말라와 자극된 방출 소모 (호텔 위치) 현미경을 사용 하 여 B 세포 면역 냅에 Microtubule Cytoskeletons 시각화

Coverslips B 세포 수용 체에 항 체, 초기 단계에 대 한 모델 코팅에 확산 하는 B 세포에서 동시에 이미지 걸 구조, microtubules, 및 microtubule 플러스-엔드 바인딩 단백질에 호텔 위치 현미경 검사 법을 사용 하기 위한 프로토콜 소개 면역 시 냅 스 형성.

막 도약 항 원 (예, 항 원 제시 세포의 표면에)에 바인딩되는 B 세포 면역 시 냅 스, B 세포 수용 체 (BCR) 신호 최적화 전문된 세포 구조 및 BCR 중재 항 원 수집을 형성 한다. 모두 말라 골격 및 항 원 연락처 사이트 향해 microtubule 네트워크의 재교육의 개장 면역 시 냅 스 형성에 필수적입니다. F-말라의 조밀한 주변 반지로 걸 골격의 개장 면역 시 냅 스는 microtubule 조직 센터의 양극 화 현상이 동반 된다. 대뇌 피 질의 플러스-엔드 캡처 단백질 뿐만 아니라 microtubule 플러스-엔드 바인딩 단백질, 조정 방식으로 재구성 하는 말라와 microtubule cytoskeletons 간의 실제 상호 작용을 중재. 이러한 cytoskeletal 구조 이해 뿐만 아니라이 cytoskeletal 개편 모양 면역 시 냅 스 대형과 BCR 신호, 제어 B 세포 활성화에 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다 메커니즘 elucidating 이것은 cytoskeletal 네트워크의 새로운 세부 공개 슈퍼 해상도 현미경 방식의 개발에 의해 주 었 되었습니다. 여기 B 셀에 동시에 이미지 걸 구조, microtubules, transfected GFP 태그 microtubule 플러스-엔드 바인딩 단백질을 자극된 방출 소모 (호텔 위치) 현미경을 사용 하는 방법을 설명 합니다. 면역 시 냅 스 형성에서 초기 이벤트를, 우리는 반대로 면역 글로불린 (안티-Ig) 항 체, BCR 신호 및 골격 개장을 시작으로 coverslips에 B 세포 허용. 우리 A20 B-림프 종 세포에서 GFP 융해 단백질을 표현 하기 위한, 안티 Ig 유도 세포 확산 및 후속 셀 고정, Immunostaining, 이미지 수집 및 이미지 deconvolution 단계 단계별 프로토콜을 제공 합니다. 이 절차를 사용 하 여 얻은 고해상도 이미지 하나 동시에 말라 구조, microtubules, 및 이러한 두 개의 cytoskeletal 네트워크를 연결할 수 있습니다 microtubule 플러스-엔드 바인딩 단백질을 시각화 수 있습니다.

B 세포 바인딩할 때 편광 항의 배열 (예, 항 원 제시의 표면에 표시 세포 (Apc)), 결과 B 세포 수용 체 (BCR) 신호 드라이브에 설명 된 처음 고전 면역 시 냅 스 구조 형성 T 세포^{1,2,3,,45,6,7,8,9,10, 11,,1213}. 처음에, B 세포: APC의 주변에서 항 원 바인딩 BCRs 폼의 microclusters 사이트 문의. 이 microclusters는 다음 항 원 연락처 사이트, 그들은 면역 시 냅 스의 핵심을 형성 하는 중앙 supramolecular 활성화 클러스터 (cSMAC)으로 합체의 중심을 향해 이동 합니다. 면역 시 냅 스 형성 BCR 신호 최적화 하 고 APC 막¹⁴BCR 중재 항 원 추출 용이 하 게 한다. BCR 중재 항 원 국제화 및 후속 항 원 처리 뒤,이 항 원 인수, 펩 티 드: MHC II 단지 T 세포 및 T 세포 도움¹⁴유도 B 세포 수 있습니다. 면역 시 냅 스 형성이 기능 패턴 수용 체 조직의 새로운 제공할 수 있는 설정 하는 메커니즘을 elucidating B 세포 활성화를 촉진 하기 때문에 어떻게 체액 면역 반응에 시작 하 고 통제.

말라와 microtubule cytoskeletons의 개편은 면역 시 냅 스 형성에 필수적입니다. 지역화 된 BCR 공간 편광 항 배열에 의해 자극 신호 급속 하 고 극적인 걸 골격^1,15의 리 모델링을 유도 합니다. B 세포의 주변에서 수지상 말라 구조의 형성 원형질 막에 추진 세력을 미치는 및 B 세포 확산을 촉진. 이 B 세포 항 원-베어링 표면의 큰 영역을 스캔을 허용 하 고는 항 원 바인딩 및 활성화 경로 신호 BCR BCRs의 수를 증가. 같은 시간에는 MTOC 및 microtubule 네트워크 항 원 접촉의 사이트 쪽으로 방향도 있습니다. MTOC 항 원 연락처 사이트 접근, B 세포 및 항 원-베어링 표면^16,17사이의 인터페이스에서 원형질 막의 내부 얼굴 따라는 MTOC에서 유출 하는 microtubules 확장. 이러한 juxtamembrane microtubules 다음 항 원 바인딩 BCR microclusters¹⁸, 선도 cSMAC의 대형에 다 중재 구심 운동에 대 한 트랙으로 작동할 수 있습니다.

