Method Article
该协议描述了构建芯片实验室微流体电穿孔设备所需的微加工技术。该实验装置在连续流中执行受控的单细胞水平转染,并且可以通过基于群体的对照扩展到更高的通量。提供了实时电监测细胞膜透化程度的能力的分析。
目前的治疗创新,如CAR-T细胞疗法,严重依赖于病毒介导的基因传递。虽然高效,但这种技术伴随着高昂的制造成本,这引起了人们对使用替代方法进行基因传递的兴趣。电穿孔是一种用于基因和其他外源性物质的细胞内递送的电物理、非病毒方法。在施加电场时,细胞膜暂时允许分子传递到细胞中。通常,电穿孔在宏观上进行以处理大量细胞。然而,这种方法需要大量的经验方案开发,这在处理原代和难以转染的细胞类型时成本高昂。漫长的协议开发,加上需要大电压才能达到足够的电场强度来透化细胞,导致了微型电穿孔设备的发展。这些微电穿孔设备采用常见的微细加工技术制造,允许更大的实验控制,并有可能保持高通量能力。这项工作建立在微流体电穿孔技术的基础上,该技术能够在连续流动下检测单细胞水平的细胞膜透化水平。然而,该技术仅限于每秒处理4个单元,因此本文提出并介绍了一种提高系统吞吐量的新方法。这种新技术,表示为基于细胞群的反馈控制,考虑细胞对各种电穿孔脉冲条件的透化响应,并确定最适合被测细胞类型的电穿孔脉冲条件。然后使用更高通量模式,其中该"最佳"脉冲应用于运输中的细胞悬液。详细介绍了制造设备、设置和运行微流体实验以及分析结果的步骤。最后,通过将编码绿色荧光蛋白(GFP)的DNA质粒递送到HEK293细胞中来证明这种微电穿孔技术。
目前生物医学研究中的治疗创新,如CAR-T(嵌合抗原受体工程T细胞)细胞疗法和使用CRISPR(成簇规则间隔短回文重复DNA序列)/ Cas9的基因编辑,在很大程度上依赖于成功和有效地将外源性物质递送到细胞内空间的能力1。在CAR-T疗法中,在细胞疗法生产中执行基因递送步骤的金标准是使用病毒载体2。虽然病毒介导的基因递送是一种有效的递送方式,但它也有几个缺点。这些包括制造成本、细胞毒性、免疫原性、诱变/肿瘤发生潜力以及要递送的基因的大小限制3.这些限制导致了替代性非病毒递送技术的研究和开发。
电穿孔是病毒介导的基因递送的替代方法,它依赖于应用最佳电脉冲波形来执行细胞的DNA、RNA和蛋白质转染。在施加外部电场后,细胞膜短暂受损,使细胞容易受到细胞内递送其他不可渗透的外源性物质的影响4。与病毒介导的递送相比,电穿孔是有利的,因为它通常是安全的,易于操作的,并且运行成本低。电穿孔可以传递小分子和大分子货物,并且可以有效地转染细胞,无论谱系如何5。为了在电穿孔后获得理想的结果,即良好的活性和良好的电转染效率,需要共同优化各种实验参数。这些包括细胞类型6、细胞密度、分子浓度7、电穿孔缓冲液特性(例如,分子组成、电导率和渗透压)8、电极尺寸/几何形状9 和电脉冲波形(形状、极性、脉冲数)10 (参见 图 1 进行说明)。尽管这些参数中的每一个都会对电穿孔实验的结果产生重大影响,但脉冲波形已被特别详细地研究,因为所施加脉冲的电能是所得细胞活力和电转染效率之间内在权衡的根源8。
通常,电穿孔实验在宏观尺度上进行,其中细胞悬浮在电穿孔比色皿内的一组大型平行板电极之间的100微升缓冲液中。电极通常由铝制成,电极距离为1-4毫米。一旦通过移液器手动加载细胞,比色皿就会电连接到一个笨重的电脉冲发生器,用户可以在其中设置和应用脉冲波形参数来电穿孔细胞悬液。虽然宏观或体电穿孔可以处理细胞密度>106 个细胞/mL,但在优化电脉冲波形设置时,此功能可能会浪费。在电穿孔原代细胞类型时,这一点尤其值得关注,因为细胞群数量可能有限。此外,由于电极之间的距离很大,脉冲发生器必须能够提供大电压以实现电场强度>1kV/cm11。这些高电压会导致阻性功率耗散通过电解质缓冲器,从而导致焦耳热,这可能不利于由此产生的电池活力12。最后,对密集的细胞悬浮液进行电穿孔将始终伴随着由此产生的电转染效率和细胞活力的先天变化。由于周围的细胞,悬浮中的每个细胞可能会经历不同的电场强度。根据经历的电场强度是增加还是减少,由此产生的细胞活力或电转染效率可能会受到负面影响11。宏观电穿孔的这些缺点导致了对微观尺度操作的替代技术的追求和开发,并允许在单细胞水平上进行更好的控制。
