Perls/DAB Stainingによる5xFADマウスの脳内における鉄沈着の評価

このプロトコルの目標は、ADマウスモデルの脳内の鉄沈着量と分布を評価する方法を説明することです。このプロトコルでは、ADマウスモデルとして生後8か月の5xFADトランスジェニックマウスを使用し、それらを同じ年齢の野生型マウスと比較しました。化学試薬の調製、脳の切片化、Perls/DAB染色の実施、および得られた画像の解析の手順の詳細が含まれています。

マウスに適切に麻酔をかけ、麻酔と鎮痛の深さを確認します。その心臓を露出させ、次に右心房を切り開きます。左心室から20ミリリットルのPBSと4%PFAを順番に注入します。.

固視の振戦が観察される必要があることに注意してください。ネズミの首を切り落とし、脳を取り出します。次に、脳を4%PFAに12〜24時間固定します。

脳を15%と30%のスクロースに12〜24時間浸します。脳を中央から矢状に切り取り、どちらかの半分を切片化に使用します。ノブに脳を取り付け、脳の周りに錫箔の輪をはめ、それにOCTを追加して脳を埋め込みます。

クライオスタットのセクションの厚さと温度を設定します。次に、脳を切断します。セクションが折りたたまれている場合は、柔らかいブラシを使用してセクションを広げます。

PBSで各セクションをスライドに集めてから、セクションの気泡を取り除きます。無傷の脳組織を含むスライドを選択し、PBSを充填したプラスチック製の染色ボックスに入れます。ボックスを低速に設定されたロータリーシェーカーに5分間置き、残留OCTコンパウンドを完全に洗い流します。

20ミリリットルの2%フェロシアン化カリウムと等量の2%塩酸を準備します。次に、50ミリリットルの遠心分離チューブでそれらを混合します。鉗子を使用してスライドをチューブに固定し、混合物を摂氏60度の予熱水浴で30分間インキュベートしました。

スライドをPBSで洗い、ティッシュペーパーで余分な液体を拭き取ります。スライドを実験台に平らに置き、ピペットを使用して組織にDAB溶液を塗布します。10分間インキュベートして、Perls染色を強化します。

余分なDAB溶液を取り除き、PBSで3回洗って組織をすすぎます。切片を等級付けされたアルコール溶液とキシレンでそれぞれ3分間連続して脱水します。セクションをニュートラルガムとカバースリップで覆います。

その後、ドラフトで乾かします。顕微鏡の電源を入れます。光源の明るさを調整します。

4倍の倍率で脳の部分にピントを合わせます。顕微鏡ステージを動かして、Perls/DAB染色シグナルが高い領域、特に海馬と大脳皮質に焦点を合わせます。画像をキャプチャします。

対物レンズ画像を10倍で開き、画像形式を8ビットグレースケールに変換します。画像のグレー値をOD値に変換し、しきい値機能を使用してPerls/DAB染色陽性領域をカバーしました。次の設定オプションを選択し、最も重要なのは、バックグラウンドノイズを除外するためにしきい値への制限を選択することです。

最後に、統計分析の結果を取得するための測定値を選択します。ADマウスモデルにおける鉄の分布と蓄積を調べるために、脳の矢状切片のPerls/DAB染色を行った。高いPerls/DABシグナルは、海馬と皮質、特に5xFADマウスの海馬の亜細胞で観察されましたが、2か月と8か月の両方の野生型マウスの脳は弱い信号を示しました。

40倍以上の倍率で見ると、5xFADマウスのシグナルはA-βプラーク様構造で現れ、これまでの研究と一致しています。これらの結果は、Perls/DABが鉄検出の組織化学的手法として有効であることを示しています。また、染色不良の2つの例も示しています。

過度の覆いや不適切な脱水症状は、これらのケースを引き起こします。Perls/DAB染色は、従来のPerls染色よりも強いシグナルと優れた背景コントラストを提供し、鉄検出をより感度と精度の高いものにします。さらに、疎結合したタンパク質複合体中の第二鉄を検出します。

ヘモグロビンのように強く結合している鉄は反応しません。これにより、赤血球やヘモグロビン中の鉄分による不要なシグナルが大幅に減少します。全体として、Perls/DAB染色は、動物実験や、内側の特異性と感度を必要とする病理学的研究に適しています。

これにより、研究者は、時間とコストを節約しながら、鉄の蓄積を視覚化および定量化する方法を得ることができます。