재교육 및 면역 시 냅 스를 향해 MTOC의 분극 그대로 말라와 microtubule cytoskeletons를 요구 하 고 종종 피 질 말라 네트워크 및 microtubules^{16,17, 사이 상호 작용에 따라 달라 집니다. 19,20}. IQGAP1, 같은 대뇌 피 질의 말라-바인딩 단백질²¹microtubule 플러스 끝 장식 하는 단백질 복합물 상호 작용에 의해 microtubules를 캡처할 수 있습니다. 플러스-엔드 바인딩 단백질의이 동적 단지 등이 EB1 클립-170, microtubule로 플러스-엔드 단백질 (+ 팁) 추적^21,22이라고 통칭 되는 있습니다. + 팁 microtubules의 끝에는 원형질 막 또는 피 질 말라 골격에 연관 된 단백질에 바인딩할 수 있습니다. 힘 생성 메커니즘 수 있습니다 (예를 들어, 빼기-엔드 감독 microtubules 따라 cortically 고정 다의 움직임) microtubules에 당기 힘을 발휘 하는 MTOC 함으로써 위치. 클립-170 말라 관련 비 계 단백질 IQGAP1²³, 바인딩할 수 있는 그리고 우리가 이러한 단백질의 모두 면역 시 냅 스¹⁷향해 MTOC BCR 유도 분극에 필요한 것으로 나타났습니다. 이 IQGAP1-클립-170 상호 작용 B 세포 면역 시 냅 스에 microtubule 네트워크의 재배치로 말라 골격의 개장 조정에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다.

기존의 형광 현미경 검사 법 B 세포 면역 시 냅 스 형성²동안 말라와 microtubule cytoskeletons의 극적인 개편을 발표 했다. 그러나,이 방법은 자세히는, Abbe의 법, 샘플 및 객관적인²⁴의 조리개를 밝게 하는 데 사용 하는 빛의 파장에 따라 빛의 회절 한계 때문에 작은 세포 구조를 해결할 수 없습니다. 이 회절 제한 200-300 nm 측면 방향에서 및 축 방향²⁵에서 500-700 nm에 기존의 가벼운 현미경의 해상도 제한합니다. 따라서, 말라와 microtubule cytoskeletons의 정밀한 세부 사항 뿐 아니라 작은 subcellular 구조만 관찰 될 수 있었다 전자 현미경을 사용 하 여. 골격의 전자 현미경 영상 시간이 소요, 가혹한 샘플 고정 및 준비 프로토콜 생물학 구조를 변경할 수 있습니다 하 고 중재 하는 항 체 탐지에 제한 됩니다 필요 합니다. Immunostain 하 고 동시에 이미지 여러 단백질 또는 세포질 구조는 형광 현미경 검사 법의 상당한 장점. 또한, 실시간 이미징 수 있도록 셀에 형광 성 융해 단백질을 표현 그리고 immunostaining 관심사의 단백질에 대 한 효과적인 항 체 사용할 수 없을 때 유용.

슈퍼 해상도 현미경에 최근의 기술 진보 빛의 회절 한계를 극복 하 고 나노 세포 구조²⁴의 시각화를 허용. 같은 1 개의 슈퍼 해상도 현미경 검사 법 기술은 자극된 방출 소모 (호텔 위치) 현미경을 이라고 합니다. 호텔 위치는 두 레이저, 어디 한 레이저 fluorophore는 흥분 하 고 도넛 모양의 패턴으로 두 번째 레이저는 선택적으로 주위에 fluorophore 형광 방출 억제를 사용 합니다. 이 단 하나 형광 입자의 포인트 확산 기능 (명백한 지역)을 감소 하 고 하위 회절 제한 형광 이미지^25,26를 제공 한다. 바닥 상태 고갈 현미경 또한 슈퍼 해상도 이미지 형광 기반 기술을 사용 합니다. 그러나, 이미지 수집 및 재구성 시간 긴, 거기만 제한 된 수의 사용할 수 있는 fluorophores 고 여러 cytoskeletal 컴포넌트의 동시 고해상도 이미징은 유지 하기 때문에 기술적으로 도전 말라와 microtubule 구조는 다른 고정 절차를 요구 한다. 따라서, 호텔 위치는 전자 현미경에 비해 여러 장점 및 다른 슈퍼 해상도 현미경에 그로 제공 하는 빠른 이미지 수집, 최소한의 후 처리 요구 사항, 같은 fluorophores 및 얼룩 기법을 사용 하 여 접근 그 고정된 샘플²⁶의 전통적인 형광 현미경 검사 법 사용 됩니다.

슈퍼 해상도 현미경 지금 자연적인 살인자 (NK) 세포 및 T 세포^{26,,2728,29,30,} 면역 시 냅 스에서 말라 구조를 시각화 하는 데 사용 되었습니다. ^{그러나 31}., microtubule 골격의 슈퍼 해상도 영상 뿐만 아니라 면역 시 냅 스 형성, 동안 말라와 microtubule cytoskeletons의 조정된 개편 최근 되었습니다 보고¹⁷. 우리는 coverslips (안티-Ig) 반대로 면역 글로불린 항 체, BCR 신호 자극 하 고 골격 개편을 시작으로 허용 했다 이미지 B 셀에 호텔 위치 현미경을 사용 합니다. 고정된 안티-Ig 항 체에 도금 할 때 B 세포 받을 극적인 걸 종속 확산, 어떤 면역 시 냅 스 형성 동안 초기 이벤트를이. 중요 한 것은, 호텔 위치 현미경 검사 법 공개 하는 면역의 주변에 양식 냅 뿐만 아니라 그것에 연결 하는 microtubules MTOC, 항 원 연락처 사이트¹⁷가까이 이동 했다 보여주었다 F 걸의 수지상 링의 세밀. 이러한 microtubules F 걸의 주변 링 쪽으로 밖으로 확장. 또한, F 걸, tubulin, IQGAP1, 그리고 GFP 태그 클립-170 + 팁의 다양 한 조합의 멀티 컬러 호텔 위치 이미징 나타났다는 microtubule 플러스-끝 클립-170-GFP에 의해 표시 주변 말라 채널와 IQGAP1, 밀접 하 게 관련 된 대뇌 피 질의 캡처 단백질¹⁷.

