意識のあるラットにおける腎血流の長期連続測定

本プロトコルは、意識のあるラットにおける腎血流の長期連続測定と、埋め込まれたカテーテル(液体充填または遠隔測定による)による血圧の同時記録について説明しています。

腎臓は体液の恒常性を維持する上で重要な役割を果たします。腎血流(RBF)の調節は、腎機能における濾過および代謝の重要な機能に不可欠です。腎灌流の調節に関与するメカニズムを決定するために、さまざまな条件下でRBFを測定するために、麻酔をかけた動物で多くの急性研究が行われています。しかし、技術的な理由から、拘束されていない無麻酔ラットのRBFを長期間にわたって連続的に(24時間/日)測定することは不可能でした。.これらの方法により、数週間にわたってRBFを継続的に測定すると同時に、埋め込まれたカテーテル(液体充填またはテレメトリによる)で血圧(BP)を記録することができます。RBFモニタリングは、ラットを円形のサーボ制御ラットケージに入れて実施され、研究全体を通してラットの無制限の動きを可能にします。同時に、フロープローブと動脈カテーテルからのケーブルの絡まりが防止されます。ラットは、最初に左腎動脈に超音波フロープローブを配置し、右大腿動脈に動脈カテーテルを埋め込むことで計装されます。これらは首のうなじに皮下配線され、それぞれ流量計と圧力トランスデューサに接続されて、RBFとBPを測定します。外科的移植後、ラットは直ちにケージに入れられ、少なくとも1週間回復し、超音波プローブの記録を安定させる。このシステムでは採尿も可能です。継続的なモニタリングのための外科的および術後の手順は、このプロトコルで示されています。

腎臓は体重のわずか0.5%ですが、血流が豊富で、総心拍出量の20%〜25%を受け取ります¹。腎血流(RBF)の調節は、腎機能、体液、電解質恒常性の中心です。腎臓への血流調節の重要性は、片側腎摘^出術後の残りの腎臓におけるRBFの大幅な増加2,3,4および腎不全で起こるRBFの減少によってうまく示されています^5,6,7。このようなRBFの変化が腎機能の変化に応答して起こるのか、それともRBFの減少による機能の低下が起こるのかは、麻酔をかけた外科的に調製された動物またはヒト被験者で確認することは困難でした。定義された変化の前後にイベントを決定し、イベントの進行中に同じ動物で観察できる時間的研究が必要です。動物およびヒトの研究では、RBFはパラアミノ馬尿酸(PAH)8,9,10のクリアランスによって間接的に推定されており、最近では超音波^9,11,12、MRI ^4,13、およびPET-CT14,15などのイメージング技術によって推定されています。 これは、各腎臓の有用なスナップショット画像を提供し、病気の進行を追跡することができます。麻酔なしで超音波またはMRIスキャンによって小動物のRBFを評価することは困難です。同じラットの意識条件下でRBFを長期間にわたって連続的に測定することは不可能でした。

したがって、本プロトコルは、RBFの24時間/日の同時連続測定を可能にする技術を開発し、これは、前述のように自由に動くラットの連続血圧測定法と組み合わされた16,17,18,19,20,21。.この技術により、ラットの様々なモデルにおけるRBFの時間的評価が可能になり、将来の様々な腎障害における因果関係を研究することができます。

このプロトコルは、ウィスコンシン医科大学施設の動物の世話と使用によって承認されています。ダール塩感受性ラット(雄および雌)、~8週齢、200〜350gを実験に使用した。

1.動物の準備

1. ラット用の運動反応ケージシステム、血管周囲フローモジュール、シリンジポンプ、記録装置、およびソフトウェア( 材料表を参照)を動物室に設置します。
2. ラットをケージに入れて、少なくとも手術の前の週に環境、食物、水システムに慣れてください。胃の内容量が多いと、左腎動脈へのフロープローブの配置が妨げられ、気管吸引を引き起こす可能性があるため、手術の前日からラットを絶食させます。
3. 5cmのポリウレタンチューブ(内径0.30mm、外径0.64mm)を90cmのポリウレタンチューブ(内径0.64mm、外径1.02mm)の端にPVCセメントで接続し、大腿動脈カテーテルを作ります( 材料表を参照)。
   1. エチレンオキシド滅菌器でカテーテルを滅菌し、2.5%グルタルアルデヒドでフロープローブを滅菌し、蒸気オートクレーブで手術器具を滅菌します。手術台、顕微鏡、照明を1%次亜塩素酸ナトリウムで拭きます。

