División ingeniería-TET2 enzima ADN químico-inducible Hydroxymethylation y remodelación epigenéticos

Protocolos detallados para la introducción de una enzima de la división ingeniería-TET2 (sidra) en células de mamífero para químicas inducible hydroxymethylation de ADN y remodelación epigenéticos se presentan.

Metilación del ADN es una modificación epigenética estable y heredable en el genoma mamífero y participa en la regulación de expresión génica para controlar las funciones celulares. La inversión de la metilación del ADN o la desmetilación del ADN, está mediada por la familia de proteínas de translocación (TET) de diez-once de dioxygenases. Aunque se ha reportado ampliamente que aberrante metilación del ADN y desmetilación se asocian a defectos del desarrollo y cáncer, cómo estos cambios epigenéticos contribuyen directamente a la posterior alteración en la progresión de enfermedad o expresión de gen sigue siendo confuso, en gran parte debido a la falta de herramientas fiables para exactamente agregar o quitar modificaciones de ADN en el genoma en resolución temporal y espacial definido. Para superar este obstáculo, se diseñó una enzima TET2 split para permitir el control temporal de la 5-METILCITOSINA (5mC) oxidación y posterior remodelación de Estados epigenéticos en células de mamífero simplemente añadiendo productos químicos. Aquí, describimos los métodos para la introducción de una herramienta remodelación del epigenoma química-inducible (sidra), basado en una enzima ingeniería split-TET2, en células de mamífero y cuantificar la producción inducible química de la 5-hidroximetilcitosina (5hmC) con immunostaining, citometría de flujo o un análisis de dot-blot. Esta herramienta remodelación del epigenoma inducible por la química encuentra amplio uso interrogando a sistemas celulares sin alterar el código genético, así como en las relaciones epigenotype−phenotype de sondeo en diversos sistemas biológicos.

La metilación del ADN, en su mayoría se refiere a la adición de un grupo metilo a la posición del carbono 5 del citosina para formar 5-METILCITOSINA (5mC), es catalizada por la DNA metil-transferasa (DNMTs). 5mC actúa como una marca epigenética más importante en el genoma mamífero que a menudo las señales de represión transcripcional, la inactivación del X-cromosoma y transposon silenciamiento¹. La inversión de la metilación del ADN está mediada por la familia de proteínas diez elfos desplazamiento (TET). Enzimas de TET pertenecen al hierro (II) y 2-oxoglutarato dioxygenases dependiente que catalizan la oxidación sucesiva de 5mC 5-hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (fC 5) y 5-carboxycytosine (5caC). Oxidación mediada por TET 5mC impone una capa adicional de control epigenético del genoma mamífero. El descubrimiento de TET ha despertado gran interés en el campo de la epigenético para desvelar las funciones biológicas de las proteínas del TET y sus 5hmC principales productos catalíticos. 5hmC no es sólo un intermedio durante el TET-mediada activa ADN desmetilación^2,3,4, pero también actúa como un establo epigenético marca^5,6,7,8 . Aunque hydroxymethylation de ADN es altamente correlacionado con la expresión génica y aberrante cambios en ADN hydroxymethylation se asocian con algunos trastornos humanos^9,10,11, las relaciones causales entre las modificaciones epigenéticas en el ADN y los fenotipos permanecen a menudo difíciles de establecer, que se puede atribuir parcialmente a la falta de una herramienta confiable con precisión agregar o quitar modificaciones de ADN en el genoma en definida temporal y espacial resolución.

Aquí divulgamos el uso de un epigenoma químicas inducibles remodelación herramienta (sidra) para superar el obstáculo que enfrentan los estudios de las relaciones causales entre ADN hydroxymethylation y gene la transcripción. El diseño se basa en el supuesto de que el dominio catalítico de TET2 (TET2CD) puede dividirse en dos fragmentos inactivos cuando se expresa en células de mamíferos y su función enzimática puede ser restaurado por un enfoque de dimerización químicamente inducible ( Figura 1A). Para establecer un sistema split-TET2CD, se seleccionaron seis sitios en TET2CD, compuesto de una región rica en Cys y un pliegue doble hebra β-helix (DSBH), sobre la base de una estructura cristalina divulgado del complejo TET2-ADN que carece de una complejidad baja región¹². Un gen sintético que codifica proteína inducible por la rapamicina dimerización módulo FK506 12 (FKBP12) y dominio de unión a rapamicina FKBP (FRB) del blanco mamífero de rapamicina^14,15, junto con un péptido auto Hendedoras T2A polipéptido secuencia^16,17, individualmente fue insertado en los sitios de fractura seleccionados en TET2CD. La selección de TET2 como nuestro destino de ingeniería se basa en las siguientes consideraciones. En primer lugar, somáticas mutaciones en TET2 con reducción concomitante de ADN hydroxymethylation se observan con frecuencia en desordenes humanos incluyendo desordenes mieloides y cáncer¹⁰, que proporciona información útil en sitios sensibles a evitarse para inserción. En segundo lugar, una gran parte del dominio catalítico TET2, particularmente la región de baja complejidad, es prescindible para la función enzimática¹², lo que nos permite diseñar un split-TET2 minimizado por modificaciones epigenéticas inducibles. Después de evaluar más de 15 construcciones, una construcción que exhiben restauración rapamicina-inducible más alto de su actividad enzimática en el sistema mamífero fue elegida y designada como sidra¹⁸. En este documento se describe el uso de sidra etiquetada mCherry inducible ADN hydroxymethylation y remodelación epigenéticos con rapamicina y presentan tres métodos para la validación de 5hmC mediada por la sidra de producción en un sistema celular modelo HEK293T.