BioMEMS或生物医学微机电系统领域源于微电子行业的技术进步。具体来说,利用微加工工艺开发用于推进生物医学研究的微型设备。这些进步包括开发用于体内电监测的微电极阵列13,用于原位电穿孔的电容式微电极14,小型化器官芯片器件15,微流体即时诊断16,生物传感器17和药物输送系统18,包括纳米和微电穿孔设备19,20,21.由于能够以与生物细胞相同尺寸的规模设计和制造设备,因此与宏观尺度的对应物22,23相比,纳米和微电穿孔技术具有优势。这些电穿孔设备消除了高压脉冲应用的要求,因为通常集成了间距为10s至100s微米的电极组。这一特性大大降低了通过电解质的电流,从而减少了有毒电解产物的积累以及这些系统中焦耳热的影响。微尺度通道还确保在脉冲施加期间将更均匀的电场可靠地施加到电池上,从而产生更一致的结果24。此外,将微电穿孔设备集成到微流体平台中也很常见,该平台有助于将来集成到全自动技术中,这是细胞治疗制造中非常理想的能力25。最后,微尺度电穿孔允许对电穿孔事件进行电询问。例如,可以在单个细胞水平26,27上实时监测细胞膜的透化程度。该方法的目的是描述微流体单细胞微电穿孔装置的微加工、系统操作和分析,该设备能够测量细胞膜透化程度以优化电穿孔方案,同时提高通量超过以前的技术。
进行单细胞水平电穿孔不再是一种新技术,正如Rubinsky等人在2001年通过静态细胞电穿孔技术的发展首次证明的那样28。他们的微型设备是创新的,因为他们是第一个展示电转事件电监测能力的设备。这进一步导致了静态单细胞电穿孔技术的发展,该技术能够以并行方式电检测细胞膜透化程度,以提高设备的通量。然而,即使使用并行化和批处理,这些设备也严重缺乏它们每单位时间可以处理的单元总数29,30。这种限制导致了流通装置的发展,这些装置能够以更高的通量执行单细胞水平的微电穿孔31。该装置从静态环境过渡到流通环境,限制了在应用电穿孔脉冲后电监测细胞膜透化程度的能力。这项工作中描述的方法弥合了这两种技术之间的差距,这是一种微电穿孔技术,能够以连续流动、连续的方式电检测、脉冲和监测单个细胞的细胞膜透化程度。
这项技术最近在Zheng等人中得到了描述。在该工作中,随着参数研究的完成,引入了该技术的功能,其中电穿孔脉冲的振幅和持续时间都发生了变化,并探索了指示细胞膜透化的随后的电信号32。结果表明,电穿孔脉冲强度的增加(即外加电场的增加或脉冲持续时间的增加)导致被测细胞膜透化的增加。为了进一步验证该系统,将成功电穿孔的常用荧光指示剂碘化丙啶33添加到细胞悬液中,并在应用电脉冲后立即捕获荧光图像。光信号,即细胞内碘化丙啶的荧光强度,与细胞膜透化程度的电测量密切相关,验证了该电测量的可靠性。然而,这项工作只考虑了小分子碘化丙啶的递送,这几乎没有可转化的意义。
在这项工作中,引入了该技术的新应用,以提高系统的通量,同时提供生物活性质粒DNA(pDNA)载体并评估电穿孔后重新铺板和培养的细胞的电转染效率。尽管之前的工作优于现有的能够电测量电穿孔事件的微电穿孔技术,但该设备的当前状态仍然需要电极组之间的较长细胞传输时间(~250 ms)才能执行细胞检测、脉冲应用和细胞膜透化测量。对于单通道,这将吞吐量限制在 4 个单元/秒。为了克服这一限制,引入了基于细胞群的反馈控制电穿孔的新概念来进行pDNA电转染。通过使用低生理电导率电穿孔缓冲液,该系统允许在多种电穿孔脉冲应用中对单个细胞进行电询问。根据电响应,然后确定"最佳"电穿孔脉冲。然后实施"高通量"模式,其中细胞膜透化测定无效,流速增加,电穿孔脉冲占空比与细胞传输时间相匹配,以确保每个细胞在电极之间传输一个脉冲。这项工作将为制造微器件的微细加工步骤、执行实验所需的材料/设备及其设置以及器件的操作/分析及其电转染效率(eTE)提供广泛的细节。
图1:影响电穿孔结果的实验因素 。 (左)细胞悬液-电穿孔开始前要考虑的重要因素包括:有效载荷(在本例中为pDNA)、浓度、细胞密度和电穿孔缓冲液特性。要考虑的电穿孔缓冲液特性是电导率、渗透压和影响这些值的确切分子组成。(中)脉冲应用-必须优化精确的脉冲类型(方波与指数衰减)和脉冲波形(单脉冲与脉冲序列),以最大限度地提高细胞活力和电转染效率。在电穿孔过程中实施的常见脉冲序列通常由一系列高压(HV)脉冲或在高压和低压(LV)脉冲幅度之间旋转的一系列脉冲组成。(右)细胞回收-下游处理步骤,特别是细胞转移到的回收细胞培养基,应进行优化。未显示(最左边),可以实施额外的上游细胞处理步骤,以实现整体电穿孔工艺优化。 请点击此处查看此图的大图。
注意:用户应查看所有MSDS以了解本协议中使用的材料和耗材。在每一步都应佩戴适当的PPE,并在实验过程中使用无菌技术。第 1-7 节讨论了器件制造。
1. 器件制造-掩模设计
