אנזים פיצול-TET2 הנדסה כימית-inducible DNA Hydroxymethylation, שיפוץ Epigenetic

פרוטוקולים מפורט ידביקו אנזים פיצול מהונדסים-TET2 (סיידר) בתרבית של תאים עבור hydroxymethylation כימיים של הדנ א inducible ובניה epigenetic מוצגים.

מתילציה DNA הוא שינוי epigenetic heritable ויציבה הגנום יונקים, והוא מעורב בוויסות ביטוי גנים לשלוט תאיים. ההיפוך של מתילציה DNA, או ה-DNA demethylation, מתווך על ידי משפחת חלבונים 10-11 טרנסלוקציה (ט) dioxygenases. למרות נרחב דווח כי חריגה מתילציה DNA ו demethylation קשורים עם ליקויים התפתחותיים, סרטן, כמה שינויים epigenetic אלה תורמות בצורה ישירה משינוי עוקבות בהתקדמות ביטוי או מחלה ג'ין עדיין לא ברור, בעיקר בשל העדר כלי אמין במדויק להוסיף או להסיר שינויים DNA הגנום ברזולוציה שהוגדרו הטמפורלי, מרחבית. כדי להתגבר על המשוכה הזו, תיכננו אנזים פיצול-TET2 כדי לאפשר שליטה הטמפורלי של חמצון 5-methylcytosine (5mC) ו שיפוץ עוקבות של הברית epigenetic בתרבית של תאים על-ידי פשוט הוספת כימיקלים. כאן, אנו מתארים שיטות היכרות עם כלי שיפוץ epigenome כימית-inducible (סיידר), המבוסס על אנזים פיצול מהונדסים-TET2, לתוך תאים בתרבית של וכימות הייצור inducible כימי של 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) עם immunostaining, cytometry זרימה או וזמינותו של נקודה-כתם. כלי זה epigenome כימית-inducible שיפוץ תוכלו למצוא לשימוש נרחב חוקר מערכות סלולריות מבלי לשנות את הקוד הגנטי, וכן בודק את הקשרים epigenotype−phenotype במערכות ביולוגיות שונות.

מתילציה DNA, בעיקר מתייחס התוספת של קבוצת מתיל למיקום פחמן 5 של ציטוזין לטופס 5-methylcytosine (5mC), על ידי ה-DNA מתיל-transferases (DNMTs). 5mC משמש סימן epigenetic הגדולות הגנום יונקים כי לעיתים קרובות אותות עבור דיכוי גנים ברמת השעתוק, שמושרש איון transposon להשתיק¹. ההיפוך של מתילציה DNA מתווך על ידי משפחת חלבונים 10-העלפים טרנסלוקציה (ט). אנזימים ט שייכים הברזל (II) ו- 2-oxoglutarate dioxygenases תלויים אשר לעודד חמצון רצופים של 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), 5-carboxycytosine (5caC). 5mC בתיווך ט חמצון כופה על שכבה נוספת של שליטה epigenetic על הגנום יונקים. גילוי ט עוררה עניין אינטנסיבי בתחום epigenetic לחשוף את תפקודים ביולוגיים של חלבונים ט ו 5hmC מוצר קטליטי גדולה שלהם. 5hmC אינה רק ביניים במהלך בתיווך ט הפעיל DNA demethylation^2,3,4, אלא גם פועלת כמו אורווה epigenetic לסמן^5,6,7,8 . למרות hydroxymethylation ה-DNA הוא מאוד מתואם עם ביטוי גנים וסוטה שינויים ב- DNA hydroxymethylation משויכים כמה הפרעות האדם^9,10,11, הקשרים סיבתי בין שינויים epigenetic על ה-DNA על הפנוטיפים לעיתים קרובות להישאר מאתגר שתוקם, אשר יכול להיות חלקית המיוחס חוסר כלי אמין במדויק להוסיף או להסיר שינויים DNA הגנום-שהוגדרו הטמפורלי, מרחבית רזולוציה.