1. cultivo, transfección de plásmidos e inducción química de la célula

1. Cultura una línea de células adherentes (por ejemplo, el humano embrionario riñón células HEK293T) en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementada con 10% suero bovino fetal inactivado con calor, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina en 37 ° C con 5% CO₂.
2. Transfectar las células con el plásmido de sidra.
   1. Al menos 18 horas antes de la transfección, semilla 0.3 x 10⁶ células en 2,5 mL de DMEM apropiado por bien en una placa de 6 pozos e incuban las células a 37 ° C durante la noche para llegar a 60-80% de confluencia.
   2. Precalentar el reactivo de transfección a temperatura ambiente antes de usar.
   3. Lugar 250 μl de medio sin suero en un tubo estéril.
      Nota: Esta cantidad se adapta para una placa de 6 pozos con 80% de confluencia. Si es necesario, ajustar proporcionalmente los importes medio según los tamaños de placas o número de células.
   4. Añadir 2,5 μg de plásmido codificación de sidra¹⁸ o el dominio catalítico de TET2 (TET2CD como control positivo)^12,13 en el medio libre de suero y suavemente mezclar mediante pipeteo.
   5. Añadir 7,5 μl de reactivo de transfección para la mezcla diluida de ADN y suavemente mezclar mediante pipeteo.
   6. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 20-30 min.
   7. Cambiar medio precalentado y añadir la mezcla mediante goteo a los pozos y agitar suavemente la placa de cultivo celular para distribuir uniformemente la mezcla de ADN y reactivo de transfección.
   8. Incube las células y la mezcla durante la noche y vuelva a colocar el reactivo de transfección con medios con 2ml de DMEM completo fresco.
3. Inducción química
   1. Diluir 2 mM de acción de la rapamicina (disuelto en DMSO) a una concentración de 20 μm en medio mas apropiado.
   2. Añadir 20 μl de la rapamicina diluida a células transfected mantenidas en medio de 2 mL a una concentración final de 200 nM.
      Nota: Después de la incubación durante 48 h, las células están listas para la cuantificación de la generación de 5hmC o cualquier otras aplicaciones posteriores. Si es necesario, la eficacia de la inducción puede ser por sacar células cada 3 h para la cuantificación de otros 5hmC como se describe a continuación y se muestra en la figura 1.
   3. Para la mejor cuantificación de la eficacia de la inducción de 5hmC, semilla separada pozos para supervisar células cada 3 horas.

2. cuantificación de la producción de 5hmC inducida por la rapamicina por inmunotinción

