Ein veränderter Split-TET2 Enzym für chemische-induzierbaren DNA Hydroxymethylation und epigenetische Umbau

Detaillierte Protokolle für die Einführung ein veränderter Split-TET2 Enzym (Apfelwein) in Säugerzellen für chemische induzierbaren DNA-Hydroxymethylation und epigenetische Umbau werden vorgestellt.

DNA-Methylierung ist eine stabile und vererbbare epigenetische Modifikation im Säugetier-Genom und engagiert sich bei der Regulierung der Genexpression Zellfunktionen steuern. Die Umkehrung der DNA-Methylierung und DNA Demethylierung wird durch die zehn-elf-Translokation (TET)-Proteinfamilie von Dioxygenases vermittelt. Obwohl es weit berichtet wurde, dass aberrante DNA-Methylierung und Demethylierung Entwicklungsschäden und Krebs zugeordnet sind, tragen wie diese epigenetischen Veränderungen unmittelbar auf die nachträgliche Veränderung im gen-Expression oder Krankheit Fortschreiten bleibt unklar, hauptsächlich aufgrund der Mangel an zuverlässigen Tools genau hinzufügen oder Entfernen von DNA-Veränderungen im Genom mit definierten zeitlichen und räumlichen Auflösung. Um diese Hürde zu überwinden, entwarfen wir ein Split-TET2 Enzym, zeitliche Steuerung der 5-Methylcytosine (5mC) Oxidation und anschließenden Umbau des epigenetischen Staaten in Säugerzellen durch einfaches Hinzufügen von Chemikalien zu ermöglichen. Hier beschreiben wir Methoden für die Einführung einer Chemikalie-induzierbaren Epigenom umgestaltet Tools (Apfelwein), basierend auf ein Enzym entwickelt Split-TET2 in Säugetierzellen und Quantifizierung der chemischen induzierbaren Produktion des 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC) mit Immunostaining, Durchflusszytometrie oder eine Dot-Blot-Test. Diese Chemikalie-induzierbaren Epigenom Umbau Werkzeug finden breite Verwendung in Verhören zellulare Systeme ohne Veränderung des genetischen Codes sowie in Epigenotype−phenotype Beziehungen in verschiedenen biologischen Systemen zu sondieren.

DNA-Methylierung, meist bezieht sich auf die Zugabe von einer Methylgruppe an die Carbon 5 Position von Cytosin, 5-Methylcytosine (5mC) zu bilden, ist durch DNA-Methyl-Transferasen (DNMTs) katalysiert. 5mC fungiert als eine wichtige epigenetische Markierung im Säugetier-Genom, das oft für transkriptionellen Repression, X-Chromosom Inaktivierung und Transposon-Stummschaltung¹signalisiert. Die Umkehrung der DNA-Methylierung wird durch die zehn Elfen Translokation (TET) Protein-Familie vermittelt. TET Enzyme gehören zum Eisen (II) und 2 Oxoglutarate abhängigen Dioxygenases, die die aufeinanderfolgenden Oxidation von 5mC, 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-Formylcytosine (5-Fu) und 5-Carboxycytosine (5caC) katalysieren. TET-vermittelten 5mC Oxidation stellt einen zusätzlichen epigenetischen Kontrolle über das Säugetier-Genom. Die Entdeckung der TET löste intensives Interesse an epigenetischen Bereich, die biologischen Funktionen von TET Proteine und ihre katalytische Hauptprodukt 5hmC zu enthüllen. 5hmC ist nicht nur ein Zwischenprodukt während der TET-vermittelte aktive DNA Demethylierung^2,3,4, aber auch Handlungen als stabile epigenetische markieren,^5,6,7,8 . Zwar DNA Hydroxymethylation hoch korreliert mit Genexpression und aberrante sind Veränderungen der DNA-Hydroxymethylation mit einige menschliche Störungen^9,10,11, die kausale Beziehungen verbunden zwischen epigenetische Veränderungen an der DNA und die Phänotypen bleiben oft anspruchsvoll eingerichtet werden, die teilweise zugeschrieben werden kann, um den Mangel an zuverlässigen Werkzeug genau hinzufügen oder Entfernen von DNA-Veränderungen im Genom an definierten zeitlichen und räumlichen Auflösung.

