자기 공명 영상 준비, 정화하고, 명암 요원 이용 란탄족 단지의 특성화

우리는 metalation, 정화 및 란탄족 단지의 특성을 보여줍니다. 여기에서 설명한 단지는 자기 공명 영상을 사용하여 이러한 분자의 추적 활성화 macromolecules하는 복합 수 있습니다.

Polyaminopolycarboxylate 기반 리간드는 일반적으로 란탄족 이온을 킬레이트하는 데 사용하고, 그 결과 단지는 자기 공명 영상 (MRI)에 대한 대비를 대리인으로 유용합니다. 그들이 기능을 빠르고, 높은 순도를 허용 그룹 및 아민 반응 활성 에스테르 및 isothiocyanate 그룹 또는 thiol 반응 maleimides 통해 macromolecules 및 biomolecules에 높은 항복 활용을 포함하기 때문에 많은 상용 리간드 특히 유용합니다. 이러한 리간드의 metalation가 bioconjugation 화학, metalation 절차에 미묘한 차이의 분야에서 일반적인 지식으로 간주되는 동안 금속 시작 재료를 선택할 때 고려되어야합니다. 또한, 정화 및 특성이 존재하고, 가장 효과적인 절차의 선택에 대한 여러 옵션을 부분적으로 시작 물질의 선택에 따라 달라집니다. 이러한 미묘한 차이는 종종 출판 프로토콜에서 무시됩니다. 여기, 우리의 목표는 metalation, 정화하고, MRI (그​​림 1)에 대한 대비 에이전트로 사용할 수 있습니다 란탄족 단지의 특성화를위한 일반적인 방법을 입증하는 것입니다. 우리는이 책자는 생명 의학 과학자 시작 자료 및 정화 방법의 선택을 완화하여 일반적으로 사용되는 반응을 자신의 레퍼토리에 란탄족 complexation 반응을 통합할 수있게 것으로 기대합니다.

1. LnCl ₃ 소금을 사용 Metalation

1. 30-265 mm의 솔루션을 생산하기 위해 물속에 리간드를 해산. 리간드 2 - (4 - isothiocyanatobenzyl) diethylenetriamine pentaacetic의 산성 (P - SCN - BN - DTPA)는 73 mm의 농도에서이 비디오에 사용되었습니다.
2. 1 M NH ₄ OH를 추가하여 5.5 및 7.0 사이의 리간드의 솔루션의 산도를 조정합니다. 이 비디오에서, 1 M NH ₄ OH 솔루션의 0.2 ML 사용되었다.
3. 5,000에서 1,000 사이 mm의 농도와 솔루션을 생산하기 위해 물에 LnCl _세 1-2에 상응하는 디졸브. 이 비디오에서는 EuCl ₃ GdCl ₃ 111 mm의 농도에 사용되었습니다. 금속의 초과는 종종 완료 metalation을 유도하고 결과적으로 정화 작업을 단순화하는 데 사용됩니다.
4. 교반하면서 리간드의 솔루션에 LnCl ₃ 솔루션을 추가합니다.
5. LnCl ₃ 추가 후, 0.2 M NH ₄ OH를 추가하여 5.5 및 7.0 사이에 발생하는 반응 혼합물의 산도를 조정합니다. 0.2 M NH ₄ OH 솔루션의 0.5 ML 총이 동영상에 사용되었습니다. 귀하의 리간드가 산성에 민감한 기능 그룹을 포함하는 경우이 단계에서 산도를 여러 번 조정합니다. 주의 - 솔루션도 기본되면 모든 기본 기능 민감한 그룹, isothiocyanate와 같은 활용을 위해 사용할 수 없게 표시됩니다.
6. 산도 측정을 통해 반응을 모니터링합니다. 산도 상수 남아 때 반응이 완료됩니다.

2. 육아 산도의 검사 결과 (이 동영상에 포함되어 있지만, 기본 기능에 민감한 그룹없이 리간드에 도움되지 않음)

1. ≥ 11 산도를 조절하기 위해 반응 혼합물에 NH ₄ OH를 집중 추가합니다. 이 단계는 불용성 수산화 같은 uncomplexed 금속을 촉진합니다.
2. 0.2 μm의 필터를 통해 뜨는을 필터링합니다. 반응 혼합물은 필터를 나막신 경우, centrifuging 사전 필터링 decanting 권장합니다.
3. 투석을 수행하지 않는 경우, 압력 감소 (회전 증발 또는 동결 건조 권장)에서 용매 제거합니다.
4. 무료 란탄족가 남아있을 경우 단계 2.1-2.3 반복 수 있습니다.

