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이 프로토콜은 랩온어칩, 마이크로유체 전기천공 장치를 구축하는 데 필요한 미세 가공 기술을 설명합니다. 실험 설정은 연속 흐름에서 제어된 단일 세포 수준 형질주입을 수행하며 집단 기반 제어를 통해 더 높은 처리량으로 확장할 수 있습니다. 세포막 투과 정도를 실시간으로 전기적으로 모니터링하는 기능을 보여주는 분석이 제공됩니다.
CAR-T 세포 요법과 같은 현재의 치료 혁신은 바이러스 매개 유전자 전달에 크게 의존하고 있습니다. 이 기술은 효율적이지만 높은 제조 비용을 수반하여 유전자 전달을 위한 대체 방법을 사용하는 데 관심을 갖게 되었습니다. 전기 천공은 유전자 및 기타 외인성 물질의 세포 내 전달을위한 전기 물리적, 비 바이러스 적 접근법입니다. 전기장을 인가하면 세포막이 일시적으로 세포 내로 분자 전달을 허용합니다. 일반적으로 전기 천공은 많은 수의 세포를 처리하기 위해 대규모로 수행됩니다. 그러나 이러한 접근 방식에는 광범위한 경험적 프로토콜 개발이 필요하며, 이는 1차 및 형질주입하기 어려운 세포 유형으로 작업할 때 비용이 많이 듭니다. 세포를 투과시키기에 충분한 전기장 강도를 달성하기 위해 큰 전압의 요구 사항과 결합 된 긴 프로토콜 개발은 마이크로 스케일 전기 천공 장치의 개발로 이어졌습니다. 이러한 미세 전기 천공 장치는 일반적인 미세 가공 기술을 사용하여 제조되며 높은 처리량 기능을 유지할 수있는 잠재력으로 더 큰 실험 제어를 허용합니다. 이 작업은 연속 흐름 하에서 단일 세포 수준에서 세포막 투과 수준을 감지 할 수있는 미세 유체 전기 천공 기술을 기반으로합니다. 그러나 이 기술은 초당 처리되는 4개의 셀로 제한되었으므로 시스템 처리량을 늘리기 위한 새로운 접근 방식이 제안되고 여기에 제시됩니다. 세포 집단 기반 피드백 제어로 표시되는이 새로운 기술은 다양한 전기 천공 펄스 조건에 대한 세포 투과 반응을 고려하고 테스트중인 세포 유형에 가장 적합한 전기 천공 펄스 조건을 결정합니다. 그런 다음 더 높은 처리량 모드가 사용되며, 여기서 이 '최적의' 펄스가 이동 중인 세포 현탁액에 적용됩니다. 장치를 제작하고, 미세유체 실험을 설정 및 실행하고, 결과를 분석하는 단계가 자세히 제시됩니다. 마지막으로, 이 미세 전기천공 기술은 녹색 형광 단백질(GFP)을 암호화하는 DNA 플라스미드를 HEK293 세포에 전달함으로써 입증됩니다.
CAR-T(키메라 항원 수용체 조작 T 세포) 세포 치료 및 CRISPR(클러스터링된 규칙적인 간격의 짧은 회문 반복 DNA 서열)/Cas9를 사용한 유전자 편집과 같은 생물의학 연구의 현재 치료 혁신은 외인성 물질을 세포 내 공간1에 성공적이고 효율적으로 전달하는 능력에 크게 의존합니다. CAR-T 요법에서, 세포 치료제 제조에서 유전자 전달 단계를 수행하기 위한 황금 표준은 바이러스 벡터2를 사용하는 것이다. 바이러스 매개 유전자 전달은 효율적인 전달 방식이지만 몇 가지 단점도 있습니다. 여기에는 제조 비용, 세포 독성, 면역원성, 돌연변이 유발/종양 발생 가능성및 전달될 유전자의 크기 제한이 포함됩니다3. 이러한 한계로 인해 대체 비 바이러스 전달 기술의 연구 개발이 이루어졌습니다.
바이러스 매개 유전자 전달의 대안인 전기천공은 세포의 DNA, RNA 및 단백질 형질감염을 수행하기 위해 최적의 전기 펄스 파형의 적용에 의존합니다. 외부 전기장의 인가 후, 세포막이 잠시 손상되어, 세포가 불침투성 외인성 물질4의 세포내 전달에 취약하게 된다. 바이러스 매개 전달에 비해 전기 천공은 일반적으로 안전하고 작동하기 쉽고 운영 비용이 낮기 때문에 유리합니다. 전기천공은 소분자 화물과 대분자 화물을 모두 전달할 수 있으며 혈통에 관계없이 세포를 형질감염시키는 데 효율적일 수있습니다5. 전기천공 후 바람직한 결과, 즉 양호한 생존력 및 양호한 전기-형질주입 효율을 달성하려면, 다양한 실험 파라미터가 공동-최적화될 필요가 있다. 여기에는 세포 유형6, 세포 밀도, 분자 농도7, 전기천공 버퍼 특성(예: 분자 조성, 전도도 및 삼투압)8, 전극 크기/기하학적구조9, 전기 펄스 파형(모양, 극성, 펄스 수)10 이 포함됩니다(그림은 그림 1 참조). 이러한 각 파라미터가 전기천공 실험의 결과에 상당한 영향을 미칠 수 있지만, 적용된 펄스의 전기 에너지가 결과 세포 생존율과 전기 형질주입 효율8 사이의 본질적인 트레이드 오프의 근원이기 때문에 펄스 파형이 특히 자세히 연구되었습니다.
