의식이있는 쥐의 신장 혈류에 대한 장기간 연속 측정

본 프로토콜은 의식이있는 쥐에서 신장 혈류의 장기간 연속 측정과 동시에 이식 된 카테터 (유체 충전 또는 원격 측정)로 혈압을 기록하는 것을 설명합니다.

신장은 체액의 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을합니다. 신장 혈류 (RBF)의 조절은 신장 기능에서 여과 및 신진 대사의 중요한 기능에 필수적입니다. 신장 관류의 조절을 담당하는 메커니즘을 결정하기 위해 다양한 조건에서 RBF를 측정하기 위해 마취 된 동물에서 많은 급성 연구가 수행되었습니다. 그러나 기술적인 이유로 장기간 동안 억제되지 않은 마취되지 않은 쥐에서 RBF를 지속적으로(24시간/일) 측정하는 것은 불가능했습니다. 이러한 방법을 사용하면 몇 주에 걸쳐 RBF를 지속적으로 측정할 수 있으며 동시에 이식된 카테터(유체 충전 또는 원격 측정)로 혈압(BP)을 기록할 수 있습니다. RBF 모니터링은 연구 전반에 걸쳐 쥐의 억제되지 않은 움직임을 가능하게 하는 원형 서보 제어 쥐 케이지에 배치된 쥐와 함께 수행됩니다. 동시에 유동 프로브와 동맥 카테터의 케이블이 엉키는 것을 방지합니다. 쥐는 먼저 왼쪽 신장 동맥에 초음파 흐름 프로브를 배치하고 오른쪽 대퇴 동맥에 이식 된 동맥 카테터를 계측합니다. 이들은 목덜미에 피하로 라우팅되고 각각 유량계와 압력 변환기에 연결되어 RBF와 BP를 측정합니다. 외과 적 이식 후, 쥐는 즉시 케이지에 배치되어 적어도 1 주일 동안 회복하고 초음파 프로브 기록을 안정화시킵니다. 소변 수집도이 시스템에서 가능합니다. 지속적인 모니터링을 위한 수술 및 수술 후 절차가 이 프로토콜에서 입증됩니다.

신장은 체중의 0.5 %에 불과하지만 혈류가 풍부하여 총 심 박출량의 20 % -25 %를받습니다¹. 신장 혈류 (RBF)의 조절은 신장 기능, 체액 및 전해질 항상성의 핵심입니다. 신장에 대한 혈류 조절의 중요성은 일측 신장 절제술 ^2,3,4 후 나머지 신장에서 RBF의 실질적인 증가와 신부전 5,6,7에서 발생하는 RBF의 감소에 의해 잘 설명됩니다. RBF의 이러한 변화가 신장 기능의 변화에 반응하여 발생하는지 또는 RBF의 감소로 인한 기능의 감소가 마취된 외과적으로 준비된 동물 또는 인간 대상체에서 확인하기가 어려웠습니다. 사건이 정의 된 변화 전후에 결정되고 사건이 진행되는 동안 동일한 동물에서 관찰 될 수있는 시간적 연구가 필요합니다. 동물 및 인간 연구에서 RBF는 파라 아미노 히푸르산 (PAH)8,9,10의 제거에 의해 간접적으로 추정되었으며, 최근에는 초음파^9,11,12, MRI^4,13 및 PET-CT ^14,15와 같은 이미징 기술에 의해 추정되었습니다. 각 신장의 유용한 스냅 샷 이미지를 제공하고 질병의 진행을 추적 할 수 있습니다. 마취없이 초음파 또는 MRI 스캔으로 작은 동물에서 RBF를 평가하는 것은 어렵습니다. 장기간에 걸쳐 동일한 쥐의 의식 조건에서 RBF를 지속적으로 측정하는 것은 불가능했습니다.

따라서, 본 프로토콜은 RBF의 동시 연속 24시간/일 측정을 가능하게 하는 기술을 개발했으며, 이는 이전에 기술된 바와 같이 자유롭게 움직이는 쥐를 위한 연속 혈압 측정 방법과 결합되었다 16,17,18,19,20,21 . 이 기술은 미래의 다양한 신장 질환에서 인과 관계를 연구하기 위해 쥐의 다양한 모델에서 RBF의 시간적 평가를 허용합니다.

이 프로토콜은 위스콘신 의과 대학 기관 동물 관리 및 사용의 승인을 받았습니다. 달염에 민감한 래트(수컷 및 암컷), ~8주령, 200-350g을 실험에 사용하였다.

