Herstellung und Betrieb eines kontinuierlichen Durchfluss-Mikroelektroporationssystems mit Permeabilisierungsdetektion

Dieses Protokoll beschreibt die Mikrofabrikationstechniken, die erforderlich sind, um ein mikrofluidisches Lab-on-a-Chip-Elektroporationsgerät zu bauen. Der Versuchsaufbau führt kontrollierte Transfektionen auf Einzelzellebene in einem kontinuierlichen Fluss durch und kann mit populationsbasierter Kontrolle auf höhere Durchsätze erweitert werden. Es wird eine Analyse bereitgestellt, die die Fähigkeit zeigt, den Grad der Permeabilisierung der Zellmembran in Echtzeit elektrisch zu überwachen.

Aktuelle therapeutische Innovationen, wie die CAR-T-Zelltherapie, sind stark von der viral-vermittelten Genabgabe abhängig. Obwohl diese Technik effizient ist, geht sie mit hohen Herstellungskosten einher, was zu einem Interesse an der Verwendung alternativer Methoden für die Genlieferung geführt hat. Die Elektroporation ist ein elektrophysikalischer, nicht-viraler Ansatz zur intrazellulären Abgabe von Genen und anderen exogenen Materialien. Bei Anlegen eines elektrischen Feldes ermöglicht die Zellmembran vorübergehend die molekulare Abgabe in die Zelle. Typischerweise wird die Elektroporation auf der Makroskala durchgeführt, um eine große Anzahl von Zellen zu verarbeiten. Dieser Ansatz erfordert jedoch eine umfangreiche empirische Protokollentwicklung, die bei der Arbeit mit primären und schwer zu transfizierenden Zelltypen kostspielig ist. Langwierige Protokollentwicklung, gepaart mit der Anforderung großer Spannungen, um ausreichende elektrische Feldstärken zur Permeabilisierung der Zellen zu erreichen, hat zur Entwicklung von Elektroporationsgeräten im Mikromaßstab geführt. Diese Mikroelektroporationsgeräte werden mit gängigen Mikrofabrikationstechniken hergestellt und ermöglichen eine bessere experimentelle Kontrolle mit dem Potenzial, hohe Durchsatzfähigkeiten aufrechtzuerhalten. Diese Arbeit baut auf einer mikrofluidischen Elektroporationstechnologie auf, die in der Lage ist, den Grad der Zellmembranpermeabilisierung auf Einzelzellebene unter kontinuierlichem Fluss zu detektieren. Diese Technologie war jedoch auf 4 pro Sekunde verarbeitete Zellen beschränkt, so dass hier ein neuer Ansatz zur Erhöhung des Systemdurchsatzes vorgeschlagen und vorgestellt wird. Diese neue Technik, die als zellpopulationsbasierte Rückkopplungskontrolle bezeichnet wird, berücksichtigt die Zellpermeabilisierungsantwort auf eine Vielzahl von Elektroporationspulsbedingungen und bestimmt die am besten geeigneten Elektroporationspulsbedingungen für den zu testenden Zelltyp. Anschließend wird ein Modus mit höherem Durchsatz verwendet, bei dem dieser "optimale" Impuls auf die Zellsuspension während des Transports angewendet wird. Die Schritte zur Herstellung des Geräts, zum Aufbau und zur Durchführung der mikrofluidischen Experimente und zur Analyse der Ergebnisse werden detailliert vorgestellt. Schließlich wird diese Mikroelektroporationstechnologie demonstriert, indem ein DNA-Plasmid, das für grün fluoreszierendes Protein (GFP) kodiert, in HEK293-Zellen eingebracht wird.

Aktuelle therapeutische Innovationen in der biomedizinischen Forschung, wie die CAR-T-Zelltherapie (Chimeric Antigen Receptor Engineered T cell) und die genetische Editierung mittels CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat DNA sequences)/Cas9, hängen stark von der Fähigkeit ab, exogenes Material sowohl erfolgreich als auch effizient in den intrazellulären Raum zu bringen¹. In der CAR-T-Therapie ist der Goldstandard für die Durchführung des Genabgabeschritts bei der Zelltherapieherstellung die Verwendung viraler Vektoren². Obwohl die viral vermittelte Genabgabe eine effiziente Verabreichungsmodalität ist, hat sie auch mehrere Nachteile. Dazu gehören Herstellungskosten, Zytotoxizität, Immunogenität, Mutagenese/Tumorgenesepotenzial und Größenbeschränkungen für das/die zu liefernde(n) Gen(e)³. Diese Einschränkungen haben zur Erforschung und Entwicklung alternativer, nicht-viraler Verabreichungstechnologien geführt.

Die Elektroporation, eine Alternative zur viral vermittelten Genabgabe, beruht auf der Anwendung einer optimalen elektrischen Pulswellenform, um DNA-, RNA- und Proteintransfektionen von Zellen durchzuführen. Nach dem Anlegen eines externen elektrischen Feldes wird die Zellmembran kurzzeitig kompromittiert, wodurch die Zelle anfällig für die intrazelluläre Abgabe von ansonsten undurchlässigen exogenen Materialien^{wird 4}. Im Vergleich zur viralvermittelten Verabreichung ist die Elektroporation vorteilhaft, da sie im Allgemeinen sicher, einfach zu bedienen und mit niedrigen Betriebskosten verbunden ist. Die Elektroporation kann sowohl kleine als auch große molekulare Fracht liefern und kann bei der Transfizierung von Zellen unabhängig von der Linie⁵ effizient sein. Um wünschenswerte Ergebnisse nach der Elektroporation zu erzielen, d.h. gute Lebensfähigkeit und gute Elektrotransfektionseffizienz, müssen eine Vielzahl von experimentellen Parametern co-optimiert werden. Dazu gehören Zelltyp⁶, Zelldichte, Molekülkonzentration⁷, Elektroporationspuffereigenschaften (z. B. molekulare Zusammensetzung, Leitfähigkeit und Osmolarität)⁸, Elektrodengröße/-geometrie⁹ und elektrische Pulswellenform (Form, Polarität, Anzahl der Impulse)¹⁰ (siehe Abbildung 1 für eine Abbildung). Obwohl jeder dieser Parameter einen signifikanten Einfluss auf die Ergebnisse von Elektroporationsexperimenten haben kann, wurde die Pulswellenform besonders detailliert untersucht, da die elektrische Energie des angelegten Impulses (der angelegten Impulse) die Wurzel des intrinsischen Kompromisses zwischen der resultierenden Zelllebensfähigkeit und der Elektrotransfektionseffizienz ist⁸.

Typischerweise werden Elektroporationsexperimente auf der Makroskala durchgeführt, wo Zellen in 100 Mikrolitern Puffer zwischen einem Satz großer, paralleler Plattenelektroden innerhalb einer Elektroporationsküvette suspendiert werden. Die Elektroden werden üblicherweise aus Aluminium mit einem Elektrodenabstand von 1-4 mm hergestellt. Sobald die Zellen manuell per Pipette geladen sind, wird die Küvette elektrisch mit einem sperrigen, elektrischen Impulsgenerator verbunden, wo der Benutzer die Pulswellenformparameter einstellen und anwenden kann, um die Zellsuspension elektropolieren. Obwohl die Makro- oder Massenelektroporation Zelldichten >10⁶ Zellen / ml verarbeiten kann, kann diese Funktion bei der Optimierung der Einstellungen der elektrischen Pulswellenform verschwenderisch sein. Dies ist besonders besorgniserregend, wenn primäre Zelltypen galoppieren, bei denen die Anzahl der Zellpopulationen begrenzt werden kann. Zusätzlich muss der Impulsgeber aufgrund des großen Abstands zwischen den Elektroden in der Lage sein, große Spannungen zu liefern, um elektrische Feldstärken >1kV/cm¹¹ zu erreichen. Diese hohen Spannungen verursachen eine Widerstandsverlustleistung durch den Elektrolytpuffer, was zu einer Joule-Erwärmung führt, die sich nachteilig auf die resultierende Zelllebensfähigkeit auswirken kann¹². Schließlich wird die Durchführung der Elektroporation an einer dichten Zellsuspension konsequent mit einer angeborenen Variabilität der resultierenden Elektrotransfektionseffizienz und Zelllebensfähigkeit belastet. Jede Zelle in Suspension könnte aufgrund der umgebenden Zellen eine andere elektrische Feldstärke erfahren. Je nachdem, ob die erlebte elektrische Feldstärke erhöht oder verringert wird, kann die resultierende Zelllebensfähigkeit oder die Elektrotransfektionseffizienz jeweils negativ beeinflusst werden¹¹. Diese Nachteile der Elektroporation im Makromaßstab haben zur Verfolgung und Entwicklung alternativer Technologien geführt, die auf der Mikroskala arbeiten und eine bessere Kontrolle auf Einzelzellebene ermöglichen.