3. 투석 검사 결과

1. 추가 길이 (샘플 볼륨의 약 10 %) 떠나면서 샘플 볼륨을 개최 적절한 길이 (제조 업체의 지침을 따르십)에 투석 튜브 컷. 이 비디오에서는 100-500 달튼 분자량 컷 - 오프 (MWCO) 멤브레인 사용되었지만, 활용이 metalation하기 전에 수행하는 경우 큰 MWCO 튜빙을 적절하게 사용할 수 있습니다. 또한, 투석 카세트가 원하는 경우 투석 튜브에 대한 대안으로 사용할 수 있습니다.
2. 제조 업체의 지침에 따라 해당되는 경우, 주변 온도에서 15 분 물에 컷 투석 튜브를 만끽해보세요.
3. 물 (dialysate)와 투석 저수지 (1 L의 비커이 동영상에 사용되었습니다) 입력합니다. dialysate 볼륨은 약 100x 그 샘플의해야합니다.
4. 팔짱을 두 번 튜브 끝과 투석 폐쇄 클램프로 튜브의 접힌 부분을 확보. 그것이 투석 도중에 폐쇄 상태를 유지하기 위해 고무 밴드와 폐쇄의 끝을 넣어.
5. 0.2 μm의 필터를 통해 반응 혼합물을 필터와 튜브를 찢어하지 않도록주의되는 튜브의 오픈 엔드에 여과물를로드합니다. 튜브를 닫습니다 충분한 머리 공간을 남겨주십시오.
6. 두 번, 폐쇄와 함께 안전하고, 단계 3.4에서와 같이 고무 밴드로 폐쇄 랩 튜브의 나머지 열린 끝을 접으십시오.
7. 고무 밴드를 사용하여 투석 튜브의 한쪽 끝을에서 클램프에 공기가 들어있는 유리관을 연결합니다. 다른 클램프로 모래가 담긴 병을 연결합니다. 이러한 튜브는 튜브가 dialysate에 포장되어 유지되었는지 확인합니다.
8. dialysate를 포함 투석 저수지에 전체 튜브를 놓습니다.
9. 주위 온도에서 느린 속도 (없음 vortexing)에서 자기 저어 접시를 사용하여 dialysate을 저어.
10. 하루 코스 (이 동영상에 dialysate가 2.5, 6.5, 및 11.5 H로 변경되었습니다)을 통해 배 dialysate를 변경하고 (투석의 20-28 H 총) 투석은 밤새 계속하실 수 있습니다.
11. dialysate에서 투석 튜브를 제거하고 신중하게 샘플을 제거 한 폐쇄를 엽니다. 물로 배 투석 튜브를 세척하고 샘플로 세탁을 결합.
12. 감소 압력 하에서 물을 제거합니다. 프리즈 건조는이 동영상에서 사용됩니다.

4. 무료로 금속의 존재를 평가

1. 아세테이트 버퍼에있는 금속 복잡한 디졸브 (버퍼 준비 : 400 ML의 물 속에 초산 1.4 ML를 해산, 1 M NH ₄ OH와 5.8으로 산도를 조정, 500 ML 총 볼륨을 생성하는 물을 추가) 및 xylenol을 추가 주황색 표시등 (산도 5.8 버퍼에서 16 μm의). 이 비디오에서는 단지 0.3 MG는 버퍼의 0.3 ML에 해산되었으며 지표 솔루션 3 ML이 추가되었습니다.
2. 보라색에 노란색에서 표시기의 색상 변화의 관찰을 통해 무료로 금속의 존재를 감지합니다.
3. 원하는 경우, 무료 금속의 금액은 교정 곡선 ^1을 만들어 계량하실 수 있습니다. 또는 염료 arsenazo III는 xylenol 오렌지 ² 대신 사용할 수 있습니다. 무료로 금속이 남아있을 경우 예제는 더 이상 이전 특성에 투석, 탈염 열, 또는 고성능 액체 크로마 토그래피 (HPLC)를 사용하여 정화되어야합니다.

