מדידה מתמשכת ארוכת טווח של זרימת הדם הכלייתית בחולדות מודעות

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מדידה רציפה ארוכת טווח של זרימת הדם הכלייתית בחולדות מודעות ובמקביל רישום לחץ דם עם צנתרים מושתלים (מלאים בנוזלים או בטלמטריה).

הכליות ממלאות תפקיד מכריע בשמירה על הומאוסטזיס של נוזלי הגוף. ויסות זרימת הדם הכלייתית (RBF) חיוני לתפקודים החיוניים של סינון וחילוף חומרים בתפקוד הכליות. מחקרים חריפים רבים בוצעו בבעלי חיים מורדמים כדי למדוד RBF בתנאים שונים כדי לקבוע מנגנונים האחראים על ויסות של זליגת כליות. עם זאת, מסיבות טכניות, לא ניתן היה למדוד RBF באופן רציף (24 שעות ביממה) בחולדות חסרות מעצורים לאורך תקופות ממושכות. שיטות אלה מאפשרות קביעה רציפה של RBF במשך שבועות רבים תוך רישום לחץ דם (BP) בו זמנית עם צנתרים מושתלים (מלאים בנוזל או בטלמטריה). ניטור RBF מתבצע עם חולדות הממוקמות בכלוב חולדות מעגלי מבוקר סרוו המאפשר תנועה בלתי מרוסנת של החולדה לאורך כל המחקר. במקביל, נמנעת הסתבכות של כבלים מבדיקת הזרימה וצנתרים עורקיים. חולדות עוברות תחילה בדיקת זרימה על-קולית הממוקמת בעורק הכליה השמאלי וצנתר עורקי המושתל בעורק הירך הימני. אלה מנותבים תת עורית לעורף הצוואר, ומחוברים למד הזרימה ומתמר הלחץ, בהתאמה, כדי למדוד RBF ו- BP. לאחר השתלה כירורגית, חולדות מוכנסות מיד לכלוב כדי להתאושש לפחות שבוע ולייצב את הקלטות הבדיקה העל-קוליות. איסוף שתן הוא גם אפשרי במערכת זו. ההליכים הכירורגיים והפוסט-כירורגיים לניטור רציף מודגמים בפרוטוקול זה.

הכליות הן רק 0.5% ממשקל הגוף אך עשירות בזרימת הדם, ומקבלות 20%-25% מתפוקת הלב הכוללת¹. ויסות זרימת הדם הכלייתי (RBF) הוא מרכזי בתפקוד הכליות, בנוזלי הגוף ובהומאוסטזיס של אלקטרוליטים. החשיבות של ויסות זרימת הדם לכליה מומחשת יפה על ידי העלייה המשמעותית של RBF בכליה הנותרת לאחר כריתת רחם חד צדדית ^2,3,4 ועל ידי הפחתות של RBF המתרחשות באי ספיקת כליות ^5,6,7. האם שינויים כאלה ב- RBF מתרחשים בתגובה לשינויים בתפקוד הכליות או ירידה בתפקוד עקב הפחתת RBF היה מאתגר לברר בבעלי חיים שהוכנו כירורגית מורדמים או נבדקים אנושיים. נדרשים מחקרים זמניים בהם ניתן לקבוע את האירועים לפני ואחרי שינוי מוגדר ולצפות באותה חיה במהלך התקדמות האירועים. במחקרים בבעלי חיים ובבני אדם, RBF הוערך בעקיפין על ידי סילוק של חומצה היפופורית פרה-אמינו (PAH)8,9,10 ובזמן האחרון על ידי טכניקות הדמיה כגון אולטרסאונד^9,11,12, MRI ^4,13 ו- PET-CT^14,15 אשר נותנים תמונות תמונה מועילות של כל כליה ואשר יכול לעקוב אחר התקדמות המחלה. זה מאתגר להעריך RBF בבעלי חיים קטנים על ידי אולטרסאונד או MRI סריקות ללא הרדמה. אי אפשר היה למדוד באופן רציף RBF בתנאים מודעים באותה חולדה לאורך תקופות ממושכות.