Hier berichten wir über die Verwendung von einer Chemikalie-induzierbaren Epigenom Umbau Werkzeug (Apfelwein) zur Überwindung der Hürde mit Blick auf Studien von Kausalbeziehungen zwischen DNA-Hydroxymethylation und gen-Transkription. Das Design basiert auf der Annahme, dass die katalytische Domäne von TET2 (TET2CD) in zwei inaktive Fragmente ausgedrückt in Säugetierzellen aufgeteilt werden kann und seine enzymatische Funktion wiederhergestellt werden kann, indem ein chemisch induzierbare Dimerisierung Ansatz ( Abbildung 1A). Um ein Split-TET2CD-System zu etablieren, haben wir sechs Standorte in TET2CD, bestehend aus einem Cys-reiche Region und eine doppelsträngige β-Helix (DSBH) Falte, auf der Grundlage einer gemeldeten Kristallstruktur von TET2-DNA-Komplex, der eine geringe Komplexität Region¹²fehlt. Ein synthetisches Gen Kodierung Rapamycin-induzierbaren Dimerisierung Modul FK506 bindendes Protein 12 (FKBP12) und FKBP Rapamycin bindende Domäne (FRB) des Säugetier-Ziel von Rapamycin^14,15, zusammen mit einem selbst anhaftenden Peptid T2A Polypeptid Sequenz^16,17, wurde einzeln in ausgewählten Teilen Websites innerhalb TET2CD eingefügt. Die Auswahl von TET2 als unser engineering Ziel basiert auf folgenden Überlegungen. Erste, somatische Mutationen im TET2 mit gleichzeitiger Reduzierung der DNA-Hydroxymethylation sind häufig zu beobachten bei menschlichen Erkrankungen einschließlich myeloische Erkrankungen und Krebs¹⁰, liefert nützlichen Informationen auf sensiblen Standorten vermieden werden sollen einsetzen. Zweitens ist ein großer Teil der TET2 katalytische Domäne, besonders in die geringe Komplexität der Region, für die enzymatische Funktion¹², so dass wir eine minimierte Split-TET2 für induzierbaren epigenetische Modifikationen Handwerk entbehrlich. Nach der Durchleuchtung über 15 Konstrukte, wurde ein Konstrukt, das höchste Rapamycin-induzierbaren Wiederherstellung der seine enzymatische Aktivität im Säugetier-System ausgestellt gewählt und als Apfelwein¹⁸bezeichnet. Wir beschreiben hier die Verwendung des mCherry-Tags Apfelwein induzierbaren DNA-Hydroxymethylation und epigenetische Umbau mit Rapamycin zu erreichen, und drei Methoden zur Validierung von Apfelwein-vermittelten 5hmC Produktion in einem Modell Zellsystem HEK293T zu präsentieren.

(1) Zell-Kultur, Plasmid Transfection und chemische Induktion

1. Kultur eine adhärente Zell-Linie (z. B. der menschlichen embryonalen Niere HEK293T Zelle) in Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % Hitze-inaktivierten fötalen Rinderserum, 100 U/mL Penicillin und Streptomycin bei 37 ° C mit 5 % CO₂.
2. Transfizieren Sie Zellen mit dem Apfelwein-Plasmid.
   1. Mindestens 18 Stunden vor Transfektion, 0,3 x 10⁶ Samenzellen in 2,5 mL des entsprechenden DMEM pro auch in eine 6-Well-Platte und inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C über Nacht um 60-80 % Konfluenz zu erreichen.
   2. Vorwärmen des Transfection Reagens vor Gebrauch auf Raumtemperatur.
   3. Platz 250 µL serumfreien Medium in ein steriles Röhrchen.
      Hinweis: Dieser Betrag ist für eine 6-Well-Platte mit 80 % Konfluenz zugeschnitten. Passen Sie ggf. anteilig die mittlere Beträge entsprechend den Größen von Platten oder Zellzahlen.
   4. Fügen Sie 2,5 µg des Plasmids Apfelwein¹⁸ oder die katalytische Domäne von TET2-Codierung (TET2CD als Positivkontrolle)^12,13 in serumfreien Medium und sanft durch Pipettieren mischen.
   5. 7.5 µL Transfection Reagens zur verdünnten DNA-Mischung hinzugeben und vorsichtig mischen durch pipettieren.
   6. Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 20-30 min.
   7. Ändern Sie vorgewärmte Medien und fügen Sie die Mischung tropfenweise in die Vertiefungen und schütteln Sie der Zellplatte Kultur um die Transfection Reagens und DNA-Gemisch gleichmäßig zu verteilen.
   8. Inkubieren Sie Zellen und Mischung über Nacht, und ersetzen Sie die Transfektion Reagenz, Medien mit 2ml frische komplette DMEM enthält.
3. Chemische Induktion
   1. Verdünnte 2 mM von Rapamycin Lager (in DMSO gelöst) zu einer Konzentration von 20 µM in geeignete vollständige Medium.
   2. Transfizierten Zellen gepflegt in 2 mL Medium, eine Endkonzentration von 200 erreichen 20 µL verdünnter Rapamycin hinzufügen nM.
      Hinweis: Nach der Inkubation für 48 h sind Zellen für die Quantifizierung der 5hmC Generation oder downstream-Anwendungen bereit. Bei Bedarf kann die Induktion Effizienz überwacht durch Herausnehmen der Zellen alle 3 h für weitere 5hmC Quantifizierung wie unten beschrieben und in Abbildung 1dargestellt.
   3. Für bessere Quantifizierung der 5hmC Induktion Effizienz trennen Samen Brunnen um Zellen überwachen alle 3 Stunden.