注意:有关微细加工工艺的说明,请参阅 图 2 。微细加工步骤将在洁净室环境中进行。需要额外的个人防护装备(发网、面部发网、口罩、洁净室服、鞋套)。
2. 器件制造-光刻
注意:提供的微细加工配方采用光刻胶制造商的建议,仅应用作起点34。烘烤时间、曝光时间等的精确值需要针对每个制造方案进行优化。建议使用晶圆镊子处理硅片和载玻片。
3.器件制造:氢氟酸(HF)刻蚀
注意:此步骤涉及氢氟酸(HF)的处理和处置,氢氟酸可能导致深度,痛苦的化学灼伤。应使用额外的个人防护用品来保护处理人员(面罩、肘部长度的耐化学手套、带套筒的耐化学防护裙)。葡萄糖酸钙中和剂和皮肤凝胶应放在实验室工作台附近。此步骤不应单独执行。HF不应储存在玻璃容器中或分配到玻璃容器中,因为容器会被酸蚀刻。
注意:HF均匀蚀刻暴露的玻璃(即电极设计)以在玻璃中形成凹槽,从而在金属沉积后使电极图案具有更好的边缘分辨率(第4节)。
4. 器件制造:物理气相沉积
注意:此步骤涉及将金属沉积到载玻片基板上以定义电极图案。常用的金属电极是铬/金和钛/铂。金和铂不粘附在玻璃基板上,因此分别需要铬或钛的晶种粘附层来促进附着力37。
5. 器件制造:光刻胶剥离
注意:此步骤涉及将光刻胶层溶解在丙酮浴中,使粘附的铂电极在载玻片上留下图案。
6. 器件制造:软光刻
注意:此步骤涉及使用弹性体聚二甲基硅氧烷(PDMS)将微流体通道复制成型到SU-8主浮雕结构上。
7. 器件制造:PDMS键合/电线连接
注意:此步骤涉及用氧等离子体处理PDMS和玻璃基板的表面,以在PDMS和玻璃38之间形成不可逆的键。提供的配方可能需要适应实验室中使用的确切系统。
图 2:微器件制造。 (a)微流体通道制造-关键步骤:硅晶圆清洁(步骤2.1.1-2.1.3),光刻胶涂层和软烘烤(步骤2.1.7-2.1.8),紫外线照射(步骤2.1.10),显影(步骤2.1.12)和PDMS浇注(第6.2小节)。(B)电极制造-关键步骤:载玻片清洁(步骤2.1.1-2.1.3),HMDS涂层和光刻胶涂层(步骤2.2.3-2.2.4),紫外线照射(步骤2.2.8),显影(步骤2.2.9),HF蚀刻(第3部分),物理气相沉积(第4部分)和光刻胶剥离(第5部分)。(c) 设备定稿-关键步骤:入口/出口接入和超声处理(步骤 6.2.3 和第 6.3 节)、PDMS 键合和电线连接(第 7 节)。请点击此处查看此图的大图。
8. 细胞培养和收获
注意:应使用标准细胞培养和无菌处理程序。遵循细胞类型特异性方案进行细胞培养。
9. 硬件/实验设置
注意:在收获细胞进行实验之前,请确保完成实验设置,以尽量减少细胞悬浮在电穿孔缓冲液中的时间。在实验前 20-30 分钟打开电子设备进行预热。有关单细胞检测模块操作的实验设置示意图,请参阅 图3 。
注意:开发了一个定制的PA90运算放大器电路,以适应使用锁相放大器进行单电池电平检测所需的灵敏度和施加足够强的电穿孔脉冲所需的高电压。有关推荐电路39 的规格,请参阅 PA90 数据表。
图 3:实验设置原理图-单细胞检测。 高功率运算放大器(PA-90)允许将高压电穿孔脉冲叠加到单电池检测所需的锁相输出交流信号上。该激励信号通过微电穿孔器件(被测器件,DUT),然后电流前置放大器放大电流并馈入算法。系统持续监测细胞检测事件。进入细胞后,锁相放大器产生数字信号,以触发电穿孔脉冲施加到传输中的细胞。图例:PA-90(高功率运算放大器)、DUT(被测器件)、DIO(数字输入/输出)、FG-EP(函数发生器/电穿孔脉冲)、50X(50X 放大器)、PS-V-(PA 90 的电源/负电压)、FG-V+(函数发生器,PA 90 的正电压)。请点击此处查看此图的大图。
10. 实验操作
11. 分析
图4突出显示了单脉冲幅度的单细胞级膜透化检测的工作原理。电穿孔实验开始后,细胞检测算法通过逐点、基于斜率的检测方法确定细胞检测的最佳阈值。然后,系统连续监测(1)测量电流的显着负变化,这表明电池进入。这是由于生物细胞膜的绝缘性质,当细胞穿过电极组时,阻抗瞬时增加,导致测量电流急剧下降,从而实现一致的细胞检测(2),最终触发切换到计算机控制的脉冲应用(4)。绝缘电池在电极之间置换一定体积的电解质,导致电流下降,与电池大小成正比。电流的这种变化表示为 ΔIC (3)。在ΔIC计算之后,立即将预定的电脉冲(4)施用于运输中的电池。这种瞬时的能量流入将一个简短的传感伪影引入系统(灰盒)。在重新锁定信号时,即切换回细胞监测,(5)很明显,电穿孔脉冲透化了细胞膜,因为由于电极组之间的细胞存在而导致的电流大小变化在退出时下降(6)。