화학을 유도할 수 있는 DNA Hydroxymethylation 및 후 리 모델링 설계 분할-TET2 효소

자세한 프로토콜 설계 분할-TET2 효소 (사이 다) 화학 유도할 수 있는 DNA hydroxymethylation 및 후 리 모델링 포유류 세포에 도입 되 게 됩니다.

DNA 메 틸 화 포유류 게놈에 안정적이 고 상속 후 성적인 수정 이며, 세포 기능 제어 유전자 발현 조절에 관여. DNA 메 틸 화, 또는 DNA demethylation의 반전은 dioxygenases의 10-11 전 (TET) 단백질 가족에 의해 중재 됩니다. 그것은 널리 알려졌다 탈 DNA 메 틸 화와 demethylation 발달 결함과 암와 관련 된, 있지만 어떻게 이러한 후 성적인 변경을 직접 기여할 진 식 또는 질병 진행에 후속 변경 신뢰할 수 있는 도구를 정확 하 게 추가 또는 정의 된 시간적, 공간적 해상도에서 게놈에 있는 DNA 수정 제거의 부족 때문에 크게 불분명 남아 있습니다. 이 장애물을 극복 하기 위해 우리는 분할 TET2 효소를 5-methylcytosine (5mC) 산화의 일시적인 제어 및 후속 개장 하는 포유류 세포에 있는 후 성적인 국가의 단순히 화학 물질을 추가 하 여 사용할 수 있도록 설계 되었습니다. 여기, 우리 화학을 유도할 수 있는 epigenome 개장 도구 (사이 다), 포유류 세포와 함께 5-hydroxymethylcytosine (5hmC)의 화학 유도할 수 있는 생산 측정 조작된 분할-TET2 효소에 따라 도입 방법 설명 immunostaining, cytometry 또는 점 오 점 분석 결과. 이 화학을 유도할 수 있는 epigenome 개장 도구 유전자 코드를 변경 하지 않고 셀룰러 시스템 질문 뿐만 아니라 다양 한 생물 학적 시스템에서 epigenotype−phenotype 관계를 프로 빙에 광범위 한 사용을 찾을 것입니다.

DNA 메 틸 화, 주로 5-methylcytosine (5mC) 형성 시 토 신의 탄소 5 위치에 메 틸 그룹의 추가를 나타냅니다, 그리고 DNA 메 틸-transferases (DNMTs)에 의해 촉매. 5mC transcriptional 억제, x 염색체 비활성화와 transposon 입을¹에 대 한 신호를 종종 포유류 게놈에 있는 주요 epigenetic 마크 역할을 합니다. DNA 메 틸 화의 반전 10-엘 프 전 (TET) 단백질 가족에 의해 중재 됩니다. TET 효소 철 (II)에 속하는 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) 및 5-carboxycytosine (5caC)의 연속 산화 촉매는 종속 dioxygenases 2 oxoglutarate. TET 중재 5mC 산화 epigenetic 제어할 포유류 게놈의 추가 계층을 부과 한다. TET의 발견 TET 단백질의 생물 학적 기능 및 그들의 주요 촉매 제품 5hmC 공개 후 필드에 강렬한 관심을 촉발 했다. 5hmC 하지만 중간 TET 중재 활성 DNA demethylation^2,,34일 동안 이지만 또한 epigenetic 안정 역할 표시^5,6,7,8 . DNA hydroxymethylation에서 변경 일부 인간의 장애^9,,1011, 인과 관계와 연결 된 DNA hydroxymethylation은 높은 유전자 발현과 관련 된 탈 선 후 성적인 수정 DNA에는 고기 사이 종종 남아 설립 도전, 시간적 및 공간적 정의 신뢰할 수 있는 도구를 정확 하 게 추가 또는에서 게놈에 있는 DNA 수정 제거의 부족에 부분적으로 관찰 될 수 있습니다. 해상도입니다.