הפרוטוקול הנוכחי, אם כן, פיתח טכניקות המאפשרות מדידות רציפות בו זמנית של RBF 24 שעות ביממה, אשר שולבו עם שיטות מדידת לחץ דם רציפות עבור חולדות הנעות בחופשיות כפי שתואר קודם לכן 16,17,18,19,20,21 . טכנולוגיה זו מאפשרת הערכה זמנית של RBF במודלים שונים של חולדות כדי לחקור יחסי סיבה ותוצאה בהפרעות כליות שונות בעתיד.

הפרוטוקול מאושר על ידי המכללה הרפואית של ויסקונסין לטיפול ושימוש מוסדי בבעלי חיים. חולדות רגישות למלח דאהל (זכרים ונקבות), ~ 8 שבועות של גיל, 200-350 גרם, שימשו לניסויים.

1. הכנת בעלי חיים

1. התקינו מערכת להגבלת תגובת תנועה עבור החולדה, מודול זרימה פריווסקולרית, משאבת מזרק, מכשיר הקלטה ותוכנה (ראו טבלת חומרים) בחדר בעלי החיים.
2. הכניסו את החולדות לכלוב כדי להכיר את הסביבה, המזון ומערכת המים לפחות בשבוע שלפני הניתוח. צמו את החולדות מיום לפני הניתוח מכיוון שתכולת קיבה גבוהה עלולה להפריע למיקום בדיקת הזרימה לעורק הכליה השמאלי ויכולה לגרום לשאיפת קנה הנשימה.
3. חבר צינור פוליאוריתן באורך 5 ס"מ (קוטר פנימי 0.30 מ"מ וקוטר חיצוני 0.64 מ"מ) לקצה צינור הפוליאוריתן באורך 90 ס"מ (קוטר פנימי 0.64 מ"מ וקוטר חיצוני 1.02 מ"מ) עם מלט PVC ליצירת קטטר עורקי הירך (ראו טבלת חומרים).
   1. לעקר את הצנתרים עם מעקר תחמוצת אתילן, את בדיקת הזרימה עם 2.5% glutaraldehyde, ואת כלי הניתוח באוטוקלאב קיטור. נגבו שולחנות ניתוח, מיקרוסקופיה ואורות עם 1% נתרן היפוכלוריט.