Das Gebiet der BioMEMS oder biomedizinischen mikroelektromechanischen Systeme stammt aus den technologischen Fortschritten in der Mikroelektronikindustrie. Insbesondere die Verwendung von Mikrofabrikationsprozessen zur Entwicklung von Mikrogeräten für die Förderung der biomedizinischen Forschung. Diese Fortschritte umfassen die Entwicklung von Mikroelektrodenarrays für die elektrische In-vivo-Überwachung 13, kapazitive Mikroelektroden für die In-situ-Elektroporation 14, miniaturisierte Organ-on-a-Chip-Geräte 15, mikrofluidische Point-of-Care-Diagnostik 16, Biosensoren 17 und Arzneimittelabgabesysteme¹⁸, einschließlich Nano- und Mikroelektroporationsvorrichtungen ^19,20,21 . Aufgrund der Fähigkeit, Geräte im gleichen Größenmaßstab wie biologische Zellen zu entwerfen und herzustellen, sind Nano- und Mikroelektroporationstechnologien im Vergleich zu ihrem makroskaligen Gegenstück^22,23 vorteilhaft. Diese Elektroporationsgeräte machen Hochspannungsimpulsanwendungen überflüssig, da typischerweise Elektrodensätze mit Abständen von 10s bis 100s Mikrometern integriert sind. Diese Eigenschaft reduziert den Strom durch den Elektrolyten drastisch, was wiederum die Ansammlung toxischer Elektrolyseprodukte und die Auswirkungen der Joule-Erwärmung in diesen Systemen reduziert. Die mikroskaligen Kanäle stellen auch sicher, dass während der Pulsapplikation zuverlässig ein viel gleichmäßigeres elektrisches Feld an die Zellen angelegt wird, was zu konsistenteren Ergebnissen führt²⁴. Darüber hinaus ist es auch üblich, dass Mikroelektroporationsgeräte in eine mikrofluidische Plattform integriert werden, die sich für die zukünftige Integration in eine vollautomatische Technologie eignet, eine höchst wünschenswerte Fähigkeit bei der Herstellung von Zelltherapien²⁵. Schließlich ermöglicht die Elektroporation im Mikromaßstab die elektrische Abfrage von Elektroporationsereignissen. Zum Beispiel kann der Grad der Zellmembranpermeabilisierung in Echtzeit auf Einzelzellebene überwacht werden^26,27. Der Zweck dieser Methode besteht darin, die Mikrofabrikation, den Systembetrieb und die Analyse einer mikrofluidischen, einzelligen Mikroelektroporationsvorrichtung zu beschreiben, die in der Lage ist, den Grad der Zellmembranpermeabilisierung zur Optimierung von Elektroporationsprotokollen zu messen und gleichzeitig den Durchsatz gegenüber dem vorherigen Stand der Technik zu erhöhen.

Die Durchführung der Elektroporation auf Einzelzellebene ist keine neuartige Technik mehr, wie Rubinsky et al. erstmals 2001 mit der Entwicklung einer statischen Zellelektroporationstechnologie^{demonstrierten 28}. Ihr Mikrogerät war innovativ, da sie die ersten waren, die die Fähigkeit demonstrierten, das Ereignis der Elektroporation elektrisch zu überwachen. Dies hat weiter zur Entwicklung statischer, einzelliger Elektroporationstechnologien geführt, die in der Lage sind, den Grad der Permeabilisierung der Zellmembran parallel elektrisch zu erfassen, um den Durchsatz der Geräte zu erhöhen. Aber selbst bei Parallelisierung und Stapelverarbeitung fehlt diesen Geräten die Gesamtzahl der Zellen, die sie pro Zeiteinheit verarbeiten können,^29,30. Diese Einschränkung hat zur Entwicklung von Durchflussvorrichtungen geführt, die in der Lage sind, Mikroelektroporation auf Einzelzellebene bei viel größeren Durchsätzen durchzuführen³¹. Dieser Geräteübergang von der statischen zur Durchflussumgebung begrenzt die Fähigkeit, den Grad der Permeabilisierung der Zellmembran nach der Anwendung des Elektroporationsimpulses elektrisch zu überwachen. Die in dieser Arbeit beschriebene Methode schließt die Lücke zwischen diesen beiden Technologien, eine Mikroelektroporationstechnologie, die in der Lage ist, den Grad der Zellmembranpermeabilisierung einzelner Zellen kontinuierlich seriell zu detektieren, zu pulsieren und zu überwachen.

Diese Technologie wurde kürzlich in Zheng et al. In dieser Arbeit wurden die Fähigkeiten dieser Technologie mit dem Abschluss einer parametrischen Studie eingeführt, bei der sowohl die Amplitude als auch die Dauer des Elektroporationsimpulses variiert wurden und das daraus resultierende elektrische Signal, das auf eine Permeabilisierung der Zellmembran hinweist, untersucht wurde³². Die Ergebnisse zeigten, dass eine Zunahme der Intensität des Elektroporationsimpulses (d.h. Zunahme des angelegten elektrischen Feldes oder Erhöhung der Pulsdauer) eine Erhöhung der gemessenen Zellmembranpermeabilisierung verursachte. Um das System weiter zu validieren, wurde der Zellsuspension ein üblicher Fluoreszenzindikator für eine erfolgreiche Elektroporation, Propidiumiodid³³, zugegeben, und unmittelbar nach der Anwendung des elektrischen Impulses wurde ein Fluoreszenzbild aufgenommen. Das optische Signal, d.h. die Fluoreszenzintensität von Propidiumiodid in der Zelle, korrelierte stark mit der elektrischen Messung des Permeabilisierungsgrades der Zellmembran, was die Zuverlässigkeit dieser elektrischen Messung bestätigte. Diese Arbeit betrachtete jedoch nur die Abgabe des niedermolekularen Propidiumiodids, das wenig bis gar keine übersetzbare Bedeutung hat.

In dieser Arbeit wird eine neue Anwendung dieser Technologie vorgestellt, um den Durchsatz des Systems zu verbessern und gleichzeitig einen biologisch aktiven Plasmid-DNA-Vektor (pDNA) zu liefern und die Elektrotransfektionseffizienz von Zellen zu bewerten, die nach der Elektroporation neu plattiert und kultiviert werden. Obwohl die vorherige Arbeit bestehende Mikroelektroporationstechnologien übertrifft, die in der Lage sind, das Ereignis der Elektroporation elektrisch zu messen, erfordert der aktuelle Zustand des Geräts immer noch lange Zelllaufzeiten zwischen dem Elektrodensatz (~ 250 ms), um die Zellerkennung, die Pulsanwendung und die Permeabilisierungsmessung der Zellmembran durchzuführen. Bei einem einzigen Kanal begrenzt dies den Durchsatz auf 4 Zellen/s. Um diese Einschränkung zu bekämpfen, wird ein neues Konzept der zellpopulationsbasierten rückkopplungsgesteuerten Elektroporation eingeführt, um pDNA-Elektrotransfektion durchzuführen. Durch die Verwendung eines hypophysiologischen Leitfähigkeits-Elektroporationspuffers ermöglicht dieses System die elektrische Abfrage einzelner Zellen über eine Vielzahl von Elektroporationspulsanwendungen. Basierend auf der elektrischen Reaktion wird dann ein "optimaler" Elektroporationsimpuls bestimmt. Anschließend wird ein "Hochdurchsatz"-Modus implementiert, bei dem die Bestimmung der Permeabilisierung der Zellmembran aufgehoben, die Flussrate erhöht und der Tastverhältnis des Elektroporationsimpulses an die Zelllaufzeit angepasst wird, um einen Impuls pro Zelle im Transit zwischen den Elektroden sicherzustellen. Diese Arbeit wird umfangreiche Details zu den Mikrofabrikationsschritten für die Herstellung des Mikrogeräts, dem Material / der Ausrüstung und deren Aufbau liefern, die für die Durchführung des Experiments erforderlich sind, sowie dem Betrieb / der Analyse des Geräts und seiner Elektrotransfektionseffizienz (eTE).