כאן אנחנו מדווחים על השימוש epigenome כימית-inducible שיפוץ כלי (סיידר) להתגבר על המשוכה מול מחקרים של קשרים סיבתי בין שעתוק DNA hydroxymethylation, ג'ין. העיצוב מבוסס על ההנחה כי תחום קטליטי של TET2 (TET2CD) ניתן לפצל לשני מקטעים שאינם פעילים כשאני לידי ביטוי בתרבית של תאים, תפקידה אנזימטי ניתן לשחזר על-ידי נקיטת גישה dimerization כימית inducible ( איור 1A). להקים מערכת פיצול-TET2CD, בחרנו 6 אתרי ב TET2CD, מורכב של אזור עשיר Cys קיפול כפול גדילי β-סליל (DSBH), על בסיס מבנה קריסטל המדווחת של מתחם TET2-DNA חסר מורכבות נמוכה באזור¹². גן סינתטי קידוד dimerization rapamycin-inducible מודול FK506 מחייב חלבון 12 (FKBP12) ובתחום FKBP rapamycin מחייב (FRB) של מטרת יונקים rapamycin^14,15, יחד עם פפטיד שהפריד עצמית T2A מפוליפפטיד רצף^16,17, הוכנס בנפרד האתרים שנבחרו פיצול בתוך TET2CD. הבחירה של TET2 המטרה הנדסה מבוססת על השיקולים הבאים. מוטציות הראשון, סומאטית TET2 עם צמצום והמצוות DNA hydroxymethylation הם נצפו לעתים קרובות בהפרעות האנושי, כולל הפרעות מיאלואידית סרטן¹⁰, אשר מספק מידע שימושי באתרי רגיש כדי להימנע במשך ההכנסה. שנית, חלק גדול של התחום קטליטי TET2, במיוחד באזור מורכבות נמוכה, היא לוותר על הפונקציה אנזימטי¹², ובכך מאפשר לנו מלאכה של TET2-פיצול הממוזערת עבור שינויים epigenetic inducible. לאחר הקרנת בונה מעל 15, מבנה זה הציג שחזור rapamycin-inducible הגבוהה של פעילותה אנזימטי למערכת יונקים היה נבחר, כמנהל סיידר¹⁸. אנחנו מתארים בזאת את השימוש מתויג mCherry סיידר כדי להשיג inducible DNA hydroxymethylation ובניה epigenetic עם rapamycin, להציג שלוש שיטות אימות 5hmC בתיווך סיידר ייצור מערכת סלולרית דגם HEK293T.

1. תא תרבות, פלסמיד תרביות תאים, אינדוקציה כימי

1. תרבות תא חסיד קו (למשל, האדם מתחלקים הכליה תא HEK293T) הנשר של Dulbecco ששונה בינוני (DMEM), בתוספת 10% לא פעיל חום העובר שור סרום 100 פניצילין U/mL, סטרפטומיצין ב 37 ° C עם 5% CO₂.
2. Transfect תאים עם פלסמיד סיידר.
   1. לפחות 18 h לפני תרביות תאים, זרע 0.3 x 10⁶ תאים 2.5 מ של DMEM המתאים לכל טוב בצלחת 6-ובכן, דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי להגיע confluency 60-80%.
   2. לחמם הכימית תרביות תאים לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
   3. µL 250 במקום ללא סרום בינוני בשפופרת סטרילי.
      הערה: סכום זה הוא מותאם לצלחת 6-ובכן עם 80% confluency. אם יש צורך, באופן פרופורציונלי להתאים את הכמויות בינוני לפי הגדלים של צלחות או מספרי הטלפון הנייד.
   4. להוסיף 2.5 µg של פלסמיד קידוד סיידר¹⁸ או את תחום קטליטי TET2 (TET2CD כפקד חיובי)^12,13 בתוך המדיום ללא סרום, בעדינות לערבב על ידי pipetting.
   5. מוסיפים את µL 7.5 של תרביות תאים ריאגנט לתערובת DNA מדולל ומערבבים בעדינות על-ידי pipetting.
   6. דגירה התערובת בטמפרטורת החדר למשך 20-30 דקות.
   7. שנה מדיה מראש ומחוממת, להוסיף את התערובת drop-wise הבארות ולאחר לנער בעדינות את הצלחת תרבות תא לפיזור אחיד של תרביות תאים ריאגנט של ה-DNA תערובת.
   8. דגירה התאים ואת תערובת בין לילה, ולאחר מכן החלף הכימית תרביות תאים המכילים מדיה עם 2 מ של טרי DMEM מלאה.
3. אינדוקציה כימי
   1. שתדללו 2 מ מ של המניה rapamycin (מומס דימתיל סולפוקסיד) ריכוז של 20 מיקרומטר המתאים בינוני מלא.
   2. להוסיף 20 µL של rapamycin מדולל לתאים transfected בהשתתפות 2 mL בינוני להגיע ריכוז סופי של 200 ננומטר.
      הערה: לאחר דגירה של 48 שעות, תאים הם מוכנים כימות של דור 5hmC או יישומים אחרים במורד הזרם. במידת הצורך, אינדוקציה יכול להיות במעקב על ידי הוצאת תאי כל 3 שעות על 5hmC כימות עוד יותר, כפי שמתואר להלן ויעילות המוצג באיור1.
   3. על כימות יותר של יעילות אינדוקציה 5hmC, זרע נפרדים בארות כדי לעקוב אחר תאים כל 3 שעות.