电穿孔脉冲应用前后由于电池阻抗大小引起的两次电流下降的差异称为透化电流,表示为ΔIP。一旦细胞离开电极之间的体积,基线稳定,系统返回细胞检测模式(1)。在电穿孔预定数量的细胞后,测试下一个最高能量的电穿孔脉冲(有关脉冲设置,请参阅表1)。对于测试的每个电穿孔脉冲,确定平均"膜透化程度"。该值计算为 Δ IP/ΔIC。测试每个预定的电穿孔脉冲后,将Δ IP/ΔIC与施加的电能密度(σ x E 2 x t)作图,其中σ是溶液电导率(S/cm),E是电场强度(kV/cm), t是脉冲持续时间(ms)。有关本例中使用的HEK293细胞的细胞膜透化图,请参阅图5。
表1:电穿孔脉冲参数。 在这项研究中,选择电穿孔脉冲使得电荷通量(σ×E×t)保持不变,其中 σ 是溶液电导率(S/cm), E 是电场强度(kV/cm), t 是脉冲持续时间(ms)。结果是施加的脉冲电能的频谱。提供了实现指定脉冲参数所需的占空比(直流)示例,初始(单细胞检测)流速增加 5× 和 10×。 请按此下载此表格。
图4:单细胞膜透化-算法操作。 (上)一系列单电池检测/脉冲应用的电记录(由电流的尖峰指示)。(下)用于检测和脉冲单个电池的系统操作。(1) 系统通过逐点斜率计算连续检测电流变化。(2)检测到斜率急剧下降,表明电极之间的电池进入并触发计算机控制的脉冲应用。(3)确定电流降(ΔIC),并与电池的大小成正比。(4)电穿孔脉冲施加到运输中的细胞上,在电信号中引起传感伪影(灰色框)。(5) 锁相放大器在传输过程中重新锁定到电池中时切换回电池监控。(6)电池离开电极组,引起另一个较小幅度的电流尖峰(Δ IC >(I 6 - I5))。阻抗测量的差异是由于通过绝缘细胞膜形成孔。电流的这种变化称为透化电流(ΔIP)。计算细胞膜透化程度(Δ IP / ΔIC)。基线稳定,系统返回检测模式 (1)。请点击此处查看此图的大图。
在施加的电能与细胞膜透化程度之间观察到明显的相关性(图5),存在一个过渡区域,其中细胞膜透化程度显着增加。为此,为微电穿孔过程的高通量阶段选择超过该过渡区域的电能脉冲(图6)。在该实验中,1.8 kV/cm:670 μs脉冲被确定为"最佳"。如协议第10.3小节中详细描述的那样,系统流速增加,函数发生器设置为以设定的脉冲和占空比连续输出脉冲(有关1.5μL/min和3.0μL/min流速的脉冲设置,请参阅表1),以确保向传输中的每个电池施加 1 个脉冲。在这项研究中,流速增加了5倍,因此脉冲宽度设置为50毫秒(与细胞传输时间相匹配),占空比(直流)为2.7%。
图5:HEK293细胞膜透化映射-Δ Ip/ ΔIc与电能的关系。 电数据(Δ IP/ ΔIC)表示为平均±SEM。 脉冲条件(从左到右)- 0.4 kV/cm : 3 ms, 0.8 kV/cm : 1.5 ms, 1.0 kV/cm : 1.2 ms, 1.2 kV/cm : 1 ms, 1.8 kV/cm : 0.67 ms, 2.4 kV/cm : 0.5 ms.观察到细胞膜透化程度与所施加脉冲的电能密度之间存在明显的相关性。在本轮实验中,选择1.8 kV/cm:0.67 ms脉冲条件作为高通量模块的"最佳"电穿孔脉冲。请点击此处查看此图的大图。
图 6:基于细胞群的反馈控制电穿孔过程工作流程。 首先,对初始流速(Q0)进行编程,以允许单电池级电询问。在每个预定的电穿孔脉冲条件(E 0/t0 至 E N/tN)下,可编程数量的细胞被脉冲,施加的电能随着电穿孔脉冲应用的每次迭代而增加。在完成研究中包含的最高电能脉冲E N / tN之后,绘制细胞膜透化曲线,并确定被测细胞群的最佳电穿孔脉冲。系统进入高通量模式,其中流速增加到Q通量,并且省略了限速单单元询问步骤。最佳脉冲序列将在d.c.opt处连续施加E opt/t opt,使得运输中的每个细胞将根据细胞传输时间和脉冲宽度占空比(d.c.)接收单个电穿孔脉冲。 请点击此处查看此图的大图。
电穿孔后恢复24小时后,对细胞进行成像以确定电转染效率(eTE)。如协议第11.2小节所述,将eTE确定为表达GFP的细胞总数归一化为用DRAQ5染色的细胞总数。1.8 kV/cm:670 μs脉冲的eTE被确定为~70%(图7A)。为了强调系统在过渡到高通量模式时准确绘制细胞膜透化程度并选择足够高的电穿孔脉冲能量的重要性,还根据 eTE 探索了 0.4 kV/cm:3 ms 脉冲条件(图 7B)。在这种情况下,24 小时产生的 eTE 小于 5%。