Abbildung 1: Experimentelle Faktoren, die die Ergebnisse der Elektroporation beeinflussen. (Links) Zellsuspension-Wichtige Faktoren, die vor Beginn der Elektroporation zu berücksichtigen sind, sind: Nutzlast (in diesem Fall pDNA), Konzentration, Zelldichte und Elektroporationspuffereigenschaften. Zu berücksichtigende Eigenschaften des Elektroporationspuffers sind Leitfähigkeit, Osmolarität und die genaue molekulare Zusammensetzung, die zu diesen Werten beiträgt. (Mitte) Pulsanwendung - Der genaue Pulstyp (Rechteckwelle vs. exponentieller Zerfall) und die Pulswellenform (Einzelpuls vs. Pulsfolge) müssen optimiert werden, um sowohl die resultierende Zelllebensfähigkeit als auch die Elektrotransfektionseffizienz zu maximieren. Übliche Pulsfolgen, die in Elektroporationsprozessen implementiert werden, bestehen typischerweise aus einer Reihe von Hochspannungsimpulsen (HV) oder einer Reihe von Impulsen, die zwischen HV- und Niederspannungsimpulsgrößen (LV) rotieren. (Rechts) Zellwiederherstellung-Nachgelagerte Verarbeitungsschritte, insbesondere die Rückgewinnungszellkulturmedien, auf die Zellen übertragen werden, sollten optimiert werden. Nicht vorgestellt (ganz links) können zusätzliche vorgeschaltete Zellverarbeitungsschritte zur Optimierung des gesamten Elektroporationsprozesses implementiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

HINWEIS: Benutzer sollten alle Sicherheitsdatenblätter auf die in diesem Protokoll verwendeten Materialien und Verbrauchsmaterialien überprüfen. Bei jedem Schritt und jeder sterilen Technik, die während des Experimentierens verwendet wird, sollte eine geeignete PSA getragen werden. In den Abschnitten 1-7 wird die Geräteherstellung erläutert.

1. Geräteherstellung - Maskendesign

HINWEIS: In Abbildung 2 finden Sie eine Veranschaulichung des Mikrofabrikationsprozesses. Die Mikrofabrikationsschritte sollen in einer Reinraumumgebung durchgeführt werden. Zusätzliche PSA ist notwendig (Haarnetz, Gesichtshaarnetz, Maske, Reinraumanzug, Schuhüberzieher).

1. Installieren Sie eine CAD-Software Ihrer Wahl, entwerfen Sie eine 2-dimensionale "Maske" sowohl des mikrofluidischen Kanals als auch der Elektroden und speichern Sie das Design im gewünschten Dateiformat (d. H. .dxf, .dwg).
   HINWEIS: In der ergänzenden Abbildung 1 finden Sie ein Beispiel für einen 2-dimensionalen Maskenschema.
2. Senden Sie es an einen Lieferanten Ihrer Wahl, um gedruckt zu werden. Stellen Sie sicher, dass die Abmessungen der Designs innerhalb der Auflösungsmöglichkeiten des Lieferanten liegen.

2. Geräteherstellung - Photolithographie

HINWEIS: Die mitgelieferten Mikrofabrikationsrezepte sind den Empfehlungen des Fotolackherstellers entnommen und sollten nur als Ausgangspunkt³⁴ verwendet werden. Genaue Werte für Backzeiten, Einwirkzeiten etc. müssen für jedes Fertigungsprotokoll optimiert werden. Es wird empfohlen, eine Waferpinzette für die Handhabung von Siliziumwafern und Glasobjektträgern zu verwenden.

1. Mikrofluidische Kanalfertigung
   1. Reinigung von Siliziumwafern und Kalk-Natron-Glasobjektträgern: Führen Sie die Schritte 2.1.2-2.1.3 aus, um Siliziumwafer und 1" × 3" Kalk-Kalk-Kalk-Objektträgerreinigung (beide als "Substrat" bezeichnet) durchzuführen.
   2. Tauchen Sie die Substrate für jeweils 10 min in ein Acetonbad, ein Isopropanol (IPA)-Bad und ein entionisiertes Wasserbad. Führen Sie diese 3-stufige Wäsche seriell bei Raumtemperatur durch.
   3. Entfernen und trocknen Sie die Oberfläche mit einer unter Druck stehenden Stickstoff- oder gefilterten Luftgasquelle. Legen Sie die Substrate für mindestens 30 min in einen 150 °C heißen Ofen, damit die restliche Feuchtigkeit verdampfen kann.
   4. SU-8-Fotolithographie auf Siliziumwafer: Führen Sie eine Fotolithographie auf dem Siliziumwafer durch, indem Sie die Schritte 2.1.5-2.1.14 ausführen.
      HINWEIS: Um eine mikrofluidische Kanalhöhe von 20 μm zu erreichen, wurde negativer Fotolack der SU-8 2000-Serie verwendet. Die genauen Spin-Raten variieren je nach Formulierung von SU-8 (z. B. 2010, 2015 usw.); Die folgenden Bedingungen gelten jedoch für die Formulierung SU-8 2010³⁵.
   5. Nehmen Sie den Siliziumwafer aus dem 150 °C-Ofen und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur (RT) abkühlen.
   6. Befestigen Sie den Wafer mit dem Vakuumsystem des Spin Coaters am Chuck des Wafer Spin Coaters. Programmieren Sie den Spinner. Schritt 1 - 500 U/min für 10 s bei einer Beschleunigung von 100 U/min/s, Schritt 2 - 1000 U/min für 30 s bei einer Beschleunigung von 300 U/min.
   7. Geben Sie 4 ml SU-8 2010 Fotolack auf die Mitte des Siliziumwafers. Führen Sie das Programm aus. Sobald das System zum Stillstand kommt, schalten Sie das Vakuum aus.
   8. Mit einer Pinzette den SU-8-beschichteten Siliziumwafer für 4-5 min auf eine Heizplatte bei 95 °C zum Weichbacken überführen. Nehmen Sie dann den Wafer von der Heizplatte und lassen Sie ihn auf RT abkühlen.
      HINWEIS: Befolgen Sie das ordnungsgemäße Startverfahren für den laborspezifischen photolithografischen Masken-Aligner.
   9. Befestigen Sie die Fotomaske mit den mikrofluidischen 2D-Kanaldesigns auf dem Maskenhalter. Setzen Sie den Siliziumwafer mit der SU-8-Beschichtung nach oben auf das Waferfutter ein.
   10. Stellen Sie die Belichtungseinstellungen auf 150 mJ/cm² ein und starten Sie das Gerät.
       VORSICHT: Schauen Sie nicht direkt auf die UV-Lichtquelle, um mögliche Augenschäden zu vermeiden.
   11. Legen Sie den SU-8-beschichteten Siliziumwafer für 4-5 Minuten für den Backvorgang nach der Exposition auf eine Heizplatte bei 95 °C.
   12. Tauchen Sie den Siliziumwafer für 3-4 min in die SU-8-Entwicklerlösung (siehe Materialtabelle). Sanftes Rühren auftragen. Entfernen Sie den Wafer aus der Lösung und spülen Sie die Oberfläche mit IPA ab.
   13. Trocknen Sie die Oberfläche mit einer unter Druck stehenden Stickstoff- oder gefilterten Luftgasquelle. Untersuchen Sie die Merkmale unter dem Mikroskop mit einem UV-Filter und stellen Sie sicher, dass keine offensichtlichen Defekte in den mikrofluidischen Kanälen auftreten.
   14. Legen Sie den Siliziumwafer für mindestens 30 Minuten in einen 150 °C-Ofen für ein hartes Backen.
   15. Lassen Sie es auf RT abkühlen und verwenden Sie die Tasterprofilometrie, um die genaue Höhe und Neigung der Kanalseitenwände zu messen.
2. Fotolithographie auf Glasobjektträgern
   HINWEIS: Hexamethyldisilazan (HMDS) wird als Haftvermittler für den positiven Fotolack S1818³⁶ verwendet.
   1. Nehmen Sie den Objektträger aus dem 150 °C heißen Ofen und lassen Sie ihn auf RT abkühlen.
   2. Befestigen Sie den Glasobjektträger mit Vakuum am Spannfutter des Spinners und programmieren Sie den Spinner. Schritt 1 - 500 U/min für 10 s bei einer Beschleunigung von 100 U/min/s. Schritt 2 - 3000 U/min für 30 saß eine Beschleunigung von 300 U/min/s.
   3. Geben Sie 3-4 Tröpfchen HMDS über die Oberfläche des Objektträgers. Führen Sie das Programm aus.
      HINWEIS: Um eine Oberflächenbeschichtung von ~3 μm zu erreichen, sollte die positive Fotolackserie S1800 verwendet werden. Die genauen Schleuderraten variieren je nach Formulierung; Die folgenden Empfehlungen gelten für die S1818-Formulierung³⁴.
   4. Geben Sie 1 ml Fotolack auf die Oberfläche des Objektträgers. Stellen Sie sicher, dass Sie genügend Fläche abdecken.
   5. Führen Sie das Programm aus. Sobald das System zum Stillstand kommt, schalten Sie das Vakuum aus und entfernen Sie den Glasträger.
   6. Legen Sie den S1818 beschichteten Glasobjektträger für 4 min für einen weichen Backvorgang auf eine Heizplatte bei 120 °C. Entfernen und zu RT kommen lassen.
   7. Befestigen Sie die Fotomaske mit den 2D-Elektrodendesigns auf dem Maskenhalter.
   8. Setzen Sie den Objektträger mit der S1818-Beschichtung nach oben auf das Waferfutter ein und richten Sie es aus. Stellen Sie die Belichtungseinstellungen auf 250 mJ/cm² ein und starten Sie das Gerät.
      HINWEIS: Verschiedene Kontakt-Aligner-Modelle können mehr oder weniger für nicht kreisförmige, unterschiedlich dicke Substrate geeignet sein.
   9. Tauchen Sie den Objektträger für 2 Minuten in die MF-319-Entwicklerlösung. Sanftes Rühren auftragen. Spülen Sie die Oberfläche des Objektträgers mit entionisiertem Wasser ab.
   10. Trocknen Sie die Oberfläche mit einer unter Druck stehenden Stickstoff- oder gefilterten Luftgasquelle und beobachten Sie die Merkmale unter einem Mikroskop mit einem UV-Filter. Stellen Sie sicher, dass die lithografischen Muster keine offensichtlichen Mängel aufweisen.
   11. Legen Sie den Glasobjektträger in den 150 °C-Ofen und stellen Sie sicher, dass die gewünschte Substratoberfläche nach oben zeigt, für mindestens 30 Minuten für einen harten Backvorgang. Aus dem Ofen nehmen und vor Licht geschützt aufbewahren.