1. 동물 준비

1. 동물실에 쥐를 위한 움직임 반응 케이지 시스템, 혈관주위 흐름 모듈, 주사기 펌프, 기록 장치 및 소프트웨어( 재료 표 참조)를 설치합니다.
2. 적어도 수술 일주일 전에 환경, 음식 및 수계에 익숙해 지도록 쥐를 새장에 넣으십시오. 높은 위 함량은 왼쪽 신장 동맥으로의 유동 프로브의 배치를 방해하고 기관 흡인을 유발할 수 있기 때문에 수술 전날부터 쥐를 빨리 먹습니다.
3. 5cm의 폴리우레탄 튜빙(내경 0.30mm, 외경 0.64mm)을 90cm의 폴리우레탄 튜빙(내경 0.64mm, 외경 1.02mm)의 끝에 PVC 시멘트로 연결하여 대퇴 동맥 카테터를 만듭니다( 재료 표 참조).
   1. 에틸렌 옥사이드 멸균기로 카테터를, 2.5% 글루타르알데히드가 포함된 플로우 프로브를, 증기 오토클레이브에서 수술 기구를 멸균합니다. 수술대, 현미경 검사 및 조명을 1% 차아염소산나트륨으로 닦습니다.

2. 수술

1. 아래 단계에 따라 RBF 프로브를 놓습니다.
   1. 쥐가 통증 자극에 반응하지 않는 정도까지 2.0%-2.5% 이소플루란으로 쥐를 마취합니다. 37°C로 설정된 수술대에 놓고 수술 전에 부프레노르핀 SR 0.09mg/kg과 세파졸린 15mg/kg( 재료 표 참조)을 주사합니다.
   2. 전기 클리퍼로 복부 전체를 면도하고 카테터와 흐름이 와이어가 빠져 나가는 7^번째 자궁 경부 척추 주변의 목덜미 부위를 면도합니다.
   3. 면도 후 70 % 에탄올, 10 % 포비돈 요오드 및 70 % 에탄올로 해당 부위를 닦으십시오.
   4. 쥐를 경향이있는 위치에 놓습니다. 목덜미와 왼쪽 옆구리에 메스를 사용하여 1cm 자릅니다. 그런 다음 지혈 겸자로 둔기 해부를 수행하고 옆구리 절개에서 목 뒤쪽까지 피하 공간을 청소하십시오.
   5. 지혈 겸자로 목에서 옆구리 절개로이 피하 터널을 통해 흐름 프로브를 통과시킵니다.
   6. 쥐를 앙와위 자세에 놓습니다. 4-5cm 정중선 복부 절개를하십시오.
   7. 곡선 핀셋으로 신장 동맥 주변 영역을 해부하여 유동 프로브를 배치하기에 충분한 공간을 노출시킵니다( 재료 표 참조). 그런 다음 지혈 겸자로 왼쪽 사각 요추 근육을 뚫고 흐름 프로브의 머리를 복강 내로 당깁니다.
   8. 유량 프로브의 끝을 왼쪽 신장 동맥에 걸고 유량계에 연결합니다( 재료 표 참조). 프로브 팁 주위에 젤을 추가하면 유량 값이 유량계에 나타납니다.
      알림: 쥐의 크기에 따라 다르지만 3g 쥐에서 약 5-230mL/분의 흐름이 관찰됩니다.
   9. 복벽에 조직 접착제로 프로브에 부착 된 폴리 에스테르 섬유 메쉬를 붙이고 건조하고 접착 될 때까지 유지합니다 (~ 1-2 분). 흐름이 제자리에 있으면 유량계에서 유량 프로브를 분리하고 식염수에 적신 거즈로 복부를 덮고 카테터를 삽입하는 단계로 넘어갑니다.
2. 아래 단계에 따라 대퇴 카테터를 삽입합니다.
   참고: 유체로 채워진 카테터를 삽입하는 방법은 일반 원격 분석 설치와 동일합니다. 원격 측정이 선호되지만 동맥 카테터는 의식이 있는 쥐의 압력 모니터링 및 기간 혈액 샘플링을 가능하게 합니다.
   1. 먼저 카테터를 식염수로 채우고 혈관 집게로 고정한 후 왼쪽 허벅지에 메스를 사용하여 1cm 피부 절개를하여 대퇴 동맥을 해부하고 노출시킵니다. 실로 대퇴 동맥의 근위부의 흐름을 차단하면서 카테터를 삽입하십시오.
   2. 소량의 식염수로 플러시하고 적절한 크기의 스테인리스 와이어로 꽂고 카테터를 실로 묶어 고정합니다.
   3. 합자가 카테터 주위에 묶이면 허벅지에서 목 뒤쪽까지 스테인리스 스틸 투관침을 사용하여 카테터를 목 부위로 가져와 피하 터널을 만듭니다. 승모근에 3-0 실크 봉합사로 고정하십시오.
3. 프로브를 봉합하십시오.
   1. 쥐를 엎드린 위치로 돌리고 흐름 프로브의 원형 루프를 측면에서 피하로 꿰매십시오. 옆구리와 목의 절개 부위를 4-0 수술 봉합사로 봉합합니다 ( 재료 표 참조).
   2. 플로우 프로브에 스킨 버튼을 부착하고 목 뒤쪽에 3-0 실크로 봉합하십시오.
   3. 유량 프로브를 유량계에 다시 연결하고 쥐를 등쪽 위치로 되돌려 RBF를 확인하고 유량 프로브를 최종 조정하여 신장 동맥에서의 위치를 최적화합니다.
   4. 마지막으로 3-0 실크로 근육을 봉합하고 4-0 수술 봉합사로 피부를 봉합합니다.