图7:24小时电转染效率-GFP表达。 将HEK293细胞在微电穿孔实验后在37°C下孵育24小时。所有细胞均用DRAQ5(红色)染色,并根据表达GFP(绿色)的细胞与总细胞数(红色)的比率确定电转染效率(eTE)。在这项研究中,细胞活力未被评估为结果指标。(A) 通过 1.8 kV/cm:670 μs 脉冲成功转染的 HEK293 细胞的代表性堆叠 4× 荧光图像,显示 eTE 约为 70%。(B)代表性的,堆叠的4×HEK293细胞的荧光图像,通过0.4 kV / cm:3 ms脉冲转染未成功,显示eTE<<5%。比例尺:100 μm。 请点击这里查看此图的大图。
补充图1:二维CAD原理图。 微电穿孔设备由一个100 μm宽的直微通道组成,入口直径为1 mm,出口直径为3 mm。每条电极迹线宽 100 μm,电极组包含设备的电穿孔区域,该区域长 300 μm。微通道的三维高度由光刻胶的厚度控制。在这项工作中,设备的高度为20μm。 请点击这里下载此文件。
该协议中提出的方法主要侧重于微流体装置的微加工,然后将其集成到专门的电穿孔实验装置中。术语"配方"通常用于描述微细加工过程的细节,暗示了遵循/优化每个步骤以成功制造功能设备的重要性。然而,工艺中的某些关键步骤,如紫外线照射时间/能量、PVD 溅射速率/持续时间和氧等离子发生器设置,可能会对制造工艺以及电穿孔实验的成功执行造成问题。制造过程的故障排除主要通过反复试验或更可控的实验设计实验设计来完成。此外,还有替代的微细加工技术,例如深反应离子蚀刻(DRIE),可以替代它们来执行协议中的不同步骤(即,使用DRIE蚀刻成型结构来执行软光刻工艺)。此外,对于该领域的新手来说,优化配方和设计/制造设备可能非常耗时。然而,一旦微细加工工艺开发成功,工程师/科学家就可以自由设计适合其特定需求的设备。
为此,开发了该协议中描述的设备,以扩展我们之前的工作32。这需要使用单细胞膜透化电检测,但以更高的通量方式。其中描述的实验设置需要专门的设备,即锁相放大器,这对于标准研究实验室来说可能并不常见,因此限制了该技术的潜在扩展和适应性。然而,"裸骨"微流体电穿孔装置可以按照该协议实现,只需要一个函数发生器和可能的电压放大器来产生电穿孔脉冲。
然而,这种微电穿孔平台与其他单细胞电穿孔技术不同。在连续流动环境中对单细胞悬浮液进行电检测和优化电穿孔参数的能力是真正的创新。未来的工作涉及优化与成功的电穿孔结果相关的其他重要实验参数(见 图1),以进一步提高该平台的整体有效性。将开发和实施额外的活力和代谢测定,以评估与微电穿孔平台相关的任何潜在的负面下游影响。此外,微流体设计可以继续改进以实现更高的细胞通量,正如其他组40所证明的那样。在解决这些问题后,该技术有可能被采用到细胞疗法制造过程中,以执行基因传递和/或基因编辑,因为该方法非常适合封闭和自动化过程。
作者没有什么可透露的。
作者要感谢美国国家科学基金会(NSF CBET 0967598,DBI IDBR 1353918)和美国教育部在新兴精准和个性化医学领域的研究生培训(P200A150131)的财政支持,以资助研究生J.J.S.奖学金。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
150-mm diameter petri dishes | VWR | 25384-326 | step 6.1.1 to secure wafer |
24-well tissue culture plates | VWR | 10062-896 | step 10.3.6 to plate electroporated cells |
33220A Waveform/Function generator | Agilent | step 9.2.3 electroporation pulse generator | |
4'' Si-wafers | University Wafer | subsection 2.1 for microfluidic channel fabrication | |
6-well tissue culture plates | VWR | 10062-892 | step 8.1.8 to plate cells |
Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | step 2.1.2 for cleaning and step 5.1 photoresist lift-off |