일반적으로 전기 천공 실험은 거시적 규모로 수행되며, 여기서 세포는 전기 천공 큐벳 내의 대형 병렬 플레이트 전극 세트 사이에 100 마이크로 리터의 버퍼에 현탁됩니다. 전극은 일반적으로 전극 거리가 1-4mm 인 알루미늄으로 제조됩니다. 피펫을 통해 셀을 수동으로 로드하면 큐벳이 부피가 큰 전기 펄스 발생기에 전기적으로 연결되어 사용자가 펄스 파형 파라미터를 설정하고 적용하여 셀 현탁액을 전기천공할 수 있습니다. 매크로 스케일 또는 벌크 전기천공은 셀 밀도>106 cells/mL를 처리할 수 있지만 전기 펄스 파형 설정을 최적화할 때 이 기능은 낭비가 될 수 있습니다. 이는 세포 집단 수가 제한될 수 있는 1차 세포 유형을 전기천공할 때 특히 중요합니다. 또한 전극 사이의 거리가 멀기 때문에 펄스 발생기는 전계 강도 >1kV / cm11)를 달성하기 위해 큰 전압을 공급할 수 있어야합니다. 이러한 고전압은 전해질 버퍼를 통한 저항성 전력 소산을 일으켜 줄 가열을 초래하며, 이는 결과적인 셀 생존율(12)에 해로울 수 있다. 마지막으로, 조밀한 세포 현탁액 상에서 전기천공을 수행하는 것은 결과적인 전기-형질감염 효율 및 세포 생존율의 선천적 가변성으로 일관되게 부담될 것이다. 현탁액의 각 셀은 주변 셀로 인해 다른 전기장 강도를 경험할 수 있습니다. 경험된 전기장 강도가 증가 또는 감소하는지 여부에 따라, 생성된 세포 생존율 또는 전기-형질주입 효율이 각각 부정적인 영향을 받을 수 있다(11). 거시적 규모의 전기 천공에 대한 이러한 단점은 마이크로 규모에서 작동하고 단일 셀 수준에서 더 나은 제어를 허용하는 대체 기술의 추구 및 개발로 이어졌습니다.
BioMEMS 또는 생물 의학 마이크로 전자 기계 시스템 분야는 마이크로 일렉트로닉스 산업의 기술 발전에서 비롯됩니다. 특히, 생물 의학 연구의 발전을위한 마이크로 장치를 개발하기 위해 미세 가공 공정을 활용합니다. 이러한 발전은 생체 내 전기 모니터링(13)을 위한 마이크로-전극 어레이, in situ 전기천공을 위한 용량성 마이크로-전극(14), 소형화된 organ-on-a-chip 장치(15), 마이크로유체 현장 진단 16, 바이오 센서(17), 및 나노-및 마이크로-전기천공 장치(19,20,21)를 포함하는 약물 전달 시스템(18)의 개발을 포함한다. . 생물학적 세포와 동일한 크기 규모로 장치를 설계하고 제조할 수 있는 능력으로 인해, 나노- 및 마이크로-전기천공 기술은 그들의 거시적 규모의 대응물(22, 23)과 비교할 때 유리하다. 이러한 전기 천공 장치는 일반적으로 10에서 100 마이크로 미터 간격의 전극 세트가 통합되므로 고전압 펄스 응용 분야의 요구 사항을 제거합니다. 이 기능은 전해질을 통한 전류를 크게 줄여 독성 전기 분해 제품의 축적과 이러한 시스템에서 줄 가열의 영향을 줄입니다. 마이크로스케일 채널은 또한 펄스 인가 동안 훨씬 더 균일한 전기장이 셀에 신뢰성 있게 인가되는 것을 보장하여, 보다 일관된 결과(24)를 초래한다. 또한, 미세-전기천공 장치가 미세유체 플랫폼에 통합되는 것도 일반적이며, 이는 세포 치료제 제조(25)에서 매우 바람직한 기능인 완전 자동화된 기술로의 미래 통합을 위해 그 자체를 제공한다. 마지막으로, 마이크로 스케일 전기 천공은 전기 천공 이벤트의 전기 조사를 허용합니다. 예를 들어, 세포막 투과화의 정도는 단일 세포 수준(26,27)에서 실시간으로 모니터링될 수 있다. 이 방법의 목적은 전기천공 프로토콜을 최적화하면서도 이전 최첨단 기술에 비해 처리량을 증가시키기 위해 세포막 투과 정도를 측정할 수 있는 미세유체, 단일 셀 미세 전기천공 장치의 미세 가공, 시스템 작동 및 분석을 설명하는 것입니다.