3. 동물의 회복

1. 주의 깊게 관찰 한 후, 쥐가 마취에서 완전히 회복 될 때까지, 쥐를 운동 반응 케이지 시스템으로 되돌리고, 유량 프로브를 혈류 측정기에 연결하고, 프로브 및 유량 측정을 안정화시키기 위해 약 일주일의 회복 기간을 허용한다.
   참고: 이 기간 동안 녹음을 수행할 필요는 없습니다.
2. 응고를 방지하기 위해 동맥 카테터에서 연구 전반에 걸쳐 3% 헤파린화 식염수를 100μL/h의 속도로 지속적으로 주입합니다.
3. 5-6일 후에 흐름이 안정되면 유량계 보정을 설정하여 0-20mL/min에서 혈류를 측정하고 RBF의 연속 기록을 시작합니다.

대표적인 수컷 달 염에 민감한 쥐로부터의 평균 동맥압 데이터(도 1A) 및 혈류 데이터(도 1B)가 도시되어 있다. Dahl 소금에 민감한 쥐는 식민지에서 유지되며 위스콘신 의과 대학에서 사육됩니다. 수술은 8 주령에 이루어졌으며 수술 당시 체중은 249g이었습니다. 쥐에게 0.4% NaCl 식단을 공급하고 10주령에 4% NaCl 식단으로 식단을 변경했습니다. 측정은 4% NaCl 식이에서 3주 동안 계속되었고, 실험은 13주령에 종료되었다. 데이터는 분 평균으로 표시됩니다. 평균 동맥압과 혈류에서 명확한 일주 차이가 관찰되었습니다. 고염분 식단으로 혈압이 상승하는 반면, 혈류는 증가하기보다는 감소하는 경향이 있어 신장 혈관 저항이 증가함을 시사합니다.

그림 1: 대표적인 동맥압 및 혈류 데이터. 평균 동맥압 (mmHg) (A) 및 신장 혈류 (mL / min) (B)는 분 평균으로 표시됩니다. LS : 저염 (0.4 % NaCl) 다이어트, HS : 고 염 (4 % NaCl) 다이어트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

본 프로토콜은 RBF 및 동맥압을 수주에 걸쳐 연속적으로 기록하기 위해 상업적으로 이용가능한 계측기를 이용하는 기술을 기술한다. 또한 단계 1.1에 설명 된 장치를 사용하여 소변을 수집 할 수 있습니다. 또한 소변의 대사 산물을 평가하고 동맥 카테터를 이식 할 때 분석을 위해 혈액 샘플링을 수행하는 데 사용할 수 있습니다.

전통적으로, RBF 측정은 외과적으로 준비된 마취된 동물에서 급성으로 얻어지거나 PAH 클리어런스에 의해 추정되었다. 그러나 다양한 마취제와 수술^22,23이 신장 혈류와 동맥압을 변화시키는 것으로 나타났습니다. 인간을 대상으로 한 연구에 따르면 이소플루란은 PAH 청소율을 각각 476.8-243.3mL/분으로, 이눌린 청소율을 88.0-55.7mL/분으로 감소^{시켰습니다8.} 티오바르비탈은 쥐에 대한 비판적 연구에 널리 사용되는 마취제입니다. 그럼에도 불구하고 신장 피질의 미토콘드리아에서 H 2 O₂생성은 혈류에 영향을 줄 수있는 티오바르비탈²⁴로 마취 후 90 분 후에 증가한다고보고되었습니다. 마취되지 않고 스트레스를받지 않은 동물에서의 측정은 많은 실험 연구에서 훨씬 바람직 할 것입니다. 유동 프로브를 이식하여 RBF를 측정하는 방법은 개²⁵ 및 래트²⁶에서 입증되었습니다. 이 연구는 또한 실험실에서 쥐의 RBF를 측정하는 방법을 확립했습니다.