3. Geräteherstellung: Flusssäure (HF) ätzen

ACHTUNG: Dieser Schritt beinhaltet die Handhabung und Entsorgung von Flusssäure (HF), die tiefe, schmerzhafte chemische Verbrennungen verursachen kann. Zum Schutz des Hundeführers sollte zusätzliche PSA verwendet werden (Gesichtsschutz, ellbogenlange, chemisch beständige Handschuhe, chemisch beständige Schürze mit Ärmeln). Calciumgluconatsäure-Neutralisator und Hautgel sollten in der Nähe des Labortisches aufbewahrt werden. Dieser Schritt sollte nicht alleine durchgeführt werden. HF sollte niemals in Glasbehältern gelagert oder in Glasbehältern abgegeben werden, da der Behälter von der Säure geätzt wird.

HINWEIS: Der HF ätzt das belichtete Glas (d. H. Das Elektrodendesign) gleichmäßig, um eine Aussparung im Glas zu bilden, was eine bessere Kantenauflösung des Elektrodenmusters nach der Metallabscheidung ermöglicht (Abschnitt 4).

1. Tauchen Sie den Objektträger in 10:1 gepufferte HF-Lösung für 1 min in einen Polytetrafluorethylenbehälter. Übertragen und waschen Sie die Glasobjektträger in entionisiertem Wasser. Wiederholen Sie den Waschschritt 3 mal.
2. Trocknen Sie die Oberfläche mit einer unter Druck stehenden Stickstoff- oder gefilterten Luftgasquelle. Glassubstrate über Nacht in einen 65 °C heißen Ofen geben, um die restliche Feuchtigkeit zu entfernen. Bedecken Sie die Substrate vor Licht.

4. Geräteherstellung: Physikalische Gasphasenabscheidung

HINWEIS: Dieser Schritt beinhaltet die Metallabscheidung auf den Glasträgersubstraten, um die Elektrodenmuster zu definieren. Häufig verwendete Metallelektroden sind Chrom/Gold und Titan/Platin. Gold und Platin haften nicht am Glassubstrat, so dass eine Samenhaftschicht aus Chrom bzw. Titan erforderlich ist, um die Adhäsion^{zu fördern 37}.

1. Befolgen Sie das reinraumspezifische Protokoll, um die hauseigene PVD-Anlage zu betreiben. Diese Arbeit verwendet ein DC-Sputtersystem und Sputtern mit 100 SCCM Argongas bei einem Druck von ~ 8 mTorr und 200 W Leistung.
2. Titan 8 min mit einer Geschwindigkeit von ~100 Å/min sputtern. Platin für 10 min mit einer Rate von ~200 Å/min sputtern. Entfernen Sie die Substrate aus der PVD-Kammer.

5. Geräteherstellung: Fotolack-Abheben

HINWEIS: Dieser Schritt beinhaltet das Auflösen der Fotolackschicht in einem Acetonbad, wobei die aufgeklebten Platinelektroden auf den Glasobjektträgern gemustert bleiben.

1. Tauchen Sie die metallbeschichteten Glasdias für ~10 min in ein Acetonbad.
2. Beschallen Sie das Bad, um eine Bewegung einzuleiten, um den nicht haftenden Metallfilm aufzubrechen. Verwenden Sie ein mit Aceton getränktes Tuch, um bei Bedarf Rückstände zu entfernen.
3. Sobald alle Fotolacke / Metall entfernt sind, waschen Sie die Elektrodenmuster mit entionisiertem Wasser und legen Sie sie über Nacht in einen 65 ° C Ofen, um die verbleibende Oberflächenfeuchtigkeit zu entfernen.
4. Verwenden Sie die Tasterprofilometrie, um das Profil der strukturierten Elektroden zu messen.

6. Geräteherstellung: Softlithographie

HINWEIS: Dieser Schritt beinhaltet das Nachformen des mikrofluidischen Kanals auf die SU-8-Masterreliefstruktur unter Verwendung eines Elastomers, Polydimethylsiloxan (PDMS).

1. Siliziumwafer-Silanisierung
   HINWEIS: Dies ist ein optionaler Schritt. Es wird jedoch die Lebensdauer der SU-8-Reliefstruktur erhöhen, die in Unterabschnitt 2.1 hergestellt wurde. Dieser Schritt sollte in einem chemischen Abzug durchgeführt werden.
   1. Befestigen Sie die Waffel am Boden einer Petrischale und legen Sie die Petrischale in einen Exsikkator.
   2. Umgeben Sie den Umfang des Siliciumwafers mit etwa 50 μL Trichlor(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silan. Vakuum anschließen (Vakuumpumpe oder Hausvakuumleitung) und 20 min laufen.
2. PDMS-Replikatspritzguss
   1. Mischen Sie in einem Einwegbehälter (z. B. Wiegeboot, Plastikbecher) PDMS-Elastomerbasis mit Härter im Gewichtsverhältnis 10:1 auf einer elektronischen Waage. Gießen Sie die PDMS-Lösung über den Siliziumwafer und stellen Sie die Mischung unter Vakuum, um alle Luftblasen zu entfernen.
   2. Bei 65 °C für mindestens 4 h aushärten, damit das PDMS erstarren kann. Schneiden Sie mit der Spitze einer Rasierklinge das geformte PDMS aus und ziehen Sie es vom Siliziumwafer ab.
   3. Entfernen Sie PDMS mit einem geschärften Biopsiestempel aus dem Einlass / den Auslässen des Geräts. Für dieses Gerät wurden 0,75 mm bzw. 3 mm Biopsiestempel für die Einlässe bzw. die Auslässe verwendet.
      HINWEIS: Der verwendete Biopsiestempel sollte einen etwas kleineren Durchmesser als der Außendurchmesser des Verbindungsschlauchs haben, um eine dichte Abdichtung der Schläuche in den Behältern zu gewährleisten.
3. Beschallungsreinigung von PDMS
   1. Tauchen Sie die PDMS-Geräte in IPA ein und legen Sie sie für 30-45 Minuten in einen Ultraschallgerät, um PDMS-Ablagerungen aus dem Einlass / den Auslässen zu entfernen. PDMS kann in der IPA-Lösung anschwellen.
   2. Mit entionisiertem Wasser abspülen und über Nacht in einen 65 °C heißen Ofen stellen, damit das PDMS wieder auf die normale Größe anschwellen kann.
      HINWEIS: Reste von Ablagerungen können das Gerät während des Experimentierens verstopfen. Große Schmutzteile können vor der Beschallung mit einem Stück Klebeband von der PDMS-Oberfläche entfernt werden.

7. Geräteherstellung: PDMS-Bonden / Drahtbefestigung

ANMERKUNG: Dieser Schritt beinhaltet die Behandlung der Oberfläche des PDMS und des Glassubstrats mit einem Sauerstoffplasma, um eine irreversible Verbindung zwischen dem PDMS und Glas³⁸ zu bilden. Die mitgelieferte Rezeptur muss möglicherweise an das genaue System angepasst werden, das im Labor verwendet wird.

1. Schneiden Sie die Geräte zu und stellen Sie sicher, dass die Oberfläche des PDMS-Geräts sauber ist. Wenn Sie nicht erneut reinigen, befolgen Sie die Schritte in Unterabschnitt 6.3.
2. Programmieren Sie den Plasmagenerator. Leistung auf 70 W, Zeit auf 35 s, Druck auf 325 mTorr, Durchfluss des Sauerstoffgases auf 60 SCCM. Legen Sie PDMS und Elektrodenglasschieber mit den Funktionen nach oben in das System und führen Sie das Programm aus.
3. Entfernen Sie die Geräte und richten Sie die Kanalmerkmale mithilfe eines Stereoskops schnell an den Elektroden aus. Üben Sie festen Druck von der Mitte des PDMS zu den Seiten aus, um unerwünschte Luftblasen an der Klebeschnittstelle zu entfernen.
4. An einem heißen Ort bei 95 °C für mindestens 2 min aufbewahren, um den Klebevorgang abzuschließen, und das Gerät bei RT abkühlen lassen.
5. Schneiden Sie 2 Stück 22-G-Volldraht bei ~ 6 "Längen und entfernen Sie den Isolator von beiden Enden.
6. Verkleben Sie die Drähte mit silberleitfähigem Epoxidharz mit Elektrodenpads. Fertige Geräte über Nacht in einen 65 °C heißen Backofen stellen.