2.手術

1. 以下の手順に従ってRBFプローブを配置します。
   1. ラットが痛みの刺激に反応しない程度に2.0%〜2.5%のイソフルランでラットを麻酔します。.37°Cに設定した手術台に置き、手術前に0.09 mg / kgのブプレノルフィンSRと15 mg / kgのセファゾリン( 材料の表を参照)を注射します。
   2. 電気バリカンと、カテーテルと流れがワイヤーを出ることを証明する7^番目の 頸椎の周りの首のうなじの領域で腹部全体を剃ります。
   3. 剃った後、70%エタノール、10%ポビドンヨード、そして再び70%エタノールでその領域を拭きます。
   4. ラットを腹臥位にします。首のうなじと左脇腹にメスを使って1cmのカットをします。その後、止血鉗子で鈍的解剖を行い、脇腹切開部から首の後ろまで皮下空間をきれいにします。
   5. フロープローブをこの皮下トンネルに通し、首から止血鉗子で脇腹切開部まで通します。
   6. ラットを仰臥位に置きます。4〜5 cmの正中線腹部切開を行います。
   7. 湾曲したピンセットで腎動脈の周囲を解剖し、フロープローブを配置するのに十分なスペースを露出させます( 材料の表を参照)。次に、止血鉗子で左腰方形筋を鈍く突き刺し、フロープローブの頭を腹腔に引き込みます。
   8. フロープローブの先端を左腎動脈に引っ掛け、流量計に接続します( 材料の表を参照)。プローブの先端の周りにゲルを追加すると、流量の値が流量計に表示されます。
      注:ラットのサイズにもよりますが、230gのラットでは約3〜5 mL / minの流れが観察されます。
   9. プローブに取り付けられたポリエステル繊維メッシュを組織接着剤で腹壁に接着し、乾いて接着するまで保持します(~1〜2分)。流れが整ったら、流量計からフロープローブを外し、生理食塩水に浸したガーゼで腹部を覆い、カテーテルを挿入するステップに進みます。
2. 以下の手順に従って大腿骨カテーテルを挿入します。
   注意: 液体で満たされたカテーテルを挿入する方法は、通常のテレメトリインストールと同じです。テレメトリが好ましいが、動脈カテーテルは、意識のあるラットからの圧力モニタリングおよび期間採血を可能にする。
   1. まず、カテーテルに生理食塩水を入れ、血管鉗子でクランプしてから、左大腿部のメスを使って1cmの皮膚切開を行い、大腿動脈を解剖して露出させます。大腿動脈の近位側の流れを糸で塞ぎながら、カテーテルを挿入します。
   2. 少量の生理食塩水で洗い流し、適切なサイズのステンレスワイヤーで栓をし、カテーテルを糸で結んで固定します。
   3. 結紮糸がカテーテルの周りに結ばれたら、太ももから首の後ろまでステンレス鋼のトロカールを使用して皮下トンネルを作り、カテーテルを首の領域に持ってきます。僧帽筋に配置された3-0シルク縫合糸で固定します。
3. プローブを縫合します。
   1. ラットを腹臥位に回し、フロープローブの円形ループを側面で皮下縫い合わせます。脇腹と首の切開部を4-0外科用縫合糸で縫合します( 資料表を参照)。
   2. フロープローブにスキンボタンを取り付け、首の後ろに3-0シルクで縫合します。
   3. フロープローブを流量計に再度接続し、ラットを背側位置に戻してRBFを確認し、フロープローブの最終調整を行って腎動脈上の位置を最適化します。
   4. 最後に、3-0シルクで筋肉を縫合し、4-0外科用縫合糸で皮膚を縫合します。

3.動物の回復

1. 注意深く観察した後、ラットが麻酔から完全に回復するまで、ラットを運動反応ケージングシステムに戻し、フロープローブを血流計に接続し、約1週間の回復期間を待ってプローブと流量測定を安定させます。
   注:この期間中に録音を行う必要はありません。
2. 凝固を防ぐために、動脈カテーテルから100 μL / hの速度で研究全体を通して3%ヘパリン化生理食塩水を継続的に注入します。
3. 5〜6日後に流れが安定したら、流量計のキャリブレーションを設定して血流を0〜20 mL / minで測定し、RBFの連続記録を開始します。

代表的な雄ダール塩感受性ラットからの平均動脈圧データ(図1A)および血流データ(図1B)を示す。ダールの塩分感受性ラットはコロニーで飼育され、ウィスコンシン医科大学で飼育されています。手術は8週齢で行われ、手術時の体重は249gであった。ラットに0.4%NaCl食を与え、10週齢で食餌を4%NaCl食に変更した。測定は4%NaCl食で3週間継続され、実験は13週齢で終了した。データは分平均で表示されます。平均動脈圧と血流に明確な日周差が認められた。高塩分食で血圧が上昇する一方で、血流は増加するのではなく減少する傾向があり、腎血管抵抗の増加を示唆しています。

図1:代表的な動脈圧と血流データ。 平均動脈圧(mmHg)(A)と腎血流(mL /分)(B)を分平均で示します。LS:低塩(0.4%NaCl)食、HS:高塩(4%NaCl)食。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