2. Quantifizierung der Rapamycin-induzierte 5hmC Produktion von Immunostaining

1. 5hmC Immunfluoreszenz Färbung
   Hinweis: Fügen Sie ausreichende Mengen an die Fixierung-Lösung, bestehend aus 4 % Paraformaldehyd, 0,2 % Tensid (z. B. Triton x-100) in PBS mit 3 N HCl, um alle Zellen im Teller zu decken. Beispielsweise wäre genug für einen Brunnen in einem 6-Well-Platte 500 µL Lösung. Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur.
   1. Um Zellen zu beheben, fügen Sie 4 % Paraformaldehyd in PBS Rapamycin-behandelten Zellen für 15 min bei Raumtemperatur. Verwenden Sie für die Kontrollgruppe Zellen mit dem Ausdruck mCherry-Apfelwein ohne Rapamycin Behandlung. Nicht schütteln.
      Achtung: Paraformaldehyd ist giftig. Angemessenen Schutz zu tragen.
   2. Fixativ Lösung zu verwerfen. Inkubieren Sie fixe Zellen mit 0,2 % Tensid mit PBS-Puffer für 30 min zur Zellmembran permeabilize.
   3. Permeabilisierung Lösung zu verwerfen. Die permeabilized Zellen 3 N HCl hinzu und inkubieren Sie für 15 min, um die DNA zu denaturieren.
   4. HCl. Add 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) auf die Zellen für 10 min für die Neutralisierung des pH-Wertes zu verwerfen.
   5. Die Lösung zu verwerfen. Zellen mit PBS für gründlich waschen 3-5 Mal. Entfernen Sie PBS gründlich.
      Hinweis: Fügen Sie ausreichende Mengen an PBS für jedem Waschschritt. Zum Beispiel ist 1 mL PBS genug für eine 6-Well-Platte.
   6. Zellen zu blockieren, indem man die blockierenden Puffer, bestehend aus 1 % BSA und 0,05 % des Tensids (z. B. Tween 20) mit PBS-Puffer für 1 h mit sanft schütteln.
   7. Entsorgen Sie die blockierende Lösung. Die Zellen der verdünnten 5hmC Antikörper (1: 200) hinzu und 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° c inkubieren
   8. Waschen Sie die Zellen mit PBS drei Mal für 15 Minuten.
   9. Hinzufügen einer verdünnten Fluorophor (FITC)-konjugierten Sekundärantikörper (1: 200) zu den Zellen und 1 h inkubieren.
   10. Waschen Sie die Zellen mit PBS dreimal ausgiebig um verbleibende Antikörper zu entfernen.
   11. Fügen Sie 250 ng/mL 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) die Keimzelle für 5 min. Fleck entfernen der Färbelösung.
   12. Montieren Sie die Folie oder Glasboden Kulturschale mit Immunostained Zellen für die konfokale Bildgebung. Ein repräsentatives Ergebnis zeigte sich in Abbildung 1 b.
2. Durchflusszytometrie
   Hinweis: Verwenden Sie eine 96-Well-Runde Bodenplatte für folgende Färbeverfahren. In der Regel genügt für jedes gut 150 µL Reagenzien.
   1. Aufschwemmen Sie transfizierte und Rapamycin-induzierte Zellen in FACS Puffer (PBS mit 1 % BSA, 2 mM EDTA). Verwenden Sie für die Kontrollgruppe Apfelwein exprimierenden Zellen ohne Rapamycin Behandlung.
   2. Fix und permeabilize der Zellen, wie in Schritt 2.1 beschrieben.
   3. Fügen Sie 2 N HCl zu den Zellen, die DNA für 10 min zu denaturieren.
   4. Verwerfen Sie HCl. neutralisieren und blockieren Sie die Zellen zu, wie in Schritt 2.1 beschrieben.
   5. Die Zellen einen verdünnten Anti-5hmC-Antikörper (1: 200) hinzufügen und 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° c inkubieren
   6. Waschen Sie die Zellen mit FACS Puffer dreimal. Entfernen Sie FACS Puffer gründlich.
   7. Hinzufügen einer verdünnten Fluorophor (FITC)-konjugierten Sekundärantikörper (1: 400) für Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) Analyse und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
   8. Waschen Sie die Zellen mit FACS Puffer dreimal.
   9. Muster sind für die FACS-Analyse bereit. Ein repräsentatives Ergebnis zeigte sich in Abbildung 1-D.