단일 세포 수준의 전기 천공을 수행하는 것은 더 이상 새로운 기술이 아니며, 2001 년 Rubinsky et al.에 의해 정적 세포 전기 천공 기술28의 개발로 처음 입증되었습니다. 그들의 마이크로 장치는 전기 천공 사건을 전기적으로 모니터링하는 능력을 최초로 입증했기 때문에 혁신적이었습니다. 이는 장치의 처리량을 증가시키기 위해 병렬화된 방식으로 세포막 투과 정도를 전기적으로 감지할 수 있는 정적 단일 세포 전기천공 기술의 개발로 이어졌습니다. 그러나 병렬화 및 배치 처리를 사용하더라도 이러한 장치는 단위 시간29,30 당 처리 할 수있는 총 셀 수가 심각하게 부족합니다. 이러한 제한은 훨씬 더 큰 처리량(31)에서 단일 셀 레벨 마이크로-전기천공을 수행할 수 있는 유동-관통 장치의 개발로 이어졌다. 정적에서 유동 환경으로의 이 장치 전환은 전기천공 펄스 적용 후 세포막 투과 정도를 전기적으로 모니터링하는 기능을 제한합니다. 이 작업에 설명 된 방법은 개별 세포의 세포막 투과 정도를 연속적인 직렬 방식으로 전기적으로 감지, 펄싱 및 모니터링 할 수있는 미세 전기 천공 기술인이 두 기술 간의 격차를 해소합니다.
이 기술은 최근 Zheng et al. 그 작업에서이 기술의 기능은 전기 천공 펄스의 진폭과 지속 시간이 모두 다양하고 세포막 투과를 나타내는 후속 전기 신호가 탐구 된 파라 메트릭 연구의 완료와 함께 도입되었습니다32. 결과는 전기천공 펄스의 강도의 증가(즉, 인가된 전기장의 증가 또는 펄스 지속시간의 증가)가 측정된 세포막 투과화의 증가를 야기한다는 것을 보여주었다. 시스템을 추가로 검증하기 위해 성공적인 전기 천공의 일반적인 형광 지표 인 요오드화 프로피듐33을 세포 현탁액에 추가하고 전기 펄스를 적용한 직후에 형광 이미지를 캡처했습니다. 광 신호, 즉 세포 내부의 요오드화 프로피듐의 형광 강도는 세포막 투과 정도의 전기적 측정과 강한 상관 관계가 있었으며,이 전기 측정의 신뢰성을 검증했습니다. 그러나이 연구는 번역 할 수있는 의미가 거의 또는 전혀없는 소분자 프로피듐 요오드화물의 전달만을 고려했습니다.
이 작업에서는 생물학적 활성 플라스미드 DNA(pDNA) 벡터를 전달하고 전기천공 후 재도금 및 배양된 세포의 전기 형질감염 효율을 평가하는 동시에 시스템의 처리량을 개선하기 위해 이 기술의 새로운 응용 프로그램이 도입되었습니다. 이전 작업은 전기천공 이벤트를 전기적으로 측정할 수 있는 기존 미세 전기 천공 기술을 능가하지만, 장치의 현재 상태는 여전히 세포 감지, 펄스 적용 및 세포막 투과화 측정을 수행하기 위해 전극 세트 사이의 긴 세포 이동 시간(~250ms)이 필요합니다. 단일 채널을 사용하면 처리량이 초당 4셀로 제한됩니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, pDNA 전기-형질감염을 수행하기 위해 새로운 개념의 세포집단-기반 피드백-제어 전기천공이 도입된다. 이 시스템은 저생리학적 전도도 전기천공 버퍼를 사용하여 다양한 전기천공 펄스 응용 분야에서 단일 세포의 전기적 조사를 허용합니다. 전기적 반응에 기초하여, '최적의' 전기천공 펄스가 결정된다. 그런 다음 세포막 투과화 결정이 무효화되고 유속이 증가하며 전기천공 펄스 듀티 사이클이 세포 통과 시간과 일치하여 전극 사이를 이동하는 셀당 하나의 펄스를 보장하는 '고처리량' 모드가 구현됩니다. 이 작업은 마이크로 장치의 제조를 위한 미세 가공 단계, 실험을 수행하는 데 필요한 재료/장비 및 설정, 장치의 작동/분석 및 전기 형질주입 효율(eTE)에 대한 광범위한 세부 정보를 제공합니다.
그림 1: 전기천공 결과에 영향을 미치는 실험 요인. (왼쪽) 세포 현탁액 - 전기 천공이 시작되기 전에 고려해야 할 중요한 요소에는 페이로드 (이 경우 pDNA), 농도, 세포 밀도 및 전기 천공 완충액 특성이 포함됩니다. 고려해야 할 전기천공 완충액 특성은 전도도, 삼투압 및 이러한 값에 기여하는 정확한 분자 조성입니다. (가운데) 펄스 애플리케이션-정확한 펄스 유형(구형파 대 지수 감쇠) 및 펄스 파형(단일 펄스 대 펄스 트레인)을 최적화하여 결과 세포 생존율과 전기 형질주입 효율을 모두 최대화해야 합니다. 전기 천공 공정에서 구현되는 일반적인 펄스 트레인은 일반적으로 일련의 고전압 (HV) 펄스 또는 HV와 저전압 (LV) 펄스 크기 사이에서 회전하는 일련의 펄스로 구성됩니다. (오른쪽) 세포 회수-다운스트림 처리 단계, 특히 세포가 이송되는 회수 세포 배양 배지는 최적화되어야 합니다. 특징이 없는 경우(맨 왼쪽), 전체 전기천공 공정 최적화를 위해 추가 업스트림 셀 처리 단계를 구현할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
알림: 사용자는 이 프로토콜에 사용된 재료 및 소모품에 대한 모든 MSDS를 검토해야 합니다. 각 단계에서 적절한 PPE를 착용하고 실험 중에 멸균 기술을 사용해야합니다. 섹션 1-7에서는 장치 제작에 대해 설명합니다.