1. 5hmC tinción de inmunofluorescencia
   Nota: Agregue una cantidad suficiente de la solución de fijación, compuesto de paraformaldehído al 4%, 0.2% de surfactante (como Tritón X-100) en PBS con HCl N 3, para cubrir todas las celdas de la placa. Por ejemplo, 500 μl de solución sería suficiente para un pozo en una placa de 6 pozos. Realizar todos los pasos a temperatura ambiente.
   1. Para fijar las células, agregar paraformaldehído al 4% en PBS a las células tratados con rapamicina durante 15 min a temperatura ambiente. Para el grupo de control, utilice las células expresaban mCherry sidra sin tratamiento de rapamicina. No agitar.
      PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es tóxico. Usar protección adecuada.
   2. Deseche la solución fijadora. Incube las células fijas con surfactante de 0.2% en PBS por 30 min a permeabilizar la membrana celular.
   3. Deseche la solución de permeabilización. Añadir HCl N 3 a las células permeabilized e incubar durante 15 min desnaturalizar el ADN.
   4. Desechar el tampón de HCl. agregar 100 mM Tris-HCl (pH 8.0) a las células durante 10 min para la neutralización del pH.
   5. Deseche toda la solución. Lavar las células con PBS para 3 - 5 veces. Remover minuciosamente el PBS.
      Nota: Agregue una cantidad suficiente de PBS para cada paso de lavado. Por ejemplo, 1 mL de PBS es suficiente para una placa de 6 pozos.
   6. Bloquear las células mediante la adición de la solución amortiguadora de bloqueo formado por 1% de BSA y 0.05% de surfactante (como Tween 20) en PBS durante 1 h con agitación suave.
   7. Deseche la solución de bloqueo. Añadir el anticuerpo 5hmC diluido (1: 200) a las células e incubar 2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
   8. Lavar las células con PBS 3 veces durante 15 minutos.
   9. Añadir un fluoróforo diluido (FITC)-conjugado de anticuerpo secundario (1: 200) a las células e incubar durante 1 h.
   10. Lavar las células con PBS tres veces ampliamente para eliminar anticuerpos residuales.
   11. Añadir 250 ng/mL de 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para teñir el núcleo 5 minutos retirar la solución de tinción.
   12. Montaje de la diapositiva o el fondo de cristal placa de cultivo con células immunostained para la proyección de imagen confocal. Un resultado representativo fue mostrado en la figura 1B.
2. Citometría de flujo
   Nota: Use una placa 96 pocillos redondos inferior para el siguiente procedimiento de tinción. Generalmente, 150 μL de los reactivos es suficiente para cada pozo.
   1. Resuspender las células transfected y rapamicina-inducida en tampón FACS (PBS con 1% BSA, 2 mM EDTA). Para el grupo de control, utilice sidra-expresar las células sin tratamiento de rapamicina.
   2. Fijar y permeabilizar las células como se describe en el paso 2.1.
   3. Añadir ácido clorhídrico N 2 a las células para desnaturalizar el ADN durante 10 minutos.
   4. Deseche el HCl. neutralizar y bloquear las células como se describe en el paso 2.1.
   5. Añadir un anticuerpo anti-5hmC diluido (1: 200) a las células e incubar 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
   6. Lavar las células con tampón FACS tres veces. Extraiga el tampón FACS cuidadosamente.
   7. Añadir un fluoróforo diluido (FITC)-conjugado de anticuerpo secundario (1: 400) para celular activado por fluorescencia clasificación análisis (FACS) e incubar 1 h a temperatura ambiente.
   8. Lavar las células con tampón FACS tres veces.
   9. La muestras están listas para el análisis FACS. Un resultado representativo se muestra en la figura 1-D.

3. dot-blot ensayo para cuantificar 5hmC y la 5-METILCITOSINA (5mC) asciende

1. Aislar el ADN genómico de células transfected y rapamicina-inducida utilizando un kit comercial de extracción de ADN. Para el grupo de control, utilice sidra-transfected las células sin tratamiento de rapamicina.
2. Calor de la estufa de vacío a una membrana de nitrocelulosa 80 ° C y remojo previo en agua destilada doble H₂O y luego 6 x buffer citrato salino-sódico (SSC) durante 10 minutos.
3. Carga 60 μL de cantidades iguales de DNA (total 2 μg en tampón TE) a una placa de PCR de 96 pocillos. Añadir 30 μl de tampón TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) a los pozos del resto.
4. Hacer diluciones dobles en serie vertical en la placa de 96 pocillos transfiriendo 30 μl de la solución en fila 1 en la misma posición de columna en la fila 2. Mezclar otra vez y 30 μl de solución de transferencia a los pocillos de la fila posterior hasta alcanzar el límite.

Conversión química de 5mC para 5hmC inducible puede validarse por inmunotinción a nivel unicelular, análisis de citometría de flujo en poblaciones de la célula (positivo de mCherry) transfected o un análisis más cuantitativo de dot-blot como se ilustra en la figura 1. El dominio catalítico de TET2 o TET2CD, fueron utilizados a lo largo del estudio como control positivo. Ver referencias 18-20 para más detalles sobre el mapeo del genoma de los cambios inducidos por la rapamicina en accesibilidad 5hmC y cromatina.