여기, 우리는 호텔 위치 현미경을 사용 하 여 면역 시 냅 스에서 말라와 microtubule cytoskeletons 이미징에 대 한 상세한 프로토콜을 제시. 이러한 방법은 널리 BCR 신호 및 면역 시 냅 스 형성^{17,,3233,,3435} 공부에 대 한 고용 된 A20 murine B 세포 라인을 사용 하 여 최적화 된 ^{, 36 , 37 , 38 , 39}. 클립-170에 상업 항 체 이전 실험에서 immunostaining를 위해 잘 작동 하지 않았다, 왜냐하면 우리가 자세하게에서 설명 GFP 태그 클립-170까지 동시에 시각화에 대 한 프로토콜을 얼룩이 지 함께 A20 셀에서의 표현 3 cytoskeletal 구성 요소 또는 골격 관련 단백질입니다. NK 세포 면역 시 냅 스에서 이미지 걸을 호텔 위치 현미경을 사용 하는 방법 되었습니다⁴⁰위에서 설명한. 여기, 우리는 B 세포에서 말라와 microtubule cytoskeletons의 멀티 컬러 슈퍼 해상도 이미지 획득을이 확장.

슈퍼 해상도 현미경에 대 한 중요 한 고려 세포 구조를 유지 하 고 형광 단백질에 손상을 방지에 대 한 적절 한 고정 절차를 사용 하는. 고정 하 고 여기에 소개 하는 방법 얼룩 GFP 형광을 유지 하 고 말라와 microtubule 네트워크의 고해상도 이미지 제공에 최적화 되었습니다. 형광 단백질을 표현 하는 때 B 세포는 보통 transfect 어렵다 주목 해야한다. 이 프로토콜, 20-50%를 사용 하 여 A20의 세포는 일반적으로 transfected GFP 융해 단백질 표현 되며이 인구 중 단백질 표정 수준 변수. 그럼에도 불구 하 고, 말라와 우리 설명 하는 절차를 사용 하 여 microtubules의 슈퍼 해상도 이미징 매우 강력한 이며 높은 품질 이미지 쉽게 얻을 수 있습니다. A20 셀 기준으로 그들의 작은 크기에도 불구 하 고 우리는 이러한 절차 또한 microtubule 네트워크 짧게 lipopolysaccharide (LPS)와 활성화 된 기본 B 셀에 이미지를 사용할 수 있습니다 보여줍니다. 우리가 (즉, 같은 단백질 소모 immunoblotting에 의해 검출 될 수 있다), 상대적으로 높은 효율에서 siRNAs와 LPS 활성화 기본 B 세포를 페 수 것으로 나타났습니다 일부 연구에 대 한 B 세포의 사용에 대 한 좋은 대안 들을 만들고 ¹⁷.

모든 동물 절차는 브리티시 컬럼비아 동물 관리 위원회의 대학에 의해 승인 되었다.

1. A20 B-림프 종 세포에서 GFP 융해 단백질을 표현

1. 문화 A20 셀 5 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 RPMI 매체 (RPMI-1640와 10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 50 µ M 2-mercaptoethanol, 글루타민 2 mM, 1 mM pyruvate, 50 U/mL 페니실린, 50 µ g/mL 스 보충) 완료 % CO₂.
2. Transfection 시 약 준비 ( 재료의 표참조) 제조업체의 지침에 따라.
   참고:이 프로토콜 특정 시 약에 대 한 최적화 된 및 transfection 프로토콜에서 설명 자료 테이블. 우리는 시도 하는 다른 transfection 시 약 충분 한 transfection 효율 굴복 하지는.
3. hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 분리기 2.5 x 10⁶ A20 셀 (각 transfection) 525 x g.에서 5 분 동안 Resuspend transfection 시 약 포함 하는 플라스 미드 DNA의 1-2.5 µ g의 100 µ L에 셀. DNA 클립-170-GFP²³인코딩, transfection 당 2.5 µ g 사용 하 여. 부드럽게 혼합.
4. 6 잘 플레이트의 셀 전송 고 미리 예 열 완료 RPMI 매체 2 mL를 볼륨을 조정 합니다. 단백질 표정 있도록 37 ° C에 18 h에 대 한 셀을 문화.

2. 기본 마우스 B 세포를 분리 하 고 LPS로 활성화

1. 멸 균된 수술 도구를 사용 하 여 프로토콜 기관의 동물 관리 위원회에 의해 승인에 따라, 마우스에서 비장을 제거.
2. 조직 문화 후드에서 실내 온도 살 균 PBS의 3 mL를 포함 하는 35 m m 조직 문화 접시에 멸 균 70 µ m 셀 여과기를 놓습니다. 5 ml 주사기에서 플런저의 고무 부분을 사용 하 여 셀 스 트레이너를 통해 비장 호감.
3. 피펫으로 멸 균 15 mL 튜브와 5 분 525 x g에서 원심 분리기로 splenoctyes의 단일 세포 현 탁 액.
4. 마그네틱 비드 기반 B 세포 격리 키트 ( 재료의 표참조) B 세포의 매우 풍부한 인구를 사용 합니다.
5. B 세포 2.5 µ g/mL LPS 플러스 5 ng/mL B 세포 활성화 요인 (BAFF, 생존 cytokine) 보완 하는 완전 한 RPMI 매체에 3 x 10⁶/mL resuspend
6. 37 ° c.에 6 시간에 대 한 셀 문화