Abbildung 2: Herstellung von Mikrogeräten. (A) Mikrofluidische Kanalherstellung - Schlüsselschritte: Siliziumwaferreinigung (Schritte 2.1.1-2.1.3), Fotolackbeschichtung und weiches Backen (Schritte 2.1.7-2.1.8), UV-Exposition (Schritt 2.1.10), Entwicklung (Schritt 2.1.12) und PDMS-Gießen (Unterabschnitt 6.2). (B) Schlüsselschritte zur Elektrodenherstellung: Glasobjektträgerreinigung (Schritte 2.1.1-2.1.3), HMDS-Beschichtung und Fotolackbeschichtung (Schritte 2.2.3-2.2.4), UV-Exposition (Schritt 2.2.8), Entwicklung (Schritt 2.2.9), HF-Ätzen (Abschnitt 3), physikalische Gasphasenabscheidung (Abschnitt 4) und Fotolackabhebung (Abschnitt 5). (C) Schlüsselschritte zur Gerätefinalisierung: Zugang zum Einlass/Ausgang und Beschallung (Schritt 6.2.3 und Abschnitt 6.3), PDMS-Bonding und Drahtbefestigung (Abschnitt 7). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

8. Zellkultur und Ernte

HINWEIS: Standard-Zellkultur- und sterile Handhabungsverfahren sollten verwendet werden. Befolgen Sie das zelltypspezifische Protokoll für die Zellkultur.

1. Zellkultur
   1. Zellpassage: Kultur und Durchgang der Zellen nach den Schritten 8.1.2-8.1.5.
   2. Kultur von HEK293-Zellen in vollständiger DMEM-Lösung (88% DMEM, 10% hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum, 1% L-Glutamin, 1% Penicillin-Streptomycin) in einem T25-Kolben in einem Inkubator bei 37 °C, 95% O2, 5% CO2. Durchgangszellen planmäßig, wenn ~80% Konfluenz erreicht wird.
   3. Die Medien werden entweder mit einer Pipette oder einem Vakuumsystem abgesaugt und die Zellen in 0,25% Trypsin-EDTA (2 ml-T25-Kolben) für 2 min bei 37 °C inkubiert. Neutralisieren Sie Trypsin mit dem doppelten Volumen von Kulturmedien.
   4. Die Zellsuspension in ein 15 mL konisches Röhrchen geben und HEK293-Zellen bei 770 x g für 2 min zentrifugieren. Absaugen des Überstands entweder mit einer Pipette oder einem Vakuumsystem
   5. Resuspendieren Sie HEK293-Zellen in 1 ml vorgewärmtem DMEM.
   6. Zellplattierung: Beschichten Sie die Zellen nach den Schritten 8.1.7-8.1.8
   7. Die Zellen werden in einer Verdünnung von 10:1 bis 20:1 in einem T25-Kolben (5 ml DMEM) beschichtet, um die Kultur fortzusetzen.
   8. Die Zellen werden in einer Verdünnung von 5:1 bis 20:1 in einer 6-Well-Platte (2 ml DMEM pro Well) für Elektroporationsexperimente geerntet.
      HINWEIS: HEK293-Zellen wurden 24 Stunden vor Elektroporationsexperimenten plattiert, um ~70% Konfluenz bei der Zellernte zu erreichen (Unterabschnitt 8.3). Ein inkonsistenter Ernteplan kann zu Schwankungen in den Elektroporationsergebnissen führen.
2. Elektroporationspuffer
   1. Elektroporationspuffer vorbereiten
      HINWEIS: Einzelheiten zur Elektroporationspufferzubereitung⁸ finden Sie in Sherba et al. Die Pufferzusammensetzung betrug 285 mM Saccharose, 0,7 mM_MgCl2, 1 mM KCl, 10 mM HEPES, 3 mM NaOH (pH: 7,4; Osmolalität: 310 mOsm, Leitfähigkeit: 500 μS/cm). Elektroporationspuffer sollte steril formuliert und bei 4 °C für eine Haltbarkeit von ~1 Monat gelagert werden. Die Formulierung des Elektroporationspuffers sollte pro Zelltyp optimiert werden.
3. Zellernte und pDNA-Addition
   1. Führen Sie die gleichen Schritte wie bei der Zellpassage (8.1.2-8.1.4) aus.
   2. Waschen Sie die Zellen in sterilem 1x PBS, Transferzellsuspension in ein 15 ml konisches Röhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen bei 770 x g für 2 min.
   3. HEK293 Zellpellet im Elektroporationspuffer waschen und bei 770 x g 2 min zentrifugieren. Resuspendieren Sie die Zellen im Elektroporationspuffer bei ~ 5 Millionen Zellen / ml.
      HINWEIS: Die Zelldichte sollte pro Zelltyp optimiert werden.
   4. Fügen Sie pDNA, die für grün fluoreszierendes Protein (GFP) kodiert, zu einer Endkonzentration von 20 μg / ml hinzu. Mischen Sie vorsichtig die pDNA/Zell-Suspension und geben Sie die Suspension zum Experimentieren in eine 1-cc-Spritze.

9. Hardware/Versuchsaufbau

HINWEIS: Stellen Sie vor der Ernte von Zellen für Experimente sicher, dass der Versuchsaufbau abgeschlossen ist, um die Zeit zu minimieren, in der die Zellen im Elektroporationspuffer suspendiert sind. Schalten Sie die Elektronik 20-30 Minuten vor dem Aufwärmen ein. Abbildung 3 zeigt einen schematischen Aufbau des Versuchsaufbaus für den Betrieb des Einzelzellen-Detektionsmoduls.

HINWEIS: Eine speziell angefertigte PA90-Operationsverstärkerschaltung wurde entwickelt, um sowohl die Empfindlichkeit zu berücksichtigen, die für die Einzelzellen-Füllstandserkennung mit dem Lock-in-Verstärker erforderlich ist, als auch die hohen Spannungen, die erforderlich sind, um ausreichend starke Elektroporationsimpulse zu verwenden. Spezifikationen der empfohlenen Schaltung³⁹ finden Sie im PA90-Datenblatt.

1. Initialisieren Sie den Lock-in-Verstärker mit aktuellen Vorverstärkereinstellungen und stellen Sie ihn über den Algorithmus ein. Einzelheiten zu den Lock-in-Einstellungen³² finden Sie in Zheng et al.
2. Netzteile, Funktionsgenerator und Verstärker
   1. Stromversorgung 1: Stellen Sie auf -15 V ein, um das negative Ende des Stromkreises mit Strom zu versorgen.
   2. Stromversorgung 2 (Funktionsgenerator): Stellen Sie die Ausgabe des DC-Signals ein und stellen Sie die Amplitude auf 2 V ein.
   3. Programm Elektroporationsimpulsgenerator für die Rechteckwelle: Stellen Sie die gewünschte Pulsbreite (Tastverhältnis) und die gewünschte Pulsamplitude (Volt) ein.
   4. Stellen Sie den Ausgang auf den Triggermodus (1 Impuls). Verbinden Sie den Ausgang mit dem Eingang des 50x-Verstärkers.
      HINWEIS: Beachten Sie die 50-fache Verstärkung bei der Programmierung der Impulsamplitude. D.h. um eine elektrische Feldstärke von 1 kV/cm zu erreichen, sind insgesamt 30 V erforderlich, 30 V/300 μm (Abstand zwischen den Elektroden), daher sollte die Leistung des Funktionsgenerators auf 30/50 oder 600 mV eingestellt werden.
   5. Überprüfen Sie die Ausgänge des 50-fachen Verstärkers mit einem Oszilloskop. Ausgang 1-100 V aus Netzteil 2 (9.2.2). Ausgang 2-Variable Amplitude für den Elektroporationsimpuls (9.2.4).
   6. Schließen Sie eine 10x-Sonde an einen Oszilloskopkanal und an das fertige Mikrogerät (Device under Test, DUT) in Schritt 7.6 an, wo der Elektroporationsimpuls angelegt wird. Überwachen Sie das System während des Experimentierens, um sicherzustellen, dass Impulse angewendet werden.
   7. Stellen Sie sicher, dass der Lock-in-USB-Anschluss angeschlossen und registriert ist. Überprüfen Sie alle Lock-in-Einstellungen im Algorithmuscode (vor allem die Lock-in-Ausgangsfrequenz).
3. Mikroskop/CCD-Kamera
   1. Legen Sie das Mikrogerät über einen Objektträgerhalter auf den Tisch des Mikroskops. Schalten Sie die CCD-Kamera ein und bringen Sie den mikrofluidischen Kanal in den Fokus. Verwenden Sie ein 4x- oder 10x-Objektiv.