2. כימות של ייצור Rapamycin-induced 5hmC על ידי Immunostaining

1. 5hmC immunofluorescence מכתים
   הערה: להוסיף כמויות מספיקות של הפתרון קיבעון, המורכבת paraformaldehyde 4%, 0.2% חומרים פעילי שטח (כגון טריטון X-100) ב- PBS עם HCl N 3, כדי לכסות את כל התאים בצלחת. לדוגמה, µL 500 של פתרון יהיה מספיק טוב בצלחת 6-. טוב. בצע את כל השלבים בטמפרטורת החדר.
   1. כדי לתקן תאים, להוסיף paraformaldehyde 4% ב- PBS לתאים שטופלו rapamycin למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. עבור קבוצת בקרה, להשתמש בתאים המבטאים mCherry-סיידר ללא טיפול rapamycin. לא להתסיס.
      התראה: Paraformaldehyde הוא רעיל. לענוד הגנה הולמת.
   2. למחוק פתרון מקבע. דגירה תאים קבוע עם חומרים פעילי שטח 0.2% ב- PBS למשך 30 דקות כדי permeabilize את קרום התא.
   3. למחוק פתרון permeabilization. להוסיף 3 N HCl תאים permeabilized, תקופת דגירה של 15 דקות denature את ה-DNA.
   4. להתעלם HCl. הוסף 100 מ מ טריס-HCl מאגר (pH 8.0) על התאים במשך 10 דקות על נטרול של pH.
   5. למחוק את כל הפתרון. לשטוף את התאים ביסודיות עם PBS במשך 3 - 5 פעמים. הסר PBS ביסודיות.
      הערה: להוסיף כמויות מספיקות של PBS על כל צעד לשטוף. לדוגמה, 1 מ"ל של PBS מספיקה צלחת 6-. טוב.
   6. לחסום תאים על-ידי הוספת המאגר חסימה הכוללת BSA 1% ל- 0.05% של חומרים פעילי שטח (כגון Tween 20) ב- PBS עבור h 1 ברעידות עדין.
   7. לבטל את הפתרון חסימה. להוסיף הנוגדן 5hmC מדולל (1:200) התאים, תקופת דגירה של 2 h בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 º C.
   8. לשטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים למשך 15 דקות.
   9. להוסיף על fluorophore מדולל (FITC)-מצומדת נוגדנים משניים (1:200) על התאים ואת תקופת דגירה של 1 h.
   10. לשטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים בהרחבה כדי להסיר שאריות נוגדנים.
   11. להוסיף 250 ננוגרם למ"ל של 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) כדי להכתים את הגרעין של 5 דק. הסר הפתרון מוכתמים.
   12. הר המנה תרבות שקופיות או זכוכית-התחתון עם immunostained תאים עבור הדמיה קונפוקלי. תוצאה נציג היה באיור איור 1B.
2. Cytometry זרימה
   הערה: השתמש צלחת תחתית עגולה 96-ובכן מכתימים שהפרוצדורה הבאה. בדרך כלל, µL 150 של ריאגנטים מספיקה עבור כל טוב.
   1. Resuspend תאים transfected ו הנוצרות על-ידי rapamycin במאגר FACS (PBS עם BSA 1%, 2 מ מ EDTA). עבור קבוצת בקרה, השתמש לבטא סיידר תאים ללא טיפול rapamycin.
   2. לתקן, permeabilize את התאים כפי שמתואר בשלב 2.1.
   3. להוסיף 2 N HCl לתאים כדי denature את ה-DNA למשך 10 דקות.
   4. למחוק HCl. נטרול וחסום את התאים כפי שמתואר בשלב 2.1.
   5. להוסיף של נוגדן anti מדולל-5hmC (1:200) התאים, תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר או ללון ב- 4 מעלות צלזיוס.
   6. לשטוף את התאים באמצעות מאגר FACS שלוש פעמים. הסר את מאגר FACS ביסודיות.
   7. להוסיף על fluorophore מדולל (FITC)-מצומדת נוגדנים משניים (1:400) עבור תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) ניתוח ולאחר תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר.
   8. לשטוף את התאים באמצעות מאגר FACS שלוש פעמים.
   9. דוגמאות מוכנים לניתוח FACS. תוצאה נציג היה באיור איור 1C-D.