5. 수상 조정 번호 (Q)의 결정

1. H ₂ O에서 복잡한 (~ 1 ㎜)을 포함하는 ^III - EU의 솔루션과 D ₂ O.에서 같은 농도의 다른 솔루션을 준비 이전 분석, D ₂ O 솔루션은 잔류 H ₂ O.을 제거하는 세 번 증발와 D ₂ O에 용해되어야합니다
2. 깨끗한 쿠베트에 물 솔루션을 추가하고, spectrofluorometer에 쿠베트를 놓습니다.
3. 각 (~ 395 nm의와 ~ 595 nm의, 각각)의 맥시멈을 결정하기 위해 여기와 방출 스캔을 수행합니다.
4. 여기와 단계 5.3 여기 및 발광 슬릿 너비 (5 NM), 플래시 개수 (100), 초기 지연 (0.01 MS), 최대 지연 (13 MS)에서 결정 방출 파장 다음 매개 변수를 사용하여 인광 시간 붕괴 실험을 수행 및 지연 증가 (0.1 MS). 이러한 조건은 대부분의 단지에 적합하지만, 최대 지연과 증가 값은 매우 긴 또는 극단적으로 짧은 붕괴 시간과 함께 증가 또는 종족에 대한 감소 수 있습니다.
5. 단계 5.1 준비 D ₂ O 솔루션 단계 5.4를 반복합니다.
6. 5.4 및 5.5에서 얻어진 발광 - 붕괴의 데이터에서, 강도 대 시간의 자연 로그를 플롯. 이 라인의 경사가 붕괴 속도 (τ ^-1) (그림 2)입니다. 이 비디오에서 Microsoft Excel 2007 원시 데이터에서 자연 로그 플롯을 생성하는 데 사용되었다. 호록스 및 동료 (EQ 1) ³ 개발한 방정식의 붕괴 속도를 사용합니다. 귀하의 리간드가 금속에 맞춰 조정 OH 또는 NH 그룹을 포함하는 경우, 다음 방정식이 사용하는 ^세 전에 수정해야합니다.

EQ 1 :

6. Relaxivity 측정

1. T ₁ (세로 완화 시간) 또는 T ₂ (가로 휴식 시간) 휴식 시간 분석기에 원하는 응용 프로그램 모드를 선택합니다.
2. GD의 다른 농도 ^III 함유 수성 용매에서 복잡한을 포함 샘플 시리즈를 준비합니다. 이 비디오에서는, 물은 0.625, 1.25, 2.50, 5.00, 10.0의 용매 및 솔루션으로 사용되었다, 0 MM이 준비되었습니다. 기타 수성 용매 또는 버퍼를 사용하지만, 그것은 빈으로 솔벤트를 사용하는 것이 중요합니다 수 있습니다. 예제의 마지막 볼륨 사용되고있는 악기에만 적용됩니다.
3. 악기의 샘플을 장소와 그것이 악기 (37 ° C이 비디오에서)의 온도 평형 5 분 앉아 보자.
4. T ₁ T ₂ (T _1과 T ₂ 대표적인 곡선 그림 3에 표시됩니다)에 대한 원활한 지수 곡선을 얻기 위해 소프트웨어의 매개 변수를 조정하여 휴식 시간 (s의 단위)를 확인합니다.
5. 단계 6.3 및 빈 포함한 모든 샘플 6.4 반복합니다.
6. S ^-1 단위로 측정된 T ₁ T ₂ 값의 역수를 계산합니다.
7. T ₁ ^-1 또는 T GD ^{III 농도} 비교 ₂ ^-1 값 (mm의 단위) 플롯. 때문에 GD ^III -가 포함된 단지의 흡습 특성, 원자 흡수 분광 광도법 또는 유도 결합 플라즈마 질량 분광법을 사용하여 GD ^III의 농도를 확인합니다. 직선과 줄거리를 맞습니다. 대표 플롯은 그림 4에 표시됩니다.
8. 장착되어 라인의 경사가 relaxivity (T _1과 T ₂ 각각에 대한 R ₁ R _2)이며, MM ^-1 S ^-1의 단위를했다.

7. 대표 결과

이 프로토콜에서 설명하는 단계에 대한 대표적인 데이터는 테이블과 인물 섹션에 포함되었습니다. 프로토콜에서 설명한 물 조정 번호와 relaxivity 특성화 이외에, 그것은 표준 화학 기술을 사용하여 최종 제품을 특성화하는 것이 중요합니다. 및 EU ^III -가 포함된 단지는 그림 5에 표시된 - 화합물의 신분은 질량 분광법 및 질량 스펙트럼 대표 GD ^III에 대한 진단 동위 원소 패턴을 보여주는을 사용하여 얻을 수있다. 또한, 비 - GD ^III에 대한 란탄족 함유 단지, NMR 분광법은 제품의 식별에 사용될 수 있습니다. 복합 순도, HPLC 또는 원소 분석을 특성화 또는 둘 모두를 사용할 수 있습니다.