2. ניתוח

1. מקם את הבדיקה RBF לפי השלבים הבאים.
   1. הרדימו את החולדות עם 2.0%-2.5% איזופלורן עד כדי כך שהחולדות אינן מגיבות לגירוי הכאב. הניחו אותו על שולחן הניתוחים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס והזריקו 0.09 מ"ג/ק"ג של בופרנורפין SR ו-15 מ"ג/ק"ג של צפזולין (ראו טבלת חומרים) לפני הניתוח.
   2. לגלח את כל הבטן עם קוצץ חשמלי ואזור על העורף סביב חוליות צוואר הרחם⁷ שבו קטטר וזרימה להוכיח חוטים ייצאו.
   3. לאחר הגילוח, נגבו את האזור עם 70% אתנול, 10% פובידון-יוד, ושוב עם 70% אתנול.
   4. מניחים את החולדה במצב נוטה. בצע חתך של 1 ס"מ באמצעות אזמל על העורף של הצוואר ואת האגף השמאלי. לאחר מכן, בצע דיסקציה קהה עם מלקחיים המוסטטיים ונקה חלל תת עורי מהחתך באגף לחלק האחורי של הצוואר.
   5. מעבירים את גשושית הזרימה דרך מנהרה תת עורית זו מהצוואר אל חתך האגף עם מלקחיים המוסטטיים.
   6. מניחים את החולדה במצב שכיבה. בצע חתך בטן בקו האמצע 4-5 ס"מ.
   7. נתחו את האזור סביב עורק הכליה בפינצטה מעוקלת כדי לחשוף חלל מספיק כדי למקם את בדיקת הזרימה (ראו טבלת חומרים). ואז לחדור בבוטות את שריר הלומבורום השמאלי עם מלקחיים hemostatic ולמשוך את הראש של בדיקה זרימה לתוך חלל הבטן.
   8. חברו את קצה גשושית הזרימה לעורק הכליה השמאלי וחברו אותו למד הזרימה (ראו טבלת חומרים). הוסיפו מעט ג'ל סביב קצה הבדיקה, וערך קצב הזרימה יופיע על מד הזרימה.
      הערה: למרות שזה תלוי בגודל החולדה, זרימה של כ-3-5 מ"ל/דקה תיצפה בחולדה במשקל 230 גרם.
   9. מדביקים את רשת סיבי הפוליאסטר המחוברת לבדיקה עם דבק רקמה לדופן הבטן ומחזיקים עד לייבוש ומלוכדים (~1-2 דקות). לאחר שהזרימה נמצאת במקומה, נתקו את גשושית הזרימה ממד הזרימה וכסו את הבטן בגזה ספוגה במי מלח ועברו לשלב החדרת הקטטר.
2. הכנס את קטטר הירך לפי השלבים הבאים.
   הערה: השיטה להחדרת קטטר מלא בנוזל זהה לזו של התקנות טלמטריה רגילות. למרות שעדיף טלמטריה, הצנתר העורקי מאפשר ניטור לחץ ודגימת דם מחזורית מהחולדה המודעת.
   1. ראשית, מלאו את הקטטר במי מלח ומהדקים אותו במלקחיים וסקולריים לפני ביצוע חתך עור של 1 ס"מ באמצעות אזמל בירך שמאל כדי לנתח ולחשוף את עורק הירך. בעת חסימת הזרימה בצד הפרוקסימלי של עורק הירך עם חוט, הכנס את הקטטר.
   2. יש לשטוף בכמות קטנה של מי מלח, לחבר חוט נירוסטה בגודל מתאים ולקשור את הקטטר בחוט כדי לתקן אותו.
   3. לאחר שהליגטורה נקשרת סביב הקטטר, צור מנהרה תת עורית על ידי שימוש בטרוקאר מפלדת אל-חלד מהירך ועד העורף כדי להביא את הקטטר לאזור הצוואר. אבטחו אותו עם 3-0 תפרי משי המונחים בשריר הטרפז.
3. לתפור את הבדיקה.
   1. סובבו את החולדה למצב נוטה ותפרו את הלולאה העגולה של גשושית הזרימה באופן תת עורי באגף. תפר את החתך באגף ובצוואר בתפר כירורגי 4-0 (ראו טבלת חומרים).
   2. חברו כפתור עור לבדיקת הזרימה ותפרו אותו עם משי 3-0 בחלק האחורי של הצוואר.
   3. חבר שוב את בדיקת הזרימה למד הזרימה, סובב את החולדה בחזרה למצב הגבי כדי לבדוק RBF, ובצע התאמות סופיות של בדיקת הזרימה כדי לייעל את מיקומה בעורק הכליה.
   4. לבסוף, לתפור את השריר עם 3-0 משי ואת העור עם 4-0 תפר כירורגי.

3. התאוששות של החיה

1. לאחר התבוננות מדוקדקת, עד שהחולדות יתאוששו לחלוטין מההרדמה, החזירו את החולדות למערכת כלוב של תגובת תנועה, חברו את גשושית הזרימה למד זרימת הדם, ואפשרו תקופת החלמה של כשבוע לייצוב הבדיקה ומדידת הזרימה.
   הערה: אין צורך לבצע הקלטה במהלך תקופה זו.
2. יש להחדיר 3% מי מלח שעברו הפרין באופן רציף לאורך כל המחקר מהקטטר העורקי בקצב של 100 μL/h כדי למנוע את קרישת הדם.
3. כאשר הזרימה מתייצבת לאחר 5-6 ימים, הגדר את כיול מד הזרימה למדידת זרימת הדם ב- 0-20 מ"ל לדקה והתחל בהקלטה רציפה של RBF.