Allegra X-22R Centrifuge | Beckman Coulter | steps 8.1.4 , 8.3.2. and 8.3.3. to spin down cells | |
AutoCAD 2018 | Autodesk | subsection 1.1. to design transparency masks | |
Buffered oxide etchant 10:1 | VWR | 901621-1L | subsection 3.1 for HF etching |
CCD Monochrome microscope camera | Hamamatsu | Orca 285 C4742-96-12G04 | step 11.2.3. for imaging |
CMOS camera- Sensicam QE 1.4MP | PCO | subsection 9.3 part of the experimental setup | |
Conductive Epoxy | CircuitWorks | CW2400 | subsection 7.6. for wire attachement |
Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-70C | step 8.1.4. for cell centrifuging |
Dektak 3ST Surface Profilometer | Veeco (Sloan/Dektak) | step 2.1.15 and 5.4 for surface profilometry | |
Disposable biopsy punch, 0.75 mm | Robbins Instruments | RBP075 | step 6.2.3 for inlet access |
Disposable biopsy punch, 3 mm | Robbins Instruments | RBP30P | step 6.2.3 for outlet access |
DRAQ5 | abcam | ab108410 | step 11.2.2. for live cell staining |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | ThermoFisher Scientific | 11885084 | step 8.1.2. part of media composition |
E3631A Bipolar Triple DC power supply | Agilent | step 9.2.1.-9.2.2.part of the experimental setup | |
Eclipse TE2000-U Inverted Microscope | Nikon | subsection 9.3. part of the experimental setup | |
EVG620 UV Lithography System | EVG | step 2.1.9. and 2.2.7. for UV Exposure | |
Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001 | step 8.1.2. part of media composition |
FS20 Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | subsection 5.1. for photoresist lift-off | |
Glass Media Bottle with Cap, 100mL | Fisher Scientific | FB800100 | step 8.2.1. for buffer storage |
Glass Media Bottle with Cap, 500mL | Fisher Scientific | FB800500 | step 8.1.2.for media storage |
HEK-293 cell line | ATCC | CRL-1573 | subsection 8.1 for cell culturing |