(3) Dot-Blot-Test, 5hmC und 5-Methylcytosine (5mC) quantifizieren beträgt

1. Genomischen DNA aus transfizierten und Rapamycin-induzierte Zellen mit einem kommerziellen DNA Extraktion Kit zu isolieren. Verwenden Sie für die Kontrollgruppe Apfelwein-transfizierten Zellen ohne Rapamycin Behandlung.
2. Erhitzen Sie die Vakuum Ofen auf 80 ° C und Pre-Einweichen Nitrozellulose-Membran in bidestilliertem H₂O und dann 6 x Kochsalzlösung Natriumcitrat (SSC) Puffer für 10 min.
3. Laden Sie 60 µL gleiche Mengen von DNA (insgesamt 2 µg in TE-Puffer), eine 96-Well-PCR-Platte. Die übrigen Brunnen 30 µL TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) hinzufügen.
4. Stellen Sie zweifache Verdünnungsreihen vertikal auf der 96-Well-Platte durch die Übertragung von 30 µL Lösung auf Zeile 1 in der gleichen Spaltenposition in Zeile 2. Nochmals mischen und 30 µL der Lösung in die Vertiefungen in der nachfolgenden Zeile bis zum Erreichen der Grenze zu übertragen.

Chemische induzierbaren 5mC-5hmC-Umwandlung kann durch Immunostaining auf einzellige, Flow-Zytometrie-Analyse auf transfizierten (mCherry-positiv) Zell-Populationen, oder eine mehr quantitative Dot-Blot-Test wie in Abbildung 1dargestellt validiert werden. Die katalytische Domäne von TET2 oder TET2CD, wurden während der Studie als Positivkontrolle verwendet. Siehe Referenzen 18-20 für weitere Einzelheiten über die genomweite Kartierung von Rapamycin-induzierten Veränderungen in 5hmC und Chromatin Zugänglichkeit.