이 프레젠테이션에 설명된 기술을 적용하면 주어진 자극에 따른 순차적 이벤트와 관련된 많은 질문을 해결할 수 있습니다. 마취되지 않은 계측 쥐 모델은 약물에 대한 즉각적이고 만성적 인 반응과 고혈압 발병 중에 발생할 수있는 다양한 자극의 장기적인 결과를 결정할 수있게합니다.

수술은 약간의 훈련을 통해 거의 100 %의 생존율로 최소한의 혈액 손실을 포함합니다. 플로우 프로브는 프로테아제가 함유된 음이온성 세제로 세척하고 4주간의 실험 후 살균한 후 재사용할 수 있습니다. 그러나 플라스틱 코팅은 점차 열화되고 여러 번 사용한 후에는 수리가 필요합니다. 카테터가 나오는 다음 피부 버튼은 조심스럽게 세척하고 소독하지 않으면 감염, 자극 및 긁힘에 취약하기 때문에 가장 심각한 잠재적 문제를 나타냅니다. 그러나 이것이 느슨해지면 마취하에 신속하게 수리 할 수 있습니다.

절차의 중요한 단계는 수술이며 기술을 습득하는 데 시간이 걸릴 수 있습니다. 그러나 일단 달성되면 마취되지 않은 만성 연구를 최소한의 문제로 생산적으로 수행 할 수 있습니다. 균주 또는 성별에 관계없이 200-350g의 쥐를 수술하는 것이 가능합니다. 다양한 크기와 동물의 쥐에 대한 실험은 제조업체가 이미 준비한 다양한 크기의 흐름 프로브를 사용하여 가능합니다.

그러나 주의해야 할 한계와 특정 문제가 있습니다. 첫째, 수술 후 감염을 최소화하기 위해 가능한 한 멸균 된 도구, 카테터 및 흐름 프로브를 사용하여 수술을 수행해야합니다. 둘째, 수술이 광범위하고 한 시간 이상이 필요하기 때문에 연구를 위한 "대조" 측정을 얻기 전에 충분히 긴 회복 기간을 제공해야 합니다. 우리 실험실의이 기간은 일반적으로 7-10 일입니다. 셋째, 장폐색 (장의 폐색 또는 마비)은 수술 후 합병증을 나타내는 경우에 따라 문제가되었습니다. 이것은 시술 중 장의 노출을 피하고 (예 : 축축한 거즈로 싸서 유지) 결합이 잘 건조 될 때까지 복부 절개를 닫지 않음으로써 예방할 수 있습니다. 수술 중 장이 신장 동맥에 노출되는 것을 피하고 봉합 시 장이 뒤틀리지 않도록 하는 것이 중요합니다. 넷째, RBF는 신장 체중 증가에 비례하여 증가 할 것임을 인식해야합니다. 이것은 반대쪽 신장 제거 후 신장 비대가 발생하는 연구에서 고려되어야합니다. 다섯째, 우리는 최대 한 달 동안 RBF를 측정 한 경험이 있으며이 기간 이상으로 측정을 연장하려고 시도하지 않았습니다. 거의 모든 경우에 이 기간 동안 일이 잘 작동했기 때문에 연구는 몇 주 이상 연장될 수 있었습니다. 마지막으로, 평행 동맥압 측정에 대한 간략한 설명: 24시간/일 개통성을 유지하기 위해 희석된 헤파린이 주입된 유체 충전 카테터와 이식된 원격 측정 장치가 사용됩니다. 각각은 실험 설계 및 필요에 따라 장단점이 있습니다. 예를 들어, 카테터 방법을 선택하면 동맥 카테터에서 혈액 샘플링이 가능하며 원격 측정 방법에는 헤파린 화가 필요하지 않습니다. 그러나 둘 다 RBF와 BP의 장기 측정 중에 우리에게 도움이 되었습니다.

저자는 공개 할 것이 없습니다.

이 연구는 과학 연구 보조금(P01 HL116264, RO1 HL137748)의 지원을 받았습니다. 저자는 실험실 관리자로서 실험 환경을 유지하는 데 도움이 된 Theresa Kurth의 조언과 도움에 감사드립니다.