1. 장치 제작 - 마스크 디자인
참고: 미세 가공 공정의 그림은 그림 2 를 참조하십시오. 미세 가공 단계는 클린룸 환경에서 수행되어야 합니다. 추가 PPE가 필요합니다 (헤어 그물, 얼굴 털 그물, 마스크, 클린 룸 슈트, 신발 커버).
2. 장치 제작 - 포토리소그래피
참고: 제공된 미세 가공 레시피는 포토레지스트 제조업체의 권장 사항에서 채택되었으며 시작점(34)으로만 사용해야 합니다. 베이킹 시간, 노출 시간 등에 대한 정확한 값은 각 제조 프로토콜에 맞게 최적화되어야 합니다. 실리콘 웨이퍼와 유리 슬라이드를 모두 처리하기 위해 웨이퍼 핀셋을 사용하는 것이 좋습니다.
3. 장치 제작 : 불화 수소산 (HF) 에칭
주의 : 이 단계에는 깊고 고통스러운 화학적 화상을 유발할 수 있는 불산(HF)의 취급 및 폐기가 포함됩니다. 핸들러를 보호하기 위해 추가 PPE를 사용해야합니다 (안면 보호대, 팔꿈치 길이의 내 화학성 장갑, 슬리브가있는 내 화학성 앞치마). 글루 콘산 중화제와 피부 젤은 실험실 벤치 근처에 보관해야합니다. 이 단계는 단독으로 수행해서는 안 됩니다. HF는 용기가 산에 의해 에칭되므로 유리 용기에 보관하거나 분배해서는 안됩니다.
참고: HF는 노출된 유리(즉, 전극 설계)를 균일하게 에칭하여 유리에 홈을 형성하여 금속 증착 후 전극 패턴의 더 나은 에지 해상도를 허용합니다(섹션 4).
4. 장치 제작 : 물리적 기상 증착
참고: 이 단계는 전극 패턴을 정의하기 위해 유리 슬라이드 기판에 금속을 증착하는 것을 포함합니다. 일반적으로 사용되는 금속 전극은 크롬/금 및 티타늄/백금입니다. 금 및 백금은 유리 기판에 부착되지 않으므로, 접착력을 촉진하기 위해 각각 크롬 또는 티타늄의 종자 접착층이 요구된다(37).
5. 장치 제작 : 포토 레지스트 리프트 오프
참고: 이 단계는 포토레지스트 층을 아세톤 욕조에 용해시키고 부착된 백금 전극을 유리 슬라이드에 패턴화하는 것을 포함합니다.
6. 장치 제작 : 소프트 리소그래피
참고: 이 단계는 엘라스토머인 폴리디메틸실록산(PDMS)을 사용하여 미세유체 채널을 SU-8 마스터 릴리프 구조 상에 복제 성형하는 것을 포함합니다.
7. 장치 제작 : PDMS 본딩 / 와이어 부착
참고: 이 단계는 PDMS와 유리 기판의 표면을 산소 플라즈마로 처리하여 PDMS와 유리(38) 사이에 비가역적 결합을 형성하는 것을 포함한다. 제공된 레시피는 실험실에서 사용되는 정확한 시스템에 맞게 조정해야 할 수도 있습니다.
그림 2: 마이크로 장치 제조. (A) 미세 유체 채널 제조 - 주요 단계 : 실리콘 웨이퍼 세척 (단계 2.1.1-2.1.3), 포토 레지스트 코팅 및 소프트 베이크 (단계 2.1.7-2.1.8), UV 노출 (단계 2.1.10), 개발 (단계 2.1.12) 및 PDMS 주입 (하위 섹션 6.2). (b) 전극 제조 - 주요 단계 : 유리 슬라이드 청소 (단계 2.1.1-2.1.3), HMDS 코팅 및 포토 레지스트 코팅 (단계 2.2.3-2.2.4), UV 노출 (단계 2.2.8), 현상 (단계 2.2.9), HF 에칭 (섹션 3), 물리적 기상 증착 (섹션 4) 및 포토 레지스트 리프트 오프 (섹션 5). (C) 장치 마무리-주요 단계: 입구/출구 액세스 및 초음파 처리(단계 6.2.3 및 섹션 6.3), PDMS 본딩 및 와이어 부착(섹션 7). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
8. 세포 배양 및 수확
참고: 표준 세포 배양 및 멸균 취급 절차를 사용해야 합니다. 세포 배양을 위한 세포 유형별 프로토콜을 따르십시오.
9. 하드웨어/실험 설정
알림: 실험을 위해 세포를 수확하기 전에 세포가 전기 천공 버퍼에 현탁되는 시간을 최소화하기 위해 실험 설정이 완료되었는지 확인하십시오. 예열을 위해 실험 20-30분 전에 전자 장치를 켜십시오. 단일 셀 검출 모듈의 작동을 위한 실험 설정의 개략도는 그림 3 을 참조하십시오.
참고: 맞춤형 PA90 연산 증폭기 회로는 잠금 증폭기를 사용하는 단일 셀 레벨 감지에 필요한 감도와 충분히 강한 전기천공 펄스를 적용하는 데 필요한 고전압을 모두 수용하기 위해 개발되었습니다. 권장 회로39에 대한 사양은 PA90 데이터시트를 참조하십시오.