Abbildung 1: Apfelwein-vermittelten induzierbaren DNA Hydroxymethylation in den HEK293T Zellen. (A) Entwurf eines Chemie-induzierbaren Epigenom Umbau (Apfelwein) Tool basierend auf einer Split TET2 Enzym. (B) Vertreter Immunostaining führt zu HEK293T Zellen mit dem Ausdruck Apfelwein-mCherry vor (obere Abdeckung) und nach (untere Leiste) Rapamycin Behandlung (200 nM). Grün, 5hmC, rot, Apfelwein-mCherry, DAPI Blaufärbung der Kerne. Maßstabsleiste = 10 µm. (C) Quantifizierung der Apfelwein-vermittelten 5hmC Produktion von Flow-Zytometrie-Analyse. HEK293T Zellen mit Apfelwein-mCherry TET2CD-mCherry (als Positivkontrolle) transfiziert wurden mit einer Anti-5hmc Primärantikörper und ein FITC-markierten Sekundärantikörper gebeizt. Nur TET2 (mCherry) und 5hmC (FITC) Doppel-positiven Zellen wurden eingezäunt und angegeben. (D) zeitlichen Verlauf der induzierbaren Chemieproduktion von 5hmC in den HEK293T Zellen mit dem Ausdruck Apfelwein nach Verwaltung oder den Entzug der Rapamycin (200 nM). n = 5, Angaben als Mittelwert ± S.D. (E) Dot-Blot Assay, Rapamycin-induzierbaren Veränderungen in 5hmC in HEK293T Zellen zu quantifizieren. HEK293T Zellen wurden mit Apfelwein oder ein TET2CD Konstrukt transfiziert. Ein synthetisches Oligonukleotid mit einer bekannten Menge des 5hmC diente als Positivkontrolle (obere Zeile). Das Laden-Steuerelement visualisiert durch Ethylen blaue Färbung der Gesamtbeträge der Eingabe DNA wurde im unteren Bereich angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Hier haben wir gezeigt, die Verwendung eines technischen Split-TET2 Enzyms, zeitliche Steuerung der DNA-Hydroxymethylation zu erreichen. Nach der Entdeckung des TET-Familie von 5-Methycytosine-Dioxygenase wurden viele Studien durchgeführt, um die biologischen Funktionen von TET Proteine und ihre katalytische Hauptprodukt 5hmC^{1,2,3zu entschlüsseln, 4,5,6,7,8,9,10,11}. Jedoch weiterhin zeitliche und präzise Kontrolle über DNA-Veränderungen im Genom eine anspruchsvolle Herausforderung für das Feld. Unser Apfelwein-System ist eines der wenigen Systeme, die unter Verwendung einer veränderten DNS Enzym ändern um diese technische Lücke zu füllen. Das Protokoll beschriebenen ist vor allem für zellulären Modellsystemen, wie die menschliche embryonale Niere (HEK) 293T und die HeLa-Zelllinien zugeschnitten. Rapamycin-Konzentrationen und Behandlungszeit müssen möglicherweise angepasst werden, um optimale Leistung in verschiedene Zelltypen zu erzielen. Um herauszufinden, der beste Zeitpunkt 5hmC Induktion, wird eine Zeit-Kurs-Experiment, wie wir im Abschnitt 1.3.3, beschrieben dringend empfohlen. Immunfluoreszenz-Färbung des 5hmC in transfizierten Zellen einsetzbar als das bequemste auslesen. Für eine Quantitative Analyse eine Dot-Blot-Test wird empfohlen, aber es kann dauern, aufwendige Verfahren. Für Dot-Blot Assays müssen die Beträge der Eingabe DNA für verschiedene Zelltypen optimiert werden. Eine sorgfältige Titration Experiment mit 2-fold serielle Verdünnung mit unterschiedlichen Mengen DNA beladen wird dringend empfohlen.

Der Apfelwein-System einsetzbar im großen und ganzen die Korrelation zwischen DNA-Hydroxymethylation und phänotypischen Veränderungen in verschiedenen biologischen Systemen zu sezieren. Im folgenden sind beispielhaft downstream-Anwendungen oder Fragen, die mit dem Apfelwein-System angesprochen werden können.

Verändern TET-vermittelten 5mC Oxidation wird wie die DNA-Methylierung Landschaft in verschiedenen zellulären Modellsystem? Dies kann nun leicht behoben werden, durch den Vergleich der DNA Methylome und Hydroxymethylome vor und nach der Behandlung Rapamycin. Wie wird DNA Hydroxymethylation Chromatin Zugänglichkeit und Histon-Modifikationen verändern? Ein Vergleich der ATAC-Seq und ChIP-Seq führt in der gleichen Zelle vor und nach der Verabreichung von Rapamycin die Antwort geben wird. Da TET Proteine in bestimmte Arten von Krebs eine suppressive Rolle spielen, es wird interessant sein zu testen, wie chemische induzierbaren Wiederherstellung der TET-Protein und 5hmC Produktion wird auf das Tumorwachstum beeinflussen. Angesichts der Rolle der TET/5hmC in Stammzelldifferenzierung, bleibt es bestimmt wie zeitlich gesteuerte 5hmC-Produktion zu einem definierten Zeitpunkt Übergangszeit auf Linie Spezifikation von Stammzellen bei der Entwicklung auswirken wird.

In seiner aktuellen Konfiguration der Apfelwein-System nur lässt sich weltweit 5mc-5hmC-Konvertierung zu induzieren. Im Idealfall kann Apfelwein fusioniert werden, mit einer katalytisch inaktive Cas9 oder seine Orthologe, die Loci-spezifische Ausrichtung und induzierbaren DNA-Methylierung Bearbeitung im Genom ermöglichen wird. So präzise chemische induzierbaren Epigenom Umbau Werkzeug kann weit angewendet werden, um eindeutig die Epigenotype-Phänotyp Beziehungen bei Säugetieren Sonde ohne Veränderung des genetischen Codes.

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Wir bedanken uns bei den finanziellen Unterstützungen von den National Institutes of Health zu gewähren (R01GM112003, YZ), Welch Foundation (BE-1913 bis YZ), der American Cancer Society (RSG-16-215-01 FSME, YZ) und Cancer Prevention Research Institute of Texas (RR140053, YH, RP170660, YZ), der American Heart Association (16IRG27250155, YH), und John S. Dunn Stiftung Verbundforschung Award Programm.