3. 코팅 유리 Coverslips 안티 Ig 항 체와

1. 코팅은 coverslips 항 체 솔루션을 준비 합니다. 12.5 µ g/mL 솔루션; 실 온 살 균 PBS에 염소 반대로 마우스 Ig 항 체의 재고 솔루션을 희석 항 체 해결책의 400 µ L가 각 coverslip 필요 합니다.
   참고: 사용 하 여 염소 반대로 마우스 IgG A20 셀; 염소 반대로 마우스 IgM를 사용 하 여 기본 B 세포에 대 한. 염소 IgG 항 체 할 하지 바인딩할 잘 마우스 Fc 수용 체. 그러나, 어떤 잠재적인 Fc 수용 체 바인딩을 피하기 위해, 하나 반대로 마우스 IgG의 F(ab) 또는 F(ab')₂ 조각 또는 반대로 마우스 IgM 항 체를 사용할 수 있습니다.
2. 100% 메탄올에서 #1.5 18 m m 둥근 유리 coverslip 찍어 하 고 완전히 말리 (~ 10 분).
3. 집게를 사용 하 여 넣으십시오 말린된 coverslip는 12 음 조직 문화 접시와 피펫으로 400 µ L는 coverslip에 12.5 µ g/mL 항 체 솔루션 (5 µ g 총, 2 µ g/c m²)의 coverslip의 중심에 거품을 형성 하 고 가장자리에 확산 되도록.
4. 커버 전체 coverslip 조심 하지만 항 체 솔루션 조직 문화 플라스틱에 유리 coverslip 가장자리 확장을 허용 하지 마십시오. 30 분 동안 실 온에서 품 어.
5. 솔루션에 밖으로 잘 그리고 연속적으로 발음으로 coverslips pipetting 1 mL의 멸 균 PBS에 의해 세척. 언바운드 항 체를 제거를 두 번 더 반복 합니다.
6. 잘 포함 된 항 체-코팅 coverslip 셀 추가 될 준비가 될 때까지 무 균 PBS의 1 mL를 추가 합니다.
   참고: 있는 coverslips 덮여 PBS, 같은 날에 사용 하기 위해 상 온에서 보관할 수 있습니다.

4. B 셀 안티 Ig 코팅 Coverslips에 확산

1. 준비 HEPES 버퍼링 수정 염 분 (mHBS): 25mm HEPES, pH 7.2, 125 mM NaCl, KCl, 1mm CaCl₂5mm, 1mm 나₂HPO₄, 0.5 m m MgSO₄, 1 mg/mL 포도 당, 2 mM 글루타민, 1mm 나트륨 pyruvate 그리고 50 µ M 2-mercaptoethanol). 필터가이 솔루션 소독 및 4 ° c.에 저장
2. 실험 당일 확인 2% mHBS 50 mL 50 mL mHBS에 열 비활성화 FBS의 1 mL을 추가 하 여 FBS (mHBS FBS). 사용 하기 전에 37 ° C에 mHBS FBS 따뜻한.
3. 원심 transfected A20 셀 또는 5 분 525 x g에 BAFF 플러스 LPS 경작 했다 기본 B 세포.
4. Resuspend mHBS FBS의 1 mL에 셀, hemocytometer를 사용 하 여 셀 그리고 2 x 10⁵ 셀/ml mHBS FBS에 셀을 희석.
5. 집게를 사용 하 여 조직 배양 접시에서 파라핀 영화의 조각에는 coverslip 전송.
6. 각 coverslip에 B 세포 (5 x 10⁴ 의 세포)의 250 µ L를 추가 합니다.
7. 안티 IgG-입히는 표면에 걸쳐 B 세포 수 있도록 어둠 속에서 15 분 동안 37 ° C에서 coverslips를 품 어.

5. 고정 및 Immunostaining 셀

1. 16 %paraformaldehyde 재고 솔루션을 diluting 하 여 고정 솔루션 및 3 %paraformaldehyde 및 0.1% 글의 최종 농도를 실 온 소 주 물에 50%도 재고 솔루션을 준비 합니다. 사용 하 고 초과 삭제 하는 날에 고정 솔루션을 준비 합니다.
   주의: paraformaldehyde도 재고 솔루션 화학 증기 두건만 사용 해야 합니다. 물질 안전 데이터 시트 (MSDS)에 지시를 따릅니다.
2. Permeabilization/차단 버퍼를 준비 (3 %BSA 0.1% 트라이 톤 X-100 희석 PBS에). 필터가이 솔루션 소독 및 4 ° c.에 저장 실험의 날, 따뜻한 실내 온도에 필요한 금액.
3. (1% 및 0.1 %BSA 사포닌 PBS에) 얼룩 버퍼를 준비 합니다. 0.2 µ m 필터를 사용 하 여이 솔루션을 소독 및 4 ° c.에 저장 실험의 날, 따뜻한 실내 온도에 필요한 금액.
4. 피펫으로 350 µ L 표면 완전히 덮여 보장 각 coverslip에 고정 솔루션의. 어둠 속에서 10 분 동안 실내 온도에 품 어.
5. 신중 하 게는 micropipet를 사용 하 여 하는 coverslip의 가장자리에서 발음으로 coverslip에서 고정 솔루션을 제거 합니다.
   주의: 고정 솔루션 유해 화학 폐기물로 폐기 해야한다.
6. Coverslips permeabilization/차단 버퍼의 500 µ L로 한 번 씻는 다. 피펫으로 액체에서.
7. Permeabilize 고 각 coverslip를 permeabilization/차단 버퍼의 250 µ L을 추가 하 고 어둠 속에서 실 온에서 10 분 동안 배양 하 여 세포를 차단 합니다.
8. 버퍼를 얼룩이 지기에서 토끼 방지 tubulin 항 체 1: 100 희석.
9. Aspirate는 coverslips에서 permeabilization/차단 버퍼에서 고 각 coverslip 50 µ L 희석된 방지 tubulin 항 체 솔루션의 추가. 어둠 속에서 30 분 동안 실 온에서 품 어.
10. 알 렉 사 Fluor 532 활용 된 염소-토끼 IgG 이차 항 체와 버퍼를 얼룩이 지기에서 phalloidin 알 렉 사 Fluor 568 활용 1: 100 희석 하 여 2 차 항 체/말라 얼룩이 솔루션을 준비 합니다.
11. 버퍼를 얼룩이 지 고 다음 그것을 발음의 500 µ L을 추가 하 여 초과 1 차적인 항 체를 제거 하는 coverslips 3 번을 씻어.
12. 각 coverslip을 이차 항 체/말라 얼룩 솔루션의 50 µ L을 추가 하 고 어둠 속에서 실 온에서 30 분 동안 품 어.
13. 버퍼를 얼룩이 지 고 다음 그것을 발음의 500 µ L을 추가 하 여 초과 이차 항 체를 제거 하는 coverslips 3 번을 씻어.
14. 현미경 슬라이드를 장착 시 약의 10 µ L를 추가 합니다. 아래 셀 쪽으로 현미경 슬라이드에 coverslip를 탑재 합니다.
    참고: "반대로 페이드" 장착 매체 ( 재료의 표참조)이 좋습니다 GFP 융해 단백질의 형광 강도 유지 하기 위해. DAPI는 fluorophores의 이미징 호텔 위치 레이저를 사용 하 여 때을 방해할 수 있는 포함 된 시 약을 장착 하는 사용을 하지 않습니다.
15. 어둠 속에서 하룻밤 건조를 슬라이드 수 있습니다. 이미지 슬라이드 다음 날.
    참고:는 coverslip 건조 자 마자 슬라이드 이미징이 좋습니다로 GFP 형광 시간이 지남에 저하 됩니다.