여기 우리는 화학을 유도할 수 있는 epigenome 도구 (사과주) 인과 관계의 연구를 직면 하는 장애물을 극복 하기 위해 DNA hydroxymethylation와 유전자 전사 사이 개장의 사용을 보고 합니다. 가정에는 디자인을 기반으로 하는 TET2의 촉매 도메인 (TET2CD) 2 개의 비활성 파편 포유류 세포에서 표현 하는 때로 분할할 수 있습니다 및 화학적으로 유도할 수 있는 이합체 화 접근법 ( 여 효소 기능을 복원할 수 있습니다 그림 1A). 분할-TET2CD 시스템을 설정 하기 위해 우리는 TET2CD, Cys 풍부한 지역 및 더블-좌초 β 나선 (DSBH) 배, TET2 DNA 복잡 한 낮은 복잡성 지역¹²부족의 보고 된 결정 구조 기초의 구성에서 6 사이트를 선택. 합성 유전자 인코딩 rapamycin 유도할 수 있는 이합체 화 모듈 FK506 바인딩 단백질 12 (FKBP12)와 FKBP rapamycin 바인딩 도메인 (FRB) rapamycin^14,15, 자체 cleaving 펩타이드 T2A 함께 포유류 대상의 polypeptide 시퀀스^16,17, TET2CD 내의 선택한 분할 사이트에 개별적으로 삽입 되었다. 우리의 엔지니어링 대상으로 TET2의 선택 다음과 같은 고려 사항을 기반으로 합니다. 수 반하는 감소 된 DNA hydroxymethylation TET2에서 첫 번째, 체세포 돌연변이 골수성 질환 등 암¹⁰, 대 피할 수 민감한 사이트에 유용한 정보를 제공 하는 인간의 장애에서 자주 관찰 된다 삽입입니다. 둘째, TET2 촉매 도메인, 특히 낮은 복잡성 지역의 큰 분수는 효소 기능¹², 유도할 수 있는 후 성적인 수정에 대 한 최소화 된 분할 TET2 공예를 활성화를 위해 불가결 이다. 15 구조, 심사 후 포유류 시스템에서 그것의 효소 활동의 가장 높은 rapamycin 유도할 수 있는 복원 전시 하는 구문 선택 되었고 사과 쥬 스¹⁸로 지정. 우리는 여기 유도할 수 있는 DNA hydroxymethylation 및 rapamycin와 리 모델링 후 사과 mCherry 태그를 사용 하 여 설명 하 고 사과 중재 5hmC 생산 모델 셀룰러 시스템 HEK293T에서에서 유효성 검사에 세 가지 방법 제시.

1. 세포 문화, 플라스 미드 Transfection 및 화학 유도

1. 문화는 부착 셀 라인 (예, 인간 미 발달 신장 HEK293T 셀) Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM)에 10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 100 U/mL 페니실린, 5% CO₂와 37 ° C에서 스 보완.
2. 사과 쥬 스 플라스 미드와 셀 transfect
   1. Transfection 전에 적어도 18 h, 2.5 ml 당 적절 한 DMEM의 씨앗 0.3 x 10⁶ 셀 6 잘 플레이트에 고 37 ° C 하룻밤 60-80 %confluency 도달에서 세포를 품 어.
   2. 미리 사용 하기 전에 실내 온도에 transfection 시 따뜻한.
   3. 무 균 튜브에 혈 청 자유로운 매체의 장소 250 µ L.
      참고:이 금액은 80 %confluency 6 잘 플레이트에 대 한 맞춤형. 필요한 경우, 비례 또는 셀 숫자의 크기에 따라 중간 금액을 조정 합니다.
   4. 사과 쥬 스¹⁸ 또는 TET2의 촉매 도메인 인코딩 플라스 미드의 2.5 µ g 추가 (긍정적인 제어 TET2CD)^12,13 혈 청 무료 매체와 부드럽게 pipetting으로 혼합.
   5. 7.5 µ L transfection 시 약의 희석된 DNA 혼합물에 추가 하 고 부드럽게 pipetting으로 혼합.
   6. 20-30 분 동안 실내 온도에 혼합물을 품 어.
   7. 미리 데워 진된 미디어 변경 우물에 drop-wise 혼합물을 추가 하 고 부드럽게 흔들어 균일 하 게 배포 transfection 시 약 및 DNA 혼합물 셀 문화 접시.
   8. 하룻밤 사이, 세포와 혼합 incubate 고 transfection 시 약 2 ml 신선한 완전 한 DMEM 미디어를 포함 하를 바꿉니다.
3. 화학 유도
   1. Rapamycin 재고 (DMSO에 용 해) 적절 한 완전 한 매체에서 20 µ M의 농도의 희석 2 mM.
   2. 20 µ L 희석된 rapamycin의 200의 최종 농도 도달 2 mL 매체에 유지 하는 transfected 세포에 추가 nM.
      참고: 48 h에 대 한 보육, 후 셀은 5hmC 세대의 정량화 또는 다른 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 준비. 필요한 경우, 유도 효율은 셀 아래 설명 된 대로 추가 5hmC 부 량에 대 한 모든 3 h를 취 함으로써 모니터링 고 그림 1에 표시 된 수 있습니다.
   3. 5hmC 유도 효율성의 더 나은 정량화에 대 한 시드 웰 스 모니터 셀 3 시간 마다 구분 합니다.