그림 1 metalation 및 정화를위한 일반적인 제도 :. 제도 metalation와 다른 정화 경로를 선택하는 이유에 대한 일반적인 절차를 묘사.

그림 2 - 발광 강도를 줄거리 :. 강도 비교 섹션에서 5 시간의 자연 로그의 대표 플롯. 물, D ₂ O 솔루션에 대한 인수와 비슷한 곡선에서 생성된 라인의 슬로프는 EU의 물 조정 번호 ^III 함유 단지를 특성화 EQ 1 사용됩니다.

그림 3 휴식 붕괴 시간 곡선 :. (왼쪽) T ₁ (오른쪽) _T이 취득 대표 데이터입니다. 이러한 곡선 모양의 편차가 신뢰할 데이터를 생산합니다.

그림 4 Relaxivity 결정 :. GD ^III의 농도 비교 1 / T ₁ 대표 플롯. 장착되어 라인의 경사가 relaxivity이며 MM ^-1 S ^-1의 단위를했다.

그림 5 질량 스펙트럼 :.위한 진단 동위 원소 패턴을 보여주는 대표적인 질량 스펙트럼 (왼쪽) GD ^III 함유 단지과 (오른쪽) 약속 ^III 함유 단지 있습니다. 검은 가우스 봉우리는 이론 동위 원소 분포를 나타내며 빨간색 라인은 실제 데이터입니다.

란탄족 기반 대비 요원 ^4-14을 포함 출판물의 증가 감안할 때, 그것은 치료가, 준비 정화하고, 재현성과 유사한 결과를 보장하기 위해 제품을 특성화로 촬영하는 것이 중요합니다. 이 단지는 종종 정화하고 상자 성체의 자연과 bioconjugation 사용할 수있는 기능 그룹의 감도에 따라 유기 분자에 상대적 성격 도전 간주됩니다. 우리는 란탄족 단지의 합성, 정제 및 특성에 대한 일반적인 방법을 설명합니다. 그러나 이러한 방법 중 하나를 선택할 때 그것은 연구되고있는 특정 시스템을 고려하는 것이 중요합니다.

complexation 반응에서 상업적으로 사용할 수있는 금속 소금의 다​​양한 사용과 소금의 선택은 연구의 목적에 따라 수 있습니다. 예를 들어, 염화 (또는 triflate 또는 질산) 소금을 사용하는 장점은 비교적 온화 조건이 온도와 관련하여 필요한 것입니다. 그러나 이러한 방법은 산도주의 모니터링을 필요로하고 부산물로 소금을 생산합니다. 공부중인 시스템이 산도의 변화에​​ 특히 민감한있다면 산도주의 모니터링 및 제어가 수행되어야합니다. 또한, 소금 부산물이 연구되고있는 시스템에 해로운 될 경우, 그들은 제거되어야합니다 또는 다른 합성을 사용해야합니다. 자료 시작 란탄족 수산화 (또는 산화물)와 함께, 높은 온도 때문에 이러한 종류의 낮은 용해도의 사용했지만 metalation의 유일한 부산물은 물이 있어야합니다. 이 방법은 탈염하다 어려울 것입니다 반응에 이상적이지만, 온도에 민감한 시스템에 대한 작동하지 않을 것입니다. 또한 이러한 metalation 반응은 금속과 리간드의 농도에 관하여 매우 견고한 것을 언급할 가치가있다. 농도는 한 스팬에게 부분에 우리가 문학에서 찾을 수있는 농도의 범위를 나열 범위.

금속 재료의 시작 사려깊은 선택 이외에, 그것은 금속과 리간드가 모두 가능성이 밀접하게 연관된 것을 강조하는 것이 중요하다 물, 용매 분자 - 심지어 그들이 마른 것으로 나타날 경우. 이러한 추가 분자는 종종 반응의 stoichiometry을 대폭 왜곡 정도입니다. 따라서, 그것은 잘 시작 물질 (원소 분석) 이러한 물질의 정확한 양의이 반응에 사용되는 것을 특징해야 도움이됩니다.