그림 3: 실험 설정 회로도-단일 세포 감지. 고전력 연산 증폭기(PA-90)를 사용하면 단일 셀 감지에 필요한 잠금 출력 AC 신호에 고전압 전기천공 펄스를 중첩할 수 있습니다. 이 여기 신호는 마이크로 전기 천공 장치 (테스트 대상 장치, DUT)를 통과하여 전류가 전류 프리 앰프에 의해 증폭되어 알고리즘에 공급됩니다. 시스템은 세포 검출 이벤트를 지속적으로 모니터링합니다. 셀 입력 시 잠금 증폭기에 의해 디지털 신호가 생성되어 전송 중인 셀에 전기천공 펄스의 적용을 트리거합니다. 범례: PA-90 (고출력 연산 증폭기), DUT(테스트 대상 장치), DIO(디지털 입력/출력), FG-EP(함수 발생기/전기 천공 펄스), 50X(50X 증폭기), PS-V-(전원 공급 장치/PA 90용 음전압), FG-V+(함수 발생기, PA 90용 포지티브 전압). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
10. 실험 작업
11. 분석
그림 4는 단일 펄스 진폭에 대한 단일 셀 수준 막 투과화 감지의 작동 원리를 강조합니다. 전기천공 실험 개시 후, 세포 검출 알고리즘은 포인트-바이-포인트, 기울기 기반 검출 방법을 통해 세포 검출을 위한 최적의 임계값을 결정한다. 그런 다음 시스템은 측정된 전류의 상당한 음의 변화에 대해 (1)을 지속적으로 모니터링하며, 이는 셀의 유입을 나타냅니다. 이는 생물학적 세포막의 절연 특성으로 인해 세포가 전극 세트를 통과 할 때 임피던스가 순간적으로 증가하여 측정 된 전류가 급격히 감소하여 일관된 세포 감지 (2)가 가능하여 궁극적으로 컴퓨터 제어 펄스 애플리케이션 (4)으로의 전환을 트리거합니다. 절연 셀은 전극 사이에서 부피의 전해질을 대체하여 셀 크기에 비례하는 전류 강하를 초래합니다. 이러한 전류의 변화는 ΔIC (3)로서 표기된다. ΔIC 계산 직후, 미리 결정된 전기 펄스가 이동 중인 세포에 투여된다(4). 이 순간적인 에너지 유입은 시스템에 간단한 감지 아티팩트를 도입합니다 (회색 상자). 신호에 다시 고정될 때, 즉 셀 모니터링으로 다시 전환하면, (5) 전기천공 펄스가 출구 (6) 시 전극 세트 사이의 셀 존재로 인한 전류 변화의 크기가 떨어지면서 세포막을 투과시켰음이 분명합니다. 전기천공 펄스 적용 전/후 셀의 임피던스 크기로 인한 두 전류 강하의 차이를 투과화 전류라고 하며 ΔIP로 표시됩니다. 셀이 전극 사이의 부피를 벗어나면 기준선이 안정화되고 시스템은 셀 검출 모드로 돌아갑니다(1). 미리 결정된 수의 셀이 전기천공된 후 다음으로 높은 에너지 전기천공 펄스가 테스트됩니다(펄스 설정은 표 1 참조). 테스트된 각 전기천공 펄스에 대해 평균 '막 투과화 정도'가 결정됩니다. 이 값은 Δ IP / ΔIC로 계산됩니다. 미리 결정된 각 전기천공 펄스가 테스트되면, Δ IP/ΔI C는 적용된 전기 에너지 밀도 (σ x E 2 x t)에 대해 플롯되며, 여기서 σ는 용액 전도도 (S / cm), E는 전계 강도 (kV / cm), t는 펄스 지속 시간 (ms)입니다. 본 실시예에서 사용된 HEK293 세포에 대한 세포막 투과화 맵은 도 5를 참조한다.
표 1: 전기천공 펄스 매개변수. 이 연구를 위해 전하 플럭스 (σ×E ×t)가 일정하게 유지되도록 전기 천공 펄스가 선택되었으며, 여기서 σ는 용액 전도도 (S / cm), E는 전계 강도 (kV / cm) 및 t는 펄스 지속 시간 (ms)입니다. 결과는 적용된 펄스 전기 에너지의 스펙트럼입니다. 지정된 펄스 파라미터를 달성하기 위해 요구되는 듀티 사이클(d.c.)의 예는 초기(단일 셀 검출) 유량의 5× 및 10× 증가 모두에 대해 제공됩니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 단일 세포막 투과화 - 알고리즘 작동. (상단) 일련의 단일 셀 검출 / 펄스 애플리케이션의 전기적 기록 (전류의 급격한 스파이크로 표시). (하단) 단일 셀의 감지 및 펄스를 위한 시스템 작동. (1) 시스템은 포인트별 기울기 계산을 통해 전류의 변화를 지속적으로 감지합니다. (2) 기울기의 급격한 감소가 감지되어 전극 사이에 셀이 들어가는 것을 나타내며 컴퓨터 제어 펄스 적용을 트리거합니다. (3) 전류 강하 (ΔIC)가 결정되고 셀의 크기에 비례합니다. (4) 전기 천공 펄스가 이동 중인 셀에 적용되어 전기 신호(회색 상자)에 감지 아티팩트가 발생합니다. (5) 잠금 증폭기는 전송 중인 셀에 다시 잠길 때 셀 모니터링으로 다시 전환됩니다. (6) 셀이 전극 세트를 빠져 나와 전류에서 또 다른 더 작은 크기의 스파이크를 일으 킵니다 (Δ IC > (I 6 - I5)). 임피던스 측정의 차이는 절연 된 세포막을 통한 기공 형성 때문입니다. 이러한 전류의 변화를 투과 전류(ΔIP)라고 합니다. 세포막 투과화의 정도가 계산된다 (Δ IP / ΔIC). 기준선이 안정화되고 시스템이 감지 모드(1)로 돌아갑니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
적용된 전기 에너지와 세포막 투과 정도 사이에 뚜렷한 상관 관계가 관찰되며(그림 5), 세포막 투과 정도가 크게 증가하는 전이 영역의 존재가 있습니다. 이를 위해 이 전이 영역을 능가하는 전기 에너지를 가진 펄스가 미세 전기천공 공정의 고처리량 단계를 위해 선택됩니다(그림 6). 이 실험에서는 1.8kV/cm:670μs 펄스가 '최적'으로 결정되었습니다. 프로토콜의 하위 섹션 10.3에서 자세히 설명한 바와 같이 시스템 유량이 증가하고 함수 발생기가 설정된 펄스 및 듀티 사이클(1.5μL/min 및 3.0μL/min 유량에 대한 펄스 설정은 표 1 참조)로 펄스를 지속적으로 출력하도록 설정되어 이동 중인 각 셀에 1 펄스가 적용되도록 합니다. 이 연구에서는 유량이 5배 증가하여 펄스 폭이 2.7%의 듀티 사이클(dc)에서 50ms(셀 통과 시간과 일치)로 설정되었습니다.