Abbildung 3: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus - Einzelzellenerkennung. Der Hochleistungs-Operationsverstärker (PA-90) ermöglicht die Überlagerung des Hochspannungs-Elektroporationsimpulses auf das Lock-in-Ausgangs-AC-Signal, das für die Einzelzellenerkennung erforderlich ist. Dieses Anregungssignal durchläuft das Mikroelektroporationsgerät (Device Under Test, DUT), wo der Strom dann durch den Stromvorverstärker verstärkt und in den Algorithmus eingespeist wird. Das System überwacht kontinuierlich das Zellerkennungsereignis. Beim Zelleintritt wird vom Lock-in-Verstärker ein digitales Signal erzeugt, um die Anwendung des Elektroporationsimpulses an die Zelle(n) während des Transports auszulösen. Legende: PA-90 (Hochleistungs-Operationsverstärker), DUT (Gerät unter Test), DIO (digitaler Ein-/Ausgang), FG-EP (Funktionsgenerator / Elektroporationsimpuls), 50X (50X Verstärker), PS-V- (Stromversorgung / negative Spannung für PA 90), FG-V+ (Funktionsgenerator, positive Spannung für PA 90). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

10. Versuchsbetrieb

1. Mikrofluidische Kanalgrundierung
   1. Entfernen Sie alle Luftblasen aus der zellbeladenen Spritze. Befestigen Sie eine 30 G Nadel an der zellbeladenen Spritze.
   2. Schieben Sie den Tygonschlauch mit einer Pinzette über die Länge der Nadel. Füllen Sie den Auslassbehälter mit Rückgewinnungsmedien vor (wie Schritt 8.1.2 ohne Antibiotika), ~40-50 μL.
   3. Üben Sie mit dem Daumen vorsichtigen Druck auf den Kolben aus, so dass die Flüssigkeit langsam das Ende der Schlauchleitung erreicht.
   4. Befestigen Sie die Spritze an der Spritzenpumpe. Schalten Sie die Spritzenpumpe ein und stellen Sie sicher, dass sie auf Durchblutung eingestellt ist.
   5. Programmieren Sie die Pumpe auf den richtigen Durchmesser der Spritze, um sicherzustellen, dass die Durchflussraten genau sind. Einzelheiten zu Spritzendurchmessern finden Sie im Pumpenhandbuch.
      HINWEIS: Um zu verhindern, dass sich Zellen in der Spritze absetzen, befestigen Sie die Spritzenpumpe auf einem Klemmständer so, dass sie in vertikaler Position mit dem Spritzenende nach unten arbeiten kann.
   6. Stellen Sie die Durchflussrate der Spritzenpumpe auf ~10-20 μL/min ein und lassen Sie die Pumpe laufen, bis die Flüssigkeit das Ende der Schlauchleitung erreicht. Befestigen Sie den Schlauch am mikrofluidischen Gerät.
   7. Senken Sie die Durchflussrate der Spritzenpumpe um ~ 5-10 μl / min und lassen Sie die Pumpe laufen, bis die gesamte Luft aus dem mikrofluidischen Gerät ausgestoßen ist und die Zellen zum Geräteauslass gelangen.
   8. Entfernen Sie die Zellen über die Pipettenaspiration aus dem Auslass. Füllen Sie den Auslassbehälter wieder mit Rückgewinnungsmedien (wie Schritt 8.1.2 ohne Antibiotika), ~40-50 μL.
2. Single-Cell-Elektroporationszell-Membran-Permeabilisierungs-Mapping
   HINWEIS: Siehe Abbildung 4 und Abbildung 5 für ein besseres Verständnis der elektrischen Daten, die auf die Permeabilisierung der Zellmembran und die Permeabilisierung der Zellmembran hinweisen.
   1. Stellen Sie die Durchflussrate der Spritzenpumpe auf ~0,1-0,3 μl/min ein, um einen Fluss einzelner Zellen durch den Elektrodensatz zu gewährleisten. Die Zelllaufzeit zwischen den Elektroden sollte ~250 ms betragen.
   2. Starten Sie das Computerprogramm, indem Sie auf Ausführen klicken. Stellen Sie sicher, dass das System die elektrischen Daten speichert.
   3. Stellen Sie sicher, dass das System Zellen zuverlässig erkennt, um die computergesteuerten Impulsanwendungen auszulösen. Passen Sie den Erkennungsschwellenwert entsprechend an.
   4. Stellen Sie die Pulsparameter für den anfänglichen, stromsparenden Elektroporationsimpuls mit niedrigster elektrischer Energie ein. In Tabelle 1 finden Sie die pulsierenden Parameter der Elektroporation in dieser Studie.
   5. Schalten Sie den Ausgangskanal für den Elektroporationsimpulsgenerator ein (Schritt 9.2.3.).
   6. Folgen Sie einer vorgegebenen Anzahl von Zelldetektions-/Impulsanwendungen (n = 100). Am Ende jedes getesteten Zustands saugen Sie die Zellen aus dem Mikrogeräteauslass ab und füllen Sie den Auslass mit Wiederherstellungsmedien auf.
   7. Iterieren Sie zur nächsten Elektroporationsimpulsbedingung. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Bedingungen des Elektroporationsimpulses getestet sind.
   8. Bestimmen Sie den Grad der Zellmembranpermeabilisierung für jede getestete Pulsanwendung. (Die Validierung nach dem Prozess wird in Unterabschnitt 11.1 beschrieben.) Generieren Sie die Permeabilisierungskarte der Zellmembran (Abbildung 5).
   9. Bestimmen Sie die Elektroporationspulsparameter für populationsbasiertes Feedback mit hohem Durchsatz.
   10. Schalten Sie die Spritzenpumpe aus, entfernen Sie Zellen aus dem Auslassbehälter und füllen Sie den Auslass mit Wiederherstellungsmedien auf.
3. Populationsbasierte, rückkopplungsgesteuerte Elektroporation – hoher Durchsatz
   HINWEIS: In Abbildung 6 finden Sie ein Schema, das den populationsbasierten Feedbackprozess veranschaulicht.
   1. Stellen Sie die Durchflussrate der Spritzenpumpe auf ~1-3 μL/min ein, um einen Fluss einzelner Zellen durch den Elektrodensatz zu gewährleisten. Die Zelllaufzeit zwischen den Elektroden sollte ~25 ms betragen.
   2. Stellen Sie die Impulsamplitude auf den "optimierten" Zustand (10.2.9) ein, schalten Sie den Triggermodus aus und stellen Sie die Pulsbreite an die Sendezeit der Zelle an.
   3. Stellen Sie das Tastverhältnis so ein, dass die Einschaltzeit des Impulses der "optimierten" Bedingung entspricht. Siehe Tabelle 1.
   4. Stellen Sie den Ausgabekanal-Funktionsgenerator auf ON, schalten Sie die Spritzenpumpe ein und lassen Sie das System laufen, bis die gewünschte Anzahl von Zellen elektroporiert wurde.
   5. Wenn Sie fertig sind, schalten Sie sowohl die Spritzenpumpe als auch den Funktionsgenerator aus.
   6. Die Zellen werden aus dem Auslassbehälter in den mit vorgewärmten Rückgewinnungsmedien gefüllten Zellkulturkolben/die Zellkulturplatte überführt und in den Inkubator überführt.

