פו-מימטית (T144D) בסרקומר¹⁶. הניתוח הראשוני מראה את ההפחתה המושרה על ידי PO בתפקוד ההתכווצות (טבלה 1, פאנל עליון) שהוחזרה לרמות דמה במיוציטים של PO 4 ימים לאחר העברת גנים של cTnIT144D (טבלה 1; פאנל תחתון).

פלטפורמה זו יכולה לשמש גם למדידת Ca²⁺ טרנזיינטים, יחד עם קיצור במיוציטים מבודדים. קיצור ו-Ca 2+ לא תועדו לאחר PO מכיוון ש-PO מפחית את ההיצמדות של מיוציטים של חולדות ללמינין¹³, ומודל דומה הראה בעבר שינוי בטיפול ב-Ca²⁺ מתפתח בנקודת זמן דומה¹⁷. במקום זאת, ניסויים מייצגים בוצעו במיוציטים טעונים Fura-2AM שבודדו מחולדות בנות 2-3 חודשים. הקלטה מייצגת ועקבות ממוצעים של אותות מוצגים באיור 3, יחד עם ניתוח הנתונים בטבלה 2. עבור סדרה זו של ניסויים, מיוציטים שבודדו מחולדות בוגרות נחקרו 4 ימים לאחר העברת גנים בתיווך אדנו-ויראלי (ריבוי זיהום = 100) של cTnIT144D או cTnI מסוג בר. גם קיצור סרקומר וגם ארעי Ca 2+ נמדדו לאחר טעינת מיוציטים עם^Fura-2AM. העברת גנים של cTnIT144D שיפרה את קיצור השיא ואת רמות Ca²⁺ דיאסטוליות גבוהות בהשוואה ל-cTnI במחקרים ראשוניים אלה (טבלה 2). אמנם יש צורך בניתוח מקיף יותר, אך התוצאות הראשוניות מצביעות על כך שהחלפת in vivo ב-cTnIT144D עשויה לייצר פנוטיפ לבבי מורכב עקב שינויים הן בתפקוד ההתכווצות והן בטיפול ב-Ca²⁺ לאורך זמן.

איור 1: מיוציטים לבביים של חולדות בוגרות המשמשים למחקרים פונקציונליים. (A) מיוציטים לבביים מבודדים מייצגים מחולדה בוגרת (סרגל קשקשים = 50 מיקרומטר). החץ מצביע על מיוציט מייצג שצולם לצורך ניתוח פונקציית התכווצות. (B) מיוציט מייצג עם ROI (ורוד) הממוקם בצד (סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר). (C) מיוציט מייצג עם ROI (פאנל עליון), תבנית הסרקומר עבור מיוציט זה (פאנל תחתון, כחול; סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר), והשיא החד של ספקטרום ההספק (פאנל תחתון, אדום). (D) לכידת מסך של 0.01 מ"מ graticule כדי לכייל את המדידות המקוצרות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: הקלטות מייצגות של מיוציטים של חולדות. הקלטה גולמית (פאנל עליון) ועקבות עם ממוצע אותות (פאנל תחתון) שנרשמו ב-0.2 הרץ במיוציטים מחולדות שטופלו בעומס יתר של (A) בלחץ (A) ו-(B). מיוציטים בודדו 18-20 שבועות לאחר הניתוח, עם PO המיוצר על ידי כריתת כליות¹³. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: רישום וניתוח מייצגים של אורך סרקומר (SL) ו-Ca 2+ ארעיים ממיוציטים לבביים בוגרים טעונים ב-Fura-2AM. (A) עקבות גולמיים עבור SL, Ca 2+ יחס ארעי (יחס), ועקבות הנומרטור והמכנה המשמשים ליצירת יחס ארעי Ca ²⁺. (B) דוגמה לעקבות ממוצעים של אותות עבור SL (עקבה עליונה) ויחס ארעיות Ca²⁺ (עקבה תחתונה). (C) עקבות מנותחות עבור אורך סרקומר (SL) ויחס הטרנזיינט Ca²⁺ באמצעות אלגוריתם המעקב המונוטוני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה 1: השוואה של תפקוד התכווצות במיוציטים לבביים בתגובה לעומס לחץ (PO) והעברת גנים. תוצאות קיצור מיוציטים הן מלבבות חולדות sham ו- PO 18-20 שבועות לאחר הניתוח (פאנל עליון)^5,13 ומיוציטים מחולדות sham ו- PO 4 ימים לאחר העברת גנים cTnIT144D (פאנל תחתון). תפקוד התכווצות נמדד 4 ימים לאחר בידוד מיוציטים/העברת גנים בכל הקבוצות. התוצאות מבוטאות כממוצע ± SEM (n = מספר המיוציטים). כל קבוצה של נתוני sham ו- PO מושווית על ידי מבחן t של סטודנט, כאשר *p < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית. תוצאות שיא המשרעת עבור מיוציטים של sham ו- PO בלבד דווחו מוקדם יותר ב- Ravichandran et ^al.5.