6. 호텔 위치 현미경을 사용 하 여 이미징

참고: 아래 설명 하는 모든 소프트웨어 단계는 현미경 및 소프트웨어 사용에 유의 하시기 바랍니다 ( 재료의 표참조). 단계 및 설정이 이미징 다른 현미경/소프트웨어를 사용 하 여 수행 되는 경우 조정 해야 합니다.

1. 호텔 위치 현미경, 레이저 및 epifluorescence 조명 램프, 활성화 켜고 현미경 소프트웨어를 시작.
2. 호텔 위치 고갈 레이저에 대 한 매개 변수를 설정 합니다.
   참고:이 사용 되 고 특정 현미경에 장착 된 레이저 따라 달라 집니다. 권장 되는 일부 설정은 흰색 빛 (WLL) 70%; 592 nm 레이저 80%; 660 nm 레이저 80 %입니다.
3. 호텔 위치 설정을 활성화 하 고 호텔 위치 레이저 빔 100 X 목표를 사용 하 여 정렬.
4. 접 안 렌즈를 사용 하 여 샘플을 집중 하 고 온건한 GFP 식 셀을 선택 합니다.
   참고: 낮은 GFP 표현 하지 표시 됩니다 호텔 위치 방출 강도 줄일 수 있기 때문에. 반대로, 클립-170-GFP의 높은 식 일반 microtubule 플러스-엔드 단백질 복잡 한 형태와 분포 반영 하지 않는 큰 클러스터의 자연 형성을 유도 합니다. 온건한 GFP 식이 있는 셀을 선택 하면 정확 하 게 항 원 연락처 사이트에서 cytoskeletal 구조 이미징을 위한 필수적 이다.
5. 선택한 셀에 zoom 하 고 이미지 수를 관심 영역을 선택 합니다. B 세포는 coverslip 가장 가까운의 x y 평면 초점에는 초점을 조정 한다.
   1. 이렇게 하려면 이동 목표를 점차적으로 더 가까이 coverslip에 B 세포 cytoskeletal 구조와 초점으로 서 다음 초점 이동 합니다. 그런 다음 점차적으로 이동 목표 반대 방향으로 B 세포 cytoskeletal 구조 처음 초점으로 다시 올 때까지.
6. 레이저 파워, 여기 빔 및 검출기 범위 설정을 최적화. 제조업체의 지침에서 권장 하는 설정으로 시작 합니다. 다음에 샘플에 대 한 신호를 최적화 하는 데 필요한 조정 확인 합니다. 동일한 설정으로 서로 비교 하기 모든 샘플 이미지.
7. 소프트웨어의 "취득" 탭에서 "프레임" 사이의 옵션을 선택 하 여 사용 하단 왼쪽된 "순차 스캔" 패널에서 순차적 프레임 수집 이미지 수집을 설정 합니다.
8. 수집 시퀀스를 설정 합니다.
   참고: 인수 GFP 형광 먼저 GFP 신호 저하를 방지 하기 위해 합니다.
   GFP 이외에 사용 되는 fluorophores의 조합에 따라 더 긴 파장 형광 신호를 이미징 먼저 얻을 수 있습니다 더 나은 결과. 그러나, 순서는 fluorophores 또는 형광 단백질 자극된 방출 소모를 받게 되며 몇 군데 강한 형광 신호 및 최고의 해상도를 최적화 합니다.
9. 및 호텔 위치 레이저 전원을 각 fluorophore는 소프트웨어의 "인식" 탭에 대 한 설정 선택한 592-nm 또는 660 nm 호텔 위치 레이저의 슬라이더 막대를 사용 하 여 레이저 파워를 조정 합니다. GFP와 알 렉 사 Fluor 532 592-nm 고갈 레이저에 대 한 파워를 조정 합니다. 알 렉 사 Fluor 568 660 nm 고갈 레이저에 대 한 파워를 조정 합니다.
10. 해상도 증가 하 고 배경 신호 감소를 하는 소프트웨어의 "취득" 탭에서 "인수" 설정으로 이동, 선 또는 각 옵션에 대 한 드롭 다운 메뉴를 사용 하 여 1 보다 큰 값을 선택 하 여 평균 프레임 증가.
11. 또한, fluorophore "취득" 탭 아래에 대 한 제어 옵션을 선택 하 고 시간 게이팅에 대 한 값을 지정 하 여 시간 문이 호텔 위치를 사용 하 여 형광 신호를 취득 (아래 참고 참조). 이 fluorophores의 photobleaching 증가 하지만 해상도 향상 시키기 위해 호텔 위치 레이저 파워를 증가.
    참고: 제어 시간 현미경, 샘플 및 fluorophores 사용 되 고 최적화가 필요 합니다. 한 시간 게이팅의 0.3 ~ 6 ns는 것이 좋습니다. 고정, 후 GFP는 높은 레이저 전원에 특히 민감합니다. 적용 되어야 시간 게이팅 GFP의 photobleaching를 줄이기 위해, 그리고 호텔 위치 레이저 파워를 감소 한다.
12. 3D 호텔 위치 이미지를 캡처, 포인트를 변경 하려면 슬라이더를 사용 하 여 "3D 호텔 위치" 기능 (PSF) 확산.
13. 수동으로 재현성을 보장 하기 위해 여러 개의 이미지를 취득 합니다. ( 그림 1참조) 이미지를 deconvolve deconvolution 소프트웨어를 사용 하 여 패키지⁴¹( 재료의 표참조).