מוצגים נתוני לחץ עורקי ממוצע (איור 1A) ונתוני זרימת דם (איור 1B) מחולדה רגישה למלח דאהל זכר מייצג. החולדות הרגישות למלח דאהל מתוחזקות במושבה ומגודלות במכללה הרפואית של ויסקונסין. הניתוח נעשה בגיל 8 שבועות, ומשקל הגוף היה 249 גרם בזמן הניתוח. החולדות הוזנו בדיאטת NaCl של 0.4%, והדיאטה שונתה לדיאטת NaCl של 4% בגיל 10 שבועות. המדידות נמשכו במשך 3 שבועות בדיאטת NaCl של 4%, והניסוי הופסק בגיל 13 שבועות. הנתונים מוצגים עם ממוצע דקה. הבדל יומי ברור נצפה בלחץ העורקים הממוצע ובזרימת הדם. בעוד לחץ הדם עולה עם דיאטה עשירה במלח, זרימת הדם נוטה לרדת ולא לעלות, מה שמרמז על עמידות מוגברת של כלי הדם הכליים.

איור 1: נתוני לחץ עורקי מייצג וזרימת דם. לחץ עורקי ממוצע (מ"מ כספית) (A) וזרימת דם כלייתית (מ"ל/דקה) (B) מוצגים עם ממוצע דקה. LS: דיאטה דלת מלח (0.4% NaCl), HS: דיאטה עשירה במלח (4% NaCl). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה המשתמשת במכשור זמין מסחרית כדי להקליט RBF ולחץ עורקי ברציפות במשך שבועות רבים. בנוסף, ניתן לאסוף שתן באמצעות המכשיר המתואר בשלב 1.1. זה יכול לשמש גם כדי להעריך מטבוליטים בשתן, וכאשר קטטר עורקי מושתל, דגימת דם לניתוח.

באופן מסורתי, מדידות RBF התקבלו באופן חריף בבעלי חיים מורדמים שהוכנו בניתוח או הוערכו על ידי אישור PAH. עם זאת, הוכח כי הרדמה וניתוחים שונים^22,23 משנים את זרימת הדם הכלייתית ואת לחץ העורקים. מחקרים בבני אדם דיווחו כי איזופלוראן הפחית את מרווח ה-PAH מ-476.8-243.3 מ"ל/דקה ואת מרווח האינולין מ-88.0 ל-55.7 מ"ל/דקה,^{בהתאמה 8}. Thiobarbital הוא חומר הרדמה הנמצא בשימוש נרחב למחקרים ביקורתיים של חולדות. ובכל זאת, הוא דיווח כי ייצורH 2 O₂ במיטוכונדריה של קליפת הכליה עולה 90 דקות לאחר הרדמה עם thiobarbital²⁴, אשר עשוי להשפיע על זרימת הדם. מדידות בבעלי חיים לא משוננים ולא מתוחים יהיו עדיפות בהרבה על מחקרים ניסיוניים רבים. השיטה למדידת RBF על ידי השתלת גשושית זרימה הודגמה בכלבים²⁵ ובחולדות²⁶. עבודה זו גם הקימה דרך למדידת RBF בחולדות במעבדה.

יישום הטכניקות המתוארות במצגת זו יכול לענות על שאלות רבות הקשורות לאירועים הרציפים בעקבות גירוי נתון. מודל החולדה הבלתי מנוצחת מאפשר לקבוע תגובות מיידיות וכרוניות לתרופות ולהשלכות ארוכות טווח של גירויים שונים שעלולים להתרחש במהלך התפתחות יתר לחץ דם.