טבלה 2: תפקוד התכווצות ו-Ca²⁺ חולף במיוציטים של חולדות בוגרות 4 ימים לאחר העברת גנים cTnIT144D. ניתוח של פונקציית התכווצות (פאנל עליון) ו- Ca²⁺ טרנזיינטים (פאנל תחתון) מוצג במיוציטים לאחר העברת גנים של cTnIT144D בהשוואה ל- cTnI מסוג פראי. מיוציטים מבודדים מחולדות בוגרות בנות 2-3 חודשים, והנתונים מוצגים כממוצע ± SEM (n = מספר המיוציטים). השוואות סטטיסטיות של פונקציית כיווץ (משמאל) ו- Ca²⁺ ארעיים (מימין) מבוצעות באמצעות מבחן t של סטודנט לא משויך עם מובהקות המוגדרת ל- *p < 0.05.

איור משלים 1: רכיבים של מערכת הקצב עבור מיוציטים המצופים ב-CSs מצופים למינין. (A) תא קצב מותאם אישית המכיל אלקטרודות פלטינה בכל תא. (B) תא קצב עם ארבעת התאים הראשונים מלאים במדיה. (C) תא קצב המחובר לכבלי ג'ק בננה, המחוברים לתא ו-(D) למגרה. (E) החיבור בין הגירוי (מימין) לבין האינקובטור של 37 מעלות צלזיוס (משמאל). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: הרכיבים הדרושים לתפקוד כיווץ מיוציטים ו/או למדידות ארעיות של Ca²⁺. (A) פלטפורמת פונקציית ההתכווצות המציגה כל רכיב, כאשר הפריטים הממוספרים מוסברים ביתר פירוט בטבלת החומרים. הרכיבים בפלטפורמה כוללים שולחן נגד רעידות , מיקרוסקופ שדה בהיר הפוך (#2,3), מצלמת CCD , בקר CCD וספק כוח קסנון , מקור אור פליטה כפולה , בקר טמפרטורה , משאבה פריסטלטית , מחזיק צינור מבודד , תא זלוף המורכב על כיסוי (#10) ומערכת ואקום (#11). (B) רכיבים נוספים כוללים את ממשק הפלואורסצנציה (#12), מגרה התא (#13) ומחשב PC (#14), אשר מוסברים בפירוט רב יותר בטבלת החומרים. תצוגות תקריב של פריטים ממוספרים בחלונית A מוצגות ב- C-F. (C) תצוגה של ספק הכוח קסנון (משמאל) ובקר CCD (מימין). (D) בקר טמפרטורה. (E) משאבה פריסטלטית. (F) מבט על הבסיס של תא הזילוח CS (חץ שחור), תושבת אלקטרודת הפלטינה (חץ אפור) והתושבת העליונה (חץ לבן) עם ברגים עם ראש פאן #0. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

פרוטוקול הקצב הכרוני המתואר בשלב 1 מאריך את הזמן השימושי לחקר מיוציטים מבודדים ולהערכת ההשפעה של טיפולים ארוכים יותר. במעבדה שלנו, תוצאות עקביות התקבלו עד 4 ימים לאחר הבידוד בעת מדידת תפקוד התכווצות באמצעות אורך סרקומר על מיוציטים בקצב כרוני. עם זאת, תפקוד התכווצות המיוציטים מתדרדר במהירות בעת שימוש במדיה מעל שבוע אחד לקצב מיוציטים.