2. Immunostaining에 의해 Rapamycin 유도 5hmC 생산의 정량화

1. 5hmC 면역 형광 염색
   참고: 접시의 모든 세포를 충당 하기 위해 3 N HCl와 PBS에서 충분 한 양의 4 %paraformaldehyde, 0.2% 계면 활성 제 (Triton X-100) 등으로 구성 된 고정 솔루션을 추가 합니다. 예를 들어 솔루션의 500 µ L 6-잘 접시에 잘에 대 한 충분 한 것입니다. 실 온에서 모든 단계를 수행 합니다.
   1. 셀을 수정, 추가 4% paraformaldehyde PBS에 rapamycin 치료 셀 주위 온도에 15 분 동안에. 컨트롤 그룹에 대 한 mCherry-사과주 rapamycin 치료 없이 표현 하는 셀을 사용 합니다. 교 반 하십시오 하지 않습니다.
      주의: Paraformaldehyde 독성이 있다. 적절 한 보호를 착용 하십시오.
   2. 통 솔루션을 삭제 합니다. 세포 막 permeabilize를 30 분 PBS에 0.2% 계면 활성 제와 고정된 셀을 품 어.
   3. Permeabilization 솔루션을 삭제 합니다. Permeabilized 셀에 3 N HCl를 추가 하 고 DNA를 변성을 15 분 동안 품 어.
   4. HCl 추가 100 mM Tris HCl 버퍼 (pH 8.0) pH의 중성화에 대 일 분에 대 한 셀을 삭제 합니다.
   5. 모든 솔루션을 삭제 합니다. 셀에 대 한 PBS와 철저 하 게 씻어 3-5 시간. PBS를 철저 하 게 제거 합니다.
      참고: 모든 세척 단계에 대 한 PBS의 충분 한 양을 추가 합니다. 예를 들어 1 mL의 PBS 6 잘 플레이트에 대 한 충분 하다.
   6. 1 %BSA 및 0.05%의 계면 활성 제 (예: 트윈 20) PBS에 부드러운 동요와 1 시간에 대 한 블로킹 버퍼를 추가 하 여 셀을 차단 합니다.
   7. 삭제 차단 솔루션. 셀에 희석된 5hmC 항 체 (1: 200)을 추가 하 고 실 온에서 2 시간 또는 하룻밤 4 ° c.에 품 어
   8. 3 시간 15 분 대 한 PBS 가진 세포를 씻어.
   9. 추가 희석된 fluorophore (FITC)-셀에 이차 항 체 (1: 200)을 활용 하 고 1 시간에 품 어.
   10. 워시 PBS 가진 셀 세 번 광범위 하 게 잔여 항 체를 제거 하.
   11. 4'의 250 ng/mL을 추가, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 5 분에 대 한 핵 얼룩 제거 얼룩 솔루션.
   12. Immunostained 셀 confocal 영상에 대 한 슬라이드 또는 유리 하단 문화 접시를 탑재 합니다. 대표 결과 그림 1B에 보였다.
2. Cytometry
   참고: 다음 얼룩 절차에 대 한 96-잘 라운드 바닥판을 사용 합니다. 일반적으로, 150 µ L의 시 약은 각 잘 충분 합니다.
   1. FACS 버퍼 (1 %BSA, 2 mM EDTA와 PBS)에 rapamycin 유도 transfected 세포 resuspend Rapamycin 치료 없이 사과 표현 셀을 사용 하 여 컨트롤 그룹에 대 한 있습니다.
   2. 수정 하 고 단계 2.1에 설명 된 대로 세포를 permeabilize.
   3. 10 분 동안 DNA를 변성 하 셀 2 N HCl를 추가 합니다.
   4. HCl 중화를 취소 하 고 단계 2.1에 설명 된 대로 세포를 차단 합니다.
   5. 셀에 희석된 안티-5hmC 항 체 (1: 200)을 추가 하 고 1 시간 실내 온도에 또는 하룻밤 4 ° c.에 대 한 품 어
   6. FACS 버퍼 셀 세 번 씻어. FACS 버퍼를 철저 하 게 제거 합니다.
   7. 추가 희석된 fluorophore (FITC)-형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 분석, 이차 항 체 (1:400)를 활용 하 고 실 온에서 1 h에 품 어.
   8. FACS 버퍼 셀 세 번 씻어.
   9. 샘플은 FACS 분석에 대 한 준비가 되었습니다. 대표 결과 그림 1 c-D에 표시 했다.