הניתוח כרוך באיבוד דם מינימלי עם כמעט 100% אחוזי הישרדות עם הכשרה מסוימת. ניתן לעשות שימוש חוזר בבדיקות הזרימה לאחר שטיפה עם פרוטאז המכיל חומר ניקוי אניוני ועיקור לאחר ניסוי של 4 שבועות. עם זאת, ציפוי הפלסטיק יתדרדר בהדרגה, ולאחר מספר שימושים, ידרוש תיקון. כפתור העור הבא שבו יוצאים הצנתרים מייצג את הבעיה הפוטנציאלית המשמעותית ביותר שכן הוא פגיע לזיהום, גירוי וגירוד אם לא מנקים ומחטאים אותו בקפידה. עם זאת, אם זה הופך להיות רופף, זה יכול להיות מתוקן במהירות תחת הרדמה.

השלב הקריטי של ההליך הוא הניתוח, וייתכן שייקח זמן מה לשלוט בטכניקה. עם זאת, לאחר שהושג, מחקרים כרוניים unanesthetized יכול להתבצע באופן פרודוקטיבי עם בעיות מינימליות. ניתן לנתח חולדות של 200-350 גרם ללא קשר לזן או למין. ניסויים על חולדות בגדלים שונים ובבעלי חיים אפשריים גם באמצעות בדיקות זרימה בגדלים שונים שכבר הוכנו על ידי היצרנים.

עם זאת, ישנן מגבלות ונושאים ספציפיים שיש לשים לב אליהם. ראשית, יש לבצע את הניתוח באמצעות מכשירים מעוקרים, קטטרים ובדיקות זרימה ככל האפשר כדי למזער זיהומים לאחר הניתוח. שנית, מכיוון שהניתוח הוא נרחב ואורך יותר משעה, יש לספק תקופת החלמה ארוכה מספיק לפני קבלת מדידות "בקרה" למחקר. תקופה זו במעבדה שלנו משתרעת בדרך כלל בין 7-10 ימים. שלישית, איליאוס (חסימה או שיתוק של המעיים) היווה בעיה במקרים מסוימים המייצגים סיבוך לאחר הניתוח. ניתן למנוע זאת על ידי הימנעות מחשיפה של המעי (למשל, לשמור עטוף בגאזה לחה) במהלך ההליך והימנעות מסגירת החתך בבטן עד שהקשר התייבש היטב. זה חיוני כדי למנוע חשיפת המעי לעורק הכליה במהלך הניתוח ולהבטיח את המעי אינו מעוות בעת תפירה. רביעית, יש להכיר בכך ש- RBF יגדל באופן יחסי עם הגדלת משקל הכליות. זה חייב להיחשב במחקרים שבהם היפרטרופיה כלייתית מתרחשת לאחר הסרת הכליה contralateral. חמישית, יש לנו ניסיון במדידת RBF רק עד חודש ולא ניסינו להאריך את המדידות מעבר לתקופה זו. מכיוון שהדברים עבדו היטב לאורך כל התקופה הזו כמעט בכל המקרים, סביר להניח שהמחקרים יוארכו שבועות רבים לאחר מכן. לבסוף, מילה קצרה על מדידות לחץ עורקי מקבילות: נעשה שימוש בצנתרים המושתלים מלאים בנוזל עם הפרין מדולל לשמירה על פטנסיות 24 שעות ביממה והתקני טלמטריה מושתלים. לכל אחד מהם יתרונות וחסרונות בהתאם לתכנון הניסוי ולצרכיו. לדוגמה, דגימת דם אפשרית מהקטטר העורקי אם נבחרה שיטת הצנתר, ואין צורך בהפריניזציה בשיטת הטלמטריה. עם זאת, שניהם שירתו אותנו היטב במהלך מדידות ארוכות טווח של RBF ו- BP.

למחברים אין מה לחשוף.

מחקר זה נתמך על ידי מענקים למחקר מדעי (P01 HL116264, RO1 HL137748). המחברים רוצים להודות לתרזה קורט על עצתה ועזרתה בשמירה על סביבת הניסוי כמנהלת המעבדה.