עבור מחקרי תפקוד התכווצות, הנתונים נאספים ב 37 מעלות צלזיוס, אשר קרוב לטמפרטורת הגוף עבור חולדות. כדי למטב את הכדאיות של מיוציטים ולקבל עקבות עקביים עבור כל מיוציט, ניסויים אלה מבוצעים בתדר קצב נמוך יותר מקצב הלב הפיזיולוגי של ~ 5 הרץ בחולדות. הגדרות אלה מייצרות נתוני פונקציית כיווץ עקביים, אך ניתן להתאים את טמפרטורת התא ו/או תדירות הקצב אם העקבות המתקצרים נשארים עקביים על פני CSs מרובים המכילים את אותה קבוצת טיפול של מיוציטים. בנוסף, תוצאות אופטימליות מתקבלות על ידי בחירת myocytes כי חסר blebs, דבקים באופן מלא CS, חוזה בשני הקצוות של תא בצורת מוט. תאים המחוברים בקצה אחד בלבד, אלה עם כתמים מרובים, ו / או מיוציטים מתכווצים רק בקצה אחד אינם רצויים ולעתים קרובות קשה יותר להקליט אותם עקב תנועת הרקע. עבור מחקרים אלה, ≥20 סרקומרים כלולים בהחזר ההשקעה כדי להשיג שיא ספקטרום הספק חד, אורכי סרקומר הניתנים לשחזור במנוחה ויחס אות/רעש אופטימלי עבור העקבות המתקצרים. ניתן להשתמש בהחזר השקעה עם שבעה סרקומרים בלבד אם שיא ספקטרום ההספק נשאר חד. אורך סרקומר המנוחה במיוציטים של חולדות מבודדות נע בדרך כלל בין 2.00-1.80 מיקרומטר. אם אורך סרקומר במנוחה קטן מ-1.5 מיקרומטר, התכווצות פעילה אינה מציאותית בהתבסס על הבנתנו את ארכיטקטורת הסרקומר¹⁸ ובדרך כלל היא תוצאה של כיוון מיוציטים תת-אופטימלי.

מדידת פונקציית ההתכווצות עם או בלי מדידות ארעיות של Ca²⁺ במיוציטים שלמים היא גישת תפוקה גבוהה יותר הדורשת פחות השקעה בפיתוח המומחיות הטכנית הדרושה למדידות כוח בתאים בודדים שלמים¹¹. מחקרי מיוציטים שלמים מתמקדים גם הם אך ורק בתפקוד המיוציטים, ללא תרומתם של סוגי תאים אחרים בתכשירים רב-תאיים². תחום מתפתח בתחום זה הוא פיתוח של ניתוח תפוקה גבוהה יותר על ידי מדידה בו זמנית של קיצורים ו/או ארעי Ca²⁺ במספר מיקרוציטים שלמים כדי להאיץ את ההקרנה של חומרים טיפוליים ברמה התאית לפני ניתוח in vivo נרחב יותר.

פונקציית התכווצות ומדידות ארעיות Ca²⁺ אפשריות גם במיוציטים שלמים שבודדו ממודלים אחרים של מכרסמים כגון עכברים, אם כי ישנם כמה שיקולים והבדלים חשובים בהשוואה למיוציטים של חולדות. מיוציטים של עכברים הם ברי קיימא בתרבית במשך 24-36 שעות, אך הכדאיות פוחתת בהדרגה במיוציטים שגודלו בתרבית במשך יותר מ-48 שעות¹⁹. יש לקחת בחשבון את מרווח התרבית החתוך הזה בעת שימוש בהעברת גנים מבוססת וקטורים, במיוחד עבור חלבוני מיופילמנט שיש להם זמן מחצית חיים בימים ולא^{בשעות 20}. שלא כמו מיוציטים של חולדות, הבידוד והתרבית המוצלחים של מיוציטים של עכברים תלויים גם בתוספת של מעכבי מיוזין ATPase, כגון מונוקסיים 2,3-בוטנדיון או בלביסטטין, למדיה תרבותית¹⁹. כתוצאה מכך, קצב כרוני אינו אפשרות מעשית בתרביות מיוציטים של עכברים. יש צורך גם בזמן שיווי משקל ארוך יותר של 15-20 דקות כדי להסיר את ההשפעה התפקודית של מעכבי מיוזין אלה על מיוציטים של עכברים מבודדים. לבסוף, מיוציטים של עכברים הם בקצב אופטימלי של 0.5 הרץ כדי לקבל עקבות קיצור הניתנים לשחזור בהשוואה ל-0.2 הרץ המשמשים עבור מיוציטים של חולדות.