11. Analyse

1. Detektion der Membranpermeabilisierung auf Einzelzellebene
   HINWEIS: Um sicherzustellen, dass der "optimale" Impuls während des Hochdurchsatzmoduls verwendet wurde, sollte nach dem Versuch eine Analyse durchgeführt werden, um die aus Unterabschnitt 10.2 exportierten elektrischen Daten zu überprüfen. In Abbildung 4 finden Sie eine grafische Darstellung des elektrischen Signals, das für die Permeabilisierung der Membran durch Elektroporation repräsentativ ist.
   1. Laden Sie Daten in eine Analysesoftware (MATLAB, Python usw.). Generieren Sie für jede pulsierende Bedingung ein Diagramm von Strom und Zeit.
   2. Bestimmen Sie manuell den Grad der Permeabilisierung der Zellmembran (Δ I_P / ΔI_C). Siehe Abbildung 4. Generieren Sie die Permeabilisierungskarte der Zellmembran (Δ I_P / ΔI_C versus elektrische Energie, Abbildung 5) über alle getesteten Pulsbedingungen. Überprüfen Sie den "optimalen" pulsierenden Zustand.
2. Elektro-Transfektionseffizienz (eTE)
   1. Nach der 24-stündigen Inkubationszeit die elektropolierten Zellen aus dem Inkubator entfernen.
   2. Führen Sie eine lebende Zellfärbung durch. DRAQ5 wird 1:1000 im Zellkulturgefäß auf eine Endkonzentration von 5 μM verdünnt. Die Zellen/Färbelösung vorsichtig mischen und bei 37 °C 5-30 min inkubieren.
      HINWEIS: In diesem Schritt kann eine andere Färbung implementiert werden. Stellen Sie sicher, dass sich die fluoreszierenden Eigenschaften nicht mit dem Fluoreszenzmarker überlappen, der eine erfolgreiche Elektrotransfektion anzeigt (d. h. GFP ist in der grünen Wellenlänge und DRAQ5 ist die fernrote).
   3. Schalten Sie ein Epifluoreszenzmikroskop, eine Lampe und Kameras ein (siehe Materialtabelle).
   4. Entfernen Sie die Zellen aus dem Inkubator und bringen Sie sie auf dem Mikroskop in den Fokus.
   5. Nehmen Sie ein Phasenkontrastbild (Hellfeld) des ausgewählten Felds auf.
   6. Nehmen Sie epifluoreszierende Bilder desselben Feldes mit FITC (GFP) und Far-Red (DRAQ5) Filtern auf. Analysieren Sie die Bildsets manuell oder über einen Algorithmus.
      Hinweis: Repräsentative Bilder finden Sie in Abbildung 7 .
   7. Zählen Sie die Gesamtzahl der GFP-positiven Zellen in allen Bildern. Zählen Sie die Gesamtzahl der DRAQ5-gefärbten Zellen in allen Bildern. Berechnen Sie eTE (Verhältnis von GFP-positiven Zellen zu DRAQ5-gefärbten Zellen).

Abbildung 4 zeigt die Funktionsprinzipien hinter der Einzelzell-Membranpermeabilisierungsdetektion für eine einzelne Pulsamplitude. Nach Beginn des Elektroporationsexperiments bestimmt der Zelldetektionsalgorithmus eine optimale Schwelle für die Zelldetektion über ein punktweises, steigungsbasiertes Detektionsverfahren. Das System überwacht dann kontinuierlich (1) auf eine signifikante negative Änderung des gemessenen elektrischen Stroms, was auf den Eintritt einer Zelle hinweist. Dies ist auf die isolierende Natur der biologischen Zellmembran zurückzuführen, so dass, wenn die Zelle durch den Elektrodensatz geht, es zu einem sofortigen Anstieg der Impedanz kommt, was zu einer starken Abnahme des gemessenen Stroms führt, was eine konsistente Zelldetektion ermöglicht (2), die schließlich den Wechsel zur computergesteuerten Impulsanwendung (4) auslöst. Die isolierte Zelle verdrängt ein Elektrolytvolumen zwischen den Elektroden, was zu einem Stromabfall führt, der proportional zur Größe der Zelle ist. Diese Stromänderung wird als ΔI_C (3) bezeichnet. Unmittelbar nach der ΔI_C-Berechnung wird der vorbestimmte, elektrische Impuls (4) der Zelle während des Transports verabreicht. Dieser momentane Energiezustrom führt ein kurzes Sensorartefakt in das System ein (graue Box). Beim erneuten Einrasten auf das Signal, d.h. beim Umschalten zurück zur Zellüberwachung, (5) ist es offensichtlich, dass der Elektroporationsimpuls die Zellmembran permeabilisiert hat, da die Größe der Stromänderung aufgrund der Anwesenheit der Zelle zwischen dem Elektrodensatz beim Austritt abfällt (6). Der Unterschied in den beiden Stromabfällen aufgrund der Impedanzgröße der Zelle vor / nach der Anwendung des Elektroporationsimpulses wird als Permeabilisierungsstrom bezeichnet und als ΔI_P bezeichnet. Sobald die Zelle das Volumen zwischen den Elektroden verlässt, stabilisiert sich die Basislinie und das System kehrt in den Zellerkennungsmodus zurück (1). Nachdem eine vorgegebene Anzahl von Zellen elektroporiert wurde, wird der nächstenergiereiche Elektroporationsimpuls getestet (Pulseinstellungen siehe Tabelle 1). Für jeden getesteten Elektroporationsimpuls wird ein mittlerer "Grad der Membranpermeabilisierung" bestimmt. Dieser Wert wird als Δ I_P/ΔI_C berechnet. Sobald jeder vorgegebene Elektroporationsimpuls getestet wurde, wird der Δ I_P / ΔI_C gegen die angelegte elektrische Energiedichte (σ x E ² x t) aufgetragen, wobei σ die Leitfähigkeit der Lösung (S / cm), E die elektrische Feldstärke (kV _/ cm) und t die Pulsdauer (ms) ist. In Abbildung 5 finden Sie die Permeabilisierungskarte der Zellmembran für HEK293-Zellen, die in diesem Beispiel verwendet werden.

Tabelle 1: Parameter des Elektroporationsimpulses. Für diese Studie wurden Elektroporationsimpulse so gewählt, dass der Ladungsfluss (σ×E×t) konstant bleibt, wobei σ die Lösungsleitfähigkeit (S/cm), E die elektrische Feldstärke (kV/cm) und t die Pulsdauer (ms) ist. Das Ergebnis ist ein Spektrum der angelegten elektrischen Pulsenergie. Beispiele für das erforderliche Tastverhältnis (Gleichstrom) zum Erreichen der spezifizierten Impulsparameter werden sowohl für eine Erhöhung der anfänglichen Durchflussrate (Einzelzellenerkennung) um 5× als auch um 10× bereitgestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Abbildung 4: Einzelzellmembranpermeabilisierung - Algorithmusbetrieb. (Seitenanfang) Elektrische Aufzeichnung einer Reihe von Einzelzelldetektionen / Impulsanwendungen (angezeigt durch die scharfen Stromspitzen). (Unten) Systembetrieb zur Detektion und zum Pulsieren einer einzelnen Zelle. (1) Das System erfasst kontinuierlich eine Änderung des Stroms über eine Punkt-für-Punkt-Steigungsberechnung. (2) Es wird eine starke Abnahme der Steigung festgestellt, die auf den Eintritt einer Zelle zwischen den Elektroden hinweist und die computergesteuerte Impulsanwendung auslöst. (3) Ein Stromabfall (ΔI_C) wird bestimmt und ist proportional zur Größe der Zelle. (4) Der Elektroporationsimpuls wird während des Transports an die Zelle angelegt, wodurch ein Sensorartefakt im elektrischen Signal verursacht wird (graue Box). (5) Der Lock-in-Verstärker schaltet zurück zur Zellenüberwachung, wenn er während der Übertragung wieder in die Zelle einrastet. (6) Die Zelle verlässt den Elektrodensatz und verursacht eine weitere, kleinere Stromspitze (Δ I_C > (I ₆ - I₅)). Der Unterschied in den Impedanzmessungen ist auf die Porenbildung durch die isolierte Zellmembran zurückzuführen. Diese Stromänderung wird als Permeabilisierungsstrom (ΔI_P) bezeichnet. Der Grad der Zellmembranpermeabilisierung wird berechnet (Δ I_P/ΔI_C). Die Baseline stabilisiert sich und das System kehrt in den Erkennungsmodus zurück (1). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Es wird eine deutliche Korrelation zwischen der angelegten elektrischen Energie und dem Grad der Permeabilisierung der Zellmembran beobachtet (Abbildung 5), wobei eine Übergangsregion vorhanden ist, in der ein erheblicher Anstieg des Permeabilisierungsgrades der Zellmembran auftritt. Dazu wird ein Impuls mit elektrischer Energie ausgewählt, der diesen Übergangsbereich überschreitet, für die Hochdurchsatzphase des Mikroelektroporationsprozesses (Abbildung 6). In diesem Experiment wurde der Puls 1,8 kV/cm:670 μs als "optimal" bestimmt. Wie in Unterabschnitt 10.3 des Protokolls ausführlich beschrieben, wird der Systemdurchfluss erhöht und der Funktionsstromgenerator so eingestellt, dass kontinuierlich ein Impuls mit einem eingestellten Impuls und Tastverhältnis ausgegeben wird (siehe Tabelle 1 für Impulseinstellungen für Durchflussraten von 1,5 μL/min und 3,0 μL/min), um sicherzustellen, dass 1 Impuls an jede Zelle während des Transports angelegt wird. In dieser Studie wurde die Durchflussrate um das 5-fache erhöht, so dass die Pulsbreite auf 50 ms (entsprechend der Zelllaufzeit) bei einem Tastverhältnis (DC) von 2,7% eingestellt wurde.