3. dot-כתם Assay לכמת 5hmC ו- 5-methylcytosine (5mC) סכומים

1. לבודד דנ א גנומי מתאי transfected ו הנוצרות על-ידי rapamycin באמצעות ערכת חילוץ DNA מסחרי. עבור קבוצת בקרה, השתמש transfected סיידר תאים ללא טיפול rapamycin.
2. מחממים תנור ואקום ל 80 ° C ומשרים קדם ממברנה ניטרוצלולוזה מזוקק פעמיים H₂O ואחר ב 6 x מאגר תמיסת מלח-נתרן ציטראט (האס) למשך 10 דקות.
3. לטעון µL 60 של כמויות שוות של DNA (סה כ 2 µg במאגר טה) על צלחת PCR 96-ובכן. להוסיף 30 µL טה מאגר (10 מ מ טריס-HCl, 1 מ"מ EDTA, pH 8.0) הבארות מנוחה.
4. להפוך דילולים טורי כפולה אנכית על הצלחת 96-ובכן על-ידי העברת 30 µL של פתרון בשורה 1 לאותו מיקום עמודה בשורה 2. לערבב שוב, להעביר 30 µL של פתרון הבארות בשורה הבאים עד שהגיע לגבול.

המרה כימית 5mC-אל-5hmC inducible הניתנים לאימות על ידי immunostaining ברמה תא בודד, ניתוח cytometry זרימה על אוכלוסיות transfected תא (mCherry-חיוביים), או assay דוט-חשופה יותר כמותיים כמופיע באיור1. תחום קטליטי של TET2, או TET2CD, שימשו לאורך כל תקופת המחקר כפקד חיובי. ראה הפניות 18-20 פרטים נוספים לגבי מיפוי הגנום כולו rapamycin-induced שינויים בנגישות 5hmC וכרומטין.

איור 1: בתיווך סיידר hydroxymethylation DNA inducible בתאים HEK293T. (א) העיצוב של כלי איחוי (סיידר) epigenome כימית-inducible בהתבסס על פיצול האנזים TET2. (B) נציג immunostaining תוצאות בתאים HEK293T לבטא סיידר-mCherry לפני (החלונית העליונה) ואחרי (החלונית התחתונה) rapamycin טיפול (200 ננומטר). ירוק, 5hmC, אדום, סיידר-mCherry, כחול, דאפי מכתים של גרעין האטום. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (ג) 5hmC בתיווך כימות של סיידר הייצור על ידי ניתוח cytometry זרימה. תאים HEK293T transfected עם סיידר-mCherry של TET2CD-mCherry (כמו בקרה חיובית) היו מוכתמים נוגדן anti-5hmc העיקרי של נוגדן משני התווית על-ידי FITC. רק TET2 (mCherry), 5hmC (FITC) תאי זוגית-חיוביות היו מגודרת ומצוינות. (ד) מסלול הזמן כימיים inducible הייצור של 5hmC בתאים HEK293T לבטא סיידר בעקבות ניהול או נסיגה של rapamycin (200 ננומטר). n = 5, הנתונים המוצג כ זאת אומרת ± ש (E) נקודה-כתם assay לכמת rapamycin-inducible שינויים ברמות 5hmC בתאים HEK293T. HEK293T התאים היו transfected עם הבונה סיידר או TET2CD. Oligonucleotide סינתטי עם כמות ידועה של 5hmC שימש פקד חיובי (שורה עליונה). הפקד הטעינה דמיינו ידי אתילן כחול צביעה של סכומים כוללים של DNA קלט היה מוצגים בחלונית התחתונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

