L’objectif de ce protocole est de décrire comment évaluer la quantité et la distribution du dépôt de fer dans le cerveau d’un modèle murin de MA. Dans ce protocole, nous utilisons des souris transgéniques 5xFAD âgées de huit mois comme modèle de souris MA et les comparons à des souris de type sauvage du même âge. Nous incluons des détails sur les procédures de préparation du réactif chimique, de section du cerveau, d’exécution de la coloration Perls/DAB et d’analyse des images résultantes.
Anesthésie correctement la souris et vérifie la profondeur de l’anesthésie et de l’analgésie. Exposez son cœur, puis ouvrez l’oreillette droite. Injecter 20 millilitres de PBS et 4 % de PFA à partir du ventricule gauche en séquence.
Notez que des tremblements de fixation doivent être observés. Décapitez la souris et extrayez son cerveau. Ensuite, fixez le cerveau dans 4 % de PFA pendant 12 à 24 heures.
Immergez le cerveau dans du saccharose à 15 % et 30 % pendant 12 à 24 heures. Coupez le cerveau sagittairement à partir du milieu et utilisez l’une ou l’autre moitié pour la section. Montez le cerveau sur le bouton, placez un anneau en papier d’aluminium autour du cerveau et ajoutez-y de l’OCT pour intégrer le cerveau.
Réglez l’épaisseur des sections et la température du cryostat. Ensuite, coupez le cerveau. Si les sections se plient, utilisez des brosses douces pour déplier les sections.
Collectez chaque section sur les diapositives avec PBS, puis éliminez les bulles sur la section. Sélectionnez une lame avec du tissu cérébral intact et placez-la dans une boîte de coloration en plastique remplie de PBS. Positionnez la boîte sur un agitateur rotatif réglé à une vitesse lente pendant cinq minutes pour rincer abondamment le composé OCT résiduel.
Préparez 20 millilitres de ferrocyanure de potassium à 2 % et un volume égal d’acide chlorhydrique à 2 %. Ensuite, mélangez-les dans un tube à centrifuger de 50 millilitres. Fixez la lame dans le tube à l’aide d’une pince et incubez le mélange dans un bain-marie préchauffé à 60 degrés Celsius pendant 30 minutes.
Lavez la lame avec du PBS et essuyez l’excès de liquide à l’aide de papier de soie. Posez la lame à plat sur la paillasse du laboratoire et appliquez même la solution DAB sur le tissu à l’aide d’une pipette. Incuber pendant 10 minutes pour améliorer la coloration de Perls.
Retirez l’excès de solution DAB et rincez les mouchoirs en les lavant trois fois avec du PBS. Déshydratez la section séquentiellement dans des solutions d’alcool graduées et de xylène pendant trois minutes chacune. Couvrez les sections avec une gomme neutre et une lamelle.
Ensuite, laissez-les sécher dans une hotte. Allumez le microscope. Ajustez la luminosité de la source lumineuse.
Concentrez-vous sur la section du cerveau sous un objectif de grossissement 4X. Déplacez la platine du microscope pour vous concentrer sur les zones où les signaux de coloration Perls/DAB sont élevés, en particulier l’hippocampe et le cortex cérébral. et capturer des images.
Ouvrez l’image objective avec un grossissement de 10, puis convertissez le format d’image en niveaux de gris de 8 bits. Les valeurs de gris de l’image ont été converties en valeurs OD, puis la fonction de seuil a été utilisée pour couvrir les zones de coloration Perls/DAB positives. Sélectionnez les options de configuration suivantes et, surtout, sélectionnez Limiter au seuil pour exclure le bruit de fond.
Enfin, sélectionnez les mesures pour obtenir des résultats d’analyse statistique. Pour étudier la distribution et l’accumulation du fer dans un modèle murin de MA, nous avons effectué une coloration Perls/DAB de sections cérébrales sagittales. Des signaux Perls/DAB élevés ont été observés dans l’hippocampe et le cortex, en particulier dans le subiculum de l’hippocampe des souris 5xFAD, tandis que les cerveaux des souris de type sauvage de deux mois et de huit mois présentaient un signal plus faible.
Sous un grossissement de 40 et plus, le signal chez les souris 5xFAD apparaît dans des structures de type plaque A-bêta, conformément aux études précédentes. Ces résultats démontrent l’efficacité de Perls/DAB en tant que technique histochimique pour la détection du fer. Nous montrons également deux cas de coloration défaillante.
Une couverture excessive ou une déshydratation inappropriée entraînera ces cas. La coloration Perls/DAB fournit un signal plus fort et un meilleur contraste d’arrière-plan que la coloration Perls conventionnelle, ce qui rend la détection du fer plus sensible et plus précise. De plus, il détecte le fer ferrique dans les complexes protéiques faiblement liés.
Le fer qui est fortement lié, comme dans l’hémoglobine, ne réagit pas. Cela réduit considérablement les signaux indésirables causés par le fer dans les globules rouges et l’hémoglobine. Dans l’ensemble, la coloration Perls/DAB est appropriée pour les expériences sur les animaux et les investigations pathologiques qui nécessitent une spécificité et une sensibilité médiales.
Il fournit aux chercheurs une méthode pour visualiser et quantifier l’accumulation de fer au détriment de moins de temps et d’argent.