그림 5: HEK293 세포막 투과화 매핑 -ΔIp/ ΔIc 대 전기 에너지. 전기 데이터(ΔIP/ΔIC)는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. 펄스 조건 (왼쪽에서 오른쪽으로) - 0.4 kV / cm : 3 ms, 0.8 kV / cm : 1.5 ms, 1.0 kV / cm : 1.2 ms, 1.2 kV / cm : 1 ms, 1.8 kV / cm : 0.67 ms, 2.4 kV / cm : 0.5 ms. 세포막 투과 정도와 적용된 펄스의 전기 에너지 밀도 사이에 명확한 상관 관계가 관찰됩니다. 이 실험에서는 1.8kV/cm: 0.67ms 펄스 조건이 고처리량 모듈의 '최적' 전기천공 펄스로 선택되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 세포 집단 기반 피드백 제어 전기천공 공정 워크플로. 시작하기 위해, 초기 유량은 단일 셀 수준의 전기 질의를 허용하도록 프로그래밍된다(Q0). 프로그래밍 가능한 수의 셀은 미리 결정된 각 전기 천공 펄스 조건 (E 0 / t0에서 EN / t N)에서 펄스되며, 적용된 전기 에너지는 전기 천공 펄스 애플리케이션의 각 반복마다 증가합니다. 연구에 포함 된 가장 높은 전기 에너지펄스 인 EN / tN이 완료되면 세포막 투과 곡선이 그려지고 테스트중인 세포 집단에 대한 최적의 전기 천공 펄스가 결정됩니다. 시스템은 유속이 Q 처리량으로 증가하고 속도 제한 단일 셀 조사 단계가 생략되는 고처리량 모드로 진행됩니다. 최적의 펄스 트레인은 d.c.opt에서 E opt/t opt를 연속적으로 적용하여 이동 중인 각 셀이 셀 이동 시간 및 펄스 폭 듀티 사이클(dc)에 기초하여 단일 전기천공 펄스를 수신할 것이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
전기천공 후 24시간 회복 후, 세포를 이미지화하여 전기-형질감염 효율(eTE)을 결정하였다. 프로토콜의 서브섹션 11.2에 기재된 바와 같이, eTE는 DRAQ5로 염색된 세포의 총 수로 정규화된 GFP를 발현하는 세포의 총 수로서 결정되었다. 1.8kV/cm: 670μs 펄스에 대한 eTE는 ~70%로 측정되었습니다(그림 7A). 세포막 투과 정도를 정확하게 매핑하고 고처리량 모드로 전환할 때 충분히 높은 전기천공 펄스 에너지를 선택하는 시스템의 중요성을 강조하기 위해 eTE 측면에서 0.4kV/cm:3ms 펄스 조건도 살펴보았습니다(그림 7B). 이 경우, 생성된 24시간에서의 eTE는 5% 미만이었다.