3. 점 오 점 분석 결과 5hmC 및 5-methylcytosine (5mC) 척도를 도달

1. 상업적인 DNA 추출 키트를 사용 하 여 transfected 및 rapamycin 유도 세포에서 게놈 DNA를 격리 합니다. Rapamycin 치료 없이 사과 쥬 스 페 셀을 사용 하 여 컨트롤 그룹에 대 한 있습니다.
2. 80 ° C와 사전 담가 니트로 막 이중 증 류 H₂O 그리고 염 분 나트륨 시트르산 (SSC) 버퍼 10 분 x 6에서에 진공 오븐이 열.
3. 96-잘 PCR 접시에 같은 양의 DNA (TE 버퍼에 총 µ 2 g)의 60 µ L을 로드 합니다. 나머지 우물에 테 버퍼 (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)의 30 µ L를 추가 합니다.
4. 확인 두 배 직렬 희석 세로 96 잘 접시에 2 행에 동일한 열 위치를 30 µ L 솔루션의 행 1에 전송 하 여 합니다. 다시 혼합 하 고 경계를 도달까지 후속 행에서 웰 스 솔루션의 30 µ L를 전송.

유도할 수 있는 화학 5mC-5hmC 변환 단일 셀 수준, 교류 cytometry 분석, transfected (mCherry 양성) 세포 인구에 또는 더 양적 점 오 점 분석 결과 그림 1에서 볼 수 있듯이 immunostaining에 의해 유효성 수 있습니다. TET2, 또는 TET2CD의 촉매 도메인 긍정적인 통제로 연구에 걸쳐 사용 되었다. 5hmC 및 chromatin 접근성에 rapamycin 유도 변경의 게놈 넓은 매핑에 대 한 자세한 내용은 참조 18-20 참조.

그림 1: HEK293T 셀에서 유도할 수 있는 DNA hydroxymethylation 중재 하는 사이 다. 화학을 유도할 수 있는 epigenome (사과주)를 리 모델링 도구 (A) 디자인 분할에 따라 TET2 효소. (B) 대표 immunostaining (위 패널) 전에 사이 다-mCherry을 표현 하는 HEK293T 셀에 결과 (하단 패널) 후 rapamycin 치료 (200 nM). 녹색, mCherry-5hmC, 빨간색, 사과 쥬 스, 블루, DAPI 얼룩 핵의. 눈금 막대 = 10 µ m. (C) 흐름 cytometry 분석 하 여 정량화의 사과주 중재 5hmC 생산. 사과 쥬 스-mCherry TET2CD-mCherry (긍정적인 컨트롤로)의 페 HEK293T 셀 안티-5hmc 주 항 체와 FITC 표시 하는 이차 항 체 얼룩이 했다. TET2만 (mCherry) 및 5hmC (FITC) 두 배 긍정적인 세포 문이 되었고 표시. (D) 사과 표현 하는 HEK293T 세포에서 5hmC의 화학 유도할 수 있는 생산의 시간 과정 관리 또는 rapamycin의 철수 다음 (200 nM). n = 5, HEK293T 세포에서 5hmC 수준에 rapamycin을 유도할 수 있는 변화 척도를 평균 ± 사 우 스 다코타 (E) 점-오 점 분석 결과로 표시 되는 데이터. HEK293T 셀 사이 다 또는 TET2CD 구조와 페 했다. 알려진 양의 5hmC 합성 oligonucleotide 긍정적인 제어 (맨 위 행)로 사용 되었다. 로드 제어 입력된 DNA의 총 금액의 얼룩 블루 에틸렌에 의해 시각 하단 패널에 표시 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