HEPES buffer solution | Sigma Aldrich | 83264-100ML-F | step 8.2.1 part of electroporation buffer composition |
Hexamethyldisilazane | Sigma Aldrich | 379212-25ML | step 2.2.3 adhesion promoter |
HF2LI Lock-in Amplifier | Zurich Instruments | subsection 9.2 part of the experimental setup | |
HF2TA Current amplifier | Zurich Instruments | subsection 9.2 part of the experimental setup | |
Isopropyl Alcohol | Fisher Scientific | A459-1 | step 2.1.2 for cleaning, step 2.1.14 for rinsing wafer following SU-8 development, and step 6.3.1 for cleaning PDMS |
IX81 fluorescence microscope | Olympus | step 11.2.3 for imaging | |
L-Glutamine Solution | Sigma Aldrich | G7513-20ML | step 8.1.2. part of media composition |
M16878/1BFA 22 gauge wire | AWC | B22-1 | subsection 7.5 for device fabrication |
Magnesium chloride | Sigma Aldrich | 208337-100G | step 8.1.2 part of electroporation buffer composition |
MF 319 Developer | Kayaku Advanced Materials | 10018042 | step 2.2.9. photoresist developer |
Microposit S1818 photoresist | Kayaku Advanced Materials | 1136925 | step 2.2.4 positive photoresist for electrode patterning |
Microscope slides, 75 x 25 mm | VWR | 16004-422 | step 2.2.1 electrode soda lime glass substrate |
Model 2350 High voltage amplifier | TEGAM | 2350 | step 9.2.5. part of the experimental setup |
National Instruments LabVIEW | National Instruments | data acquisition | |
Needle, 30G x 1 in | BD Scientific | 305128 | step 10.1.1. part of the system priming |
PA90 IC OPAMP Power circuit | Digi-key | 598-1330-ND | Part of the custom circuit |
Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4458-20ML | step 8.1.2. part of media composition |
Plasmid pMAX-GFP | Lonza | VCA-1003 | step 8.3.4. for intracellular delivery |
Plastic tubing, 0.010'' x 0.030" | VWR | 89404-300 | step 10.1.2. for system priming |
Platinum targets | Kurt J. Lesker | subsection 4.2. for physical vapor deposition | |
Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333-500G | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
Pump 11 PicoPlus microfluidic syringe pump | Harvard Apparatus | MA1 70-2213 | step 10.1.4. for system priming |
PVD75 Physical vapor deposition system | Kurt J. Lesker | subsection 4.1. for physical vapor deposition | |
PWM32 Spinner System | Headway Research | steps 2.1.6 and 2.2.2. for substrate coating with photoresist | |
PX-250 Plasma treatment system | March Instruments | subsection 7.2 for PDMS and glass substrate bonding | |
SDG1025 Function/Waveform generator | Siglent | step 9.2.2. part of the experimental setup | |
Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | S8045-500G | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
SU-8 2010 negative photoresist | Kayaku Advanced Materials | Y111053 | step 2.1.7. for microfluidic channel patterning |
SU-8 developer | Microchem | Y010200 | step 2.1.12. for photoresist developing |
Sucrose | Sigma Aldrich | S7903-1KG | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
Sylgard 184 elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | step 6.2.1 10 : 1 mixture of PDMS polymer and hardening agent |
Syringe, 1 ml | BD Scientific | 309628 | step 8.3.4. part of system priming |
SZ61 Stereomicroscope System | Olympus | subsection 7.3. for channel and electrode alignment | |
Tissue Culture Treated T25 Flasks | Falcon | 353108 | step 8.1.2 for cell culturing |
Titanium targets | Kurt J. Lesker | subsection 4.2. for physical vapor deposition | |
Transparency masks | CAD/ART Services | steps 2.1.9. and 2.2.7. for photolithography | |
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | step 6.1.2. for wafer silanization |
Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T4049-100ML | steps 8.1.3. and 8.3.1. for cell harvesting |
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