B 셀 고정된 안티-Ig에 확산, deconvolution 소프트웨어와 함께 사용 하는 호텔 위치 현미경 confocal 현미경 검사 법 보다 cytoskeletal 구조의 높은 해상도 이미지를 제공 합니다. 이것은 그림 1에서 분명 하다 어디 F 말라 네트워크 위에서 설명한 프로토콜을 사용 하 여 가시화 했다. 공초점 레이저의 비교 및 호텔 위치 슈퍼 해상도 같은 호텔 위치 이미지의 높은 해상도 보여주는 샘플 영상과 자세한 걸 골격 (그림 1)의 구조를 공개. 이 그림은 또한 그 deconvolution 고품질 호텔 위치 이미지는 걸 필 라 멘 트 더 명확 하 게 정의 얻기 위해 필수적입니다 보여줍니다. Deconvolution 공초점 이미지의 이미지의 해상도에 상당한 뛰어납니다, deconvolved 호텔 위치 이미지 deconvolved confocal 이미지 보다 자세한 구조 정보를 제공 합니다. 특히, 호텔 위치 현미경 검사 법 (그림 1 및 그림 2)에 의해 자세히 주변 F 걸 링의 돌기 구조가 드러났습니다. 항 문의 사이트에 microtubule 네트워크는 또한 샘플 준비를 사용 하 여 및 이미징 프로토콜 (그림 3) 위에서 설명한 몇 군데. Microtubules는 MTOC는 중앙 지점에서 발생 하 고 셀의 주변을 향해 바깥쪽으로 나 다. 이 실험에서 B 세포 확산 15 분 (그림 3), 시간 포인트 되는 MTOC 항 원 연락처 사이트¹⁷쪽으로 이동에 대 한 안티 Ig 코팅 coverslips에 허용 되었다. 클립-170-GFP 클러스터 microtubules의 더하기 끝을 표시 하는 그림 3과 같이 microtubules의 끝에서 볼 수 있습니다. 샘플 준비 및 호텔 위치 이미징 microtubule 네트워크의 최적, 지속적이 고 독특한 때 클립-170-GFP는 microtubules에 따라서 또는 더하기-끝 (그림 3A)에 지역화와 microtubules 관찰 된다. 항 체 또는 α-tubulin 항 체 이상 1 세를 제대로 해결 하는 불연속 섹션으로 나타나는 microtubules에 결과의 배치를 얼룩이 지기의 낮은 농도 사용 하 여 관찰 되었다 얼룩, 최적의 microtubule deconvolution 시 (그림 3B; 참고 그림 5C). 모든 이러한 이미지에 클립-170-GFP 형광은 α-tubulin-immunostained 구조와 관련, 하나 클립-170-GFP 플러스 끝 또는 불완전 한 얼룩 때문 microtubules의 길이 따라 위치 인지를 구별할 수 없다 microtubules의. 따라서 그것은 중요 한 α-tubulin 항 체 제조업체 권장 보관 조건 하 고 1 년 이내 사용 아래에 저장 됩니다.

이 프로토콜, 조직 및 말라 골격 및 microtubule 네트워크, 뿐만 아니라 이러한 두 cytoskeletons¹⁷, 연관 클립-170와 IQGAP1 단백질의 구조를 보여 주는 고품질 멀티 컬러 호텔 위치 이미지를 사용 하 여 취득 될 수 있었다. 그림 4 에 호텔 위치 이미지 수지상 말라 말라 얼룩은 훨씬 밀도 셀에 중앙 위치에서 쏘아 microtubules의 주변 링을 표시 합니다. 클립-170-GFP 이러한 microtubules의 끝에 주변 F 말라와 밀접 하 게 연결 됩니다. 이 프로토콜 하나 단색 호텔 위치 (그림 2) 이미징 또는 이미징 (그림 3 과 그림 4) 다 색 호텔 위치 중 하나를 사용 하 여 면역 시 냅 스에서 cytoskeletal 구조를 시각화 수 있습니다. 그러나, 그것은 단일 색상 호텔 위치 영상 (그림 2) 멀티 컬러 호텔 위치 (그림 4) 보다 말라 구조와 B 셀에 microtubules의 더 나은 해상도 얻을 수 있습니다 주목 해야한다. 이 photobleaching 다른 fluorophores에 대 한 순차적 호텔 위치 이미지 수집으로 인 한 원인일 수 있습니다. 최고의 슈퍼 해상도 이미지, fluorophores 및 형광 단백질을 선택의 조합으로 그들은 흥분 및 고갈 레이저를 사용 하 여 군데는 있는 시퀀스를 샘플에 대 한 최적화 되어야 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 다 색 호텔 위치 이미징 전통적인 confocal 현미경 검사 법 보다 이러한 cytoskeletal 구조의 높은 해상도 이미지를 제공합니다. 또한, 전체 B 세포 말라 또는 microtubule 네트워크 (영화 1)의 3 차원 슈퍼 해상도 이미지 단색 호텔 위치를 사용할 수 있습니다.