Figura 1: mediada por la sidra inducible hydroxymethylation de ADN en las células HEK293T. (A) diseño de una herramienta química-inducible del epigenoma de remodelación (sidra) basado en una división TET2 enzima. (B) representante immunostaining resultados en células HEK293T expresando mCherry sidra antes (panel superior) y después (panel inferior) tratamiento de rapamicina (200 nM). Verde, 5hmC rojo, sidra-mCherry, azul, DAPI tinción de núcleos. Barra de escala = 10 μm. (C) producción de mediadas de cuantificación de la sidra 5hmC por análisis de citometría de flujo. Las células HEK293T transfectadas con sidra-mCherry de TET2CD-mCherry (como control positivo) fueron teñidas con un anticuerpo primario anti-5hmc y un anticuerpo secundario marcado con FITC. Sólo TET2 (mCherry) y 5hmC (FITC) doble positivo células eran cerradas e indicadas. (D) curso temporal de la producción química inducible de 5hmC en células HEK293T expresando sidra después de la administración o retiro de la rapamicina (200 nM). n = 5, datos mostrados como media ± D.S. (E) Dot-blot ensayo para cuantificar la rapamicina-inducible cambios en los niveles de 5hmC en células HEK293T. Las células HEK293T fueron transfectadas con sidra o TET2CD construcción. Un oligonucleótido sintético con una cantidad conocida de 5hmC fue utilizado como control positivo (fila superior). El control de carga visualizado por tinción de cantidad total de ADN de entrada azul de etileno fue mostrado en el panel inferior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Aquí hemos ilustrado el uso de una enzima de split-TET2 ingeniería para lograr un control temporal de hydroxymethylation de ADN. Tras el descubrimiento de la familia de TET de 5 methycytosine dioxigenasa, se han realizado muchos estudios para descifrar las funciones biológicas de las proteínas de TET y sus principales productos catalíticos 5hmC^{1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11}. Sin embargo, temporal y preciso control sobre modificaciones del ADN en el genoma sigue siendo un desafío exigente para el campo. Nuestro sistema de sidra es uno de los pocos sistemas utilizando un ADN ingeniería modificación enzimática para llenar este vacío técnico. El protocolo descrito en este documento está diseñado sobre todo para sistemas celulares de modelo, tales como el riñón embrionario humano (HEK) 293T y las líneas celulares HeLa. Rapamicina concentraciones y tiempo de tratamiento pueden necesitar ajustarse para lograr un rendimiento óptimo en diferentes tipos celulares. Para obtener el mejor punto de tiempo de inducción de 5hmC, un experimento de curso del tiempo, como descrito en la sección 1.3.3, es muy recomendable. Inmunofluorescencia, tinción de 5hmC en las células transfected puede utilizarse como la lectura más conveniente. Un análisis más cuantitativo, se recomienda un análisis de dot-blot pero puede tomar procedimientos más laboriosos. Para los ensayos de dot-blot, las cantidades de ADN de entrada deben ser optimizadas para diferentes tipos de células. Un experimento de titulación cuidadosa mediante dilución seriada 2 veces con diferentes cantidades de carga de ADN es muy recomendable.

El sistema de sidra puede utilizarse ampliamente para diseccionar la correlación entre ADN hydroxymethylation y cambios fenotípicos en los diferentes sistemas biológicos. Los siguientes son aplicaciones posteriores ejemplares o preguntas que pueden abordarse con el sistema de sidra.

¿Cómo alterará oxidación mediada por TET 5mC el paisaje de la metilación del ADN en varios modelo de sistema celular? Esto puede ahora ser fácilmente abordar comparando el metiloma de ADN y hydroxymethylome antes y después del tratamiento de rapamicina. ¿Cómo alterará ADN hydroxymethylation modificaciones de accesibilidad y las histonas de la cromatina? Una comparación de ATAC-seq y ChIP-Seq resultados en la misma célula antes y después de la administración de rapamicina dirá la respuesta. Ya TTE proteínas juegan un papel represivo en ciertos tipos de cáncer, será interesante comprobar cómo química restauración inducible de proteína TET y 5hmC producción que inciden sobre el crecimiento tumoral. Dado el papel de TET/5hmC en la diferenciación de células madre, queda por ser determinada producción como temporal controlada de 5hmC en una etapa de transición definida tendrá un impacto en la especificación del linaje de células madre durante el desarrollo.

En su actual configuración, el sistema de sidra puede utilizarse para inducir a nivel mundial 5mc para 5hmC conversión. Idealmente, la sidra se puede fusionar con un catalítico inactivo Cas9 o su orthologues, que permitirá inducible ADN edición de metilación en el genoma y loci específicos dirigidos a. Tal epigenoma inducible por la química precisa remodelación herramienta puede ser ampliamente aplicada para probar inequívocamente las relaciones fenotipo-epigenotype en mamíferos sin alterar el código genético.

Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.

Agradecemos a la concesión de ayudas de los institutos nacionales de salud (R01GM112003 a YZ), la Fundación de Welch (BE-1913 a YZ), la sociedad americana del cáncer (RSG-16-215-01 TBE a YZ), la prevención del cáncer y Research Institute of Texas (RR140053 al albergue, RP170660 a YZ), la Asociación Americana del corazón (16IRG27250155 al albergue) y el programa de premios de investigación Fundación de John S. Dunn.