이 문서에서는, 우리는 반응 혼합물의 산도를 유지의 중요성을 강조. 이 산도 조절 때문에 산도가 중성 부근에서 벗어나고 수있다면 실패할 수있는 반응의 여러 측면 중요합니다. 란탄족 이온이 (중성 또는 낮은 산도 근처) 가용성 있어야하는 동안 발생하는 metalation 반응은 리간드에 carboxylic 지방산은 (중성 이상 산도 근처) deprotonated해야합니다. 산도가 너무 높은 경우, 란탄족 이온의 불용성 수산화 단지는 촉진 및 반응을 중지합니다. 산도가 너무 낮은 경우 또는, carboxylic 지방산은 protonated 유지되며 리간드는 금속으로 조정되지 않습니다. 또한, 극단적인 산도 값에서 반응 기능 그룹은 부패와 후속 bioconjugation 반응 방향으로 복잡한이 불활성 렌더링됩니다. metalation 반응이 발생하는 등 carboxylic 지방산이 deprotonated 있으므로 더 이상 문제를 복잡하게하고, 반응 혼합물의 산도가 낮아됩니다. metalation의 산도 균형 조정 행위가 복잡한 나타날 수 있지만, 그것은 쉽게 기지주의 더불어 함께 제어할 수 있습니다.

미묘한 차이로 metalation 많은 전략이있다. 이 문서에서 우리는 초과 금속의 사용을 설명하기 위해 선택했습니다. 또한 초과 리​​간드 또는 리간드와 금속 (시작 물질의 원소 분석 기준)의 동일한 금액을 사용하는 허용됩니다. 각 경로의 장점과 한계가 있습니다. 초과 금속을 사용하여의 주요 장점은 리간드가 종종 가장 비싼 시작 물질이며,이 방법은 비용을 절감 수있다는 것입니다. 모든 무료 금속 크게 relaxivity 및 독성을 포함하여 중요한 특성에 영향을 미칠 수 있기 때문에 금속이 초과 사용하지만 때, 초과 금속의 제거는 매우 중요합니다. 물에 대한 투석이 초과 금속, 구연 산염 버퍼에 대한 투석을 제거 부족한 경우 수행 구연 산염의 버퍼를 제거하는 물로 투석 다음 수 있습니다. 치료가 사용되는 모바일 단계의 산도의 중립성을 보장하기 위해 촬영이므로 또는 탈염 열 또는 HPLC는 긴으로 사용할 수 있습니다. 리간드가 초과 사용하면 가능성이 relaxivity 영향을받지 않습니다 초과 금속 및 초과 리​​간드를 제거하는 중요한 필요가 더 이상 없습니다,하지만, 무료 리간드가 유지됩니다. 이후 bioconjugation 반응의 경우이 초과 리​​간드 별도로 어려운 inhomogeneous conjugates의 문제 및 결과 수 있습니다. 이 문제, 금속 광고를 해결하려면lexes은 무수 디에틸 에테르 또는 HPLC를 초과하는 리간드에서 금속 복잡한를 구분하는 데 사용할 수에서 시켰던 수 있습니다. 이상적으로, 리간드와 금속없이 금속 또는 리간드 기반 부산물의 결과로 1:1 비율에 사용됩니다. 그러나 두 시작 자료에 대한 원소 분석은 각 반응하기 전에이 필요하고, 1:1 리간드 대 금속 비율에서 약간의 편차가있다면 다음 반응 중 넘어가는 일은 없을 것이다 리간드 인 초과하거나 금속 정화에 대한 필요성의 결과로 - 초과 카테고리.

그 결과 단지가 bioconjugation ^15-17 준비 어디에 metalation를 증명하고있다. 이 전략에 대한 대안 먼저 metalation ^18,19 다음 리간드 및 생분자의 활용이다. 이 공액 - 다음 - metalate 전략 같은 요소 metalation 경로 (산도 감도 및 생분자뿐만 아니라 소금의 제품을 정화하는 능력의 온도 감도)를 결정할 때 고려해야합니다.

우리는 기꺼이 웨인 스테이트 유니버 시티 (MJA), 연구 (SMV)를 노화에 대한 미국 재단에서 부여하고 독립 직업 전환 의생명 이미징 국립 연구소에서 수상 (R00EB007129)과 국립 연구소의 생물로 패스에서 시작 자금을 인정 보건 (MJA).