형광 성 융해 단백질 transfected 세포를 사용 하 여 때 최적의 식 레벨을 달성 하 고 overexpression 인해 아티팩트를 피하 중요 한 고려 사항이 있습니다. 클립-170-GFP overexpressed입니다 셀에 클립-170-GFP의 큰 집계 형성 된다 (그림 5A). 클립-170-GFP의이 mislocalization 이외에이 셀에 microtubule 네트워크의 일부만 coverslip (그림 5B)에 가장 가까운 초점 비행기 내에서 했다. 이 클립-170 overexpression MTOC BCR 유도 분극 저하도 될 수 있습니다 제안 합니다. 반대로, 강한 형광 신호 취득 고품질 호텔 위치 이미지에 대 한 일반적으로 필요 하기 때문에, 클립-170-GFP (그림 5C) 같은 형광 성 융해 단백질의 낮은 식 품질 이미지 결과입니다. 따라서, 형광 단백질 페 된 셀을 사용할 때만 퓨전 단백질 식의 최적의 수준으로 셀을 이미지를 중요 하다. 그것은 또한 그 transfection 프로토콜 A20에 사용 된 세포 ( 재료의 표참조) 일반적으로 20-50%에서 transfected 단백질을 표현 하는 셀의 결과 주의 하는 것이 중요. 플라스 미드 DNA (반대로 siRNAs)에 대 한 기본 B 세포의 transfection 주파수 들은 종종 훨씬 A20 셀, B 세포의 사용을 필요로 대 한 보다 낮은. 그럼에도 불구 하 고, 높은 품질의 호텔 위치 이미지 untransfected 기본 B 세포에서 cytoskeletal 요소 (그림 6)이이 프로토콜을 사용 하 여 얻을 수 있습니다.

그림 1: 공초점 레이저의 비교 및 F-말라의 호텔 위치 이미징. 공초점 이미지 (위) 및 호텔 위치 이미지 (아래)의 알 렉 사 Fluor 532 활용 된 phalloidin으로 얼룩이 되 고 전에 15 분 동안 안티 IgG-입히는 coverslips에 확산 했다 A20 셀. 호텔 위치 confocal 현미경을 사용 하 여, 같은 셀은 몇 군데 먼저 confocal 현미경 검사 법에 의해 그리고 호텔 위치. 와 같은 confocal deconvolution 후 호텔 위치 이미지 confocal 초기와 호텔 위치 이미지 표시 됩니다. 눈금 막대: 5 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 항 원 연락처 사이트에서 말라 골격. 15 분에 대 한 안티 IgG-입히는 coverslips에 허용 했다 A20 셀 렉 형 석 568 활용 된 phalloidin로 얼룩진 고 호텔 위치 현미경 검사 법에 의해 몇 군데. 초기 호텔 위치 이미지 deconvolved 했다. 패널 A-B 및 C-E 패널 두 개의 서로 다른 셀의 대표 이미지를 표시합니다. 패널 전자 패널 C에서 흰색 상자에 영역의 3 X 확대를 보여줍니다. 눈금 막대 패널 A-D: 5 µ m. 눈금 막대 패널 E: 1 µ m입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: microtubule 네트워크 및 클립-170-GFP의 호텔 위치 이미지. 클립-170-GFP를 표현 하는 A20 셀 고정 되 고 전에 15 분 동안 안티 IgG-입히는 coverslips와 immunostained 항 체를 α-tubulin 플러스 알 렉 사 Fluor 532 활용 된 이차 항 체에 허용 되었다. (A) 대표 이미지 클립-170-GFP microtubules의 플러스 끝에 주로 위치와 microtubule 네트워크의 immunostaining를 보여주는. (B) 최적의 얼룩 그리고 α-tubulin 항 체의 오래 된 재고의 사용으로 인해 microtubules의 해상도. 스케일 바: 5 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: 말라와 microtubule cytoskeletons의 호텔 위치 이미지. A20 셀 클립-170-GFP 표현 안티 IgG-입히는 coverslips 고정 되 고 알 렉 사 Fluor 568 활용 된 phalloidin F-말라, 시각화와 α-tubulin 항 체와 알 렉 사 Fluor 532 활용 스테인드 전에 15 분에 전파를 허용 되었다 microtubules 시각화 하 항 하 체 2 차 항 패널 A-D 와 E F 패널 두 개의 서로 다른 셀의 대표 이미지를 표시합니다. 패널 D C패널의 흰색 상자에 영역의 3.5 X 확대 이다. 스케일 바: 패널 A-C 와 E-F; 5 µ m 패널 Dµ 하 m 1 이다 패널 A 에서 이미지 그림 3A 에서 사용 하는 동일한 이미지 이지만 F-말라 채널의 오버레이 포함 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5: overexpression 또는 GFP 융해 단백질의 부족 한 표현 가난한 품질 호텔 위치 이미지의 예. A20 셀 클립-170-GFP 표현 안티 IgG-입히는 coverslips 고정 되 고 그림 4처럼 스테인드 전에 15 분 동안에 허용 되었다. (A, B) 클립-170-GFP (A) 와 항 원 접촉으로 장애인된 MTOC 분극의 큰, 비정상적인 집계에서 클립-170-GFP overexpression 결과 (B)사이트. (C) 품질 호텔 위치 이미지에서 레이저 전원 결과 증가 하 여 클립-170-GFP의 부족 한 식에 대 한 보상. 스케일 바: 5 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 6: 기본 B 셀에 microtubule 골격의 호텔 위치 이미지. 기본 비장 B 세포 6 h 5 ng / µ L BAFF 플러스 2.5 µ g/mL LPS, 경작 되었고 안티 IgM 항 체로 코팅 된 했다 coverslips에 15 분에 대 한 확산을 허용. 셀 다음 고정 되었고 α-tubulin 항 체 플러스 microtubules 시각화 하 알 렉 사 Fluor 568 활용 된 이차 항 체와 스테인드. 대표 이미지 표시 됩니다. 눈금 막대: 5 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

영화 1: B 세포 microtubule 네트워크의 3 차원 재구성. A20 셀 고정 되 고 전에 15 분 동안 안티 IgG-입히는 coverslips와 immunostained 항 체를 α-tubulin 플러스 알 렉 사 Fluor 488 활용 된 이차 항 체에 허용 되었다. Z 슬라이스 0.2 µ m 단계 크기 37 프레임의 총에 대 한 점령 했다. 3 차원 재구성 이루어졌다 이미징 소프트웨어의 호텔 위치 현미경을 사용 하 여. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)

이론적으로 50의 해상도 달성할 수 있는 호텔 위치 슈퍼 해상도 현미경을 사용 하 여 cytoskeletal 구조의 상세한 이미지를 얻을 수 있는 회절 제한 된 해상도 200 ~ 기존의 confocal 현미경 검사 법에 비해 nm nm ²⁴. 미세한 구조를 해결 하는 능력 관찰된 "흐리게" 형광 신호에서 원래 광원의 가능성이 가장 높은 위치를 계산할 deconvolution 소프트웨어를 사용 하 여 더 강화 된다. 이 프로토콜에는 호텔 위치는 말라와 microtubule cytoskeletons로 골격 관련 단백질의 이미지를 사용 하 여 방법을 설명 합니다.