כאן אנחנו יש מאויר השימוש של אנזים פיצול מהונדסים-TET2 כדי להשיג שליטה הטמפורלי של דנ א hydroxymethylation. בעקבות הגילוי של משפחת ט 5-methycytosine dioxygenase, בוצעו מחקרים רבים לפענח בפונקציות ביולוגיות של חלבונים ט ו שלהם מוצר קטליטי גדולה 5hmC^{1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11}. עם זאת, שליטה טמפורלית ומדויק על שינויים DNA הגנום ממשיכה להיות אתגר בדרישה עבור השדה. מערכת סיידר שלנו היא אחת ממערכות כמה ניצול DNA מהונדס שינוי אנזים כדי למלא את הפער הטכני הזה. הפרוטוקול המתואר במסמך זה בעיקר המותאם במיוחד עבור דגם מערכות סלולריות, כגון כליות עובריים אנושיים (HEK) 293T והקווים התא הלה. Rapamycin ריכוז וזמן הטיפול ייתכן שיהיה צורך להתאימם כדי להשיג ביצועים מיטביים סוגי תאים שונים. כדי לגלות את נקודת הזמן אינדוקציה 5hmC הטוב ביותר, ניסוי כמובן זמן, כפי שהסברנו בסעיף 1.3.3, מומלץ מאוד. Immunofluorescence מכתים של 5hmC בתאים transfected יכול לשמש גם המדידה הנוח ביותר. עבור ניתוח כמותי יותר, וזמינותו נקודה-כתם מומלץ אבל זה עלול לקחת יותר מפרך הליכים. עבור מבחני דוט-כתם, הכמויות של DNA קלט חייב להיות אופטימיזציה עבור סוגי תאים שונים. ניסוי טיטור זהיר באמצעות דילול טורי 2-fold עם משתנה כמויות טעינת ה-DNA, הוא מומלץ מאוד.

מערכת סיידר ניתן להשתמש בהרחבה לנתח את הקשר בין DNA hydroxymethylation לבין פנוטיפי שינויים במערכות ביולוגיות שונות. להלן מפורטות למופת במורד הזרם ליישומים או שאלות ניתן לטפל באמצעות מערכת סיידר.

איך 5mC בתיווך ט חמצון תשנה את הנוף מתילציה של הדנ א במערכת התאית דגם שונים? זו עכשיו ניתן בקלות לטפל על-ידי השוואת DNA methylome של hydroxymethylome לפני ואחרי טיפול rapamycin. איך תשנה דנ א hydroxymethylation על שינויים נגישות ו היסטון כרומטין? השוואה בין האטא ק-seq שבב-Seq תוצאות באותו התא לפני ואחרי מינהל rapamycin יגיד את התשובה. מאז ט חלבונים לשחק תפקיד מדכאים סוגים מסוימים של סרטן, זה יהיה מעניין לבחון כיצד כימי inducible שיקום של חלבון ט, 5hmC הייצור לפגוע הגידול. בהתחשב בתפקיד ט/5hmC ב התמיינות תאי גזע, זה נשאר להיות נחוש הפקה 5hmC איך חנותם מבוקר בשלב transitionary מוגדרים ישפיעו על מפרט שושלת היוחסין של תאי גזע במהלך הפיתוח.

במתכונתה הנוכחית, המערכת סיידר בלבד ניתן להשתמש לזירוז באופן גלובלי המרה 5mc-אל-5hmC. באופן אידיאלי, סיידר יכולה נכרכים עם Cas9 catalytically-לא פעיל או orthologues שלה, אשר יאפשר מיקוד ספציפי לוקוסים ועריכה inducible DNA מתילציה הגנום. Epigenome כימית-inducible מדויק כזה שיפוץ כלי ניתן להחיל באופן נרחב כדי חד משמעית לחקור את היחסים epigenotype-פנוטיפ ביונקים מבלי לשנות את הקוד הגנטי.

המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

אנו מודים הפיננסי תומך של מכוני הבריאות הלאומיים הענק (R01GM112003 כדי yz ימאהה), קרן Welch (להיות-1913 על yz ימאהה) האגודה האמריקנית לסרטן (TBE RSG-16-215-01 כדי yz ימאהה), מניעת סרטן, מכון המחקר של טקסס (RR140053 ל יד הנדיב, RP170660 כדי yz ימאהה), איגוד הלב האמריקאי (16IRG27250155 על יד הנדיב), לבין התוכנית פרס קרן דן ג'ון ס מחקר משותף.