L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere come valutare la quantità e la distribuzione della deposizione di ferro nel cervello di un modello murino di AD. In questo protocollo, utilizziamo topi transgenici 5xFAD di otto mesi come modello murino di AD e li abbiamo confrontati con topi wild-type della stessa età. Includiamo i dettagli delle procedure per la preparazione del reagente chimico, il sezionamento del cervello, l'esecuzione della colorazione Perls/DAB e l'analisi delle immagini risultanti.
Anestetizzare correttamente il topo e controllare la profondità dell'anestesia e dell'analgesia. Esponi il suo cuore, quindi apri l'atrio destro. Iniettare 20 millilitri di PBS e il 4% di PFA dal ventricolo sinistro in sequenza.
Si noti che i tremori di fissazione devono essere osservati. Decapita il topo ed estrai il suo cervello. Quindi, fissa il cervello al 4% di PFA per 12-24 ore.
Immergere il cervello nel 15% e nel 30% di saccarosio per 12-24 ore. Tagliare il cervello agittalmente dal centro e utilizzare una delle due metà per il sezionamento. Monta il cervello sulla manopola, metti un anello di carta stagnola attorno al cervello e aggiungi l'OCT per incorporare il cervello.
Impostare lo spessore delle sezioni e la temperatura del criostato. Quindi, taglia il cervello. Se le sezioni si piegano, utilizzare spazzole morbide per aprire le sezioni.
Raccogli ogni sezione sulle diapositive con PBS, quindi elimina le bolle sulla sezione. Selezionare un vetrino con tessuto cerebrale intatto e metterlo in una scatola di plastica riempita con PBS. Posizionare la scatola sull'agitatore rotante impostato su una velocità bassa per cinque minuti per risciacquare accuratamente il composto OCT residuo.
Preparare 20 millilitri di ferrocianuro di potassio al 2% e un volume uguale di acido cloridrico al 2%. Quindi, mescolarli in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Fissare il vetrino nel tubo con una pinza e incubare la miscela in un bagno d'acqua preriscaldato a 60 gradi Celsius per 30 minuti.
Lavare il vetrino con PBS e rimuovere il liquido in eccesso con carta velina. Appoggiare il vetrino sul banco da laboratorio e applicare la soluzione DAB sul tessuto utilizzando una pipetta. Incubare per 10 minuti per migliorare la colorazione Perls.
Rimuovere la soluzione DAB in eccesso e risciacquare i fazzoletti lavando tre volte con PBS. Disidratare la sezione in sequenza in soluzioni alcoliche graduate e xilene per tre minuti ciascuna. Copri le sezioni con una gomma neutra e un vetrino coprioggetto.
Quindi, lasciarli asciugare in una cappa aspirante. Accendere il microscopio. Regolare la luminosità della sorgente luminosa.
Concentrati sulla sezione cerebrale sotto un obiettivo con ingrandimento 4X. Spostare il tavolino del microscopio per mettere a fuoco le aree con alti segnali di colorazione Perls/DAB, in particolare l'ippocampo e la corteccia cerebrale. e catturare immagini.
Aprire l'immagine dell'obiettivo con un ingrandimento di 10, quindi convertire il formato dell'immagine in una scala di grigi a 8 bit. I valori di grigio dell'immagine sono stati convertiti in valori OD, quindi la funzione di soglia è stata utilizzata per coprire le aree positive alla colorazione Perls/DAB. Seleziona le seguenti opzioni di configurazione e, soprattutto, seleziona Limita alla soglia per escludere il rumore di fondo.
Infine, selezionare le misurazioni per ottenere risultati per l'analisi statistica. Per studiare la distribuzione e l'accumulo di ferro in un modello murino di AD, abbiamo eseguito la colorazione Perls/DAB di sezioni cerebrali sagittali. Segnali Perls/DAB elevati sono stati osservati nell'ippocampo e nella corteccia, in particolare nel subiculum dell'ippocampo dei topi 5xFAD, mentre il cervello dei topi wild-type di due mesi e otto mesi ha mostrato un segnale più debole.
Con un ingrandimento inferiore a 40, il segnale nei topi 5xFAD appare in strutture simili a placche A-beta, in linea con studi precedenti. Questi risultati dimostrano l'efficacia di Perls/DAB come tecnica istochimica per la rilevazione del ferro. Mostriamo anche due casi di colorazione fallita.
In questi casi si verificherà una copertura eccessiva o una disidratazione inappropriata. La colorazione Perls/DAB fornisce un segnale più forte e un migliore contrasto di fondo rispetto alla colorazione Perls convenzionale, rendendo il rilevamento del ferro più sensibile e accurato. Inoltre, rileva il ferro ferrico in complessi proteici debolmente legati.
Il ferro che è fortemente legato, come nell'emoglobina, non reagisce. Questo riduce notevolmente i segnali indesiderati causati dal ferro nei globuli rossi e nell'emoglobina. Nel complesso, la colorazione Perls/DAB è appropriata per gli esperimenti sugli animali e le indagini patologiche che richiedono specificità e sensibilità mediale.
Fornisce ai ricercatori un metodo per visualizzare e quantificare l'accumulo di ferro a scapito di meno tempo e costi.