B 세포 활성화 면역 시 냅 스 형성^17,42에 대 한 중요 한 두 개의 cytoskeletons의 조정 레 걸 골격 및 microtubule 네트워크의 리 모델링을 유도 합니다. 우리가 제시 하는 방법은 동시에 멀티 컬러 호텔 위치를 사용 하 여 항 원 연락처 사이트에서 말라와 microtubule cytoskeletons 이미징에 대 한 최적화 된 하지만 단색 호텔 위치에 대 한 동등 하 게 적용 됩니다. 우리 호텔 위치 어떻게 세포 구조에 새로운 통찰력을 제공할 수 있다 B 세포 골격 하이라이트에 이전 연구 구성 하 고 서로 상호 작용 하는 방법. Confocal 및 총 내부 형광 (TIRF) 현미경을 사용 하 여, 우리 microtubules F-¹⁷의 항 원 연락처 사이트 주변에 말라 반지 문의 관찰 했다. 호텔 위치 현미경을 사용 하 여, 우리는 의해 표시 된 microtubules의 더하기 끝 표시 수 있었다는 + 팁 클립-170 수지상 말라 네트워크 셀 주변에 밀접 하 게 연관 ( 그림 4참조).

어떤 이미징 기술을 하나의 특정 응용 프로그램에 가장 적합 한는 다중 요인 영향. 이 필요한 해상도, 이미지 수를 구조, 라벨 기술 및 신호 대 잡음 비율 (즉, 대비), 수집 시간, 샘플 준비, 및 재현성의 용이성을 포함 합니다. 호텔 위치에 대 한 샘플 준비 confocal 현미경 검사 법에 대 한 보다 크게 다른 이며 그것은 결합 하 여 고해상도 고속 이미지 수집. 호텔 위치의 주요 이점은 이다 광학 프로세스는 이미지는 샘플에서 직접 취득 및 해상도²⁴호텔 위치 레이저 파워를 변경 하 여 조정할 수 있습니다. 바닥 상태 고갈 슈퍼 해상도 현미경, 달리는 수천 개의 연속 이미지에서에서 이미지를 재구성, 광범위 한 전산 처리 호텔 위치, 필요 하지 않습니다 캡처하고 이미지 재건의 유물 소개 피할 수 ^{그러나 24}., 호텔 위치 이미지에서 대비는 종종 낮은²⁴ImageJ 대비를 향상 시킬 필요가 있을 수 있습니다와 같은 소프트웨어를 사용 하는 경우 후 이미지 처리에서. 이 수지상 말라 네트워크 같은 조밀한 구조, 이미지에 대 한 특히 중요 하다. 이미지 수집 동안 이미지 대비를 개선 하기 위해 한 수 고갈 레이저 전원 줄이거나 선 또는 프레임 평균을 적용 합니다. 시간 문이 호텔 위치, 사용자 설정 시간 지연 후 광자를 캡처, 영역에서 광자 수집된^24,43를 감소 하 여 해상도 높일 수 있습니다. 명암비와 해상도 개선 하기 위해 이러한 방법의 조합을 사용 하 여 면역 시 냅 스에서 cytoskeletal 구조의 호텔 위치 이미지를 최적화 하는 것이 좋습니다.

현재, 모든 fluorophores 호텔 위치와 이미징에 대 한 최적의 있으며 모든 fluorophore 조합 다 색 호텔 위치 이미지를 얻기 위해 적당 하다. 감지 범위 조절에 주의 인접 채널에 최소한의 출혈-통해 fluorophores의 보장에 대 한 중요 하다. Fluorophores이 프로토콜 (즉, GFP, 알 렉 사 Fluor 532, 그리고 알 렉 사 Fluor 568) 사용의 조합 다 색 호텔 위치 슈퍼 해상도 이미징에 대 한 최적입니다. 구조화 조명 현미경 (SIM)를 비교 하 고 단일 분자 지역화 방법 (SMLM), 사진 활성화 지역화 현미경 (팜), 호텔 위치 등 일반적으로 멀티 컬러 이미지에 적합 하지 않습니다. 그러나, 우리가 여기에 fluorophore 검출, 그 약간의-채도 표시 간단한 이미지 처리 도구와 결합 하 여 제공할 수 있습니다 말라와 microtubule cytoskeletons의 고해상도 멀티 컬러 이미지.

Cytoskeletal 구조의 호텔 위치 이미징이 프로토콜 B 세포 면역 시 냅 스에서 cytoskeletal 건축의 새로운 세부 사항을 밝혔다. 우리 B 세포에 항 원 접촉 사이트에서 말라와 microtubule cytoskeletons 이미징이 프로토콜 최적화, 비록 이러한 방법 다른 세포 유형, 특히 면역 세포 (T 세포, NK 세포, 돛대 세포, 등)를 형성에 적용 되어야 합니다. 면역 시 냅 스입니다. 또한,이 프로토콜의 유틸리티 다른 ligands 또는 접착 기판 coverslips 코팅을 연장 될 수 있습니다. 그러나, 그것은 프로토콜 및 셀 종류와 실험 설정에 대 한 이미지 수집 설정을 최적화 하는 것이 중요입니다.

저자는 공개 없다.

우리는 UBC 생명과학 연구소 (LSI) 이미징 시설 지원 및 호텔 위치 현미경을 유지에 대 한 감사 합니다. 이 작품에서에서 권한을 부여 #68865 건강 연구의 캐나다 학회 (M.R.G.)에 의해 투자 되었다. 클립-170-GFP 플라스 미드에 감사 박사 고조 Kaibuchi (나고야 대학, 나고야, 일본) 하 고.