그림 7: 24시간에서의 전기형질감염 효율-GFP 발현. HEK293 세포는 마이크로 전기천공 실험 후 24시간 동안 37°C에서 배양되었다. 모든 세포를 DRAQ5 (적색)로 염색하고, 전체 세포 수 (적색)에 대한 GFP (녹색)를 발현하는 세포의 비율에 기초하여 전기 형질 감염 효율 (eTE)을 결정하였다. 세포 생존율은 본 연구에서 결과 지표로서 평가되지 않았다. (A) 대략 70%의 eTE를 보여주는 1.8 kV/cm:670 μs 펄스를 통해 성공적으로 형질감염된 HEK293 세포의 대표적인 적층형 4× 형광 이미지. (b) 대표적인, 0.4 kV/cm:3 ms 펄스를 통해 성공적으로 형질감염된 HEK293 세포의 적층된 4× 형광 이미지는 eTE << 5%를 나타낸다. 스케일 바: 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 2차원 CAD 회로도. 마이크로 전기 천공 장치는 직경 1mm의 입구와 3mm 직경의 출구가있는 직선 100μm 너비의 마이크로 채널로 구성됩니다. 각 전극 트레이스의 폭은 100μm이며 전극 세트는 300μm 길이의 장치의 전기 천공 영역을 포함합니다. 마이크로 채널의 3차원 높이는 포토레지스트의 두께에 의해 제어된다. 이 작업에서 장치의 높이는 20 μm였습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
이 프로토콜에 제시된 방법론은 주로 특수 전기 천공 실험 설정에 통합되는 미세 유체 장치의 미세 가공에 중점을 둡니다. 미세 가공 공정의 세부 사항을 설명 할 때 자주 사용되는 '레시피'라는 용어는 작동하는 장치를 성공적으로 제작하기 위해 각 단계를 따르거나 최적화하는 것의 중요성을 암시합니다. 그러나 UV 노출 시간/에너지, PVD 스퍼터링 속도/지속 시간 및 산소 플라즈마 발생기 설정과 같이 최적화되지 않은 공정 내의 특정 중요한 단계는 제조 공정과 전기천공 실험의 성공적인 실행 모두에 문제가 될 수 있습니다. 제작 프로세스 문제 해결은 주로 시행 착오 또는보다 통제 된 실험 설계 실험 설계를 통해 수행됩니다. 추가적으로, 프로토콜 내에서 상이한 단계들을 수행하기 위해 대체될 수 있는 대안적인 미세가공 기술, 예컨대 DRIE(Deep Reactive Ion Etching)가 있다(즉, 연질 리소그래피 공정을 수행하기 위해 DRIE 에칭된 성형 구조를 사용함). 또한 레시피를 최적화하고 장치를 설계/제작하는 것은 현장 초보자에게 시간이 많이 소요될 수 있습니다. 그러나 미세 가공 공정이 성공적으로 개발되면 엔지니어/과학자는 특정 요구에 적합한 장치를 자유롭게 설계할 수 있습니다.
이를 위해, 이 프로토콜 내에 기술된 장치는 우리의 이전 작업(32)을 확장하기 위해 개발되었다. 이것은 단일 세포 막 투과 전기 검출의 활용을 수반했지만 더 높은 처리량 방식으로 이루어졌습니다. 여기에 설명된 실험 설정에는 표준 연구실에서 흔하지 않을 수 있는 특수 장비, 즉 잠금 증폭기가 필요하므로 이 기술의 잠재적인 도달 범위와 적응성이 제한됩니다. 그러나, '베어 본' 미세유체 전기천공 장치는 이 프로토콜에 따라 구현될 수 있으며, 전기천공 펄스를 생성하기 위해 함수 발생기와 전압 증폭기만 있으면 된다.
그럼에도 불구하고 이 미세 전기 천공 플랫폼은 다른 단일 세포 전기 천공 기술과 구별됩니다. 연속 흐름 환경에서 단일 셀 현탁액의 전기천공 파라미터를 전기적으로 감지하고 최적화하는 기능은 정말 혁신적입니다. 향후 작업에는 성공적인 전기 천공 결과와 관련된 다른 중요한 실험 매개 변수 ( 그림 1 참조)를 최적화하여이 플랫폼의 전반적인 효율성을 더욱 향상시키는 작업이 포함됩니다. 추가 생존력 및 대사 분석은 마이크로 전기 천공 플랫폼과 관련된 잠재적 인 부정적인 다운 스트림 효과를 평가하기 위해 개발 및 구현 될 것입니다. 더욱이, 마이크로유체 설계는 다른 그룹(40)에 의해 입증된 바와 같이, 더 높은 세포 처리량을 달성하기 위해 계속 개선될 수 있다. 이러한 우려를 해결하면이 기술은 폐쇄 형 및 자동화 된 공정 모두에 매우 적합하기 때문에 유전자 전달 및 / 또는 유전자 편집을 수행하기 위해 세포 치료제 제조 공정에 채택 될 가능성이 있습니다.
저자는 공개 할 것이 없습니다.