Abbildung 5: HEK293 Zellmembran-Permeabilisierungskartierung -Δ I_p/ ΔI_c versus elektrische Energie. Die elektrischen Daten (Δ I_P/ ΔI_C) werden als Mittelwert ± REM dargestellt. Pulsbedingungen (von links nach rechts)- 0,4 kV/cm : 3 ms, 0,8 kV/cm : 1,5 ms, 1,0 kV/cm : 1,2 ms, 1,2 kV/cm : 1 ms, 1,8 kV/cm : 0,67 ms, 2,4 kV_/cm : 0,5 ms. Es wird eine klare Korrelation zwischen dem Grad der Permeabilisierung der Zellmembran und der elektrischen Energiedichte des angelegten Pulses beobachtet. Für diese Versuchsrunde wurde die pulsierende Bedingung 1,8 kV/cm: 0,67 ms als "optimaler" Elektroporationsimpuls für das Hochdurchsatzmodul ausgewählt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 6: Zellpopulationsbasierter rückkopplungsgesteuerter Elektroporationsprozess-Workflow. Zu Beginn wird eine anfängliche Durchflussrate (Q₀) programmiert, um eine elektrische Abfrage auf Einzelzellenebene zu ermöglichen. Eine programmierbare Anzahl von Zellen wird bei jedem vorgegebenen Elektroporationspuls gepulst (E 0/t₀ bis E N/t_N), wobei die angewandte elektrische Energie mit jeder Iteration von Elektroporationspulsanwendungen zunimmt. Nach Abschluss des höchsten in der Studie enthaltenen elektrischen Energieimpulses, E N/t_N, wird die Permeabilisierungskurve der Zellmembran aufgetragen und der optimale Elektroporationspuls für die zu testende Zellpopulation bestimmt. Das System wechselt in den Hochdurchsatzmodus, bei dem die Durchflussrate auf_Q-Durchsatz erhöht wird und die geschwindigkeitsbegrenzenden Einzelzellenabfrageschritte entfallen. Die optimale Pulsfolge wird kontinuierlich E opt / t opt bei d.c.opt angewendet, so dass jede Zelle im Transit einen einzelnen Elektroporationsimpuls basierend auf der Zelllaufzeit und dem Pulsweiten-Tastverhältnis (d.c.) erhält. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Nach 24 Stunden Erholung nach der Elektroporation wurden die Zellen abgebildet, um die Elektrotransfektionseffizienz (eTE) zu bestimmen. Wie in Unterabschnitt 11.2 des Protokolls beschrieben, wurde die eTE als Gesamtzahl der Zellen bestimmt, die GFP exprimieren, normalisiert auf die Gesamtzahl der mit DRAQ5 gefärbten Zellen. Der eTE für den 1,8 kV/cm : 670 μs Puls wurde mit ~70% bestimmt (Abbildung 7A). Um die Bedeutung des Systems zur genauen Abbildung des Permeabilisierungsgrades der Zellmembran und zur Auswahl einer ausreichend hohen Elektroporationspulsenergie beim Übergang in den Hochdurchsatzmodus hervorzuheben, wurde auch die 0,4 kV/cm: 3 ms Pulsbedingung in Bezug auf eTE untersucht (Abbildung 7B). In diesem Fall betrug der resultierende eTE nach 24 Stunden weniger als 5%.

Abbildung 7: Elektro-Transfektionseffizienz-GFP-Expression bei 24 h. HEK293-Zellen wurden nach Mikroelektroporationsexperimenten 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Alle Zellen wurden mit DRAQ5 (rot) gefärbt, und die Elektrotransfektionseffizienz (eTE) wurde basierend auf dem Verhältnis von Zellen, die GFP exprimieren (grün), zur Gesamtzellzahl (rot) bestimmt. Die Zelllebensfähigkeit wurde in dieser Studie nicht als Ergebnismetrik bewertet. (A) Repräsentatives, gestapeltes 4×Fluoreszenzbild von HEK293-Zellen, das erfolgreich über einen 1,8 kV/cm: 670 μs-Puls transfiziert wurde, der einen eTE von ca. 70% zeigt. (B) Repräsentatives, gestapeltes 4×Fluoreszenzbild von HEK293-Zellen, die erfolglos über einen 0,4 kV/cm : 3 ms Puls transfiziert wurden, der eTE << 5% zeigt. Maßstabsleiste: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: 2-dimensionales CAD-Schema. Das Mikroelektroporationsgerät besteht aus einem geraden, 100 μm breiten Mikrokanal mit einem Einlass von 1 mm Durchmesser und einem Auslass mit einem Durchmesser von 3 mm. Jede Elektrodenspur ist 100 μm breit und der Elektrodensatz umfasst den Elektroporationsbereich des Geräts, der 300 μm lang ist. Die 3-dimensionale Höhe des Mikrokanals wird durch die Dicke des Fotolacks gesteuert. Bei dieser Arbeit betrug die Höhe des Gerätes 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Die in diesem Protokoll vorgestellte Methodik konzentriert sich in erster Linie auf die Mikrofabrikation eines mikrofluidischen Geräts, das dann in einen speziellen Elektroporationsversuchsaufbau integriert wird. Der Begriff "Rezept", der häufig zur Beschreibung der Besonderheiten des Mikrofabrikationsprozesses verwendet wird, deutet darauf hin, wie wichtig es ist, jeden Schritt zu befolgen / zu optimieren, um ein funktionierendes Gerät erfolgreich herzustellen. Bestimmte kritische Schritte innerhalb des Prozesses, wenn sie nicht optimiert werden, wie UV-Expositionszeit / -energie, PVD-Sputterraten / -dauern und Sauerstoffplasmageneratoreinstellungen, können jedoch sowohl für den Herstellungsprozess als auch für die erfolgreiche Durchführung der Elektroporationsexperimente problematisch sein. Die Fehlerbehebung des Herstellungsprozesses erfolgt in erster Linie durch Versuch und Irrtum oder ein kontrollierteres experimentelles Design der Versuchsplanung. Darüber hinaus gibt es alternative Mikrofabrikationstechniken wie Deep Reactive Ion Etching (DRIE), die ersetzt werden können, um die verschiedenen Schritte innerhalb des Protokolls durchzuführen (dh Verwendung einer DRIE-geätzten Formstruktur zur Durchführung des weichen Lithographieprozesses). Darüber hinaus kann die Optimierung von Rezepturen und das Entwerfen / Herstellen von Geräten für Anfänger auf diesem Gebiet zeitaufwendig sein. Sobald der Mikrofabrikationsprozess jedoch erfolgreich entwickelt wurde, hat der Ingenieur / Wissenschaftler die Freiheit, ein Gerät zu entwerfen, das für seine spezifischen Bedürfnisse geeignet ist.

Zu diesem Zweck wurde die in diesem Protokoll beschriebene Vorrichtung entwickelt, um unsere frühere Arbeit³² zu erweitern. Dies beinhaltete die Verwendung der elektrischen Detektion der Einzelzellen-Membranpermeabilisierung, jedoch mit höherem Durchsatz. Der darin beschriebene Versuchsaufbau erfordert die Notwendigkeit einer speziellen Ausrüstung, d. H. Lock-in-Verstärker, die für das Standardforschungslabor ungewöhnlich sein kann und somit die potenzielle Reichweite und Anpassungsfähigkeit dieser Technik einschränkt. Ein mikrofluidisches Elektroporationsgerät mit "nackten Knochen" kann jedoch nach diesem Protokoll implementiert werden, das nur einen Funktionsgenerator und möglicherweise einen Spannungsverstärker zur Erzeugung der Elektroporationsimpulse benötigt.

Dennoch unterscheidet sich diese Mikroelektroporationsplattform von anderen einzelligen Elektroporationstechnologien. Die Fähigkeit, Elektroporationsparameter an einer Einzelzellsuspension in einer kontinuierlichen Strömungsumgebung sowohl elektrisch zu erfassen als auch zu optimieren, ist wirklich innovativ. Zukünftige Arbeiten umfassen die Optimierung der anderen wichtigen experimentellen Parameter im Zusammenhang mit erfolgreichen Elektroporationsergebnissen (siehe Abbildung 1), um die Gesamteffektivität dieser Plattform weiter zu verbessern. Zusätzliche Machbarkeits- und Stoffwechselassays werden entwickelt und implementiert, um mögliche negative Downstream-Effekte im Zusammenhang mit der Mikroelektroporationsplattform zu bewerten. Darüber hinaus kann das mikrofluidische Design weiter verbessert werden, um einen höheren zellulären Durchsatz zu erreichen, wie andere Gruppen⁴⁰ gezeigt haben. Wenn diese Bedenken ausgeräumt werden, hat diese Technologie das Potenzial, in den Herstellungsprozess der Zelltherapie übernommen zu werden, um Gentransport und / oder Genbearbeitung durchzuführen, da diese Methodik sowohl für einen geschlossenen als auch für einen automatisierten Prozess sehr gut zugänglich ist.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Autoren danken der National Science Foundation (NSF CBET 0967598, DBI IDBR 1353918) und der Graduate Training in Emerging Areas of Precision and Personalized Medicine (P200A150131) des US-Bildungsministeriums für die Finanzierung des Doktoranden J.J.S. auf Stipendium.