本プロトコルは、市販の器具を利用してRBFおよび動脈圧を何週間にもわたって連続的に記録する技術を記載する。さらに、尿は、ステップ1.1に記載のデバイスを使用して収集できます。また、尿中の代謝物の評価や、動脈カテーテルが埋め込まれている場合は、分析のための採血にも使用できます。

伝統的に、RBF測定値は、外科的に調製された麻酔動物において急性に得られてきたか、またはPAHクリアランスによって推定されてきた。しかし、様々な麻酔薬および手術^22,23が腎血流および動脈圧を変化させることが示されている。ヒトでの研究では、イソフルランがPAHクリアランスをそれぞれ476.8〜243.3 mL /分に、イヌリンクリアランスを88.0〜55.7 mL /分に減少させたことが報告されています⁸。.チオバルビタールは、ラットの重要な研究に広く使用されている麻酔薬です。それでも、腎皮質のミトコンドリアにおける_H2O2産生は、チオバルビタール²⁴による麻酔後90分に増加し、血流に影響を与える可能性があると報告されています。麻酔をかけられていない動物やストレスを受けていない動物での測定は、多くの実験的研究にとってはるかに好ましいでしょう。フロープローブを移植してRBFを測定する方法は、イヌ²⁵およびラット²⁶において実証されている。この研究はまた、実験室でラットのRBFを測定する方法を確立しました。

このプレゼンテーションで説明されている手法を適用すると、所与の刺激に続く連続事象に関連する多くの質問に対処することができる。麻酔されていない計装ラットモデルは、薬物に対する即時および慢性の両方の反応、および高血圧の発症中に発生する可能性のあるさまざまな刺激の長期的な結果を決定することを可能にします。

手術は最小限の失血を含み、ある程度のトレーニングでほぼ100%の生存率を実現します。フロープローブは、陰イオン界面活性剤を含むプロテアーゼで洗浄し、4週間の実験後に滅菌した後に再利用できます。ただし、プラスチックコーティングは徐々に劣化し、数回使用した後、修理が必要になります。カテーテルが出る次の皮膚ボタンは、注意深く洗浄および消毒しないと、感染、刺激、および引っかき傷に対して脆弱であるため、最も重要な潜在的な問題を表しています。ただし、これが緩んだ場合は、麻酔下ですぐに修復できます。

手順の重要なステップは手術であり、テクニックを習得するのに時間がかかる場合があります。しかし、一度達成されると、麻酔されていない慢性研究は最小限の問題で生産的に実施することができます。系統や性別に関係なく、200〜350gのラットで手術することが可能です。異なるサイズのラットおよび動物に対する実験は、製造業者によってすでに調製された異なるサイズのフロープローブを用いても可能である。

ただし、注意しなければならない制限と特定の問題があります。まず、手術後の感染を最小限に抑えるために、滅菌された器具、カテーテル、およびフロープローブを使用して手術を行う必要があります。第二に、手術は広範囲で1時間以上かかるため、研究の「対照」測定値を取得する前に、十分に長い回復期間を提供する必要があります。私たちの研究室でのこの期間は、一般的に7〜10日です。第三に、イレウス(腸の閉塞または麻痺)は、術後合併症を表すいくつかの症例で問題となっています。これは、処置中に腸の露出を避け(例えば、湿ったガーゼで包んでおき)、結合がよく乾くまで腹部切開を閉じることを避けることによって防ぐことができる。手術中に腸を腎動脈にさらさないようにし、縫合時に腸がねじれないようにすることが不可欠です。第四に、RBFは腎臓重量の増加に比例して増加することを認識する必要があります。これは、反対側の腎臓の除去後に腎肥大が起こる研究では考慮する必要があります。.第五に、RBFの測定経験は最大1か月しかなく、この期間を超えて測定を延長しようとはしていません。ほぼすべてのケースでこの期間を通して物事がうまく機能していたので、研究はおそらく数週間を超えて延長される可能性があります。最後に、並列動脈圧測定についての簡単な言葉:24時間/日の開存性を維持するために希薄なヘパリンを備えた埋め込み型液体充填カテーテルと埋め込み型テレメトリデバイスが利用されます。それぞれに、実験計画とニーズに応じて長所と短所があります。例えば、カテーテル法を選択した場合、動脈カテーテルからの採血が可能であり、遠隔測定法ではヘパリン化は必要ない。ただし、どちらもRBFとBPの長期測定に役立ちました。

著者は開示するものは何もありません。

この研究は、科学研究のための助成金(P01 HL116264、RO1 HL137748)によってサポートされました。著者らは、ラボマネージャーとして実験環境を維持するための彼女のアドバイスと支援を提供してくれたTheresa Kurthに感謝したいと思います。