저자는 국립 과학 재단 (NSF CBET 0967598, DBI IDBR 1353918)과 미국 교육부의 정밀 및 개인화 의학 신흥 분야의 대학원 교육 (P200A150131)의 재정 지원을 인정하고 싶습니다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
150-mm diameter petri dishes | VWR | 25384-326 | step 6.1.1 to secure wafer |
24-well tissue culture plates | VWR | 10062-896 | step 10.3.6 to plate electroporated cells |
33220A Waveform/Function generator | Agilent | step 9.2.3 electroporation pulse generator | |
4'' Si-wafers | University Wafer | subsection 2.1 for microfluidic channel fabrication | |
6-well tissue culture plates | VWR | 10062-892 | step 8.1.8 to plate cells |
Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | step 2.1.2 for cleaning and step 5.1 photoresist lift-off |
Allegra X-22R Centrifuge | Beckman Coulter | steps 8.1.4 , 8.3.2. and 8.3.3. to spin down cells | |
AutoCAD 2018 | Autodesk | subsection 1.1. to design transparency masks | |
Buffered oxide etchant 10:1 | VWR | 901621-1L | subsection 3.1 for HF etching |
CCD Monochrome microscope camera | Hamamatsu | Orca 285 C4742-96-12G04 | step 11.2.3. for imaging |
CMOS camera- Sensicam QE 1.4MP | PCO | subsection 9.3 part of the experimental setup | |
Conductive Epoxy | CircuitWorks | CW2400 | subsection 7.6. for wire attachement |
Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-70C | step 8.1.4. for cell centrifuging |
Dektak 3ST Surface Profilometer | Veeco (Sloan/Dektak) | step 2.1.15 and 5.4 for surface profilometry | |
Disposable biopsy punch, 0.75 mm | Robbins Instruments | RBP075 | step 6.2.3 for inlet access |
Disposable biopsy punch, 3 mm | Robbins Instruments | RBP30P | step 6.2.3 for outlet access |
DRAQ5 | abcam | ab108410 | step 11.2.2. for live cell staining |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | ThermoFisher Scientific | 11885084 | step 8.1.2. part of media composition |
E3631A Bipolar Triple DC power supply | Agilent | step 9.2.1.-9.2.2.part of the experimental setup | |
Eclipse TE2000-U Inverted Microscope | Nikon | subsection 9.3. part of the experimental setup | |
EVG620 UV Lithography System | EVG | step 2.1.9. and 2.2.7. for UV Exposure | |
Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001 | step 8.1.2. part of media composition |
FS20 Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | subsection 5.1. for photoresist lift-off | |
Glass Media Bottle with Cap, 100mL | Fisher Scientific | FB800100 | step 8.2.1. for buffer storage |
Glass Media Bottle with Cap, 500mL | Fisher Scientific | FB800500 | step 8.1.2.for media storage |
HEK-293 cell line | ATCC | CRL-1573 | subsection 8.1 for cell culturing |
HEPES buffer solution | Sigma Aldrich | 83264-100ML-F | step 8.2.1 part of electroporation buffer composition |
Hexamethyldisilazane | Sigma Aldrich | 379212-25ML | step 2.2.3 adhesion promoter |
HF2LI Lock-in Amplifier | Zurich Instruments | subsection 9.2 part of the experimental setup | |
HF2TA Current amplifier | Zurich Instruments | subsection 9.2 part of the experimental setup | |
Isopropyl Alcohol | Fisher Scientific | A459-1 | step 2.1.2 for cleaning, step 2.1.14 for rinsing wafer following SU-8 development, and step 6.3.1 for cleaning PDMS |
IX81 fluorescence microscope | Olympus | step 11.2.3 for imaging | |
L-Glutamine Solution | Sigma Aldrich | G7513-20ML | step 8.1.2. part of media composition |
M16878/1BFA 22 gauge wire | AWC | B22-1 | subsection 7.5 for device fabrication |
Magnesium chloride | Sigma Aldrich | 208337-100G | step 8.1.2 part of electroporation buffer composition |
MF 319 Developer | Kayaku Advanced Materials | 10018042 | step 2.2.9. photoresist developer |
Microposit S1818 photoresist | Kayaku Advanced Materials | 1136925 | step 2.2.4 positive photoresist for electrode patterning |
Microscope slides, 75 x 25 mm | VWR | 16004-422 | step 2.2.1 electrode soda lime glass substrate |
Model 2350 High voltage amplifier | TEGAM | 2350 | step 9.2.5. part of the experimental setup |
National Instruments LabVIEW | National Instruments | data acquisition | |
Needle, 30G x 1 in | BD Scientific | 305128 | step 10.1.1. part of the system priming |
PA90 IC OPAMP Power circuit | Digi-key | 598-1330-ND | Part of the custom circuit |
Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4458-20ML | step 8.1.2. part of media composition |
Plasmid pMAX-GFP | Lonza | VCA-1003 | step 8.3.4. for intracellular delivery |
Plastic tubing, 0.010'' x 0.030" | VWR | 89404-300 | step 10.1.2. for system priming |
Platinum targets | Kurt J. Lesker | subsection 4.2. for physical vapor deposition | |
Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333-500G | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
Pump 11 PicoPlus microfluidic syringe pump | Harvard Apparatus | MA1 70-2213 | step 10.1.4. for system priming |
PVD75 Physical vapor deposition system | Kurt J. Lesker | subsection 4.1. for physical vapor deposition | |
PWM32 Spinner System | Headway Research | steps 2.1.6 and 2.2.2. for substrate coating with photoresist | |
PX-250 Plasma treatment system | March Instruments | subsection 7.2 for PDMS and glass substrate bonding | |
SDG1025 Function/Waveform generator | Siglent | step 9.2.2. part of the experimental setup | |
Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | S8045-500G | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
SU-8 2010 negative photoresist | Kayaku Advanced Materials | Y111053 | step 2.1.7. for microfluidic channel patterning |
SU-8 developer | Microchem | Y010200 | step 2.1.12. for photoresist developing |
Sucrose | Sigma Aldrich | S7903-1KG | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
Sylgard 184 elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | step 6.2.1 10 : 1 mixture of PDMS polymer and hardening agent |
Syringe, 1 ml | BD Scientific | 309628 | step 8.3.4. part of system priming |
SZ61 Stereomicroscope System | Olympus | subsection 7.3. for channel and electrode alignment | |
Tissue Culture Treated T25 Flasks | Falcon | 353108 | step 8.1.2 for cell culturing |
Titanium targets | Kurt J. Lesker | subsection 4.2. for physical vapor deposition | |
Transparency masks | CAD/ART Services | steps 2.1.9. and 2.2.7. for photolithography | |
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | step 6.1.2. for wafer silanization |
Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T4049-100ML | steps 8.1.3. and 8.3.1. for cell harvesting |
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