במחקרים על חולדות שטופלו ב-PO, תפקוד לקוי של התכווצות מזוהה באופן עקבי עם קצב בתדר נמוך במיוציטים של חולדות. הפחתה גדולה יותר תלוית תדירות בהתקצרות מתגלה גם במיוציטים לאחר PO בהשוואה לחולדות בושה כאשר יש תפקוד לקוי של התכווצות in vivo ^5,13. במהלך מחקר שהשתמש בטווח תדרים, הכפלת מהירות המשאבה כדי לספק מדיה מספקת המיוצרת התקצרות במצב יציב תוך 15-20 שניות לאחר שינוי תדר הגירוי בין 0.2 ל-2 הרץ. באופן כללי, תפקוד התכווצות המיוציטים הוכח כגישה הניתנת לשחזור כדי לאשר או לאמת תפקוד לב in vivo במודלים של חולדות, כגון PO- בהשוואה לחולדות שטופלו בבושה (טבלה 1; ראו Kim et al.13). בנוסף, פלטפורמה זו יכולה לבדוק אם טיפול המכוון למיוציטים משחזר או פוגע בתפקוד ההתכווצות לפני נקיטת גישות in vivo יקרות יותר ו/או מייגעות. הן העברה אקוטית והן חשיפה ארוכה יותר לגורמים טיפוליים ו/או לאחר העברת גנים במהלך התרבית הראשונית אפשריים בגישה זו. לדוגמה, ניסויים בהעברת גנים להחלפת cTnI אנדוגני ב-cTnIT144D מצביעים על כך שאין שינוי משמעותי במשרעת הקיצור במיוציטים מחולדות בושה. לעומת זאת, cTnIT144D משחזר משרעת שיא של קיצור לקראת ערכי בושה במיוציטים מחולדות שטופלו ב-PO (טבלה 1). חולשה מובנית של גישה זו היא היעדר העומס הטיפוסי הקיים במיוציטים בתנאי in vivo. כתוצאה מכך, תגובות עשויות להיות שונות מתגובות פונקציונליות תלויות עומס, והניסוי לדוגמה מצביע על כך שיש צורך בגישות in vivo כדי לחקור עוד יותר אם cTnIT144D משפר את ביצועי הלב במהלך PO.

המדידה של שני הקיצור וגם של טרנזיינטים Ca²⁺ באותו מיוציט היא יתרון של פלטפורמה זו. לדוגמה, כיוון השינוי עשוי להיות שונה עבור ארעי Ca²⁺ בהשוואה לפונקציית התכווצות. כפי שמוצג בטבלה 2, קיצור שיא עולה באופן משמעותי לאחר העברת גנים של cTnIT144D לתוך מיוציטים מחולדות בנות 2-3 חודשים. תוצאה זו שונה מהנתונים המתקבלים במיוציטים מבוגרים יותר שטופלו בבושה (טבלה 1) ועשויה להיות קשורה לגיל⁵. עם זאת, יש צורך בבדיקות נוספות כדי להוכיח פרשנות זו. הנתונים בטבלה 2 מראים גם כי cTnIT144D אינו משנה את משרעת השיא Ca 2+, ובמקום זאת, נוטה להאט את קצב הדעיכה של Ca 2+ ולהעלות את Ca²+ במנוחה⁺. ממצאים אלה מצביעים על כך שביטוי cTnIT144D משפר את תפקוד ההתכווצות, בעוד שמכונות המחזור Ca²⁺ מפצות על כך כדי לרכך את האפקט הזה. תוצאות אלה מדגישות את יכולתה של גישה זו להבחין בין שינויים בתפקוד הכיווץ לבין מחזוריות Ca²⁺. בעוד שהתוצאות הספציפיות המוצגות כאן עדיין אינן חד משמעיות, הן מספקות רציונל מוצק לפיתוח מודל גנטי של בעלי חיים כדי לבטא את שריר הלב cTnIT144D ולהעריך אם הביטוי שלו מקהה תפקוד לקוי שנגרם על ידי PO בעתיד. תצפית אחרונה מהנתונים הארעיים של Ca 2⁺ היא שצבעים פלואורסצנטיים כגון Fura-2AM משנים את קינטיקה של פונקציית הכיווץ במיוציטים²¹. למרות שהתגובה היחסית המיוצרת על ידי טיפול נתון או מודל של בעלי חיים דומה בתוך מיוציטים טעונים Fura-2, אין לשלב תוצאות אלה עם מדידות קיצור שנעשו בהיעדר Fura-2AM. כדי לייעל את השימוש ב- Fura-2AM לניתוח ארעי^של Ca 2+, המעבדה מודדת לרוב קיצור בהיעדר Fura-2AM ומבצעת תת-קבוצה של ניסויים למדידת ארעיות Ca²⁺.

למחברים אין אינטרסים כספיים מתחרים או ניגודי עניינים אחרים.

עבודה זו נתמכת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מענק R01 HL144777 (MVW).