여기 우리 DNA hydroxymethylation의 일시적인 제어를 달성 하기 위해 설계 된 분할-TET2 효소를 사용 하 여를 일러스트 있다. TET 가족 5-methycytosine dioxygenase의의 발견, 많은 연구 해독 TET 단백질과 그들의 주요 촉매 제품 5hmC^,12,3,^{의 생물 학적 기능 수행 되었습니다. 4,5,6,7,,89,10,11}. 그러나, 게놈에 있는 DNA 수정 일시 및 정밀 제어 분야에 대 한 까다로운 도전 되 고 있습니다. 우리의 사과 쥬 스 시스템 활용이 기술 격차를 채우기 위해 설계 된 DNA 효소를 수정 하는 몇 가지 시스템 중 하나입니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 주로 인간 미 발달 신장 (HEK) 293T HeLa 세포 선 등 모델 셀룰러 시스템에 맞게 됩니다. Rapamycin 농도 및 처리 시간 다른 세포 유형에서 최적의 성능을 달성 하기 위해 조정 해야 합니다. 최고의 5hmC 유도 시간 포인트를 찾으려면, 시간 과정 실험 우리가 1.3.3, 섹션에 설명 된 대로 좋습니다. 면역 형광 염색 transfected 세포에 5hmC의 가장 편리한 판독으로 사용할 수 있습니다. 더 많은 정량 분석에 대 한 점 오 점 분석 결과 좋지만 더 힘 드는 절차를 걸릴 수 있습니다. 점 오 점 분석에 대 한 입력된 DNA 양의 다른 세포 유형 대 한 낙관 되어야 한다. 2-fold 직렬 희석을 사용 하 여 DNA 로드 금액 변화 주의 적정 실험 하는 것이 좋습니다.

사과 쥬 스 시스템 다른 생물 학적 시스템에서 DNA hydroxymethylation 및 phenotypic 변화 간의 상관 관계를 해 부를 광범위 하 게 사용할 수 있습니다. 다음은 모범적인 다운스트림 응용 프로그램 또는 질문 사과 쥬 스 시스템으로 해결 될 수 있습니다.

TET 중재 5mC 산화는 어떻게 다양 한 모델 셀룰러 시스템에서 DNA 메 틸 화 풍경을 바꿀 것 이다? 이 지금 수 쉽게 해결할 있습니다 rapamycin 치료 전후 DNA methylome와 hydroxymethylome를 비교 하 여. 어떻게 chromatin 접근성 및 히스톤 수정 DNA hydroxymethylation 변경? Rapamycin의 대답을 말할 것 이다 전후 ATAC seq와 칩 Seq의 비교 같은 셀에 발생 합니다. TET 단백질 특정 유형의 암에 진압 역할을 하 고, 이후 TET 단백질의 화학 어떻게 유도할 수 있는 복원 테스트 하는 것이 흥미로울 것 이다 그리고 5hmC 생산 종양 성장에 범 하다 것 이다. 줄기 세포 분화에 TET/5hmC의 역할을 감안할 때, 그것은 어떻게 일시적으로 제어 하는 결정된 5hmC 생산 정의 transitionary 단계에서 줄기 세포의 개발 계보 사양에 영향을 수 있다.

현재 구성에서 사과 쥬 스 시스템 5mc-5hmC 변환 세계적으로 유도 하는 것만 사용할 수 있습니다. 이상적으로, 사이 다 촉매로 비활성 Cas9 또는 loci 특정 대상 및 유도할 수 있는 DNA 메 틸 화 게놈에서 편집 하면 그 orthologues 융합 될 수 있다. 개장 하는 도구 등 정밀 화학을 유도할 수 있는 epigenome 유전자 코드를 변경 하지 않고 포유류에서 epigenotype 표현 형 관계를 명확 하 게 조사에 광범위 하 게 적용할 수 있습니다.

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

우리 금융 감사 지원 건강의 국가 학회에서 부여 (R01GM112003 YZ), 웰 치 재단 (YZ에 될-1913 년), 미국 암 협회 (YZ에 RSG-16-215-01 TBE), 암 예방 및 연구 연구소의 텍사스 (YH에 RR140053 YZ RP170660), 미국 심장 협회 (YH에 16IRG27250155), 그리고 존 S. 던 재단 공동 연구 보너스 프로그램.